JPH08511874A

JPH08511874A - 生物学的流体中の検体の分析

Info

Publication number: JPH08511874A
Application number: JP7527043A
Authority: JP
Inventors: アルバートチェン、フー−タイ
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1995-04-12
Publication date: 1996-12-10
Also published as: EP0704053A1; AU2246195A; AU702943B2; US5858644A; WO1995028637A1; CA2165082A1

Abstract

(57)【要約】試料中の検体の検出方法は、酵素的反応の特異性および毛管電気泳動の分離力を用いる。この方法は、概して、次の工程を含む。(1)試料の第１のアリコートに毛管電気泳動のような分析手法を適用する。これはエレクトロフェログラムのような第１の出力を発生する。(2)検体を生成物に変える酵素触媒反応において試料の第２のアリコートを反応させる。生成物は分析手法により検出可能である。(3)第２の出力を発生させるために第２のアリコートに分析手法を適用する。(4)電気泳動の場合、検体または生成物が吸収して第１の吸光度走査および第２の吸光度走査を生じさせる少なくとも１つの波長におけるエレクトロフェログラムに沿った移行距離の相関的要素として、第１および第２の出力（エレクトロフェログラム）の吸光度を測定する。(5)第１の吸光度走査を第２の吸光度走査と比較して検体を検出する。反応は補酵素を含むことができ、また、分析手法は補酵素に向けられることができる。選択的に、少なくとも２つの酵素を用いることができ、第１の酵素は第１の生成物を生成し、これは次に第２の酵素の作用を受ける。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的流体中の検体の分析背景本発明は、生物学的流体中の分析対象物または検体(analyte)を検出するための方法、特に、毛管電気泳動および酵素反応の組み合わせを用いる検出方法に関する。多くの目的のため、尿、血漿、リンパ液または脳脊髄液のような生物学的流体における検体の検出が重要である。多くの場合、特定の検体は疾患状態の指標を成し、疾患状態は他の異常な検体の存在または他の通常にみられる検体の異常濃度の存在によって発見される。例えば、アミノ酸フェニルアラニンは遺伝障害のフェニルケトン尿症をもつ個体の血清中に異常に高濃度に存在し、これは、未治療の個体に深刻な精神障害を起こし得る。したがって、この遺伝障害の正しい診断が不可欠である。他のアミノ酸尿症もまた継承され得る遺伝障害であり、様々な深刻な結果を引き起こす可能性がある。これらの障害は特別な食餌療法により治療され、したがって、また、疾患の存在を正しく診断することが不可欠である。臨床目的でしばしば検定される検体の他の例は尿酸である。尿酸はプリンの分解生成物であり、また、血清および尿の正常な成分である。しかし、血清中の尿酸が通常濃度より高いのは痛風の特徴であり、これは関節炎や腎臓疾患を引き起こすことがある。レシュ−ナイハン(Lesch-Nyhan)症候群のような他の症候群は、通常の尿酸レベルより高いことと関連がある。この症候群は、ヒポキサンチン −グアニンリン酸リボシル転移酵素(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltran sferase)の欠乏により特徴付けられ、また、精神障害、異常な筋運動、および事故損傷や攻撃のような行動上の問題によって臨床的にはっきりと示される。多くの臨床状態の発生および診断をモニターするために他の多くの検体もまた検定される。しかし、混成の生物学的流体中のこのような検体の検定または分析は困難である。多くの場合、毛管電気泳動のような鋭敏な分離技術または分離手法をもってしても、これらの流体中に存在する多くの物質を特定することは困難である。例えば、毛管電気泳動による尿の分離は５０以上の容易に認識できるピークを生じさせ、これらのピークのごく僅かがこれまで特定されている。タンパク質や塩のような尿中成分の存在のため、前記物質の純粋試料のエレクトロフェログラム(electropherogram)と比べるとき、存在する各々の種の泳動時間が大きい影響を受ける。このような検体を特定することの困難は血清における方がより大きい。これは、血清中のタンパク質の濃度は、これが尿中にあるときよりもほぼ３倍程大きく、これが実質的に大きな程度の妨害およびマスキングを生じさせることによる。したがって、血清や尿のような複合の生物学的流体中の検体を検出し、また、塩やタンパク質によって導入される妨害を克服する分析方法の必要がある。このような方法は、様々な検体を特定しまた計量すること、特に、交叉反応を避けて行なうことができるものでなければならない。その方法は、また、アミノ酸アスパルタートおよびグルタマートのような類似構造の化合物間、または同じリング構造および異なる置換基を有するステロイド間で識別することができるものでなければならない。さらに、その方法は簡単に実施することができ、迅速に結果を出すことができ、また、新しい臨床慣行に適合する比鮫的少ない試料を使用することができるものでなければならない。概要これらの要求を満たす試料中の検体の検出方法を発明した。この方法では、試料の検体の量を表わす第１の信号を含む第１の出力を発生するため、選択された分析手法、典型的には毛管電気泳動を用いて、前記試料の第１のアリコートが分析される。前記試料の第２のアリコートの前記検体を還元する反応において前記第２のアリコートが反応される。典型的には、これは、前記検体から前記分析手法により分離可能である生成物を産生する酵素触媒反応である。反応した第２のアリコートは、次に、第２の出力を発生させるために前記選択された分析手法を用いて分析される。前記第２の出力は、前記反応した第２のアリコートが検体を含んでいないとき、前記検体を示す信号を実質的に含まない。選択的に、前記第２の出力は、幾分かのオリジナル検体を含む前記第２のアリコートを含む前記反応した第２のアリコートの前記検体の量を表す第２の信号を有し、ここにおいて、前記第２の出力は前記第１の出力より小さい。次に、２つの出力が、前記試料中の前記検体の存在を決定するため、比較される。例えば、前記分析手法が毛管電気泳動であるとき、分析の工程は、第１および第２の出力としての第１および第２の吸光度走査(scan)を生じさせることを含み、ここにおいて、前記検体を表わす吸光度のピークは前記第１の走査にあるが、しかし、対応する吸光度のピークは捉え損ねるか、または前記第２の走査では減じられている。吸光度のピークは前記検体を示す信号である。２つの吸光度のピークを比較することは、前記第１の走査の吸光度のピークがはずれているか、または第２の走査において減じられまたは変形されているかを示し、これにより、前記検体の吸光度のピークを明確にし、その結果、前記試料の検体の量を決定することができる。前記分析手法として前記毛管電気泳動を用いると、前記第１のアリコートから第１のエレクトロフェログラムが生じ、また、前記第２のアリコートから第２のエレクトロフェログラムが生じる。第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度は、前記第１および第２の吸光度走査を発生させるために前記検体または前記生成物が吸収する少なくとも１つの波長において前記エレクトロフェログラムに沿っての移行距離の相関的要素または関数(function)として測定される。前記波長は、前記検体が実質的に光を吸収する波長であり得る。この場合、第２のアリコートの前記エレクトロフェログラムにおいて、吸光度のピークは現われないか、または、非常に減じられている。選択的に、前記波長は、前記生成物のみが実質的に光を吸収する一つであることができる。この場合、前記検体ではなく前記生成物の吸光度のピークは、前記反応した第２のアリコートからの前記エレクトロフェログラムに現われる。反応の工程は好ましくは特別な酵素触媒反応(enzyme-catalyzed reaction)を利用する。前記検体により、前記酵素は、ウリカーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、エル−グルタマートデヒドロゲナーゼ(L-glutamate dehydrogenase)、３ −アルファヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3-α hydroxysteroid dehyd rogenase)、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターグルクロニダーゼ(β-glucuronidase)、ラクタートデヒドロゲナーセ、シュウ酸塩オキシターゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ (arginine-deiminase)、チロシナーゼ(tyrosinase)、フェニルアラニン−４−モノオキシゲナーゼ(phenylalanine-4-monooxygenase)、トリプトファンオキシゲナーゼまたはプロリンオキシダーゼからなるグループから選択することができる。本発明の好ましい実施例では、前記検体としての尿素の検出に関して、前記酵素はウリカーゼである。この好ましい実施例におけるエレクトロフェログラムを生じさせるための好ましい波長は、限定するものではないが、２００ナノメートルおよび２８０ナノメートルである。本発明の他の実施例では、前記第２のアリコートのための反応は、補酵素を必要とし、また、前記補酵素の利用が適合可能である酵素触媒反応とすることができる。本発明のこの変形例では、補酵素は第１および第２の両アリコートに添加されるが、前記酵素は前記第２のアリコートにのみ添加される。両アリコートは、前記第１および第２の出力を得るために前記選択された分析手法を適用される。前記第１の出力は前記試料の前記補酵素の量を表わす信号を含む。前記第２の出力は、前記補酵素が前記第２のアリコートにおける前記酵素触媒反応において消費されているため、前記反応した第２のアリコートの補酵素の量を表わす減じられまたは変形された信号を有するか、または信号を有しない。前記第１のアリコートの出力と前記反応した第２のアリコートの出力とを比較することにより、前記検体の前記酵素反応における前記生成物への転換によって生じた前記第２のアリコートにおける補酵素の濃度の減少を決定することができ、したがって、前記検体が前記試料中に存在するという指示を与える。前記補酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化および還元の形態、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩の酸化および還元の形態、フラビンアデニンジヌクレオチドの酸化および還元の形態、アデノシン三リン酸塩、または、グアノシン三リン酸塩のいずれかとすることができる。本発明にあっては、前記分析手法が選択され、また、前記分析手法が前記検体と前記反応工程において生じる前記生成物とを識別または区別することができるように用いられることが重要である。この結果を得るため、前記分析手法により前記検体から区別可能である第２の生成物を生じさせるために前記第２のアリコートの反応において生じた前記生成物をさらに反応させる必要がある。この第２の反応は酵素触媒反応とすることができる。図面本発明のこれらのおよび他の特徴、面および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲および添付図面を参照することによりさらに明らかとなろう。図１Ａは、尿酸およびアスコルバートの存在を示す尿の毛管エレクトロフェログラムである。図１Ｂは、尿酸の純粋試料の毛管エレクトロフェログラムである。図２Ａは、尿試料の他の毛管エレクトロフェログラムであって、尿酸の存在を示す。図２Ｂは、酵素ウリカーゼによる処理に引き続く図２Ａの尿試料の毛管エレクトロフェログラムであって、尿酸のピークの減少およびアラントインによるその代替を示す。図３Ａは、尿試料の２００ナノメートルにおける他の毛管エレクトロフェログラムであって、尿酸の存在を示す。図３Ｂは、ウリカーゼによる処理に引き続く図３Ａの尿試料の毛管エレクトロフェログラムであって、尿酸のピークのほとんど完全な消失を示す。図４Ａは、尿試料の２８０ナノメートルにおける他の毛管エレクトロフェログラムであって、尿酸の存在を再び示す。図４Ｂは、ウリカーゼによる処理に引き続く図４Ａの尿試料の毛管エレクトロフェログラムであって、尿酸のピークのほとんど完全な消失を示す。説明血清または尿のような複合の混成物中の検体を、選択された反応、好ましくは酵素反応の特性、および、選択された分析手法(analytical technique)、好ましくは毛管電気泳動の特性を用いることにより計量するための方法を発明した。本発明の好ましい態様では、この方法は、複合の混成物から一の分子を分離しかつ特定するために毛管電気泳動の能力に基づいている。特定された前記分子は、検体であるか、前記検体を含む反応を触媒する酵素によって触媒された１若しくはそれ以上の生成物であるか、または、補酵素のような、１若しくはそれ以上の反応に含まれた他の試薬または反応物である。特定は、一の酵素反応(enz ymatic reaction)または複数の酵素反応が起こっていない第２のアリコートと比較して前記酵素反応が生じていない前記試料のアリコートのための毛管電気泳動エレクトロフェログラムにおける差異または相違に気づくことにより成される。本発明は、前記分析手法として毛管電気泳動に限定されるものではない。利用可能である他の分析手法の中では、従来の電気泳動およびクロマトグラフ分離がある。さらに、前記反応は、必ずしも、酵素で触媒される必要はない。例えば、アスコルバートが前記検体である場合、化学的酸化技術は前記反応をもたらすために用いることができる。しかし、前記毛管電気泳動の特性および酵素触媒反応の特性のため、これらは望ましい。そこで、本発明は、これらの特別な技術に関して詳細に述べる。Ｉ．酵素を用いる毛管電気泳動分析の方法Ａ．一つの酵素を含む方法本発明の一実施例では、一つの酵素を用いることができ、また、前記酵素反応を伴うまたは伴わない複数のエレクトロフェログラムにおける相違が前記検体を決定するために用いられる。概して、この方法は、(1)前記検体を前記試料中の他の成分から分離するために第１のエレクトロフェログラムを生じさせるべく前記試料の第１のアリコートを毛管電気泳動にかけること、(2)前記検体を、毛管電気泳動により前記検体からまた前記試料中の他の成分から分離可能である生成物に変化または変換させる酵素触媒反応において前記試料の第２のアリコーとを反応させること、(3)前記生成物を前記試料中の他の成分からまた前記検体から分離するために第２のエレクトロフェログラムを生じさせるべく前記第２のアリコートを毛管電気泳動にかけること、(4)第１の吸光度走査(absorbance scan)および第２の吸光度走査を生じさせるために前記検体および前記生成物のいずれか一方が吸収する少なくとも１つの波長における前記エレクトロフェログラムに沿っての移行距離または泳動距離の相関的要素または関数(function)として前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定または決定すること、および(5)前記検体を検出および／または決定するために第１の吸光度走査と前記第２の吸光度走査とを比較することを含む。前記波長は、前記検体のみが光を実質的に吸収する波長を用いることができる。この場合、前記酵素反応の効果は前記検体を激減させ、また、前記検体に対応するピークの消失を生じさせることである。選択的に、前記波長は、前記生成物のみが光を実質的に吸収する波長とすることができ、これにより、前記生成物に対応するピークが前記第２のアリコートのエレクトロフェログラムに現われ、また、前記第１のアリコートには存在しない。これは前記検体を明確に特定するために行なわれる。なぜならば、前記検体が純粋または実質的に純粋な試料中に存在するときよりも血清または尿のような複合の混合物または混成物中に存在するとき、毛管電気泳動における前記検体の泳動が実質的に同じでないからである。したがって、前記酵素の特性が前記生成物および前記検体のいずれか一方のピークを特定するために用いられる。前記酵素は、前記検体を分解するかまたは前記検体を異なる移動度の生成物に転換することにより前記検体を明確に変化させるいかなる酵素でもよい。使用可能である酵素の中には、加水分解酵素、ホスホリラーゼ、リアーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、メチラーゼ、イソメラーゼ、およびシンテターゼがある。使用可能である酵素の中には、ウリカーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、エル−グルタマートデヒドロゲナーゼ、３−アルファヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ラクタートデヒドロゲナーゼ、シュウ酸塩オキシダーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、チロシナーゼ、フェニルアラニン−４−モノオキシゲナーゼ、トリプトファンオキシゲナーゼおよびプロリンオキシダーゼがある。典型的な検体−酵素−生成物の組み合わせは、使用される場合の補酵素とともに、表Ｉに記されている。尿のための一つの特に有用な適用において、前記検体は尿酸であり、前記酵素はウリカーゼである。他の有用な適用は、前記酵素としてのフェニルアラニンオキシダーゼおよび前記生成物としてのフェニルピルビン酸を使用して、フェニルケトンウーリア(phe nylketonuria)(PKU)を確認するための血清中のフェニルアラニンの検出である。同様に、前記酵素としてのデカルボキシラーゼ(decarboxy laser)と前記生成物としてのフェニル酢酸とを使用して、前記フェニルケトンウーリアを確認すべくフェニルピルビン酸を尿中で検出することができる。使用される波長は、前記検体または前記生成物の紫外または可視の吸収スペクトルの知識により選択される。典型的には、前記波長は約２００ナノメートルと約４００ナノメートルとの間にあり、最も典型的には約３７０ナノメートルより大きくなく、換言すれば、前記スペクトルの紫外領域にある。前記検体が尿酸であって前記酵素がウリカーゼであるとき、前記尿酸の検出に適当な波長は２００ナノメートルおよび２８０ナノメートルである。前記検体が芳香族化合物、アミノ酸または核酸モノマーであるとき、適当な波長は容易に決定される。前記第２のアリコートの前記反応に用いられる反応条件は、前記検体と個々の酵素とに依るが、ほとんど全ての場合、当業者には明らかである。典型的には、前記反応は、ペーハー(pH)を安定させるための適当な緩衝液中で起こる。典型的に、前記pHは、前記酵素に依り、約５から約１０までの範囲に維持される。多くの場合、用いられる前記pHは、中間に近く、約６から約８．５まで、より典型的には、約７から約７．５までの範囲にある。本発明の手順、過程または工程において使用可能である多数の適当な緩衝液が存在する。典型的な緩衝液は、リン酸塩、酢酸塩、トリス（ヒドロキシアミノ）メタン（以下、「トリス」という。）、および、N.E.Good等のBiochemistry 5:467-477(1966)に記載されたMES、ADA、 PIPES、ACES、BES、MOPS、PES、HEPES、EPPS、TRICINE、BICINE、CHESおよびCAP Sのような多数の緩衝液を含む。前記反応の温度は、また、前記検体と前記酵素の挙動に依り選択される。典型的には、前記反応は、約４℃から約３７℃までの範囲の温度で行なうことができる。典型的に、前記反応は、室の周囲温度すなわち約２０℃から約２５℃までの温度で行なわれる。しかし、ほとんどの酵素反応は、増大された温度においてより迅速に生じ、また、したがって、増大された温度で前記反応を行なうことが望ましい。反応混合物は、また、前記酵素の活動のために求められる他の成分を含む。後述するように、多くの酵素は活動のために補酵素を必要とし、また、必要なら、このような補酵素を含めることができる。含まれているとき、これらは好ましくは前記酵素反応を促進する飽和量で含まれている。他の場合、No⁺、K⁺、Ca²⁺、M g²⁺または他のイオンのような個々の一価または二価の陽イオンを添加することができる。本発明において使用可能である酵素に関して、前記反応条件はこの分野でよく知られている。使用される酵素の量は、前記検体を前記生成物に転換するのに十分な量である。典型的には、前記検体は、使用される個々の酵素についての前記検体に関するＫ_mに少なくとも等しい初めの濃度の反応混合物中に存在する。この濃度では、前記反応の割合は最大限の半分である。培養時間は前記検体の濃度、酵素の量、および、前記酵素のターンオーバー数に依存する。典型的には、約１０秒間から約１時間、より典型的には約１分間から約１０分間の範囲である。前記手順からの変化は、個々の酵素および検体の特性についての知識を有する当業者には明らかである。Ｂ．補酵素の使用−酵素の利用多くの酵素によって触媒される反応は補酵素の関与を必要とする。酵素反応にしばしば含まれる補酵素には、アデノシン三リン酸塩、グアノシン三リン酸塩、補酵素Ａ、チアミンニリン酸塩、ピリドキサルリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化および還元の形態、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩の酸化および還元の形態、フラビンアデニンジヌクレオチドの酸化および還元の形態、および、リボフラビン５’リン酸塩がある。他の補酵素はこの分野では知られている。酵素により触媒された反応が補酵素を含む場合、酵素反応の結果としての前記補酵素の濃度の変化は、前記反応の程度をモニターするのに用いることができる。Ｃ．２若しくはそれ以上の酵素を用いる共役反応複数の酵素反応を結合または連結することができ、これにより、第１の酵素反応の生成物は次いで第２の酵素反応のための基質として用いられる。ある場合には、３以上の酵素を結合することができる。結合された酵素反応の例は次の事項を含む。（１）ADPおよび1,3−ジホスホグリセレートを産生するためにホスホグリセロキナーゼにより触媒されたATPおよび３−ホスホグリセレートの反応に続いて、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩、NAD⁺および無機リン酸塩を産生するグリセルアルデヒド・ホスフェートデヒドロゲナーゼにより触媒されたNADHとの1,3− ジホスホグリセレートの反応が生じる。（２）コレステロールおよび遊離脂肪酸を産生するためにコレステロールエステルおよび水とコレステロールエステラーセとの反応に続いて、コレスト−４− エン−３−ワン(cholest-4-en-3-one)および過酸化水素を産生するためにコレステロールオキシターゼにより触媒された分子酸素での前記コレステロールの酸化があり、過酸化酸素と、キノンイミン染料を産生するペルオキシターゼにより触媒された４−アミノアンチピリンおよびｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸塩との反応がある。（３）３−ホスホグリセレートを産生するための２−ホスホグリコール酸および無機ホスフェートの存在下での2,3-ジホスホグリセレートと2,3-ジホスホグリセレート・ホスファターゼとの反応に続いて、1,3-ジホスホグリセレートおよび ADPを産生するためにATPによる３−ホスホクリセレートのリン酸エステル化があり、これに続いて、グリセルアルデヒド−３−ホソフェートおよびNAD⁺を産生するためにグリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼにより触媒されたNADHによる1,3-ジホスホグリセレートの還元がある。（４）グルコース−６−ホスフェートおよびADPを産生するため、ヘキソキナーセにより触媒された、ATPによるグルコースのリン酸エステル化に続き、６− ホスホグルコネートおよびNADHを産生するためにグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼにより触媒されたNAD⁺によるグルコース−６−ホスフェートの酸化がある。結合された酵素反応を用いる本発明の１変形例において、前記検体および前記第２の生成物のいずれか一方を前記共役反応の工程後に分析または検定することができる。この方法は、次の工程を含む。（１）前記試料中の他の成分から前記検体を分離するエレクトロフェログラムのような、第１の出力を生じさせるため、毛管電気泳動のような、分析手法を前記試料の第１のアリコートに適用する。（２）前記検体を第１の生成物に変えるために第１の酵素によって触媒された反応において前記試料の第２のアリコートを反応させること、および、前記第１の生成物を第２の生成物に変えるために第２の酵素により触媒された反応において前記第１の生成物を反応させること。ここにおいて、選択された分析手法により、前記第２の生成物と前記検体とが識別または区別される。（３）第２の出力を生じさせるため、前記第２のアリコートに、選択された分析手法を適用する。（４）前記試料中における検体の存在または検体の量を決定するために２つの前記出力を比較すること。前記分析手法が毛管電気泳動である場合、前記出力はエレクトロフェログラムであり、前記比較は次のようにして行なわれる。（ｉ）各吸光度走査を生じさせるために前記検体および前記第２の生成物の一方が吸収するエレクトロフェログラムに沿っての泳動距離の相関的要素または関数として、前記複数のエレクトロフェログラムの吸光度を測定すること、および、（ii）前記検体を検出および／または決定するために前記吸光度走査を比較すること。前記検体のみが実質的に吸収する波長において、第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定することができる。この場合、検出されるものは、前記第２のアリコートにおける前記検体の消失である。選択的に、前記第２の生成物のみが実質的に吸収する波長において、前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定することができる、その結果、前記第２の吸光度走査における前記第２の生成物の存在と前記第１の吸光度走査からのその消滅とを観察することにより前記比較がなされる。前記「第２の酵素」は単一の酵素、または、前記したように、２以上の酵素からなるものであってもよい。後者の場合、前記「第２の生成物」は、結合された反応の組における最後の酵素の触媒作用の結果である。選択的に、前記第２の酵素は、補酵素の関与を求める反応を触媒する酵素でもよい。この場合、前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度は、第１の吸光度走査および第２の吸光度走査を生じさせるために前記補酵素が吸収する少なくとも１つの波長における前記複数のエレクトロフェログラムに沿っての泳動距離を相関的要素または関数として測定され、また、前記第１および第２のエレクトロフェログラム中の補酵素の濃度を比較することにより前記検体を検出および／または決定するために前記第１の吸光度走査が前記第２の吸光度走査と比較される。この方法では、前記第２の酵素反応は、しばしば、酸化還元反応を含み、また、NAD⁺、NADH、NADP⁺またはNADP⁺のような補酵素を発生させまたは利用する結果に終わる。 II．毛管電気泳動毛管領域電気泳動(CZE)または電気泳動は、大小の分子の高効率分離を達成するために狭い穴（内径10-200μｍ）の細管を用いる手法である。この分離は、光電圧、典型的には1000ないし30,000ボルトを用いることにより促進され、緩衝液およびイオン種の電気浸透および電気泳動の流れをそれぞれ前記毛管中に生じさせることができる。前記分離の特性と、エレクトロフェログラムの確保とは、伝統的なポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(PAGE)と最近の高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)との中間物に似た特徴を有する。前記毛管の試料入力と試料出力との間で流体を移動させるための力は、前記試料入力と前記試料出力との間に適当な電圧をもたらすことにより付与され、前記した電気泳動力および電気浸透力が生じる。電気浸透は、前記毛管の壁面上の表面電荷の結果である。分離のために使用されている典型的な石英ガラスの毛管は該毛管内に収容された前記緩衝液と接してイオン性のシラノール群をもつ。石英ガラスのpIは約1.5である。電離度は主に前記緩衝液のpHによりコントロールされる。pHが1.5より大きいほとんどの緩衝液は前記毛管壁を電離することができる。負に帯電された壁は前記緩衝液から正に帯電されたイオンを引き寄せ、電気的な二重層を作る。前記毛管の一方側から他方側へ電圧が印加されると、前記二重層の散乱部分における陽イオンがこれらと共に水を運ぶ陰極へ向けて移行する。その結果、負の電極へ向けての緩衝液の正味の流れ(net flow)が生じる。その間、前記緩衝液中の負に帯電されたタンパク質、ペプチド、イオン性の小さい分子あるいは他の種のような検体が、正の電極へ向けての電気泳動により前記EOFに抗して移動することができる。前記正の電極（陽極）に向けての前記検体の電気泳動にもかかわらず、前記緩衝液は前記検体の電気泳動を壊滅させ、前記検体は負の電極（陰極）へ向けて泳動する。電気泳動は分離される各分子、例えばタンパク質または小さい分子の電荷−質量率に依存する。各分子は、その寸法およびアミノ酸組織に依存する特定の電荷−質量率を有し、このため、異なる速度で泳動する。毛管電気泳動装置では、検出窓であって前記試料が前記緩衝液により前記検出窓に運ばれるように前記試料が電気泳動領域に入る点に関して検出窓が配列されている。したがって、前記緩衝液に対する移動がより早いと、特定の分子がより遅く前記検出窓を通過する。これは、流れに抗して舟を漕ぐけれども漕ぐよりも早く下流に運ばれる一群の非常に怠惰な舟の漕ぎ手に似ている。流れに沿ったある距離の位置にいる観察者は、最初、最も遅く舟を漕ぐ漕ぎ手が到着するのを見るが、これは、漕ぎ手の正味の移動が流れの移動に最も近いからである。最も力強く舟を漕いだ漕ぎ手は、実際、観察者のところに最後に到着するであろう。したがって、負に帯電されたアミノ酸残留物アスパルタートおよびグルタマートの高い比率によって高度に負に帯電されたタンパク質は、最も遅く、前記検出窓に到達する。同様に、カルボキシレート(carboxylate)およびホスフェートのような非常に多数の負に帯電した置換基を有する小さい分子は、少なく帯電されたグループをもつ同様の分子より遅く前記検出窓に到着する。したがって、前記毛管電気泳動において測定されるものは、時間の関数として前記検出窓を通過する前記試料の吸光度である。毛管電気泳動の工程は、適当な電気泳動を発生させることができまた結果的に生じるピークを検出することができるいかなる装置においても行なうことができる。典型的に、毛管電気泳動システムは、円形の横断面および筒状の外形を有する石英または石英ガラス製毛管を含み、また、所望の波長を選択するための紫外線放出源およびモノクロメータと、前記試料を通過した紫外線を検出するための光電検出器とを備える。前記毛管の典型的寸法は、内径25μｍ×全長27ｃｍである。適当な毛管は、アリゾナ州フェニックスのPolymicro Technologiesで製造されている。前記毛管の外表面は該毛管を損傷から保護するためにポリイミドで被覆されている。光学モジュールおよび検出器は紫外光線源（重水素ランプ）と、適当な波長(例えば254nmまたは280nm)の光線を通す回転輪のフィルタと、前記窓の開口に整列する検出器とを含む。前記窓は、前記間の出口から6.5cmの位置に配置することができる。254nmまたは280nmにおける紫外線吸収に基づく尿酸検出のための適当な装置は、Beckman Instruments P/ACE 2000 CEシステム（カリフォルニア州フラートンのBeckman Instruments）である。このシステムはコンピュータで制御され、また、CCEソフトウエアのような適当なソフトウエアおよびI BM PS/2のようなIBM-コンパチブルパーソナルコンピュータと共に使用可能である。他の適当な毛管電気泳動装置もまた使用可能である。検出された信号が特定の波長に関して記述されるが、特に尿酸検出のための特定の254ナノメートルまたは280ナノメートルでは、電気泳動システムが多数の異なる波長において作動し得る。多数の個々の波長での信号は、前記管に適用された１若しくはそれ以上の検出通路に向けることができる。前記窓の幅を規定するマスキングが、前記選択された波長における信号を前記管壁の望ましくない部分の通過から適当に除外する限り、波長のこのような範囲は前記電磁スペクトルにおいて制限されまたは大きい。本発明の方法に使用される前記電気泳動システムについて単一の毛管電気泳動ユニットに関して説明したが、試料中の尿酸の濃度の時系列のような、連続したモニター手順を考慮に入れるために多数のシステムを順次にまたは直列に使用することができる。これは、痛風における食餌変化に対する応答または尿酸尿投薬 (uricosuric medicatlon)に対する応答のような臨床状態の展開をモニターするときに有用である。他の状況では、毛管の中心軸線の周りに選択角度で配置された多数の入力窓および出力窓を有することが可能である。異なる状況では、異なる選択波長の入力光は、前記軸線の周りの選択された入力窓を経て前記毛管に入力することができる。異なる出力窓は、前記管内の試料に関する適切な情報を有する光を受け入れる。この配列は、例えば、２若しくはそれ以上の内部基準(internal standard) に関して試料中のタンパク質および核酸の双方の濃度を測定するために用いることができる。 III．本発明の方法により検出可能の検体本発明の方法により広範囲の検体を分析可能である。これらの検体は任意の検体であって該検体を含む反応が利用可能である検体を含み得る。あるケースでは、他の潜在的に反応する検体が試料中に存在しそうにないかまたは他の方法により検出され得る限り、特定の検体のための絶対的特異性(absolute specificity) は求められない。本発明により検出され得る検体は、糖、糖誘導体、ヌクレオチド、および、尿酸や他のプリンやピリミジンのような核酸塩基の誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ステロイド、および、ヒドロキシル化、リン酸エステル化、水解、糖への共役、開裂または酸化のような代謝変更または代謝修飾に適用される医薬品を含む。典型的な検体は表Ｉに示されている。本発明は以下の例に基づいて図示されている。これらの例は図示の目的のみであり、また、本発明を制限するように意図されていない。例例１毛管電気泳動による尿中の尿酸の確認尿酸は、毛管電気泳動に結び付けられた酵素ウリカーゼの作用により尿中で確認された。尿のアリコート(100μl)を毛管電気泳動にかけた。尿酸を確認するため、既知量の尿酸(0.0lmg)を前記尿に添加した。Beckman CCEソフトウエア、変更の「Sys tem Gold」が用いられ、IBM PS/2 PCにより制御されるベックマンのP/ACE 2000 シリーズ電気泳動装置で毛管電気泳動を行なった。ジメチル・ホルムアミドを流量のマーカーとして使用し、また、これを図面では「EOF」と称した。複数の電気泳動を、直径21μｍ×長さ25cmの寸法を有する素材石英ガラスの毛管で行なった。前記毛管の外面は該毛管を損壊から保護するためにポリイミドで被覆された（アリゾナ州フエニツクスのPolymicro Techno1ogies,Inc．）。光学モジュール（光学ユニット）および検出器は、紫外線源と、254または280ナノメートルに設定することができる回転輪内のモノクロメータと、前記窓の開口に整列された検出器とを備える。前記窓は前記毛管の出口から6.5cmの箇所にある。毛管電気泳動のため、移動緩衝液を次のように準備した。9.27gのホウ酸を量り取り、1800mlの脱イオン水に溶かした。pH計を２つの標準pH溶液でPh7.0および10. 0に校正し、次いで、前記ホウ酸溶液を１N NaOHで10.0のpHに調整した。次に、前記ホウ酸を測容装置を用いて1000mlの最終容積に調整し、0.22μｍの薄膜(Cor ning，NY，Filter Catalogue No.25952)を通して濾過し、ガラスびんに入れて室温で保管した。試料希釈剤はBeckman Instruments ICS希釈剤であり、75mMの塩化ナトリウム、20mMのリン酸カリウムを含み、pH7.0である。試料は、１部の尿または尿酸溶液を９部の試料希釈剤で希釈して、最終全容積 100μｌに希釈した。前記電気泳動装置の試料トレイ上にバイアルをおいた。電気泳動のためのパラメータを次のように設定した。格別な指示がない場合、測定のための波長を200 nmとした。温度は２４℃とした。注入モードは１０秒間の圧力注入とした。分離電圧は２０キロボルトとした。分離時間は７分間である。電流はほぼ19μａとした［これらの値が正しいかどうか知らせてください。特に、どのような波長において、図１および図２に示す測定値が取られるかにつきお知らせください。］。操作順序は次のとおりである。カラムを移動緩衝液で1.5分間洗浄した。次に、前記カラムを移動緩衝液で0.5分間平衡した。指摘したように、圧力注入を10 秒間行ない、分離を20キロボルトで７分間行なった。次に、前記カラムを洗浄液Ａで１分間洗浄し、次いで、洗浄液Ｂで１分間洗浄した。前記洗浄液Ａは１N Na OHである。前記洗浄液Ｂは脱イオン水である。カラムのメンテナンスは次のとおりである。各日の開始に当たり、カラムを洗浄液Ａで１分間洗浄し、洗浄液Ｂで５分間洗浄し、また、移動緩衝液で15分間洗浄する。各日の終わりに、前記カラムを洗浄液Ａで１分間洗浄し、また、洗浄液Ｂで５分間洗浄する。図１Ａは尿の電気泳動の結果を示す。図１Ｂは純粋な尿酸100μg/mLの電気泳動を示す。毛管電気泳動による前記尿試料（図１Ａ）中の尿酸の定量により、尿酸の含有量13.4mg/dlの結果が得られた。アスコルバートの真正な試料を共に注入することにより、アスコルビン酸の存在が明らかにされた。前記尿中の尿酸は、3,5-ジクロロ-2-ヒドロキシベンゼンスルホン酸塩および4-アミノアンチピリンとウリカーゼとの作用から生じた過酸化水素の反応を含むTrinder反応(Beckma n Uric Acid Trinder Reaction)と結合されたウリカーぜを用いて、6.7mg/dlに決定された。相違は、前記Trinder反応上のアスコルバートの妨害のためであろう。アスコルバートオキシダーゼによる前記尿試料の処理は、前記Trinder反応により12.9mg/dlに、測定尿酸濃度の増大の結果をもたらした。例２毛管電気泳動および酵素反応を用いる尿中尿素の確認結果が図２−４に示されている実験では、毛管電気泳動を、尿酸を確認するために酵素ウリカーゼの使用と組み合わせた。図２Ａには、ウリカーゼ処理に先立つ基準または標準の尿(200μl)のエレクトロフェログラムが示されている。５μ /mlのウリカーゼ(500μ/ml)の添加後、尿酸が減り、尿素のウリカーゼ作用の生成物、化合物アラントインの対応増大があった（図２Ｂ）。図２Ａおよび図２Ｂにおける検出は200nmであった。同様の結果が、200nmにおける検出について図３Ａおよび図３Ｂに、また、280 nmにおける検出について図４Ａおよび図４Ｂに示されている。図３Ａおよび図４Ａにおいては、前記尿がウリカーゼ処理なしに電気泳動され、他方、図３Ｂおよび図４Ｂにおいては、前記尿がウリカーゼ処理に引き続いて電気泳動された。図３Ｂおよび図４Ｂの双方において、前記尿酸のピークはウリカーゼ処理後実質的に除かれている。本発明の利点本発明は多くの利点を有する。例えば、生物学的に重要な広範囲の検体を決定するために使用することができる。この方法は、純粋な試料のエレクトロフェログラムと比較して検出出力を変え得る塩、小さい分子、またはタンパク質による妨害を克服することができる。本発明の方法は、フェニルアラニン、フェニルアラニンピルビック酸および尿酸のような臨床的に重要な尿および血清中の検体を検出することができる。この方法は、実行するのに迅速、容易であり、再現可能であり、また、少量の試料体積を必要とするに過ぎない。本発明をある好ましい例に関して詳細に説明してきたが、他の変形例であってもよい。したがって、添付の請求の範囲の精神および範囲はここに含まれる好ましい例の説明に限定されるべきではない。

Claims

【特許請求の範囲】１試料中の検体の検出方法であってこの方法は前記検体の検出の妨害をする混合物を含む試料に適し、（ａ）前記試料の分析量を表わす第１の出力を発生させるため、選択された分析手法を用いて、検体を含む試料の第１のアリコートを分析すること、（ｂ）前記試料の第２のアリコートの検体の量を減少させる反応であって前記分析手法で前記検体から識別可能である生成物を生じさせる反応において前記第２のアリコートを反応させること、（ｃ）反応した第２のアリコートを、該反応した第２のアリコートの検体の量を表わす第２の出力を発生させるために前記選択された分析手法を用いて分析すること、および、（ｄ）前記試料中の検体の存在を決定するために２つの前記出力を比較すること、を含む検体検出方法。２前記比較の工程が、前記試料の検体の含有量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。３前記分析手法が毛管電気泳動である、請求項１に記載の方法。４前記反応させる工程が、酵素触媒反応において前記第２のアリコートを反応させることを含む、請求項３に記載の方法。５前記反応させる工程が、酵素触媒反応において前記第２のアリコートを反応させることを含む、請求項１に記載の方法。６試料中の検体の検出方法であってこの方法は前記検体の検出の妨害をする混合物を含む試料に適し、（ａ）第１の出力を発生させるため、選択された分析手法を用いて、前記試料の第１のアリコートを分析すること、（ｂ）前記検体が前記試料の第２のアリコート中に存在するとき、反応から、前記分析手法で前記検体から識別可能である生成物を生じさせる前記反応において前記第２のアリコートを反応させること、（ｃ）反応した第２のアリコートの生成物の量を表わす信号を含む第２の出力を発生させるために前記選択された分析手法で前記反応した第２のアリコートを分析すること、および、（ｄ）前記試料中の検体の存在を決定するために２つの前記出力を比較すること、を含む検体検出方法。７前記比較する工程が、前記試料の検体の量を決定することを含む、請求項６に記載の方法。８前記反応させる工程が、酵素触媒反応に前記第２のアリコートを適用することを含む、請求項６に記載の方法。９前記生成物が前記検体の生成物である、請求項８に記載の方法。１０前記酵素触媒反応は該反応において誘導体を生成する補酵素を必要とし、前記方法は両アリコートに前記補酵素を添加する工程を含み、また、前記分析が行なわれる前記生成物が前記補酵素の前記誘導体である、請求項８に記載の方法。１１試料中の検体の検出方法であってこの方法は前記検体の検出の妨害をする混合物を含む試料に適し、（ａ）前記試料の第１のアリコートおよび第２のアリコートに補酵素を添加すること、（ｂ）前記試料の前記補酵素の量を表わす第１の信号を含む第１の出力を発生するために選択された分析手法で前記添加された補酵素を有する前記試料の前記第１のアリコートを分析すること、（ｃ）酵素触媒反応であって該酵素触媒反応が該反応から前記補酵素の生成物を生じさせまた前記第２のアリコートの補酵素を還元し、前記補酵素と前記補酵素の生成物とが前記分析手法において前記検体から識別可能である酵素触媒反応のための前記酵素を添加することにより添加された補酵素と前記試料の第２のアリコートとを反応させること（ｄ）反応した前記第２のアリコートの補酵素の生成物量を表わす信号を含む第２の出力を発生させるために前記選択された分析手法で前記反応した第２のアリコートを分析すること、および、（ｅ）前記試料中の前記検体の存在を決定するために２つの前記出力を比較すること、を含む検体検出方法。１２前記分析する工程が、毛管電気泳動を用いることを含む、請求項１１に記載の方法。１３試料中の検体であって該検体が該検体を生成物に変える酵素触媒反応に適用される、検体の検出方法であって、（ａ）第１のエレクトロフェログラムを生じさせるために毛管電気泳動に前記試料の第１のアリコー卜を適用すること、（ｂ）前記検体を、毛管電気泳動により前記検体から分離可能である生成物に変えるための酵素触媒反応において前記試料の第２のアリコートを反応させること、（ｃ）前記検体から前記生成物を分離するために第２のエレクトロフェログラムを生じさせるべく毛管電気泳動に前記反応した第２のアリコートを適用すること、（ｄ）第１の吸光度走査および第２の吸光度走査を生じさせるために前記検体または前記生成物が吸収する少なくとも一つの波長における前記エレクトロフェログラムに沿っての移行距離の相関的要素として前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定すること、および、（ｅ）前記検体を検出するために前記第１の吸光度走査と前記第２の吸光度走査とを比較すること、を含む検体検出方法。１４前記波長は、前記検体のみが実質的に光を吸収する波長である、請求項１３に記載の方法。１５前記波長は、前記生成物のみが実質的に光を吸収する波長である、請求項１３に記載の方法。１６前記酵素は、ウリカーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、エル−グルタマートデヒドロゲナーゼ、３−アルファヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ラクタートデヒドロゲナーゼ、シュウ酸塩オキシダーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、チロシナーゼ、フェニルアラニン −４−モノオキシゲナーゼ、トリプトファンオキシゲナーゼおよびプロリンオキシダーゼからなるグループから選ばれた酵素である、請求項４、５、８、または１３に記載の方法。１７前記酵素がウリカーゼからなる、請求項１６に記載の方法。１８前記波長が２００ナノメートルまたは２８０ナノメートルである、請求項１６に記載の方法。１９試料中の検体であって該検体が該検体を生成物に変える酵素触媒反応に適用され前記酵素触媒反応が補酵素を必要とする、検体の検出方法であって、（ａ）前記試料の第１のアリコートおよび第２のアリコートに酵素触媒反応を保持するのに十分な量の補酵素を添加すること、（ｂ）エレクトロフェログラムを生じさせるために毛管電気泳動に前記試料の前記第１のアリコートを適用すること、（ｃ）前記検体を酵素触媒反応であって該反応が前記補酵素の関与を求め、前記補酵素が毛管電気泳動により前記検体および前記生成物から分離可能である酵素触媒反応における生成物に変えるために前記第２のアリコートに酵素を添加すること、（ｄ）エレクトロフェログラムを生じさせるために毛管電気泳動に前記反応した第２のアリコートを適用すること、（ｅ）第１の吸光度走査および第２の吸光度走査を生じさせるために前記補酵素が吸収する少なくとも一つの波長における前記エレクトロフェログラムに沿っての移行距離の相関的要素として前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定すること、および、（ｆ）前記補酵素を必要とする前記酵素的反応において前記検体の前記生成物への転換により生じた前記第２のアリコートにおける前記補酵素の濃度の減少を決定することにより前記検体を検出するために前記第１の吸光度走査と前記第２の吸光度走査とを比較する、検体検出方法。２０前記補酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化および還元形態、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩の酸化および還元形態、フラビンアデニンジヌクレオチドの酸化および還元形態、アデノシン三リン酸塩、および、グアノシン三リン酸塩からなるグループから選択される、請求項１９に記載の方法。２１試料中の検体であって該検体が該検体を第１の生成物に変える酵素触媒反応に適用される検体の検出方法であって、（ａ）前記試料中の他の成分から前記検体を分離する第１のエレクトロフェログラムを生じさせるために前記試料の第１のアリコートを毛管電気泳動にかけること、（ｂ）第１の酵素の存在下で前記検体を第１の生成物に変える第１の酵素触媒反応と、前記第１の生成物を、前記検体から毛管電気泳動により分離可能である第２の生成物に変える第２の酵素触媒反応とにおいて前記試料の第２のアリコートを反応させること、（ｃ）前記検体から前記第２の生成物を分離する第２のエレクトロフェログラムを生じさせるために前記反応した第２のアリコートを毛管電気泳動にかけること、（ｄ）第１の吸光度走査および第２の吸光度走査を生じさせるために前記検体または前記第２の生成物が吸収する少なくとも１つの波長において前記エレクトロフェログラムに沿っての移行距離の相関的要素として前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定すること、および、（ｅ）前記検体を検出するために前記第１の吸光度走査と前記第２の吸光度走査とを比較することを含む、検体検出方法。２２前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度が、前記検体のみが実質的に吸収する波長において測定される、請求項２１に記載の方法。２３前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度が、前記第２の生成物のみが実質的に吸収する波長において測定される、請求項２１に記載の方法。２４試料中の検体であって該検体が酵素触媒反応に適用される検体の検出方法であって、（ａ）第１の酵素の生成物を必要とする反応を触媒する第２の酵素によって触媒された反応に関与する補酵素を前記試料の第１および第２のアリコートのそれぞれに添加すること、（ｂ）前記試料中の他の成分から前記検体を分離するためにエレクトロフェログラムを生じさせるべく毛管電気泳動に前記試料の前記第１のアリコートをかけること、（ｃ）第１の生成物を生じさせるための前記第１の酵素の存在下でかつ第２の生成物を生じさせるために前記第１の生成物を反応させるための第２の酵素の存在下で前記試料の前記第２のアリコートを反応させ、また、前記第２のアリコートの補酵素を還元すること、（ｄ）前記試料中の他の成分から、また、第２のエレクトロフェログラムを生じさせるために前記検体から、前記補酵素を分離するために前記試料の前記反応した第２のアリコートを毛管電気泳動にかけること、（ｅ）第１の吸光度走査および第２の吸光度走査を生じさせるために前記補酵素が吸収する少なくとも１つの波長において前記エレクトロフェログラムに沿っての移行距離の相関的要素として前記第１および第２のエレクトロフェログラムの吸光度を測定すること、（ｆ）前記第１および第２のエレクトロフェログラムにおいて補酵素の濃度を比較することにより前記検体を検出するために前記第１の吸光度走査と前記第２の吸光度走査とを比較することを含む、検体検出方法。２５前記補酵素は、ニコチンアデニンジヌクレオチドの酸化および還元形態、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸塩の酸化および還元形態、フラビンアデニンジヌクレオチドの酸化および還元形態、アデノシン三リン酸塩、および、グアノシン三リン酸塩からなるグループから選択される、請求項２４に記載の方法。