JPH08511935A - 選択的細胞増殖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者例えばヒトのほとんどあらゆる生体細胞から原始幹細胞、始祖細胞、前駆細胞、分化の中間段階にある細胞、及び最終的に分化した細胞を含む標的細胞群を生産する方法を提供する。これらの標的細胞群は、骨髄移植、末梢血移植などの細胞移植療法、並びにあらゆる器官ないし造血系のような器官系の再形成もしくは補完に使用することができる。さらに、標的細胞群は、遺伝子及びその発現産物を系統的ないし特定的に患者に導入する遺伝子療法にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 選択的細胞増殖関連出願の引照 この出願は1993年１月27日出願の米国出願08/009,593の一部継続出願である。発明の背景 １．発明の分野 本発明は、所望の、または標的とする細胞群を産生及び使用する方法及び組成 物に関する。標的細胞群には、リンパ性細胞及び骨髄細胞を生じる造血系、及び 種々の器官系、組織、及び支持する細胞基質のような系の幹細胞の群及び分化し た子孫(progeny)の群がある。本発明の標的細胞群は、細胞移植に、疾患または 感染症に対する治療または予防剤として、不足したまたは欠損した細胞群の再構 成に、遺伝情報を患者に導入する手段として、先天性または後天性遺伝欠損及び 異常に対する治療剤として有用である。 ２．関連技術の説明 造血系は形態学的に及び機能的に認識できる、人の血液系の細胞の全てを供給 する能力がある。血液循環系の、完全に成熟した細胞は、赤血球、血小板、好中 性顆粒球、単球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、Ｂ−リンパ球およびＴ−リン パ球を含む。血球のめだつ特徴は寿命が比較的短いということである。従って一 生を通して全体の血液プールの再生が一定でなければならない。 多くの別個の血液細胞形態を絶え間なく生成するために身体によって用いらる 生理的システムの現在の容認されているモデルは造血系の幹細胞モデルである。 このモデルでは、完全に成熟した細胞は、要求があり次第、形態で認識できる分 裂する前駆細胞に置き換わる。前駆細胞は、赤血球系統では赤芽球、前骨髄球系 統では骨髄芽球、及び血小板では巨大核細胞のようにそれぞれの成熟細胞につい て別個の系統がある。前駆細胞は、祖(progenitor)細胞及び幹細胞に分類される もっと初期的な細胞から派生する。この定義は細胞がもっと分化した細胞系統を 産生する能力があるという機能的な特性に基づいてなされたものである。これら の細胞は、ある場合には、例えば、バースト形成ユニット―赤血球(BFU-E)及び バースト形成ユニット―巨大核細胞(BFU-MK)と呼ばれる赤血球祖細胞のような、 一つの別個の系統の前駆細胞である。他の細胞は、顆粒球及び組織球（マクロフ ァージ）系統細胞の元となるコロニー形成ユニット―顆粒球／組織球(CFU-GM)や T-及びB-リンパ球系統細胞の両方の元となるコロニー形成ユニット―リンパ球(C FU-L)のような多機能性細胞である。造血系の系統地図を図１に示す。 最近考察されたように、造血は、結局の処、幹細胞と呼ばれる未分化の細胞の プールに由来する。最も初期的な幹細胞は、二つの機能的な特徴によって定義さ れる。それは、幹細胞プールを自己再生し、そして維持する能力、及び全ての単 一の及び複合的な造血系統に分化するよう方向付けられた前駆体である子孫(pro geny)を生ずる能力とである。最も初期的な幹細胞は極めて稀なものであると考 えられる。骨髄細胞中では、10⁴のうち１以下で、大抵の場合10⁶のうち１より稀 である。従って、最も初期的な分化多能幹細胞の全体のプールは、大抵の場合、 １〜２×10⁶細胞以下である。未分化幹細胞のこのプールは分裂と分化によって 分化の進んだ骨髄幹細胞と祖細胞及び前駆細胞を生ずる。形態学的には幹細胞と 区別がつかない祖細胞は、一つのまたはそれ以上の特定の細胞系統に分化し前駆 細胞は特定の細胞系統に分化する。結局は、増殖と分化の連鎖的な配列によって 、これら稀な幹細胞は、全体的な造血系を再生する。この過程は絶え間なく寿命 のある限り進行するもので、人の成人の場合、一日当たり10¹¹より多い細胞を産 生する。 幹細胞及び祖細胞は、共に、骨髄、脾臓、及び血液中の全有核細胞のうち非常 に小さな割合を構成する。これらの細胞は骨髄中におけるよりも、脾臓における 方が約10倍少ない頻度であり、血液においてはさらに頻度が少ない。血液中の単 核細胞(MNC)、いわゆる白血球の大部分は、ＭＮＣの約92％より多くからなる好 中球（大多数）及びリンパ球とである。１リットルの血液には約7.5×10⁹の白血 球及び約240×10⁹の血小板が含まれている。 造血系の細胞の膜は、形態学的及び機能的表現型の点で別異の細胞型を区分し 、同定するのに用いられる異なるレセプター蛋白を含んでいる。これら多くの膜 レセプターは特定のモノクロナール抗体に対する抗原として同定され使用されて き た。これら抗原の多くは唯一の特定の系統の細胞に見いだされるのみである。特 に、抗原の特定の組み合わせが特定の細胞及び特定の系統の細胞を、細胞形態学 及び／または機能との相関において同定するのに有用であることがわかった。一 つの抗原、ＣＤ３４が、骨髄及び血液中の両方に見いだされる最も初期的な祖細 胞及び幹細胞上に見いだされた（米国特許番号4,714,680）。この抗原は発生段 階に特異的で、系統に依存しない。その抗原は、正常な人の骨髄及び血液細胞上 に現れ、顆粒球―組織球−コロニー形成細胞(CFU-GM)上に、赤血球−コロニー形 成細胞(BFU-E)上に、好酸球−コロニー形成細胞(CFU-Eo)上に、顆粒球―組織球 ―巨大核細胞−多機能コロニー形成細胞(CFU-GEMM)上に、及び未成熟リンパ性前 駆細胞上に現れる。人の骨髄では、この抗原は約1.8％の正常な骨髄細胞及び約0 .2％の正常な末梢血細胞上に現れる。ＣＤ３４は正常な、成熟した人のリンパ性 細胞または骨髄細胞上に現れない。従って、ＣＤ３４抗原は人の造血系の初期の 祖細胞及び幹細胞の同定に有用である。造血系の診断及び分類に有用な抗原のい くつかについて以下に示す。 造血祖細胞群及び幹細胞群がＣＤ３４抗原を発現することから、抗ＣＤ３４抗 原抗体が造血細胞の副次群を、研究及び治療目的で選択するのに用いられた。Ｃ Ｄ３４抗原の欠損した（ＣＤ−）骨髄細胞を含有する移植体は定着できない一方 、少量のＣＤ３４＋細胞の移植は定着することがわかった。骨髄及びリンパ性系 統に、抗原特異性抗体と分化に向かった細胞上に発現した他の抗原を用いて、３ ４＋のみならず系統ネガテイブ（lin―）である細胞の群をした。骨髄中の３４ ＋／lin―細胞群は単核細胞群全体の0.5％より少ない量を占め、末梢血中では更 に少ない。染料ローダミン１２３（Rho dull）に染まらずＨＬＡ―ＤＲ（ＤＲ― ）、ＣＤ３８（３８―）及びＣＤ４５（４５―）を発現していない細胞を単離す ることによって、３４＋細胞のさらに小さい部分を選択すると、最も原始的な幹 細胞が得られる。これらの細胞は約0.01％〜0.1％の骨髄単核細胞を意味し、お そらく末梢血中の割合さらに低いと思われる。形態学的には小さい低顆粒リンパ 球として現れる。これらの属性をもった細胞は、一般的には、細胞周期のGo期に あり、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスモデル及びその他の動物系でのイン ビトロ培養で認識できる骨髄及びリンパ性系統の細胞に分化する能力を発揮する 。 いくつかの技術が臨床および研究実験室において細胞の種を同定し、造血系の 細胞の部分集団を選択するのに用いられている。一つの技術は蛍光活性化細胞分 類（FACS）である。この技術では、多色フローサイトメーターが、蛍光をつけた 抗体が発生段階または系統段階の造血系の細胞を同定できる特定の抗原に結合し た細胞を検出し、分離するのに用いられる（図１参照）。簡潔には、検出可能な 蛍光信号を、細胞がフローシースを通過する際に細胞にレーザービームを当てる ことによって発生させる。非蛍光前進散乱信号は体積を示すのに用いられ、側面 散乱信号は細胞質組織及び粒度を検知する。抗体と結合させるのに用いた蛍光色 素のカラー信号は細胞特異性抗原を検知する。FACS分析は一般には二つまたは三 つの色彩を同時に分析することができ、このデータから、コンピュータプログラ ムが輪郭プロット、ドットプロット、ヒストグラムを発生し、統計分析等を行う 。いくつかのフローサイトメーターは、９５％より高い純度をもって分析された 試料から物理的に、細胞の副次群を単離しゲートで制御する能力がある。大抵の フローサイトメーターは0.5μｍと小さい粒子を分析でき、１細胞当たり約２０ ００ 分子の濃度の細胞膜レセプターを検知できる。かかる手段により、３４＋である 細胞群及び３４＋／ＤＲ―／３３―／１９―／３―／３８―のような副次群を検 知し分析することができ、これにより長期間の定着及び短期間の造血回復の両者 を確保するために最も有効な細胞に富んだ幹／祖細胞移植体の同定が可能となる 。 そのほかの技術も、免疫分離の物理的分離技術を用いて細胞の３４＋及び３４ ＋副次群を単離するのに用いられる。特定のレセプター分子に対する抗体を免疫 親和性カラムまたは培養容器に固定して特定の標的レセプターを有する細胞を結 合させるのに用いらる。その際理論的には標的レセプターを持たない細胞は結合 されないままである。細胞は抗体複合体から、物理的流体せん断力を用いること により物理的に分離される。親和性カラムでは細胞をカラムから分離容器中へ洗 い落とし、一方培養装置の場合には、非結合細胞はまず装置から洗い落とした後 結合した細胞を流体せん断力により分離装置中へ物理的に洗い落とす。かかる手 段により、３４＋／lin―のような幹細胞移植に特に望ましい特定の細胞群を選 択し濃度を高めることができる。しかし、細胞のアフィニティ抗体への非特異性 結合は望ましくない細胞型の細胞群による汚染を引き起こし、細胞選択の効率を 減少してしまう。 幹細胞移植は、造血性悪性腫瘍、非造血性起源の悪性固体腫瘍、免疫疾患及び 正常血液細胞の生産／成熟の機能不全／機能異常から生じる疾病からなる群の多 数の疾患や疾病を治療するのに使用される。これらの中には、重症複合免疫不全 （ＳＣＩＤ）、ウイスコット―アルドリッヒ症候群、ファンコニル貧血症、先天 性赤血球無形成症、リンゾーム性蓄積症、軟骨毛髪形成不全、重症サラセミア、 再生不良性貧血、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ） 、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び他の血液学的黒色腫、多発性骨髄腫、ヘア リーセル白血病、悪性組織球症、骨髄形成異常症、胸部癌腫のような固体腫瘍、 及び神経芽種を含む先天性疾患がある。 造血細胞の３つの源が、治療用の幹細胞移植のために使用される。骨髄、末梢 血及び臍帯血である。最も普通に使用される移植体は、高投与量化学治療及び／ 又は除去用放射線治療を受ける癌患者又は血液形成に欠陥のある患者における造 血の回復のための骨髄移植である。末梢血移植は、骨髄移植に代わるものとして 、 コストが少なく、侵襲の少ない技術として、現在進歩しつつある。 臍帯血も、また、致死的な造血不全を有する幼児の造血系の再構築のために、 最近使用されて成功をおさめている。臍帯血は、新生児の、普通は捨てられてし まうへその緒及び胎盤血から得られる。臍帯血は、単核細胞の単位数当たり成人 骨髄が含む数と約同数の祖細胞数を含む（米国特許第５００４６８１号）。 幹／祖細胞移植の３つのタイプとして、同系（１卵性双子）移植、同種移植、 及び受容者自身の細胞を使用する自家移植が使用されいる。同系移植は、拒否反 応が示されず、また対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を引き起こさない。通常ヒト 白血球抗原（ＨＬＡ）が同一であるドナーからとられる同種移植は、適正なドナ ーを有する患者の約３０〜４０％に使用される移植の最も普通のものである。表 現型が整合した同一な親のまたは関連したドナーであって、ＨＬＡ―Ａ、―Ｂ又 は―Ｄ座だけが不整合なものからの移植を受けた患者は、ＨＬＡが同一の兄弟姉 妹からの移植を受けた患者に匹敵する移植結果を有する。移植は、２以上のＨＬ Ａ座に不整合な受容者に対して成功するのは少ない。少数の患者は、血縁のない ＨＬＡ―同一ドナーからの移植を受ける。北米では、ＨＬＡが整合した兄弟姉妹 を見つけることができる患者は３０％より少なく、１つの座が不整合な親戚がい るのは３〜５％の患者だけである。そのため、同種移植を使用する多くの患者は 、ＨＬＡ―非血縁の志願者を見つけなければならない。非血縁ドナー移植の最近 の研究は、ＨＬＡ座に対するＤＮＡコーデングにおける単一塩基対不整合でさえ も臨床医学的合併症を招くことを示している。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）検 定方法は、真の適切なＨＬＡ―整合を決定することができる手段として現在調査 されている。自家骨髄移植は、ＨＬＡが同一な兄弟姉妹を有しないか又は適切な ＨＬＡ―整合ドナーを見つけることができない患者を治療するのに時々使用され る。 従来の骨髄移植（ＢＭＴ）は、白血病や再生不良性貧血を含む骨髄の疾患の治 療として、最初は発展した。一時、骨髄は、多能性幹細胞が存在する唯一の組織 であると考えられ、そのために骨髄移植は、放射線治療及び／又は高投与量化学 治療により骨髄が致死的に除去される場合に、これら細胞を置き換えるために必 要と考えられていた。現在は、これら幹細胞は末梢血中にも存在することが知ら れている。 骨髄は、全身麻酔が必要とされる侵襲的な外科的手法により集められる。約１ から２リットルの骨髄は、大きな骨、大抵は骨盤の腸骨稜から離れた位置に挿入 された大きい穴を有する注射針を使用して取り出される。通常１００回以上独立 に吸引することが必要である。純粋化した後、骨髄は冷凍され、将来のＢＭＴ再 注入のために貯蔵される。 悪性腫瘍の治療のための骨髄移植の場合、抽出操作腫瘍細胞を全部除去するた め、患者は除去の化学治療及び／又は除去の放射線治療を受ける。細胞は、しば しば腫瘍細胞を特異的に殺すように選ばれた細胞毒性薬剤で処理される。この操 作において、患者の骨髄細胞は根本的に殺され、患者を造血不全の状態にする。 患者自身の骨髄は、次に解凍され、再注入される。同種移植の場合、ドナー自身 の骨髄が使用され、注入される。骨髄は、次に通常３〜４週間内に定着し、造血 を確立する。この期間中に、血小板減少により生じる出血疾患の再現を防止する ため血小板輸血が繰り返し必要なので、集中的かつ高価な病院看護が患者に必要 となる。加えて、この期間中に、患者は、好中球減少症による重大なかつ時々致 命的な感染症を受けやすい。 重大な合併症が、副作用に加えて、移植治療からしばしば生じ、罹病率や死亡 率につながる。骨髄移植の場合、全骨髄の約２００ｍｌが患者の循環系に注入さ れる。この大容量が、血色素尿、赤色尿、吐き気、高血圧、発熱、寒気、嘔吐及 び頻脈を含む副作用を患者に引き起こす。骨髄移植の初期の合併症は、化学治療 や放射線の毒性、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、免疫減少症、感染及び間質性肺炎を含 む。間質性肺炎も、また、移植後の免疫減少から生ずる日和見感染によると同様 に、薬剤及び放射線の毒性により生ずる。細菌や真菌による日和見感染もまた合 併症である。自家移植における大きな懸念は、低温保存された骨髄と一緒に悪性 腫瘍細胞の再導入される可能性である。密度遠心分離、モノクーロン抗体及び薬 理学的技術を含む異なる方法を使用して、注入の前に骨髄から腫瘍細胞を取り除 くことが試みられている。 ＧＶＨＤからの罹病率及び死亡率は大きな問題である。同種移植において、ド ナーのＴ細胞が受容者の細胞を外敵として認識し、それらを攻撃したときに、Ｇ ＶＨＤが起きる。薬剤（メトトレキサート、シクロスポリンＡ）を使用する移植 後の免疫抑制処置が施され、ＧＶＨＤを抑制し又は最小限にする。移植前にＴ細 胞をエクスビボで除くことは、ＧＶＨＤを防止するためときどき使用される。こ のアプローチはＧＶＨＤの危険を減少させるが、移植片の機能不全や白血病の再 発増加と関連する。 全骨髄を注入する代わりに抽出した骨髄から幹／祖細胞を分離する治療的アプ ローチが最近開発された。この場合、幹／祖細胞の非常に少ない群数だけが約１ ０ｍｌの容量中に注入される。この技術を使用して、再注入される細胞の量を１ ００倍ほど減少させ、全骨髄移植と関連する罹病率を大きく減少させることがで きる。 末梢血移植においても、移植物中の幹／祖細胞を多くするため幹細胞分離が使 用されている。末梢血幹細胞移植は、骨髄吸引よりも患者に対する侵襲度が少な い。細胞は、白血球搬出により患者から集められるが、その間患者は使用される 遠心分離器に接続され白血球細胞を分離し、赤血球細胞及び血小板は連続的に患 者に戻される。末梢血もまた、抽出前にＧ―ＣＳＦやＧＭ―ＣＳＦのようなサイ トカインを使用しての患者の血中の祖細胞を活発にすることにより、幹／祖細胞 を増加させることがある。これら手段により、骨髄中に見られるレベルとほぼ等 しい末梢血中の祖幹細胞レベルを供給することは可能である。祖幹細胞の分離／ 増強を用いて調製された末梢血幹細胞の利点の１つは、同種移植における抑制Ｔ 細胞を選別して除きＧＶＨＤを減少させることができることである。加えて、全 部又はほとんどの腫瘍細胞は幹／祖細胞の群の一部ではないと信じられているの で、祖細胞の積極的選択により腫瘍細胞の除去が改善されるという利点も存在す る。 医療環境において、祖／幹細胞のレベルは、通常、系統の祖細胞用のコロニー 形成検定を使用して検定される。最も普通の検定は、コロニー形成ユニット顆粒 性白血球マクロファージ（ＣＦＵ―ＧＭ）及びバースト形成ユニット赤血球（Ｂ ＦＵ―Ｅ）である。ＣＦＵ―ＧＭ及びＢＦＵ―Ｅ検定を使用して、定着が成功す る移植体を得るのに必要な祖幹細胞の数を求める。文献の再検討は、成功する移 植はＣＦＵ―ＧＭと相関することを示している（米国特許第５００４６８１号） 。移植当たりの、ＣＦＵ―ＧＭの範囲は、２〜４２５×１０⁴／Ｋｇ体重である 。許 容できる最小限度レベルは、移植物当たり、１０×１０⁴ＣＦＵ―ＧＭ／Ｋｇ体 重より大きい。 精力的な研究が造血幹及び祖細胞、ＣＤ３４＋細胞の増殖について行われ、種 々の程度の成功をおさめている。これらの研究のほとんどにおける基礎的アプロ ーチは、（ａ）正及び／又は負の吸収を用いた８０％を越える純度でＣＤ３４＋ 細胞を富化させる、（ｂ）基礎培地、例えば、子牛血清を含むＲＰＭＩ―１６４ ０又はＩｓｃｏｖｅの修正ＤＭＥＭ中でかつ供給細胞として間質層上での細胞培 養、及び（ｃ）ＩＬ―１、ＩＬ―３、ＩＬ―６コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、 赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むサイトカイン 混合物の供給が包まれている。 これら研究を基礎にして、多数の観察がなされた。最初に、ＣＤ３４＋及び祖 細胞の増殖がある。１２−１４日で１００倍までの細胞増殖がおこることが報告 されている。細胞増殖における変動はドナーに依存する。第二に、培養中に骨髄 の系統に向かう細胞分化が示され、長期において主に単球及びマクロファージ群 になる。最後に、総細胞群数中にＣＤ３４＋細胞の割合は、培養の約１４〜２１ 日間中に、急に１パーセント未満にまで降下した。これらの結果は、現行の培養 条件下では、骨髄の系統に向かって分化するＣＤ３４＋細胞が増殖する能力はい まのところ限られていることを示している。発明の概要 本願発明は、現行の戦略や設計に関連した問題および欠点を克服し、所望の、 または標的とする細胞群を、迅速に生産する新しい方法を提供するものである。 本願発明の方法を使用すれば、細胞または組織の非常に少ない試料から、標的 細胞の多くの群を、簡単に、安く、そして迅速に生産することができる。標的細 胞は培地中で維持し、あるいは後に使用するために保存し、また、必要に応じて 、さらに分化させるため刺激することができる。ここで説明する手順は短く、簡 単で、多くの異なる細胞のタイプに応用できる。標的細胞群は、移植治療に有用 であり、また、現行の手順に対して多くの利点を有する。ドナー細胞を多数回プ ールする必要はなく、また、接種物中の幹／祖細胞群を富化するため現在必要と さ れている多くの分離手順も必要ではない。さらに、ほとんどの特別な組織のため の、多くの幹細胞、祖細胞および前駆細胞が生産できる。これらの細胞は移植治 療に最も有用である。 ここで概略を説明すると、本願発明は、所望の細胞群の増えた分画を含む増殖 した細胞培養物を生産する方法に関し、さらにはその方法によって生産された増 殖した標的細胞群に関する。細胞培養物は、標的細胞分画中で、平衡化選択因子 混合物（ＢＳＦＭ）の存在下で培養することにより増やせる。ＢＳＦＭは、標的 細胞群の増殖を促す、バランスのとれた刺激および抑制作用をもたらすものであ る。標的とする群は、原始的な幹細胞、祖細胞、前駆細胞、分化の中間段階の細 胞、最終的に分化した細胞、またはこれらの混合物を含む。これら標的細胞は、 結果的に移植治療に有用である。 また、本願発明は、所望の細胞群の増殖を促す、バランスのとれた刺激および 抑制作用を有する細胞因子の混合物を含むＢＳＦＭ組成物に関する。この組成物 は、好ましくはマイトジェンを含む誘導剤で細胞群を処理することによって生産 される。有用なマイトジェンには、フィトヘマグルチン（ＰＨＡ）またはコンカ ナバリンＡ（ＣｏｎＡ）等の植物レクチン、ＴＰＡまたはメゼレイン等のＴ細胞 マイトジェン、およびＯＫＴ３等のＴ細胞モノクローナル抗体が含まれる。一方 、ＢＳＦＭは、多くの異なる出発細胞群から生産でき、これらはＢＳＦＭ−１， ＢＳＦＭ−２等となり、それぞれ異なる標的細胞群に対し特異性を有する。 他の態様として、本願発明は移植治療方法に関する。そこでは、原始的な哺乳 類の細胞（たとえば、血液、他の体液や組織から）をＢＳＦＭとともにインビト ロで、前述の方法により培養する。得られた増殖した標的細胞群は、後に使用す るため、そのまま保存、または冷凍保存するか、または移植治療、あるいは、他 の治療や予防に使用するため患者にただちに移入される。標的細胞は、移植され る器官系や新しい器官を、治療もしくは創造するために使用することができ、ま た、現存する、病気にかかった、または損傷した器官、組織および細胞系を補填 するために使用することができる。一方、標的細胞は、赤血球からのヘモグロビ ンのような有用な細胞生産物を生産するために使用することができる。 さらに、他の態様においては、本願発明は遺伝子治療方法を提供する。標的細 胞を本願発明の方法により生産し、遺伝子配列を直接移入するか、または、遺伝 子配列を含む組換え型ウイルスのベクターを感染させる。調整し、適当に配列を 発現した細胞を選択し、分離し、そしてインビトロで培養する。その後、これら 組換え細胞を患者に移入する。遺伝子治療に有用な遺伝子には、患者の中で発現 生成物が欠けているか、または欠陥がある遺伝子、および発現が患者に対し、有 利な効果を有する遺伝子および他の遺伝子配列が含まれる。 さらに本願発明の態様の一つは、移植治療方法または予防方法を提供するもの である。そこでは、患者をインビボでＢＳＦＭで処理し、体の特別な標的群を選 択的に増殖させる。病気にかかったか、かかる可能性のある、または損傷を受け たか、受ける可能性のある器官または細胞系を創造あるいは修復するのに、ＢＳ ＦＭ治療をインビボで採用することができる。この治療の形態は相対的に非侵襲 性であるが、そのような広い範囲の細胞には現在利用できていない。図面の簡単な説明 図１ 造血系連鎖および発達上の特異な抗原を表す図 図２ 標的細胞の多様な群をＢＳＦＭで生産するために使用する方法を表した図 図３ ＢＳＦＭ処理ＰＢＭＮＣ培養物のコロニー形成ユニットを示す代表的な顕 微鏡写真 図４ ＢＳＦＭ処理ＰＢＭＮＣ培養物のバースト形成ユニットを示す代表的な顕 微鏡写真 図５ ＢＳＦＭ処理１日後の未分画細胞の代表的な顕微鏡写真（１０ｘ） 図６ ＢＳＦＭ処理３日後の未分画細胞の代表的な顕微鏡写真（１０ｘ） 図７ ＢＳＦＭ処理１日後の分画細胞の代表的な顕微鏡写真である（１０ｘ） 図８ ＢＳＦＭ処理３日後の分画細胞の代表的な顕微鏡写真である（１０ｘ） 図９ インキュベーション６日後の未分画ＰＢＭＮＣ培養物からの、ＣＤ３４＋ ＣＤ３８ＤＲの代表的なＦＡＣＳ分析 図10 インキュベーション５日後の未分画ＰＢＭＮＣ培養物からの、ＣＤ３＋Ｃ Ｄ３３ＣＤ３４の代表的なＦＡＣＳ分析発明の記述 幹細胞移植の現行の技術は、患者の消耗した若しくは欠けた細胞系を十分に再 構成するための幹／祖細胞の充分な量を提供するために侵襲的で高価な方法を必 要としている。本発明の方法を用いることで、非常に短期間且つ低コストで、多 数の細胞を作成することができる。これは消耗した若しくは欠けた細胞系の完全 な再構成を可能にするのみならずもし１回で足りなければ複数回の若しくは周期 的な処置を可能にするのに充分な細胞を有するという融通性を可能にする。又、 現行の技術は通常生物体液の非常に大きなプールからの細胞の精製を必要とする 。本発明の方法を用いて、生物体液の非常に小さな試料から多数の細胞を製造す ることが出来る。これは標的の細胞を富化する為の能率の悪い分離技術を用いる ことの費用と時間を節約し、プールを創造するために用いられた多くの試料の一 つに汚染が存在し相対的にそこからは幹細胞が殆ど集まらないという危険を解消 し、そしてより重要なことに、所期の生産を最も高いレベルで得るために当業者 が変更できる堅実な源を供給するものである。 １．標的細胞選択 本発明の方法は非常に多様な細胞型群の選択的増殖に対し幅広く適用できる。 従って、本方法における第一段階は求められる標的細胞若しくは標的細胞の混合 物の選択から成る。ここで述べられる方法の実施において、一つ以上の細胞型は 増殖された細胞群において標的細胞の分画を豊富にするように優先的に増殖され ることができる。斯様に、通常の細胞試料における非常に低いレベルで存在する １つの細胞型は、該増殖された群におけるその分画を増加するように、選択的に 増殖させられることができる。この選択的増殖と富化の間に、群中の非標的細胞 は死に絶えるに任せることができ、増殖されない侭でいるか或いは増殖された培 養物中の数及び／又は割合において下落する。本発明の方法の重要な臨床の優位 点の一つは、選択された標的細胞の割合の高い細胞群が単純にそして分離若しく は精製工程の必要無しの若しくは分離したそして高価なサイトカインの添加無し の多くのケースにおいて製造され得る、ということである。幾つかの場合では、 生理的サンプルに比べて標的細胞の割合が多くなるか、標的細胞の比が特定の有 用性を持つように変えられた所期の増殖細胞群が多くの細胞の型を含むこともあ る。例えば造血再構成が目的であり、長期間の定着を提供するために実質的に幹 細胞及び祖細胞が豊富である細胞群はまた、短期間のプラスの効果を与えるため に前駆細胞の特別に調整された分画や、最終的に分化した細胞を含んでいてもよ い。 本発明の方法を用いて出発細胞群に存在しない細胞型の実質的な分画を含む細 胞群を製造することもまた可能である。これはそれらの既知の分化の道筋に沿っ て細胞の分化若しくは脱分化を有利に運ぶ条件を提供することによって起こるこ とができる。 標的細胞はどんな哺乳類細胞からも選択することができそして好ましくは初代 培養の哺乳類細胞、さらに好ましくは初代培養のヒト細胞から選択することがで きる。標的細胞群若しくはそれが選択される哺乳類細胞群は、全細胞系統、器官 、若しくはその系の幹、祖及び前駆細胞を含む器官系から成る。それからそのよ うな細胞群が選択され得る組織及び器官の例は、造血細胞、肝細胞、膵臓細胞、 腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、心臓細胞、リンパ腺細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、 骨髄細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、内皮細胞、上皮細胞等である。好まし い標的細胞は造血細胞である。増殖された細胞群の使用の目的が組織修復若しく は再生である場合には、そのような組織において通常見いだされる細胞の混合物 が標的細胞混合物であることができ、或いは別々に調製してインビボ若しくはイ ンビトロでそのような目的を達成するように合わせてもよい。好ましいアプロー チにおいて、標的細胞群は、増殖細胞群の調製の間若しくはその使用の間に幹／ 祖細胞系統の経路にそって分化する細胞を供給できる幹細胞及び／又は祖細胞を 含む。 造血系において、要求された標的細胞は、祖細胞、前駆細胞、分化の中間段階 の細胞そして最終的に分化した細胞若しくはそれらの混合物の他に最も原始的な 型の分化多能幹細胞を含むことが出来る。これらの細胞は、ＣＦＵ−Ｇ（顆粒細 胞）、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒細胞／マクロファージ）、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（顆粒細 胞／赤血球／マクロファージ／単球）、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球）、ＣＦＵ−ＭＫ（ 単核細胞）、ＣＦＵ−Ｍ（マクロファージ）、ＣＦＵ−Ｅｏ（好酸球）、ＣＦＵ −Ｂａ（好塩基性白血球）、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球）、そしてＢＦＵ−ＭＫ（巨 大核細胞）のような骨髄祖細胞、そしてＣＦＵ−Ｌ（リンパ球）、ＣＦＵ−Ｂ（ Ｂ細胞）そしてＣＦＵ−Ｔ（Ｔ細胞）のようなリンパ性祖細胞を含む。また有用 なのはＴリンパ球、Ｂリンパ球及びそれらに分化する前駆体からなる標的細胞群 である。巨大核細胞（血小板）、赤血球、顆粒細胞、マクロファージ、単球、好 塩基性白血球、好酸球及びそれらに分化する前駆細胞もまた、単独で若しくは他 の標的細胞との混合物として、望ましい標的である。 造血系再生における使用の観点から特に興味あるのはＣＤ３４抗原として表さ れる細胞である。ＣＤ３４＋細胞は初原的なＣＤ３４＋リンパ細胞やＣＤ３４＋ ＣＤ３８−ＣＤ４５−ＤＲ−ＲＨＯ１２３（Ｄｌｌ）と特定されるより初原的な 細胞を含むことができる。また、免疫不全及び疾患を治療する場合に興味あるこ とはＣＤ３、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）及びＣＤ８（サプレッサーＴ細胞）のよ うなＴ細胞抗原を発現している細胞である。赤血球はまた移植療法における細胞 群として使用するためにもヘモグロビンの製造に使用するためにも望ましい標的 細胞である。 当業者はどの標的細胞及び標的細胞混合物がここに記した応用のためにそして 特に調製した細胞群を用いる他の応用のために有用であるかを認識するだろう。 本発明の方法によって作られる細胞及び細胞群は形態学的に、抗体的にそして 機能的に解析される。まず、選択的に増殖された細胞群は大きさ、顆粒の存在若 しくは非存在のような特徴、そして全体的な様子が顕微鏡的に調べられる。幹細 胞及び他の相対的に未分化の細胞は、小さくはっきりした膜を持っているが、よ り分化した細胞は一般にもっと大きい。第二に、幹細胞は抗原−特定のモノクロ ーナル抗体を用いたＥＬＩＳＡやＲＩＡといったアッセイで検出可能である特徴 的な抗原を発現しておりＦＡＣＳ技術により分けることができる。これらの抗原 −結合アッセイからの結果は細胞系統の発生地図を提供する。最後に、細胞はま たそれらのコロニーを作る及び／又はインビトロで他の生物学的機能を演ずる能 力によって機能的に分析される。 ２．第一細胞群の選択 本発明の好ましい態様においては、所期の標的細胞の増殖と富化とを優先的に 便宜を計る特定の刺激及び阻害効果のバランスのとれた細胞因子の混合物から成 るＢＳＦＭを製造するように、第一細胞群が選択され誘導される。これらの第一 細胞群はヒト若しくは非ヒトの血液、骨髄、体組織、好ましくは哺乳類の組織、 若しくは確立された細胞系統の初代培養細胞から成る。この第一細胞群は、要求 される標的細胞と同じ細胞型であることができ、標的細胞の型の細胞を含むこと ができ、標的細胞の型の細胞若しくは標的細胞の型とは完全に異なった型である 細胞へ分化する細胞を含むことができる。本発明の１つの態様においては、この 第一細胞群は以下に記載するように最終的に増殖させる細胞群であることができ る。 しかしながら、最終的に増殖させるのと同じ型の分離細胞群を用いることが一 般的に好ましい。このように、造血細胞群のためには、血液に基礎を置く細胞試 料が都合よく用いられることができる。しばしば第一細胞群が以下に述べるよう に増殖すべき細胞群の部分若しくは副群からなることが好ましい。しかしながら 、非造血由来の組織細胞を、造血細胞の第一群を組織内で標的細胞を選択的に増 殖できるＢＳＦＭを製造するように誘導することによって増殖させることができ る、ということが予想される。 造血系に関しては、特定の標的−特定のＢＳＦＭを好適に製造するのに有用な 第一細胞群は末梢血液細胞、臍帯血細胞及び骨髄細胞から選択される。多くの臨 床的な優位点のために、末梢血液細胞群の選択が好ましい。第一に、末梢血液は 相対的に非侵襲的な手段（針でさす）で得るのが容易である。病院での滞在は要 求されず、感染の危険は非常に小さく、そしてその手順はたいていの保険看護作 業者によって行なわれ得る。第二に、末梢血液試料は個々人の健康には殆ど配慮 しなくてよい。なぜなら患者の血液の損失は全身的な影響はほんんど無いかない しは皆無だからである。第三に、末梢血液は多くの医療アッセイの原料として既 に使われている。標準的な処置と供給がどの医療施設においても現在間に合わせ ることができる。 出発時の第一細胞群として有用な末梢血液群には末梢全血（例えば、採取した ままの試料(as-removed blood sample)）及び末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣ） を含めることができる。ＰＢＭＮＣの源は既知の収集及び分離技術の生成物を含 められる。例えば、粗遠心分離からの白血球層はＦＩＣＯＬＬのような特定の重 力に基づいた系からのより細かい分離物と同じく用いられる。第一細胞群として 高度に精製されたＰＢＭＮＣ類或いは親和性に基づいた分離技術を用いることに より特定の細胞の型（例えば、Ｔ−リンパ球）を有するその特定の下部群を用い ることは可能である。以下に述べるように、有用なアクセサリー細胞を含んおり 高度に処理された細胞よりもダメージが少ないので最小の分離手順を受けたＰＢ ＭＮＣ類を用いることはしばしば有用である。細胞の第一群は収集及び分離の後 すぐに用いることができる。若しくは後の使用のために冷蔵若しくは冷凍保管す ることができる。 ３．第一細胞群の誘導 本発明の重要な面は、ＢＳＦＭの存在下で細胞群において標的細胞を増殖し富 化することが選択的にできることである。このＢＳＦＭの製造は好ましくは、上 述の第一細胞群をこの標的特異的因子の混合物を作成するべく誘導することによ って達成される。斯様に、誘導工程は要求されるＢＳＴＭを製造するように制御 されなければならない。誘導工程は、以下に述べる第二細胞群が第一細胞群と同 じであるときに標的細胞増殖工程の一部分として或いは一つの独立の工程中で第 一細胞群において行なわれることが出来る。好適な態様においては第一細胞群を 加えられた誘導試薬によって誘導し、又、培養の間に該細胞によって製造された 因子により、例えばカスケード的に、更に誘導されてよい。 好適な態様において、標的細胞特異的ＢＳＦＭの性質は物理学的、化学的そし て生物学的パラメーターの組み合わせによって影響を及ぼされる。とりわけ重要 な一つのそのようなパラメーターは、以下に述べるように、加えられた誘導試薬 の性質である。標的細胞を変化させるために可変である他のパラメーターは、上 述したように、第一細胞群の性質である。出願人は例えば、造血細胞では、白血 球搬出法処理から得られたもののような、相対的に処理されていない、粗に分離 されたＰＢＭＮＣがＣＤ３４＋細胞のような幹／祖細胞を標的とするＢＳＦＭを 製造するということを発見した。ＢＳＦＭ誘導工程に影響を及ぼすことができる 他の因子は、例えば、培地、温度、時間、ｐＨなどの培養条件を含んでいる。 ひとつの好適な態様において誘導工程は、誘導剤を添加した白血球の成長を支 持する培地中で、選択された第一細胞群を培養することで行なわれる。培地は血 清が存在しないほうがよく、間質細胞を要求しない。好ましい培地の型はニュー ハンプシャー、レバノンのヴェラックス社(Verax Corporation)によって製造さ れるＤＭＥＭ改良ＩＳＣＯＶＥＳ、ＲＰＭＩ１６４０、及びＣＣＭ−２を含む。 一般に好ましい態様によって有用である加えられた誘導試薬は第一細胞群の細 胞型にマイトジェン効果を有する材料から成る。マイトジェンは種々の細胞型の ものに対して知られ、種々の因子においてそのようなマイトジェンの効果は造血 細胞について観察されている。Ｔ細胞マイトジェンはしばしばこの工程に用いら れる。 マイトジェンのクラスの中で造血細胞からＢＳＦＭの誘導を誘導若しくは促進 するのに有用なものは、植物レクチン、Ｔ細胞マイトジェン、及びモノクローナ ル抗体である。要求されるマイトジェン活性を有する特定の植物レクチンは以下 のものから誘導されるものを含む： レクチン源 Phaseolus vulgaris（ＰＨＡＮ フィトヘマグルチニン） Dolichos biflorus Solanum tuberosum Sophora japonica Haclura pomifera Pisum sativum Ulex europeus（ＵＥＡ−Ｉ、U.europeusアグルチニンＩ） Ulex europeus（ＵＥＡ−ＩＩ、U.europeusアグルチニンＩＩ） Arachis hypogaea Glycine max Canavalia ensiformis（Ｃｏｎ Ａ、コンカナバリンＡ） Triticum culgaris（ＷＧＡ、小麦麦芽アグルチニン） ricinus communis（ＲＣＡ−Ｉ、R.communisアグルチニンＩ） Lycopersicon esculentum Phytolacca americana（ＰＷＭ、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン） Listeria monocytogenes（ＬＰＳ、リボポリサッカライド） 植物由来マイトジェンの特に有用な群にはＰＨＡ、ＣｏｎＡ、メゼレイン（Ｍ ＺＮ）及びＴＰＡ（及び関連したジテルペンエステル）が含まれる。ＴＰＡとそ の関連化合物の幾つかを以下に示す： Phorbol 12-myristate-13-acetate（TPA） Phorbol（4-0-methyl）12-myristate-13-acetate Phorbol（20-oxo-20-deoxy）12-myristate-13-acetate Phorbol 12-monomyristate Phorbol 12,13-didecanoate Phorbol 12,13-dibutyrate Phorbol 12,13-dibenzoate Phorbol 12,13-diacetate Staphylococcal enterotoxin A(SEA)、Streptococcal protein A、ガラクトー スオキシダーゼ及びＯＫＴ３のようなＴ細胞抗体など非植物起源のマイトジェン も又有用である。幹細胞増殖因子（ＳＣＰＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、いずれ かの成長因子そして骨形態形成プロテイン（ＢＭＰｓ）の他にインターフェロン −アルファ（ＩＦＮα）及びＩＦＮβも又幾つかの状況において誘導試薬として 用いることが出来る。 好適な誘導工程において、上述されたように選択された第一細胞群は実際の誘 導工程に先だって増強（,i.e．薬効増加）試薬の存在下で培養される。誘導を増 強するのに有用な試薬はＴＰＡ（若しくは関連したホルボールエステル）ＭＺＮ 、ＩＦＮα及びＩＦＮβを含む。この工程にはそれから培養物への上述した誘導 物質の添加が続く。最も好適な組み合わせはＩＦＮαとＩＦＮβの使用、そして 増強剤としてＭＺＮ、そして誘導物質としてＰＨＡ、ＣｏｎＡ若しくはＯＫＴ３ を含む。 ＢＳＦＭは処理された細胞から上清として好適に分離されるので、上に掲げた 試薬若しくはそれらの既知の等価物からの誘導物質及び／又は増強剤の選択はそ れらの細胞障害性若しくは腫瘍形成性特性に関すること無しに為される。この工 程は、ＢＳＦＭがいかなる有害な残渣のマイトジェンもしくはその副生成物で汚 染されはしないということを確実にする方法で行なわれることが出来る。ＩＮＦ やＴ細胞抗体のような誘導若しくは増強試薬が用いられる場合、細胞若しくは細 胞生成物／残骸からのＢＳＦＭの分離は必要でなくてもよい。 用いられる誘導試薬の量及び処理の長さは処理された各々の特定の細胞培養物 によって経験的に決定されてよい。用いられる誘導試薬の好適な量は約５μｇ／ ｍｌ培地乃至約１００μｇ／ｍｌ培地である。更に好ましくは、記述した増結細 胞誘導工程のためには、全血若しくは分画血の第一細胞群を処理するとき誘導試 薬は約５μｇ／ｍｌ乃至５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０μｇ／ｍｌ乃至 ５０μｇ／ｍｌの量で加えることが出来る。薬効増強剤／増強剤を用いた場合に おいては、培地に約５ｎｇ／ｍｌ乃至５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍ ｌ乃至５０ｎｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ乃至２０ｎｇ／ｍ ｌのレベルで培地に加えることが出来る。処理時間は時間乃至日、好ましくは約 １日乃至１０日、最も好ましくは２日乃至５日であることができる。或いは処理 は、より長い時間に亙って複数の処理を若しくはより強度の処理をより短い時間 で伴うことができる。 当業者は、標的細胞効果に伴う初期条件の変更を相関させるべく、ここに含ま れた教示及び単純な実験に基づいて要求された誘導条件、試薬及び出発細胞群を 選択することができる。本発明は、陽性及び陰性の効果の両方のバランスがとれ た誘導因子混合物（ＢＳＦＭ）を用いると、求められるあらゆる数の標的細胞群 の制御された選択的増殖を許容するという発見に少なくとも幾分か基づいている 。。 誘導工程は好ましいインビトロ方式で記述してきたが、ある状況においてはこ の工程をインビボで行なうことが可能である。斯様に、細胞群（循環しているか 静的な）は他の点では患者に対して有毒ではない誘導試薬で処理できるという場 合において、ＢＳＦＭはインビボで発生させることができ、さらにエクスビボで 使用するために患者から集められるか又は選択された標的細胞群をインビボ、例 えば組織修復若しくは再生のサイトで増殖させるため患者内に留めるかされる。 インビボで利用される誘導試薬は患者内に注射又は注入されてよく、経口で与え られるか或いは、例えば経皮的パッチで治療されるべき細胞上に直接置かれても よい。そして単独の治療や多重治療にかかわることができる。 ４．均衡化選択的因子混合物 本発明は、それぞれ決まった第２の細胞群に特有の方法で作用して望みの標的 細胞の増殖と富化を起こさせるＢＳＦＭの一群を提供する。ＢＳＦＭはすべて、 選んだ標的細胞の増殖に選択的に有利に働く、刺激効果と阻害効果のバランスが とれた細胞因子の混合物であるという特徴を有する。従来の方法は一般に、狭い 範囲の細胞系とそれに対応する特定の増殖（刺激）因子を用いてこれらの因子ま たはそれらを組み合わせたものの有効性を調べるのに重点がおかれていた。本発 明の方法論は入り組んだポジティブ因子とネガティブ因子のバランスおよび自然 と同じようなフィードバックループを用いることに基づいている。その結果この 方法は強力であると同時に簡単である。 限定することなく説明すると、ＰＢＭＮＣ中のＣＤ３４＋細胞を選択的に増殖 させるＢＳＦＭは、好ましい態様によれば末梢血の白血球搬出画分をＭＺＮとｃ ｏｎＡで誘導することにより得られる。このＢＳＦＭはこれまで部分的に性質が 明らかにされており、以下の既知の細胞因子を含むことがわかっている。 サイトカイン 生産細胞 ＩＬ−１ マクロファージ ＩＬ−２ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−３ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−４ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−５ Ｔ−リンパ球 ＩＬ−６ Ｔ−リンパ球、マクロファージ 、リンパ性細胞、単球 ＩＬ−８ 単球 ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ） Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、 マクロファージ、単球 ＩＮＦ−γ Ｔ−リンパ球 ＴＮＦ（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β） Ｔ−リンパ球、マクロファージ 、好中球 これらのサイトカインのいくつかについては濃度も決定されている。例えば、 ＩＦＮ−γとＩＬ−２の濃度はそれぞれ約１０，０００−２０，０００ＩＵ／ｍ １及び約２０００−５０００ＩＵ／ｍｌである。そのほかのここにあげたサイト カインの濃度も、ＥＬＩＺＡ検定などの市販のアッセイキット及び／または方法 を用いて容易に決定することができる。その他のサイトカインとしてＥＰＯ、Ｓ ＣＰＦ、ＳＣＦ、すべての成長因子、及びＢＭＰ等があげられる。 本発明の開示があれば、当業者はこのＢＳＦＭに含まれる因子を完全に明らか にし、望みのＣＤ−３４＋細胞を増やすのに最も適した既知の活性因子（刺激と 阻害の両方）の性質と量を決定することができる。従って、このような最適化さ れ、限定されたＢＳＦＭの合成は本発明の範囲内にある。更に、本発明は、標的 細胞の増殖や標的細胞系の維持に有用または重要な新規なサイトカインを単離し 同定する方法を提供するものである。たとえば、イムノアフィニティの手法を用 いて既知のサイトカインをすべて除いたのち、残りの成分について標的細胞の増 殖及び／または分化を助ける能力を生物学的に試験をする。さらには組成のわか ったＢＳＦＭを既知の成分から再構成し、それが誘導ＢＳＦＭと同じ結果をもた らすかどうかを試験することができる。同じ結果が得られない場合には当業者は 何が足りないのかを決めることができる。 単離された「未知の」成分もまた従来技術で分析し精製することができ、蛋白 性成分のアミノ酸配列を決定し、従来の組換え手法によりそれらの成分の遺伝子 を単離し、配列決定することができる。従ってこれらの蛋白質は組換え生産する ことができる。 本発明の別の態様として、ポジティブ因子やネガティブ因子を加えたり取り除 いたりしてあるＢＳＦＭを改変し、別の標的細胞の選択的増殖に適した第２のＢ ＳＦＭを作ることがある。別のあるいは更なる標的細胞を増殖させ富化（割合を 増やす）ことができるＢＳＦＭを得るにはいくつかのアプローチがある。まずＢ ＳＦＭ標品中の一つまたはそれ以上の因子を、好ましくはアフィニティクロマト グラフィで取り除くことである。特定のサイトカインに対する抗体を有するアフ ィニティマトリックスは市販されている。例えば、ＩＬ−２を除去するアフィニ ティカラムを通過させたＢＳＦＭは、もはやリンパ系統細胞型を増殖させ富化さ せることができない。プラスチック表面に吸着させることによりマクロファージ を除くと、残りの細胞群はＢＳＦＭ中にＩＬ−１またはＣＳＦを全くまたはほと んど生産しなくなる。更にＢＳＦＭ中の既知の因子を単離せずに因子に特異的な モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いて選択的に不活性化することが できる。ポジティブ及び／またはネガティブアプローチを用いることにより、Ｂ ＳＦＭの改変型を望みの標的細胞を増殖させるために作成することができる（図 ２参照）。あるいは、サイトカイン誘導のカイネティクスに基づき、誘導後回収 する時間を変えて組成の異なるＢＳＦＭを得ることもできる。例えば、ＩＬ−２ はＩＦＮ−γより先に誘導される。９６時間で回収されたＢＳＦＭ標品は４８時 間で回収されたものよりもＩＦＮ−γの濃度は高い。一方ＩＬ−２濃度はどちら のＢＳＦＭ標品でも同じになる。 ５．標的細胞の増殖 本発明の方法の次の工程は所期の標的細胞を選択するＢＳＦＭの存在下で第２ の細胞群の標的細胞を選択的に増殖させることである。すでに述べたように、第 ２の細胞群は第１の細胞群と同じ細胞型でも違う型であってもよい。多くの場合 、元の細胞群を細胞群構成が同じ２つの群に分け、ＢＳＦＭの生産とその使用に 用いる。場合によっては第１と第２の細胞群が同一である、即ち同一の細胞をま ず誘導にかけ、それから（分離工程を経てあるいは経ずに）増殖させる。 所期の標的細胞が何であるかによりのぞましい第２の細胞群の選択が決まる。 標的細胞はこの細胞群中にある細胞型であるか、それから派生するものでなけれ ばならない。一般に第１の細胞群について上でのべた細胞型と同じ種類の細胞型 が第２の細胞群に使用することができる。 標的細胞の選択的増殖はＢＳＦＭの性質と量を変えることによりまた培養条件 を変えることにより、コントロールすることができる。ＢＳＦＭを選ぶ基準は上 に論じた。培養工程は限定されたサイトカインを添加することができる適当な基 礎培地中で行うのが好ましい。個々の細胞型に対する培養条件は変えることがで きるが、標準的組織培養条件が培養処理の基礎となる。一般的には細胞を５％Ｃ Ｏ₂インキュベーター中３７℃、培地中でインキュベートする。細胞の型によっ ては特定の化学薬品、蛋白、インシュリンや血漿のような培地成分や成長因子、 コ ロニー刺激因子（ＣＳＦ）が細胞の維持に必要となる。これらの必要条件は業界 で知られているか、当業者が決定できるものである。制限することなく説明する と、ＣＤ３４＋細胞群の増殖に有利なＢＳＦＭはＣＣＭ−２のような無血清培地 中で培養できる。 ＢＳＦＭは、所期の標的細胞の増殖／富化を達成するのに十分な量を培地に加 える。添加量はＢＳＦＭの性質、第２の細胞群の構成と培養条件により異なる。 実際には、添加量は約１％から１０％、好ましくは２％から５％である。 培養工程の長さは、標的細胞の選択的増殖を促進するために変えることができ る。細胞群が異なる分化の経路にある、またはその経路に入るように誘導された 細胞を含んでいる場合、最終的な標的細胞の割合の増加は培養をいつ終わらせる かにかかっている。通常、例をあげると、目的の富化の程度にもよるがＣＤ３４ ＋細胞に富んだ細胞群は５から２０日培養するのが最もよく、好ましくは約５か ら１０日である。 いったん所期の増殖標的細胞群が得られれば、細胞をすぐに用いてもよいし、 冷蔵あるいは冷凍して将来の使用に備えることができる。別の態様では、標的細 胞群を第２の標的細胞を多く含むように改変することができる。例えばＣＤ３４ ＋／好リンパ系細胞混合物を、Ｔ細胞の祖細胞がリンパ系統に分化していくのを 促進することが知られている因子とインキュベートすることによりＴリンパ球に 富んだ細胞群に変換することができる。また標的細胞を長期間培養する、あるい は培地に標的細胞を所期の細胞群及び／また所期の分化段階にまで持っていく因 子を補充するなど、細胞の培地を変えることもできる。そのような因子の例とし て、ＩＬ−２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ刺激因 子（Ｍ−ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン（ＩＦＮ） 、レチノイン酸、ＳＣＰＦ、ＳＣＦやＢＭＰ、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、上 皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞由来成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成 長因子（ＰＤＧＦ）などのすべての成長因子がある。この工程では培養細胞の培 地はＢＳＦＭをふくんでいてもよいし、含んでいなくてもよい。 様々な臨床応用に向けた標的細胞を得ることの他に、本発明のもう一つの利点 は細胞増殖の間に腫瘍細胞が本来的に除かれることにある。慢性の骨髄性白血病 のいくつかについては細胞の数が長期培養の間に急速に減少することが報告され ている。本発明によれば増殖中の腫瘍細胞の除去は、例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ 、活性化マクロファージのような腫瘍細胞に抗増殖作用及び／または細胞毒性を 有するサイトカインや細胞が存在することにより促進される。 誘導工程の場合と同じく、増殖工程もインビボまたはインビトロで行うことが できる。インビボでの適用は循環している細胞群のためにＢＳＦＭを血流中に導 入すること、あるいは特定の組織細胞に導入することを含む。あるいは、細胞を ＢＳＦＭと一緒に、またはＢＳＦＭで処理してから体に戻して、システム、組織 、器官の修復、再建、再生を図るものである。 別の態様によれは、本発明はインビボの生物における「自然」のコントロール をまねて、細胞培養のホメオスタシスを確立することを目指すものである。ホメ オスタシスの定義は、ここでは特定の培養条件の下での細胞／細胞、及び細胞／ 因子の相関の結果確立された動的平衡に限定される。ホメオスタシスは平衡のと れた因子の混合物と種々の細胞型からなる培養物を供給することにより達成され る。均衡のとれた因子の混合物を外部から加えると、更なる因子はデノボで培養 中に誘導されるてくる。例えば、ＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦ−αを培養に加 えると単球とマクロファージからＣＳＦが生産されてくる。特定の細胞／細胞、 細胞／シグナル間の相互作用の結果、標的細胞型細胞群数の増加及び／または分 化にとって好ましい刺激と阻害の均衡がとれた環境が作られる。この動的平衡は 細胞群が標的細胞型の増殖と富化の結果変化するのに従い変化できる。従って当 初の刺激と阻害が均衡がとれた環境は、標的細胞の連続的増殖を維持するために 変えることができる。 ６．増殖細胞群 本発明の増殖した細胞群は、最終的に当初の細胞群に比べ標的細胞の数が多く （増殖）、標的細胞のパーセントが高い（富化）。例えば、幹細胞のように非常 にその数と割合が低い細胞を増殖させ富化して標的細胞の細胞群数を約５％以上 、好ましくは約２０％、最も好ましくは約５０％以上にすることができる。当初 から多数存在する細胞、あるいは高い分画細胞数が必要とされる場合（たとえば ヘモグロビン生産のための赤血球）、本発明によれば増殖した細胞群が少なくと も ５０％の標的細胞、好ましくは少なくとも８０％の標的細胞を有することが可能 である。これらの新しい細胞群においては、標的細胞は少なくともほぼ５００倍 、好ましくはほぼ１０００倍、最も好ましくはほぼ１０，０００倍に増えること ができる。 例をあげると、本発明により富化された細胞群としてほぼ３０％のＣＤ３４＋ 細胞からなる造血細胞群がある。この細胞群は約７．５％のＣＤ３４＋ＣＤ３８ −ＣＤ４５−ＤＲ−Ｒｈｏ１２３（Ｄｕｌｌ）細胞をも有する。これらの細胞群 では正常の末梢血標品の約１５００倍にまでＣＤ３４＋細胞が富化されている。 ７．増殖細胞群の使用 本願発明の方法により作られた増殖標的細胞群は、細胞移植、骨髄置換の如き 臓器或いは細胞系の再生を含む組織再生、特定の細胞移入の如き補足的療法、及 び感染又は疾患の治療或いは防御用手段として有用である。 好ましくは、本願発明の標的細胞は幹細胞、祖細胞或いは前駆細胞である。幹 細胞、祖細胞及び前駆細胞はより分化した細胞を作り出すに容易に利用され、一 方、その逆は真実でない。一実施態様において、標的細胞は造血系、又はリンパ 系或いは骨髄系のみの細胞の如き、完全な細胞系の再生又は置換に使用される。 赤血球標的細胞群は貯蔵或いは保存でき輸血に使用できる。また、赤血球細胞は ヘモグロビンの如き大量の赤血球細胞発現生成物の発生に使用できる。リンパ性 細胞はブルートン無ガンマグロブリン血症（Ｂ細胞欠乏症）、デイジョージシン ドローム（胸腺形成不全症）、ＳＣＩＤ（アデノシンデアミナーゼ欠損症）、ビ スコットーアルドリッチシンドロームの如き血小板減少症、及びその他の免疫不 全疾患の治療に使用できる。 一般に、本願発明にかかる末梢血幹細胞移植療法はボーンマロー移植及び末梢 血移植の如き現在使用されている移植手法に変わることができる。これらの手法 のどちらに関しても、大量のボーンマロー或いは末梢血が必要であり、収集手法 は患者に非常に侵襲性のものであり、幹細胞は精製に広範な処理を必要とするの で非常に品質が劣るものである。 反対に、本願発明の末梢血移植はそのような欠点はない。第一に、少量の末梢 血のみが必要であり、このことは非常に低い侵襲的手法により得られるものであ る。第二に、精製工程を全く必要としない。自家幹細胞の濃縮した群が単一培養 で生ずる。更に、生じた細胞は必要とされる特異的な適合性を有し或いは完全な 造血系を再構成できる。これらの長所の組み合わせは現在入手可能な工学技術を 使用しても不可能なことである。 本願発明に従えば、造血系の標的細胞群は療法として或いはしばしばある種の 疾患の治療として使用できる。簡単にいえば、所望の細胞の試料は患者から得る ことができる。任意に、試料をＧ−ＣＳＦ或いは化学療法剤の如き感作剤を投与 して得る前に患者を感作してもよい。これらの細胞を必要であればいずれかの疾 患細胞を除去するために処理し、そして本願発明の方法に従って培養する。次い で体から全ての疾患細胞を破壊するために例えば高量の化学療法或いは放射線処 理により患者を処理し、その後培養細胞を再導入する。患者から全ての疾患組織 を浄化できるならば、短期間でも疾患細胞系或いは臓器の完全な破壊又は除去が 実施可能な選択である。 特定の細胞タイプ或いは細胞群に集中する感染及び疾患も本願発明により処置 できる。これらの疾患は、赤細胞膜疾患の如き貧血、赤細胞酵素欠損症、ヘマト グロビン合成疾患、同種血球凝集素、胎児赤芽球症、マラリア、赤血球細胞への 機械的或いは化学的外傷、脾機能亢進症、シデロブラスト貧血、慢性感染に関連 する貧血、及び骨髄浸潤による骨髄ろう貧血がある。更に、胞状リンパ腫、バー キットリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、及びリンパ腫を含む非−ホドキンスリンパ 腫及び急性白血病の如き免疫系の疾患がある。更に、本願発明の方法により処置 可能な疾患としては、新形成種、例えば肺細胞癌、睾丸細胞癌、固形癌、神経芽 細胞腫、神経線維腫、色素細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、胃ガン、大腸癌、 骨癌、側頭鱗細胞癌、腺癌、前立腺癌、及び網膜芽腫、さらに吸収不良シンドロ ーム、ビタミン欠乏症及び肥満症の如き栄養疾患がある。 前記したように、本願発明は非造血細胞系にも同様に適用できる。本願発明に より生じる標的細胞は組織再生、臓器置換或いは補足、細胞移植、或いは疾患及 び感染に対する予防或いは治療として使用できる。例えば、組織再生においては 、特定の組織の未分化細胞の標的細胞群を作ることができる。肝臓、腎臓、神経 、膵臓、皮膚及び骨細胞を大量に容易及び迅速に生じさせる。第一に、ＢＳＦＭ を 細胞群で培養し初期幹細胞群を作る。次いでこれらの初期細胞を特定の因子、例 えば神経成長因子、繊維芽細胞誘導成長因子、ＧＭ−ＣＳＦ或いはエリスロポエ チン、及び所望の組織を発生させる他の試薬で処理する。 本願発明の方法による１実施態様において、皮膚を効果的に及び安全に発生で きそして患者に移植できる。第一に、健常な上皮細胞の少量試料を外科的に患者 から取り除き組織培養に入れる。次に、ＢＳＦＭをこの同じ細胞試料から、別の 上皮試料又は前もって同一の患者から取り出した別の組織試料から、或いは別の 源から得られた細胞培養物から調製する。次いで患者の上皮試料を効果的量のＢ ＳＦＭの存在下で培養する。得られる豊富で増殖した培養物から、大量の上皮前 駆細胞を増殖でき患者に植皮される天然皮膚を発生できる。患者自身の細胞を試 料として使用した場合、拒絶の危険性は非常に低いか或いは全くなく、そして新 しい上皮細胞は非常に急速に発生する。そのような療法を必要とする患者、例え ばやけどした患者、に対しては、生命を脅かす二次的感染の危険性が全く厳格で あるので迅速さが本質的なものである。 別の実施態様において、祖細胞から完全な臓器系を創製できることである。例 えば、膵臓細胞の少量の試料は患者或いは健常で免疫的に適合したドナーから得 られる。ＢＳＦＭ組成物はランゲルハンス島細胞、上皮膵臓細胞、造血細胞或い は他の源からの細胞である少量の膵臓細胞試料を使用して調製される。次いで、 膵臓細胞を幹、祖、前駆或いは分化膵臓細胞において培養物を増殖及び豊富にす る効果的量のＢＳＦＭで処理する。これらの細胞から、膵臓、或いは少なくとも 膵臓の部分（例えば、Ａ，Ｂ，Ｄ及びＰＰ細胞を含有するランゲルハンス細胞） を再創製できそして外科的に患者に再導入できる。これらの細胞は免疫的に拒絶 されず天然細胞として同様な方法で機能しインシュリンを発生するであろう。結 局、本願発明の方法を使用して、ある場合においては、Ｉ型糖尿病（インシュリ ン依存性糖尿病）は治療でき、そして少なくともＩＩ型糖尿病に帰する合併症（ インシュリン抵抗性糖尿病）は軽減できる。この方法は更にインシュリン発生の 制御下で機能する移植装置に組み込むための島細胞群を発生させるために使用で きる。 本願発明の方法により発生する細胞群は更に、腎臓、肝臓、胆嚢、大腸、肺、 選択的筋組織、神経、選択的血管、動脈及び毛細管、腱及び靭帯更に胃腸系の細 胞の如き細胞系補足、再植或いは全体的な再創製に使用できる。本願発明の一面 においては、創製した細胞及び細胞群は、ここで引用例として特に組み込んだ米 国特許５、０３２、５０８での開示の如く当業者に現在入手可能で公知な方法を 利用して臓器全体の再構成に利用することができる。 本願発明にかかる細胞群は更に疾患或いは感染に対する治療剤として使用する ことができる。移植されるべき細胞群は、細胞内で利用され得ない手法を使用し て効果的及び完全に除去できるウイルス及び細菌の如き感染に対して検定及び処 理できる。例えば、感染した細胞を含有する患者の体液或いは組織の少量試料を 感染から追放できＢＳＦＭでの培養により細胞数が拡大される。移植療法におい て疾患細胞を選択的に破壊するための細胞外手法が知られている。手短に言えば 、細胞試料を培養に入れ、そして例えば逆転写酵素阻害剤（例えば３’−アジド −３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ））の如き抗ウイルス剤で処理する。ＢＳＦ Ｍ処置は抗ウイルス剤処理の前、後或いは同時に行える。別法として、細胞をク ローン化し、個々に未感染細胞の選別を検定しそして得られる群を増殖させる。 同時に、患者を高量の化学試薬、薬剤或いは放射線で処理し体中の全ての感染細 胞を除去する。疾患が増殖細胞試料及び患者から除去されれば次に増殖細胞試料 を患者に再注入し、全体的或いは部分的細胞系を再創製させる。 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ Ｖ）の如きウイルスにより発生する感染はこの手法で処理できる。少量の血液試 料を取り除きそのＴ細胞群を本願発明の方法に従って増殖させる。次いで全ての 微量ウイルスを当業界で周知の手法を使用して試料から除去し、そして患者を高 量の抗ウイルス剤（例えば（ＡＺＴ））で処理し全てのウイルス粒子を破壊し、 必要であれば他の試薬でウイルス感染した細胞を破壊する。これらの工程は現在 の移植技術を使用しても不可能なものである、なぜならば移植した細胞が確立し 機能する前に二次的感染が起こり患者を殺すからである。本願発明の方法に従え ば、患者は十分量で多種の細胞を注入でき活性な免疫系を再構成できる。別法と して、ＡＩＤＳ感染患者に、患者の血液試料からウイルスを浄化し本願発明の方 法に従い増殖させた未感染Ｔ細胞のＡＩＤＳ感染患者への新鮮な提供により連続 的に処理できる。この方法はウイルスを除去しないが、患者においてＡＩＤＳ関 連合併症が決して展開せず、兆候もなく、比較的正常な生命に導くことができる 。更に、患者が強靭な肉体状態であれば感染を浄化するより果敢な療法処置を許 容することができる。 別の実施態様において、本願発明の方法により調整した細胞群は疾患或いは感 染に対し予防的に使用できる。例えば、血液試料を患者から取り出し幹/前駆細 胞群を増殖するために処理できる。次いでこれらの細胞を骨髄中で処理し前Ｂ細 胞群の増殖のために選別する。インフルエンザ、ヘルペス、単一ウイルスＩ又は ＩＩ、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例えばＨＩＶ）、ポ リオウイルス、ライノウイルス、呼吸器シンシチウムウイルス、Ａ、Ｂ及びＣ型 肝炎ウイルス、風疹ウイルス、及びＪＣウイルスからのウイルス性感染、スタフ ィロコッカス、ストレプトコッカス、マイコバクテリウム、クロストリジウム、 ナイセリア、エンテロバクター、シュードモナス、サルモネラ、トレポネマ、キ ャンデイダ、及びアスペルギラスの如き生物体からの細菌性或いは真菌性感染、 アメーバ症、肺炎菌症、マラリア、トリパノソーマ症、ぜん虫病及びサルコイド ーシスの如き寄生虫感染であるような特定の疾患に対する抗原でこれらの前Ｂ細 胞を処理する。 標的細胞を抗原特異的抗体産生刺激手法により抗原で処理し、標的細胞を同一 或いは異なった患者に再注入する。この患者は決して感染或いは予防接種に曝さ れることなく選択した特定の疾患に抵抗する抗体を有するであろう。同様な手法 で、免疫系のいずれの細胞タイプも処理でき感染或いは疾患に抵抗する細胞質又 は体液を発生させる。別法として、この方法を使用してこれら同様な疾患及び感 染を処理することができる。 本願発明の別の実施態様は遺伝子療法に対する効果的な手段を提供する手法に 関するものである。細胞群を取り除き培養できることが比較的容易であることに 鑑み、当業者は更に患者に再導入する前に遺伝子成分を細胞に導入することがで きる。このことは単一欠失或いは欠損遺伝子成分に帰する多くの欠損疾患を治療 できる。更に、造血幹細胞は体の種々の部分に欠失生産物を拡散するための媒介 物としてそれ自体非常によく役立つものである。本願発明により先産される造血 幹細胞及び他の細胞は更に特定のリコンビナント生産物を患者の体の特定領域に 標的するために使用でき、例えば、抗ガン剤を肝臓の一次癌を有する患者の肝細 胞に標的させることにより、癌抑制遺伝子生産物を網膜芽腫の患者の特定細胞に 標的することにより、或いは抗血小板形成酵素をアテローム性動脈硬化症の患者 の造血細胞に標的することにより達成される。 本願発明の方法による遺伝子療法の他の候補となる疾患の例としては、血友病 Ａ（グルコース６−ホスフェートハイドロゲナーゼ欠損症）、家族性高コレステ ロール血症（例えば、コレステロール７−アルファーヒドロキシラーゼ欠損症） 、グリコーゲン及びリソゾーム性蓄積症（例えば、スフィンゴ脂質症、ムコ脂質 症、ウルマン病、ポンペ病、ゴーシェ病）及びＳＣＩＤ等がある。 遺伝子療法のための手法は当業界で公知である。手短に言えば、細胞試料を患 者から取り出し本願発明の方法に従い培養物中に入れる。この試料は本願発明に 従う方法で処理した培養物中に維持し、幹細胞を含有する細胞群の分画の増殖に 有利である。次いで、これらの細胞を使用して遺伝子成分の導入及び安定な組み 込み技術を行う。遺伝子成分の導入は本願発明の方法による細胞増殖の前、間中 、或いは後に達成させる。増殖中の遺伝子成分の組み込みはある場合には好まし い。これらの技術の例としては、カルシウム介在或いはミクロソーム介在トラン スフェクションの如きトランスフェクション、細胞融合、エレクトロポレーショ ン、ミクロ注入、或いはリコンビナントワクシニアウイルス又はレトロウイルス ベクターを使用する感染がある。これらのベクターはＳＣＩＤ処理用アデノシン デアミナーゼの如き生成物を発現する機能的な遺伝子成分を含んでいる。遺伝子 成分を必要とする細胞を選別し、更に増殖し患者に再導入する。これらの細胞派 体全体に循環しアデノシンデアミナーゼを供給し、或いは必要である他の生成物 を供給する。 このアプローチの他の好ましい態様は糖尿病の処置及び可能であれば治療であ る。インシュリン依存性糖尿病患者からの膵臓組織の試料に生検を実施し組織培 養に入れる。この試料をＢＳＦＭで培養し選択的に幹細胞、祖細胞、前駆細胞或 いは分化した膵臓細胞を増殖する。次いでこれらの細胞をインシュリン発現をコ ードする遺伝子でトランスフェクトする。好ましくは遺伝子を天然インシュリン プロモータである天然インシュリン遺伝子と類似或いは同一の手法で転写及び翻 訳制御されているプロモーターの制御下で行う。次いでこれらのリコンビナント 細胞を糖尿病患者の膵臓に注入し外科的に移植する。リコンビナント細胞は膵臓 に組み込まれ、インシュリンの血流への必要な供給となる膵臓Ｂ細胞の機能が完 成される。この処理は必要であれば繰り返すことができ、しかしながら生検を実 施すれば膵臓細胞は患者から連続的に取り出せないが培養物中に維持或いは後の 使用のために貯蔵（例えば低温保存）できる。このことは現在の入手可能な技術 によっては想像できない著しい有利点である。 本願発明の別の実施態様は細胞質移植による感染の治療のための遺伝子治療に 向けられている。例えば、標的細胞、好ましくは造血細胞は本願発明の方法によ り調製できる。これらの細胞は治療的生産物を発現するリコンビナントＤＮＡ配 列を使用してトランスフェクト或いは感染され、宿主の接種して治療効果を示す 。有用な治療的生産物は抗生物質、化学療法剤を含む抗ガン剤、ペプチド及び細 胞毒性化合物、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムの如き発現生産物である。特 に有用な生産物は、患者の造血細胞に組み込んだ場合、ある種の癌の処理におい てより高量で結果としてより効果的な用量の化学療法剤の使用を許容する多薬剤 耐性（ＭＤＲ）遺伝子の発現生産物である。本願発明の方法が選択的に所望の細 胞群を増殖できるという事実に鑑み、薬剤及び他の試薬が最小の副作用で最大の 治療的効果を与えるためにある種の組織及び臓器に優先的に標的化することがで きる。更に、これらと同様な手法は遺伝子成分を細胞に導入するために利用でき 、予防的処置として疾患或いは感染に抵抗性を与えることができる。これらの処 置形態は現在の技術によっては不可能である。 別法として、標的細胞は抗原性或いは免疫原性生成物を発現する遺伝子成分と 融和できる。細胞が患者に戻されると免疫応答は感染生物体の如き抗原を発現す るいずれの物質に対して抗原特異性抗体及び細胞の循環の創製を発生させる。事 実、そのようなリコンビナント細胞は感染生物体に対するワクチンを構成するで あろう。 別の実施態様において、種々の特異的細胞列に分化できる本願発明により発生 する幹細胞、祖細胞或いは前駆細胞の多群からなる細胞培養物のバンクを提供す る。この細胞バンクは単一個体を創製でき長時間、例えば低温保存のように貯蔵 できる。手短に言えば、個体の種々の臓器及び細胞系から細胞の試料が得られ、 選別されたＢＳＦＭを使用する本願発明の方法によりＨＬＡ分類され、培養され る。展開する標的細胞群は増殖され、遠心分離により球粒化され、ジメチルスル ホキシド（ＤＭＳＯ）の如き低温保存メヂウム中で懸抱くし、試料に分けられ、 十分凍結される。試料は解凍でき、必要な場合、例えば患者が細胞移植療法を必 要とする場合に培養物中で増殖することができる。別法として、試料は細胞バン クの創製のために凍結でき、必要な場合にのみ後に解凍し本願発明の方法により 増殖させることができる。これらのアプローチは現在の技術を使用しても不可能 なことである、なぜならば大量の未分化細胞は培養物中で維持或いは増殖できな いからである。 同様な方法で、標的細胞群は、自家或いは同種移植療法における使用のための 、例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の完全或いは部分的スペクトラムに表される 幹、祖及び前駆細胞の異なった個体の創製バンクから貯蔵することができる。こ れらの細胞バンクはそれぞれの臓器、組織及び組織系のために維持或いは低温保 存できる。ヒト以外のそのような細胞バンクの確立のための候補となる疾患は畜 牛、羊、ブタ及び馬の如き経済的に高価なほ乳類、犬及び猫の如き飼い慣らされ た動物、種々のサル及び他の霊長類の如き動物園及び野生動物がある。分類され た試料が必要となるまで凍結され次いで本願発明の方法を使用して増殖されるＨ ＬＡ−型血液及び/又は組織試料バンクも確立することが可能である。 別の実施態様において、胎児遺伝子検定を本願発明の方法により実施すること ができる。第一に、末梢血の試料を少量の胎児細胞を含有する妊婦から取り出す 。胎児細胞は本願発明の方法により増殖される。妊産婦細胞からの胎児細胞の分 離は、所望により増殖の前或いは後のどちらかで、ＦＡＣＳ方法或いは類似の方 法により行うことができる。得られる胎児細胞の増殖した群は公知で現在入手可 能な手法、例えば羊水穿刺により容易かつ信頼性のある遺伝的検定を行うことが できる。 以下、本発明の実施例を記載する。これらは本発明の範囲を限定するものでは ない。実施例 実施例１ ＣＤ３４＋細胞の増殖 Ａ． ＢＳＦＭの製造 白血球搬出法によって得られた末梢血細胞をヘパリンの２０単位／mlを含有す る培地ＣＣＭ−２（Verax Corporation）で１：１０に希釈した。等量の希釈血 液 サンプルを２％酢酸と混合しそして単核細胞の総数を血球計数器を使用して推 定した。一般に、１つの白血球搬出ユニットからの単核細胞の総数はおよそ３０ 乃至５０ｘ１０⁶細胞／mlである。 ＢＳＦＭを誘導するため、末梢血細胞をヘパリン２０単位／mlを含有する無血 清ＣＣＭ−２で約４ｘ１０⁶単核細胞／mlの最終濃度まで希釈した。Ｔ−１５０ フラスコ内の総量８０mlの細胞懸濁液を調湿した５％ＣＯ₂培養器の中で３７℃ の温度で約２時間mezereinの１０ｎｇ／mlを加えて予備培養した。Concanavalin -Aを最終濃度が２０μｇ／mlになるまで添加して３７℃で約４日間培養した。上 澄み液を採集しそして細胞破片を遠心分離により除去した。清澄上澄み液を使用 するまで４℃で保存するかまたは−２０℃で凍結乾燥した。 Ｂ． ＢＦＳＭ添加レベルの最適化 この実施例では実施例１Ａで製造されたＢＳＦＭを使用して末梢血細胞群の増 殖のためのＢＳＦＭの最適ポテンシャルレベルを推定した。未分画およびフィコ ール分画末梢血細胞を使用した。フィコール分画血細胞は白血球搬出ユニットか らの末梢血１０mlをヘパリンの２０単位／mlと１０％全仔ウシ血清を含有するＣ ＣＭ−２培地２０mlで希釈して製造された。この希釈血液サンプルの１５mlを無 菌５０ml培養管内のFicoll-Hypaque１０ml上に装填した。細胞を卓上遠心分離器 内で室温（２５℃）、４００ｘｇで３０分間遠心分離した。水性フィコール中間 相から細胞を採取しそして１０％ウシ胎児血清を含有するＣＣＭ−２培地で２回 洗浄した。この細胞を使用前に無血清ＣＣＭ−２培地または１０％ＦＣＳを含む ＣＣＭ−２培地に再懸濁した。 未分画細胞を上記の１乃至５％ＢＳＦＭ含有ＣＣＭ−２培地中ウシ胎児血清の 存在または不存在下に約２ｘ１０⁵／mlの最終細胞濃度まで希釈した。２４穴の 培養プレートの１穴あたり１．５mlの細胞懸濁物を入れて５％ＣＯ₂培養器内で ３７℃の温度で培養した。５日間にわたり毎日その細胞の個数と生存率を測定し た。表１に示されているように、最高の増殖率は５％ＢＳＦＭを含有するＣＣＭ −２培地で観察された。別の研究でも５％ＢＳＦＭ含有ＣＣＭ−２培地で細胞増 殖率はピークとなることが確認された。５％ＢＳＦＭ含有培地と１０％ＢＳＦＭ 含有培地とでは細胞増殖率に差異はなかった。さらに、無血清培地でも血清含有 培地でも同等によく細胞が増殖することが観察された。５％ＢＳＦＭ含有ＣＣＭ −２培地がフィコール分画ＰＢＭＮＣの増殖を支援する能力は未分画ＰＢＭＮＣ の場合と同等であった。 Ｃ． 末梢血単核細胞の増殖 未分画細胞と分画細胞の両者を２４穴培養プレートで、５％ＢＳＦＭ、組替え ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）１０ng/ml、組替えヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ） １単位／mlを含有するＣＣＭ−２培地により培養することによってＰＢＭＮＣ細 胞の増殖を調べた。各穴に１乃至２ｘ１０⁵単核細胞／mlの細胞濃度をもつ細胞 懸濁物１．５mlを接種した。５乃至６日培養後に細胞個数と生存率を算定した。 培養の終期に、同じ培養条件で１乃至２ｘ１０⁵細胞／mlの接種密度でさらに５ 乃至６日間継代培養した。最初の細胞培養から、細胞を２回継代培養した。表２ に示したように細胞個数の増加倍率は２継代１６日間で、未分画細胞培養でも分 画細胞培養でも６００倍を超えた。 Ｄ．増殖中の細胞群の分析 次の３つの方法によって全細胞群の中の増血細胞の組成を分析した： 表現表面マーカーたとえばＣＤ３４を判定するＦＡＣＳ分析； 細胞群中の前駆細胞、特にＢＦＵ−ＥとＣＦＵ−ＧＭの総数を算定するコロニー 形成検定；および 光学顕微鏡による形態学的分析。 ＦＡＣＳ分析のために使用される表面マーカーのリストを表３に示す。多くの 場合、培養中のＣＤ３４＋細胞サブ群の識別のためには三色染色を使用した（表 ４）。たとえば、３種の個別抗体対各々ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲがＣ Ｄ３４＋細胞サブ群を認識する手段として表に記載のいずれかのマーカーを表現 する細胞型判定ために使用された。他の組合わせの例はリンパ球と骨髄系統細胞 への分化を監視するためのＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ３の組合わせである。 培養で得られた前駆ＣＦＵ−ＧＭ細胞の総数を決定するため、１ｘ１０⁵単核 細胞を２０％のＦＣＳ、０．９％のメチルセルロース、１０ng/mlの組替えヒト ＧＭ−ＣＳＦを含有するＣＣＭ−２培地１ml中に懸濁しそして格子付き３５mm組 織培養皿に塗布した。５％ＣＯ₂培養器中３７℃の温度で１４日間培養後、形成 されたコロニーを数えて記録した。赤芽祖細胞、ＢＦＵ−Ｅの数を調べるため、 １ｘ１０⁵単核細胞をＣＦＵ−ＧＭ検定に関して記載したものと同様な、ただし 組替えＧＭ−ＣＳＦを組替えヒトエリトロポエチンの１単位／mlに変更した培地 にまいた。そして、同じく１４日培養後光学顕微鏡で総コロニー形成単位を判定 した。細胞形態を調べるため、cytospin染色技術を使用した。簡単にいうと、細 胞を遠心濃縮しそして細胞塗沫標本がWright's染色で染色される。細胞形態を光 学顕微鏡で分析した。 Ｅ．骨髄および赤芽祖細胞の増殖 ２４穴プレート培養器に、フィコール分画ＰＢＭＮＣを約２ｘ１０⁵/mlの細胞 密度かつ１．５ml／穴で接種した。５％ＢＳＦＭ、１０ng/mlの組替えヒトＳＣ Ｆおよび組替えヒトエリトロポエチンの１単位／mlを含有するＣＣＭ−２培地の 中で５日間培養した。前記に説明したコロニー形成検定を使用して、培養０日目 と培養５日目のＣＦＵ−ＧＭ細胞とＢＦＵ−Ｅ細胞の総数を計算した。代表的Ｃ ＦＵ−ＧＭコロニーとＢＦＵ−Ｅコロニーを図３と図４にそれぞれ示す。表５に 示したように、培養５日後にはＣＦＵ−ＧＭ祖細胞で３２．３倍の増加そしてＢ ＦＵ−Ｅ祖細胞で２３７．５倍の増加があった。この実施例の場合、培養の全細 胞は培養５日後約５倍まで増大し、ＣＦＵ−ＧＭとＢＦＵ−Ｅ細胞またはそのＣ Ｄ３４＋前駆細胞の優先的増大を示していた。 Ｆ．ＣＤ３４＋細胞の増殖 実施例１Ａに記載のごとく製造された選択されたＢＳＦＭがリンパ系統分化を 好むＣＤ３４＋細胞の増殖を意図して使用された。このために、未分画およびフ ィコール分画ＰＢＭＮＣが前記のごとき２４穴プレート内の、５％ＢＳＦＭ、１ ０ng/mlの組替えヒトＳＣＦおよび組替えヒトエリトロポエチンの１単位／mlを 含有するＣＣＭ−２培地の中で培養された。５日目と１１日目に細胞を継代培養 しそして０日目、５日目、１１日目、１６日目に採集された細胞のＦＡＣＳ分析 によって表面マーカー、ＣＤ３４を判定した。表６に示されているように、ＣＤ ３４＋細胞は細胞群の０．５％以下から７０％以上まで増加した。図５は未分画 細胞についての１日目の培養をそして図６は３日目の培養を示す。図７は分画細 胞についての１日目の培養をそして図８は３日目の培養を示す。 Ｇ．ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３＋細胞のサブ群の分析 ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３＋細胞サブ群を分析するために別の試験において、未 分画および分画細胞を前記のごとく２４穴プレート内の、５％ＢＳＦＭ、１０ng ／mlの組替えヒトＳＣＦおよびエリトロボエチン１単位／mlを含有するＣＣＭ− ２培地の中で５日および６日間それぞれ培養した。ＰＢＭＮＣ増殖の率を表７に まとめて示す。 ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３＋細胞のサブ群の両者を調べるため、次の表面マーカ ーに基づくＦＡＣＳ分析を未分画および分画ＰＢＭＮＣの両者について行った： ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ８。分析 の結果を表８にまとめて示す。未分画細胞培養中の全ＣＤ３４＋細胞は全細胞群 の２８．２％そして分画細胞培養中のそれは３６．５％である。さらに、ＣＤ３ ８、ＤＲ、ＣＤ３表面マーカーに基づいて、培養中によりプリミティブなものか らよりコミットされた祖細胞までの範囲にわたるＣＤ３４＋細胞サブ群の列を得 た。いくつかの代表的ＦＡＣＳ分析を図９と図１０に示す。 実施例２ 修飾ＢＳＦＭの製造 実施例１Ａ記載のプロトコールによって修飾ＢＳＦＭを得た。この修飾ＢＳＦ Ｍの５mlを１mlのマトリックスを含有する抗IL-2親和性カラムに通じた。流通留 分（修飾ＢＳＦＭ）を骨髄系細胞増殖のための培地の製造のために使用した。こ の培地はＣＣＭ−２培地、５％修飾ＢＳＦＭ、１０ng／ml組替えヒトＳＣＦおよ び１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチンを含有する。 ２４穴プレートに１穴につき細胞培養１．５mlずつ２ｘ１０⁵ＰＢＭＮＣ／ml を接種した。細胞を各５乃至６日間２代継代培養した。それぞれ培養５乃至６日 の終わりに、全細胞数と生存率を算定した。ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ１９、Ｃ Ｄ３マーカーの表現に関連した細胞群の組成をＦＡＣＳにより分析した。さらに 、培養から得られた細胞に対してコロニー形成検定を実施した。それらの結果は ＣＤ３４＋細胞の増殖、その細胞の群が主として各種分化度の骨髄系細胞（ＣＤ ３３＋）からなることを示した。 実施例３ リンパ系細胞の増殖 ２４穴プレートで未分画および分画ＰＢＭＮＣを培養してリンパ系細胞の増殖 を調べた。培養条件と培地は共に実施例１に記載したものと同じであった。培養 は２継代、全部で１６日間実施された。０日目、５日目、１１日目および１６日 目にＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞群をＦＡＣＳによって分析した。表９に 示されているように、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞群は増大しそして維持 された。培養１６日後において、未分画細胞培養と分画細胞培養の両方の全細胞 群は６００倍以上に増大していた。 未分画と分画の両者の細胞培養の１６日後のＣＤ３＋細胞をさらにＦＡＣＳで 分析してＣＤ４マーカーとＣＤ８マーカーに関してＣＤ３＋細胞のサブ群を調べ た。分析の結果は表１０にまとめられており、培養中それら細胞群は増大かつ維 持されたことを示している。 実施例４ 赤芽系細胞の増殖 ２４穴プレートに２ｘ１０⁵細胞／mlの細胞密度の未分画と分画ＰＢＭＮＣを 使用して１穴あたり培養液１．５mlで接種した。培養培地は実施例２に記載のＢ ＳＦＭ、１０ng/mlの組替えヒトＳＣＦおよび１単位／mlの組替えヒトエリトロ ポエチンを含有するＣＣＭ−２培地と５０ミリモルのクエン酸第二鉄から構成さ れた。 細胞は３７℃の温度で培養され、そして各５乃至６日で継代された。５乃至６ 日の培養の終わりにそれぞれ細胞総個数と生存率を測定した。細胞群はＦＡＣＳ と光学顕微鏡による形態観察によって分析された。分析結果は前赤芽細胞、赤芽 細胞および高度に分化した赤芽細胞を含む細胞集団へと導く赤芽系細胞の増大を 示した。 実施例５ 造血系の再構成 増殖により得られたＣＤ３４＋細胞の造血系再構成能力を試験するため、未分 画ならびに分画ＰＢＭＮＣを、実施例１に記載のごとく、５％ＢＳＦＭ、１０ng ／mlの組替えヒトＳＣＦおよび１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチンを含有 するＣＣＭ−２培地で５日間培養した。細胞を採集してそして卓上遠心分離器を 使用して室温で２０分間２００ｘｇの力で遠心分離した。未分画細胞培養と分画 細胞培養のそれぞれからの、pH７．４のリン酸塩緩衝食塩水の０．１乃至０．２ ml中の約５ｘ１０⁶細胞をＳＣＩＤマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。注射２週 間後、そのＳＣＩＤマウス体内の腎嚢下からの細胞を特異細胞挿入の証拠を調べ るためＦＡＣＳによって分析した。分析結果は培養されたＣＤ３４＋細胞がＳＣ ＩＤマウス内で完全に機能するヒト造血系を移植できることを示した。 実施例６ ＢＳＦＭの製造 リンパ系統分化の方向に向かうＣＤ３４＋の増殖に好ましいＢＳＦＭを誘導す るための実施例１に記載したもの以外のポテンシェーターとインデューサーを例 証するため、４ｘ１０⁶単核細胞／mlを３００ＩＵ／mlのIFN-βで２時間前処理 した。これらの細胞を、ＰＨＡの１０μｇ／mlを添加後、更に４日間培養した。 ＢＳＦＭのＰＢＭＮＣ増殖能を２４穴プレート培養により実施例１に記載のごと く試験した。試験結果は実施例１で使用されたものとは異なるポテンシェーター ／インデューサーを使用して得られたＢＳＦＭが対応するＣＤ３４＋細胞群を支 援し増大させることを示した。 実施例７ 小島細胞の増殖 ブタのすい（膵）島を単離しそしてしフィコールを使用して密度勾配遠心分離 によって約１５０μの平均直径を有する多数の小島を得た。コラーゲンマトリッ クスの１mlの存在または不存在下で６０ｍｍのペトリ皿に約１０，０００の小島 を塗布する。培養培地はＤＭＥＭ、ウマ血清の２０％、実施例１記載のＢＳＦＭ の５％および視床下部抽出物の１％からなるものである。回転プラットフォーム 上３７℃の温度で細胞を培養する。培養０日目、７日目、１４日目および２１日 目に重複ペトリ皿からコラーゲンマトリックスの存在または不存在下で培養され たそれら小島細胞を採取して全細胞個数と生存率を調べた。さらに、培養培地中 のインスリンとグルカゴンの濃度をＡ細胞とＢ細胞の増殖を実証する手段として 放射線免疫検定法によって測定した。その結果は小島細胞の増殖ならびにインス リンとグルカゴンの産生により示されるＡ細胞とＢ細胞の両者の完全機能性を示 した。 実施例８ 異なるドナーからの細胞を使用した細胞増殖 ６個体のヒトドナーからＰＢＭＮＣを別々に集めそして実施例１Ｂに記載した プトコールを使用して特別にフィコール分画した。ＢＳＦＭを実施例１Ａに記載 したプロトコールによって得た。 各ドナーからの細胞を２４穴プレートの中で、４ｘ１０⁵および１ｘ１０⁶の初 期接種密度により１穴について細胞懸濁物１．５mlを使用して培養した。培養は ５％ＣＯ₂培養器中３７℃の温度で５乃至７日間実施された。 各ドナーからの細胞を、ＣＣＭ−２基本培地に２％ＢＳＦＭ及び／又は血漿、 及び／又は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および／または選択されたサイトカ イン：１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）、１０ｎｇ／mlの組 替えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ｎｇ／mlの組替えヒトインターロイキン− ３（ＩＬ−３）、１０ｎｇ／mlの組替えヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６） を加えてつくられた培地調合物に懸濁した。使用された培地調合物を表１１に示 す。 各ドナーの細胞について、培養５乃至７日後に細胞数と生存率を測定した。各 培養の初めと終わりに実施例１Ｄに記載した方法によりＣＦＵ−ＧＭ細胞および ＢＦＵ−ＥプラスＣＦＵ−Ｅ細胞の総数を算定した。 ６種のドナー細胞の各培地組成物における平均全細胞増加（および標準偏差） を表１２に示す。 ＣＦＵ−ＧＭ祖細胞の平均増加は表１３にそしてＢＦＵ＋ＣＦＵ−Ｅ祖細胞の 平均増加は表１４にそれぞれ示されている。 表１２、１３、１４において、標準偏差の数値が平均値に比較して大きい場合 には、その標準偏差値は１個体ドナー（複数ドナーの平均値よりも２倍乃至４倍 大きいドナー）のデータによってゆがめられている。 実施例９ 細胞サイズ分布の分析 ＰＢＭＮＣを白血球搬出によって得、そして実施例１Ａに記載したごとくＢＳ ＦＭを製造した。修飾ＢＳＦＭがＢＳＦＭに血漿を添加（２％血漿）することに よって製造された。Ficoll-Hypaque分画された細胞が製造されそしてＣＣＭ−２ 基本培地（ＦＣＳを含まない）プラス１０ｎｇ／mlの組替えヒト幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）と１単位／mlの組替えヒトエリトロポエチンを使用して、実施例１Ｂに記 載のごとく培養された。 ５乃至６日培養の終わりに細胞数と生存率を測定し、ＦＡＣＳによって細胞を 分析して細胞サイズならびにＣＤ３４＋細胞のサブ群を調べた。 代表的ＦＡＣＳ分析前方光散乱（ＦＳ）と側方光散乱（ＳＳ）がＢＳＦＭに血 漿を添加して培養された細胞と添加されないで培養された細胞について図１１と 図１２にそれぞれ示されている。ＢＳＦＭに血漿を添加されなかった場合には、 図１２に見られるように、細胞サイズ分布が２つの明瞭なサブ群の中に存在して いる。下側の細胞のＦＳサブ群はサイズの小さい細胞でありそしてこのサブ群は ＣＤ３４陽性である細胞を優勢的に含んでいる。ＢＳＦＭに血漿が添加された場 合では、小さい細胞サイズのサブ群中の細胞は無視しうるほどでありそしてＣＤ ３４陽性細胞の個数は顕著に減少している。 本発明の他の実施態様または用法は本明細書に開示された発明の説明と常用技 術とを考慮すれば当技術分野に通常の知識を有する者にとっては自明であろう。 したがって、上記の説明と実施例はもっぱら例示のためになされたものであり、 本発明の真の範囲と精神は以下の請求の範囲によって示されるものであることが 理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/78 7431−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/78 Ｊ 38/00 8314−4Ｃ 48/00 38/21 ＡＤＺ 9455−4Ｃ 37/46 38/22 9455−4Ｃ 37/50 ＡＤＹ 38/36 9455−4Ｃ 37/66 ＡＤＺＧ 38/44 ＡＤＹ 9455−4Ｃ 37/02 48/00 9455−4Ｃ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分に 富む細胞群を生産する方法において： ａ）造血系細胞を含む第１の細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ る細胞因子の混合物を含み、該標的細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された 刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を該第１の細胞 群に生産させ； ｂ）造血系細胞を含む第２の群を十分量の該ＢＳＦＭの存在下に十分な時間 培養して、該標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の細胞群中の該標的細胞画分 を富化させることからなることを特徴とする方法。 ２．該標的細胞が分化多能幹細胞である請求項１記載の方法。 ３．該標的細胞が始祖細胞である請求項１記載の方法。 ４．該始祖細胞が骨髄始祖細胞である請求項３記載の方法。 ５．該骨髄始祖細胞がＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭ Ｍ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＫ、ＣＦＵ−Ｅｏ、ＣＦＵ−Ｂａ、ＢＦＵ−Ｅ及び ＢＦＵ−ＭＫからなる群より選択される請求項４記載の方法。 ６．該始祖細胞がリンパ性始祖細胞である請求項３記載の方法。 ７．該リンパ性始祖細胞がＣＦＵ−Ｂ、ＣＦＵ−Ｔ及びＣＦＵ−Ｌからなる群よ り選択される請求項６記載の方法。 ８．該標的細胞がＢリンパ球及びこれに分化する前駆細胞からなる群より選択さ れる請求項１記載の方法。 ９．該標的細胞がＴリンパ球及びこれに分化する前駆細胞からなる群より選択さ れる請求項１記載の方法。 １０．該標的細胞が赤血球及びこれに分化する前駆細胞からなる群より選択され る請求項１記載の方法。 １１．該標的細胞が血小板、顆粒球、マクロファージ、好塩基球及び好酸球、並 びにそれらに分化する前駆細胞からなる群より選択される請求項１記載の方法。 １２．少なくとも２種の造血系標的細胞画分に富む細胞群を生産する請求項１記 載の方法において、該標的細胞が分化多能幹細胞及び始祖細胞を含む方法。 １３．さらに標的細胞として骨髄細胞及びリンパ性細胞を含む請求項１２記載の 方法。 １４．該標的細胞がＣＤ３４＋細胞である請求項１記載の方法。 １５．該ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋１ｉｎ−である請求項１４記載の方法。 １６．該ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５−ＤＲ−ＲＨＯ１２３ （Ｄｕｌｌ）である請求項１４記載の方法。 １７．該ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋ＤＲ−ＣＤ３３−ＣＤ１９−ＣＤ３−ＣＤ ３８−である請求項１４記載の方法。 １８．該標的細胞がＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１９＋細 胞、ＣＤ３３＋細胞、ＣＤ３８＋細胞及びＤＲ＋細胞からなる群より選択される 請求項１記載の方法。 １９．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約５％の該標 的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２０．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約２０％の該 標的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２１．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約５０％の該 標的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２２．該培養された第２の群中の標的細胞に富む画分が少なくとも約８０％の該 標的細胞を含む請求項１記載の方法。 ２３．該第１の細胞群が全末梢血を含む請求項１記載の方法。 ２４．該第１の細胞群が末梢血単核細胞を含む請求項１記載の方法。 ２５．該末梢血単核細胞が白血球層画分を含む請求項２４記載の方法。 ２６．該末梢血単核細胞が白血球搬出画分を含む請求項２４記載の方法。 ２７．該末梢血単核細胞がＦＩＣＯＬＬ分離画分を含む請求項２４記載の方法。 ２８．該末梢血単核細胞が免疫分離画分を含む請求項２４記載の方法。 ２９．該第１の細胞群が新たに採取された細胞及び予め冷凍保存された細胞から なる群より選択される末梢血単核細胞を含む請求項１記載の方法。 ３０．該第１及び第２の細胞群が異種の細胞である請求項１記載の方法。 ３１．該第１及び第２の細胞群が同種の細胞である請求項１記載の方法。 ３２．該第１の細胞群が骨髄細胞を含む請求項１記載の方法。 ３３．該第１の細胞群が臍帯血細胞を含む請求項１記載の方法。 ３４．該第２の細胞群が全末梢血を含む請求項１記載の方法。 ３５．該第２の細胞群が末梢血単核細胞である請求項１記載の方法。 ３６．該末梢血単核細胞が白血球層画分を含む請求項３５記載の方法。 ３７．該末梢血単核細胞が白血球搬出画分を含む請求項３５記載の方法。 ３８．該末梢血単核細胞がＦＩＣＯＬＬ分離画分を含む請求項３５記載の方法。 ３９．該末梢血単核細胞が免疫分離画分を含む請求項３５記載の方法。 ４０．該第２の細胞群が新たに採取された細胞及び予め冷凍保存された細胞から なる群より選択される末梢血単核細胞を含む請求項１記載の方法。 ４１．該第２の細胞群が骨髄細胞を含む請求項１記載の方法。 ４２．該第２の細胞群が臍帯血細胞を含む請求項１記載の方法。 ４３．該第１及び第２の細胞群が同一のドナーに由来する請求項１記載の方法。 ４４．該第１及び第２の細胞群が該ドナーからの単一の血液試料に由来する請求 項４３記載の方法。 ４５．該第１及び第２の細胞群が異なるドナーに由来する請求項１記載の方法。 ４６．第１の細胞群を処理する工程が該第１の細胞群を該第１の細胞群に該ＢＳ ＦＭを生産させるための誘導剤と接触させることを含む請求項１記載の方法。 ４７．該誘導剤がマイトジェンを含む請求項４６記載の方法。 ４８．該マイトジェンが植物レクチンである請求項４７記載の方法。 ４９．該レクチンがファセオルス・ヴルガリス、ドリコス・ビフロルス、ソラヌ ム・ツベロスム、ソフォラ・ジャポニカ、マクルラ・ポミフェラ、ピスム・サチ ヴム、ウレクス・エウロペウス、アラキス・ヒポゲア、グリシネ・マクス、カナ ヴァリア・エンシフォルミス、トリチクム・ヴルガリス、リコペルシコン・エス クレンツム、フィトラッカ・アメリカナ、及びリステリア・モノシトゲネスから なる群より選択される植物に由来する請求項４８記載の方法。 ５０．該植物レクチンがＰＨＡ叉はＣｏｎＡである請求項４８記載の方法。 ５１．該マイトジェンがＴ細胞マイトジェンである請求項４７記載の方法。 ５２．該Ｔ細胞マイトジェンがスタフィロコッカル・エンテロトキシンＡ、ガラ クトースオキシダーゼ、ストレプトリシンＯプロテインＡ、及び１２−Ｏ−テト ラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）からなる群より選択され る請求項５１記載の方法。 ５３．該誘導剤がＴ細胞に対するモノクローナル抗体である請求項４６記載の方 法。 ５４．該モノクローナル抗体がＯＫＴ３である請求項５３記載の方法。 ５５．該誘導剤がジテルペンエステルである請求項４６記載の方法。 ５６．該ジテルペンエステルが１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボル−１３−ア セテート（ＴＰＡ）である請求項５５記載の方法。 ５７．該ジテルペンエステルがホルボル（４−Ｏ−メチル）１２−ミリステート −１３−アセテート、ホルボル（２０−オキソ−２０−デオキソ）１２−ミリス テート−１３−アセテート、ホルボル１２−モノミリステート、ホルボル１２， １３−ジデカノエート、ホルボル１２，１３−ジブチレート、ホルボル１２，１ ３−ジベンゾエート、及びホルボル１２，１３−ジアセテートからなる群より選 択される請求項５５記載の方法。 ５８．該誘導剤がメゼレイン（ＭＺＮ）である請求項４６記載の方法。 ５９．該第１の細胞群を促進剤で前処理した後で該誘導剤と接触させる請求項４ ６記載の方法。 ６０．該促進剤がＴＰＡ，ＭＺＮ、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、及びイ ンターフェロンβ（ＩＦＮ−β）からなる群より選択される請求項５９記載の方 法。 ６１．該誘導剤がＰＨＡであり該促進剤がＴＰＡである請求項６０記載の方法。 ６２．該標的細胞がＣＤ３４＋であり、該第１の細胞群をＴＰＡ、ＭＺＮ、ＩＦ Ｎ−α、ＩＦＮ−β及びそれらの混合物からなる群より選択される促進剤で前処 理した後でＰＨＡ、ＯＫＴ３、ＣｏｎＡ及びそれらの混合物からなる群より選択 される誘導剤と接触させる請求項１記載の方法。 ６３．該誘導剤と該第１の細胞群とを生育培地中で合わせ、約１乃至１０日間培 養する請求項４６記載の方法。 ６４．生育培地に該誘導剤を培地１ｍＬ当たり約５乃至１０μｇ加える請求項６ ３記載の方法。 ６５．該第１の細胞群をインビトロで処理して該ＢＳＦＭを生産させる請求項１ 記載の方法。 ６６．該第１の細胞群をインビボで処理して該ＢＳＦＭを生産させる請求項１記 載の方法。 ６７．該生育培地が規定無血清培地である請求項６３記載の方法。 ６８．該第２の細胞群を規定無血清培地で培養する請求項１記載の方法。 ６９．該第２の細胞群を該培地中約１乃至約１０体積％の該ＢＳＦＭの存在下に 培養する請求項６８記載の方法。 ７０．該規定無血清培地に少なくとも１種のサイトカインをさらに添加する請求 項６８記載の方法。 ７１．該第２の細胞群を約５乃至約２０日間培養し、該標的細胞がＣＤ３４＋細 胞を含む請求項１記載の方法。 ７２．さらに該富化された第２の細胞群の培養の生育力を維持する工程を含む請 求項１記載の方法。 ７３．さらに該富化された第２の細胞群の培養を冷凍保存する工程を含む請求項 １記載の方法。 ７４．該第２の細胞群をインビトロで培養する請求項１記載の方法。 ７５．該第２の細胞群をインビボで培養する請求項１記載の方法。 ７６．該ＢＳＦＭを宿主に導入することにより該インビボ培養を行う請求項７５ 記載の方法。 ７７．該第２の細胞群を該ＢＳＦＭと接触させた後で該細胞群を宿主に導入する ことにより該インビボ培養を行う請求項７５記載の方法。 ７８．該ＢＳＦＭがＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ −β、ＴＧＦ−β、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＳＣＰＦ及びＢＭＰからなる群より選択さ れる少なくとも２種の因子の混合物を含む請求項１記載の方法。 ７９．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分 に富む細胞群を生産する方法において： ａ）造血系細胞を含む第１の細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ る細胞因子の混合物を含み、分化多能幹細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化さ れた刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を該第１の 細胞群に生産させ； ｂ）該ＢＳＦＭの組成を修正して、該標的細胞の増殖を優先的に促すべく新 たに平衡化された刺激及び抑制作用を有する、修正平衡化選択因子混合物を作製 し、 ｃ）造血系細胞を含む第２の細胞群を十分量の該修正ＢＳＦＭの存在下に十 分な時間培養して、該標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の細胞群中の該標的 細胞画分を富化させることからなることを特徴とする方法。 ８０．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分 に富む細胞群を生産する方法において： ａ）造血系細胞を含む第１の細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ る細胞因子の混合物を含み、分化多能幹細胞、始祖細胞及びそれらの混合物から なる群より選択される少なくとも１種の中間標的細胞の増殖を優先的に促すべく 平衡化された刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を 該第１の細胞群に生産させ； ｂ）造血系細胞を含む第２の細胞群を十分量の該ＢＳＦＭの存在下に十分な 時間培養して、該中間標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の細胞群中の該中間 標的細胞画分を富化させ； ｃ）該富化細胞群を該標的細胞を増殖させる条件下に培養して、該標的細胞 画分が富化された増殖細胞群を生産することを特徴とする方法。 ８１．ＣＤ３４＋抗体を発現する幹細胞／始祖細胞を少なくとも約２０％含む増 殖造血系細胞群を、ドナー末梢血の原試料から生産する方法において： ａ）該原試料からの第１の細胞群をＴ細胞マイトジェンで処理して、該第１ の細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、ＣＤ３４＋細胞の増殖を優先的 に促すべく平衡化された刺激及び抑制作用を有する、平衡化選択因子混合物 （ＢＳＦＭ）を該第１の細胞群に生産させ； ｂ）該原試料からの第２の細胞群を十分量の該ＢＳＦＭの存在下に十分な時 間培養して、ＣＤ３４＋細胞の数を優先的に少なくとも５００倍に増加させ、Ｃ Ｄ３４＋細胞を少なくとも約２０％含む富化細胞群にすることを特徴とする方法 。 ８２．宿主の造血系を折衷造血系を用いて再構成する方法において、請求項２の 方法で生産される選択標的細胞に富む増殖造血系細胞群を該宿主に移植すること からなることを特徴とする方法。 ８３．移植される細胞群が該宿主の造血系を折衷する以前の該宿主に由来する請 求項８２記載の方法。 ８４．移植される細胞群が適合したＨＬＡ型を有するドナーに由来する請求項８ ２記載の方法。 ８５．移植される細胞群が分化多能幹細胞、始祖細胞又はそれらの混合物を含む 請求項８２記載の方法。 ８６．移植される細胞群がＣＤ３４＋細胞を含む請求項１記載の方法。 ８７．該宿主からの造血系細胞の採取に先立ち、該宿主を循環末梢血単核細胞数 を増加させる剤で処理する請求項８２記載の方法。 ８８．請求項１の方法で生産された富化細胞群。 ８９．請求項７９の方法で生産された富化細胞群。 ９０．請求項８０の方法で生産された富化細胞群。 ９１．請求項８１の方法で生産された富化細胞群。 ９２．造血系細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、分化多能幹細胞の培 養を優先的に増殖及び富化する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）。 ９３．造血系細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、骨髄始祖細胞、リン パ性始祖細胞及びそれらの混合物からなる群より選択される細胞の培養を優先的 に増殖及び富化する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）。 ９４．造血系細胞群から得られる細胞因子の混合物を含み、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤 血球、単球、血小板、顆粒球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、それらに分 化する前駆細胞、及びそれらの混合物からなる群より選択される細胞の培養 を優先的に増殖及び富化する、平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）。 ９５．該分化多能幹細胞がＣＤ３４＋である請求項９２のＢＳＦＭ． ９６．該Ｔ細胞がＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞からなる群より 選択される請求項９４記載のＢＳＦＭ。 ９７．該細胞因子がＩＦＮ−γ８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、 ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＦＳ−Ｇ、ＣＦＳ−ＧＭ、ＴＮＦ−α、ＴＮ Ｆ−β、ＴＧＦ−β、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＳＣＰＦ及びＢＭＰからなる群より選択 される少なくとも２種の因子を含む請求項９２記載のＢＳＦＭ。 ９８．さらに該赤血球を培養して該赤血球により生産されるヘモグロビンを回収 する工程を含む請求項１０記載の方法。 ９９．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画分 に富む細胞群を生産する方法において、造血系細胞群を請求項９２のＢＳＦＭ組 成物の活性因子を有する十分量の平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）の存在下に 十分な時間培養して、該標的細胞を優先的に増殖させ、該造血系細胞群中の該標 的細胞画分を富化させることからなることを特徴とする方法。 １００．造血連鎖中の所望の階層に位置する少なくとも１種の造血系標的細胞画 分に富む細胞群を生産する方法において、造血系細胞群を十分量の平衡化選択因 子混合物（ＢＳＦＭ）の存在下に十分な時間培養して、該標的細胞を優先的に増 殖させ、該細胞群中の該標的細胞画分を富化させることからなり、該ＢＳＦＭが 該標的細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された刺激及び抑制作用を有する細 胞因子の混合物を含み、また該ＢＳＦＭが第１の造血系細胞群をマイトジェンで 処理して該標的細胞を優先的に増殖させる細胞因子の混合物を該第１の細胞群に 生産させることにより調製される組成物の活性因子を有することを特徴とする方 法。 １０１．初代培養の動物細胞群を選択的に増殖させて所定の細胞型の標的細胞画 分を富化させる方法において： ａ）第１の初代培養細胞群を処理して、該第１の細胞群から得られ該標的細 胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された刺激及び抑制作用を有する細胞因子の 混合物を含む平衡化選択因子混合物（ＢＳＦＭ）を該第１の細胞群に生産さ せる工程；及び ｂ）第２の初代培養細胞群を十分量のＢＳＦＭの存在下に十分な時間培養し て、該標的細胞を優先的に増殖させ、該第２の初代培養細胞群中の該標的細胞画 分を富化させる工程からなることを特徴とする方法。 １０２．該第１の初代培養動物細胞が造血系細胞、肝細胞、すい臓細胞、皮膚細 胞、脳細胞、神経細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、心臓細胞、骨髄細 胞、骨細胞、軟骨細胞、内皮細胞、腎細胞、筋肉細胞及び上皮細胞からなる群よ り選択される請求項１０１記載の方法。 １０３．該第１の初代培養細胞群を処理する工程が、該第１の細胞群を該第１の 細胞群のためのマイトジェンと接触させることからなる請求項１０１記載の方法 。 １０４．該処理及び培養工程をインビトロで行う請求項１０１記載の方法。 １０５．該処理工程をインビボで行う請求項１０１記載の方法。 １０６．該培養工程をインビボで行う請求項１０１記載の方法。 １０７．該インビボ培養が組織再生を含む請求項１０６記載の方法。 １０８．ヒト幹細胞バンクを創製する方法において、 ａ）既知のＨＬＡ型の第１のドナーから造血系細胞試料を採取する工程； ｂ）請求項２の方法により分化多能幹細胞に富む該造血系細胞の増殖培養を 調製する工程； ｃ）該増殖培養を冷凍保存する工程；及び ｄ）各既知のＨＬＡ型の個々のドナーについて、工程ａ）乃至ｃ）を繰り返 す工程からなることを特徴とする方法。 １０９．同種幹細胞移植を行う方法において、適当なＨＬＡ型について請求項１ ０８の方法で生産された冷凍保存増殖培養を解凍することにより得られる幹細胞 群を患者に導入することからなることを特徴とする方法。 １１０．将来的に幹細胞移植が必要となりうる患者による使用に必要な量の健康 なヒト幹細胞の入手可能性を確保する方法において： ａ）該患者が健康なうちに請求項２の方法により分化多能幹細胞に富む造血 系細胞の増殖培養を調製する工程；及び ｂ）該患者による将来の使用のために該富化培養を冷凍保存する工程からな ることを特徴とする方法。 １１１．何らかの異常な又は病気の造血系細胞を該移植の前に該細胞群から除去 する請求項８２記載の方法。 １１２．損傷を受けたヒト組織を修復する方法において、請求項１０１の方法で 調製した、該損傷を受けた組織と同じ型の増殖初代培養細胞群を患者に移植する 工程からなることを特徴とする方法。 １１３．ヒト器官を再生する方法において、請求項１０１の方法により調製され た１種以上の増殖初代培養細胞群を適当な構造基質中に導入することからなるこ とを特徴とする方法。 １１４．胎児の遺伝的異常の非侵襲的判断方法において： ａ）循環胎児細胞を含有する造血系細胞群を含む末梢血の試料を妊婦から採 取する工程； ｂ）該造血系細胞群を増殖させ、請求項１の方法で胎児及び母体細胞画分を 富化する工程； ｃ）該胎児細胞を該母体細胞から分離する工程；及び ｄ）該胎児細胞について遺伝的解析を行う工程からなることを特徴とする方 法。 １１５．造血系細胞の予防的治療を患者に提供する方法において： ａ）予防的観点からの標的細胞に富む増殖造血系細胞群を請求項１の方法で 調製する工程；及び ｂ）予防的に有効な量の該細胞群を該患者に導入する工程からなることを特 徴とする方法。 １１６．該予防的観点からの標的細胞がＴ細胞を含む請求項１１５記載の方法。 １１７．該Ｔ細胞がＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞からなる群より選択される請 求項１１６記載の方法。 １１８．患者を治療する方法において： ａ）造血系細胞を含む原細胞群を用意する工程； ｂ）該原細胞群の少なくとも一部を造血系細胞を含む第２の細胞群で処理す ることにより調製される細胞因子の混合物を含む平衡化選択因子混合物（ＢＳＦ Ｍ）の存在下に十分な時間培養して、造血連鎖中の所望の階層に位置する少なく とも１種の標的細胞の増殖を優先的に促すべく平衡化された刺激及び抑制因子を 有し、該標的細胞を優先的に増殖させ該原細胞群中の該標的細胞画分を富化する のに十分な量の該ＢＳＦＭを該第２の細胞群に生産させる工程；及び ｃ）該富化細胞群の少なくとも一部を該患者に導入する工程からなることを 特徴とする方法。 １１９．該原細胞群及び該第２の細胞群が同じ患者からのものである請求項１１ ８記載の方法。 １２０．該第２の細胞群が該同じ患者からの原細胞群の一部である請求項１１９ 記載の方法。 １２１．該第２の細胞群が異なる人からのものである請求項１１８記載の方法。 １２２．該異なる人が該第１の人と双子である請求項１２１記載の方法。 １２３．該異なる人が該第１の人と適合するＨＬＡ型を有する請求項１２１記載 の方法。 １２４．該患者が免疫系の異常を有する請求項１１８記載の方法。 １２５．該患者が免疫不全である請求項１１８記載の方法。 １２６．該免疫不全が遺伝的欠陥による請求項１２５記載の方法。 １２７．該遺伝的欠陥がＳＣＩＤを生ずる請求項１２６記載の方法。 １２８．該免疫不全が病原性感染による請求項１２５記載の方法。 １２９．該患者がＨＩＶに感染している請求項１２８記載の方法。 １３０．該免疫不全が切除的化学療法又は放射線療法を伴う患者の治療による請 求項１２５記載の方法。 １３１．該患者が自己免疫異常を有する請求項１２４記載の方法。 １３２．該患者が溶血性異常を有する請求項１１８記載の方法。 １３３．該患者が先天性造血系異常を有する請求項１１８記載の方法。 １３４．該患者が遺伝的欠陥を有する請求項１３３記載の方法。 １３５．該患者がファンコーニ貧血、重症サラセミア及びリソソーム貯蔵疾患か らなる群より選択される異常を有する請求項１３３記載の方法。 １３６．該患者が再生不良性貧血を有する請求項１３２記載の方法。 １３７．該患者が悪性腫瘍異常を有する請求項１１８記載の方法。 １３８．該患者が造血系悪性腫瘍を有する請求項１３７記載の方法。 １３９．該患者が白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群より選択される異常を 有する請求項１３８記載の方法。 １４０．該患者が固形腫瘍を有する請求項１３７記載の方法。 １４１．該患者が乳癌、神経癌、卵巣癌及び精巣癌からなる群より選択される腫 瘍を有する請求項１４０記載の方法。 １４２．該治療が該導入細胞群の少なくとも一部のゲノム中に治療的遺伝子産物 の発現をコードする遺伝子配列を安定して導入する工程をさらに含む請求項１１ ８記載の方法。 １４３．該治療的遺伝子産物が欠陥遺伝子の欠陥部分を供給する請求項１４２記 戦の方法。 １４４．該治療的遺伝子産物が感染を起こす病原体に有毒である請求項１４２記 載の方法。 １４５．該遺伝子配列が望ましくない遺伝子産物の発現にアンチセンスであって 発現を妨げる請求項１４２記載の方法。 １４６．該原細胞群が末梢血単核細胞、骨髄細胞及び臍帯血単核細胞からなる群 より選択される請求項１１８記載の方法。 １４７．該標的細胞が分化多能幹細胞、始祖細胞、前駆細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、 単核球、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、好酸球、好塩基球及びそれ らの混合物からなる群より選択される請求項１１８記載の方法。 １４８．該培養工程がインビトロで行われる請求項１１８記載の方法。 １４９．該原細胞群が該患者から採取した細胞である請求項１１８記載の方法。 １５０．該原細胞群又は該富化細胞群の少なくとも一部を冷凍保存し使用前にそ れを解凍する工程をさらに含む請求項１１８記載の方法。