JPH08512043A - 特に神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物およびそれらの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物の調製のための、転写因子の活性に影響を及ぼす化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 特に神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物およびそれらの利用 本発明は、特に神経変性性疾患の治療のための薬剤学的組成物およびそれらの 使用に関する。本発明は、より具体的には神経変性性疾患の治療が意図される薬 剤学的組成物の調製のための、配列番号１の配列と転写因子との間の相互作用に 作用する化合物の使用に関する。 本発明は、部分的には、因子ＡＰ１が神経変性のメディエーターを構成するこ と、およびその複合体の活性を阻害することが可能な化合物の使用が神経死の過 程を遮断することが可能であることの証明の成果である。本発明は更に、転写因 子のＤＮＡとの相互作用の部位に相当する核酸が、少なくとも部分的にこの転写 因子の活性を阻害することが可能であることの証明の成果でもある。 神経変性の分子メカニズムを研究するためには、あるモデルとして本出願人は グルタメート誘導性毒性を用いた。グルタメートは中枢神経系の主要な興奮性神 経伝達物質である。しかしながら異常に長い期間もしくは生理学的濃度を上回る 濃度でのグルタメートへの露出は、用語「興奮性毒性」により表示される神経毒 性を引き起こす可能性がある（Ｏｌｎｅｙ Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ ．２０３（１９８６）６３１）。実験を基にする多くの一連の論議は、この種の 毒性が、虚血、低酸素症、低血糖症、および癲癇発作に関連するか、あるいは別 の場合には大脳損傷に関連する神経変性に寄与することを示唆している（Ｃｈｏ ｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３（１９９２）１２６１）。興奮 性毒性は更に、例えば、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）型の舞踏病（Ｙ ｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１（１９８８）９８１）、およ びアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）性疾患（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒ ａｉｎ Ｒｅｓ．５３３（１９９０）３１５、Ｍａｔｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（１９９２）３７６）のような疾患の病因に関係す るとも考えられる。 より具体的には、出願人は、初期培養物中の胎仔ラット大脳皮質ニューロンに おいてグルタメートにより誘導される死を研究した。これまでの調査により、そ の膜レセプターへのグルタメートの結合が細胞膜の脱分極および細胞内カルシウ ムの増加を生じ、このことにより数々の酵素ファミリーが関係する第二メッセン ジャーのカスケードの活性化がもたらされることを示すことが可能となった。転 写因子は所定の遺伝子の調節配列に順に相互作用を行っててそれらの発現を活性 化もしくは抑制するであろうが、本出願人はそのような転写因子をコードする初 期応答遺伝子の調節を遺伝子レベルで調査した。より具体的には、本出願人は、 驚くべきことにグルタメートもしくは他の興奮性毒素（例えばＮＭＤＡのような もの）への大脳皮質ニューロンの露出が、「１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボ ール １３−酢酸エステル応答性要素」と表示され、ＴＲＥと省略され、そして ゲノム配列に結合することが可能な蛋白質複 ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ５４（１９８８）３２５、Ｌｕｃｉｂｅｌｌｏ ｅ ｔ ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３（１９８８）４３、Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ ．、Ｃｅｌｌ ４９（１９８７）７２９、Ｂｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２３８（１９８８）１３８６］。 この配列のＴＲＥ領域を配列番号１に示す。その上、本出願人は更に、配列番号 １の配列に結合可能な因子の配列決定を行うことにより大脳皮質細胞が所定の範 囲のグルタメート濃度により誘導される死から救済されることをも示した。この ことは、配列番号１の配列が神経変性のメディエーターの一部分の役割を演じる ことを示し、この所見はこれまでには当該技術分野では全く報告されていないも のであった。この配列番号１の配列およびそれと相互作用することが可能な一連 の転写因子は、従って神経変性過程の治療における新規の薬理学的標的を構成す る。従って本発明は部分的には、配列番号１の配列の活性を遮断することが可能 な神経変性性疾患の治療のための化合物の使用である。 従って本発明の最初の主題は、配列番号１の配列およびそれと相互作用する転 写因子との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害する、神経変性性疾患の治療 および／または予防が意図される薬剤学的組成物の調製のための化合物の使用で ある。 本発明の目的のための、配列番号１の配列と転写因子との間の相互作用を少な くとも部分的に阻害する化合物は、例えば（ｉ）転写、翻訳、もしくは翻訳後の レベルでのこれらの因子もしくはそれらの構成成分の合成、（ｉｉ）これらの因 子の活性の調節の分子メカニズム（多量体形成およびリン酸化−脱リン酸化など ）、もしくは別の場合には（ｉｉｉ）配列番号１の配列へのこれらの因子の結合 、に作用する化合物である可能性がある。 配列番号１の配列と相互作用する転写因子は、遺伝子名称「ＡＰ１」として一 緒の群に総括されている（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２４０（１９８８）１７５９）。問題となる分 子は、その単位構成成分が「ロイシンジッパー」構造モチーフを通して他のもの に連結される二量体である。典型的には、それらの構成成分の内の一つはＦｏｓ プロト癌遺伝子のファミリー（具体的には蛋白質Ｆｏｓ１、Ｆｒａ１、Ｆｒａ２ 、およびＦｏｓＢを含むファミリー）に属し、そしてもう一方のものはＪｕｎフ ァミリー（具体的には蛋白質Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、およびＪｕｎＤを含むファミリ ー）に属する。一例として、Ｆｏｓ蛋白質は３８０のアミノ酸からなり、Ｊｕｎ 蛋白質は３５４のアミノ酸からなる（Ｍａｈｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｒｏｅ、ＦＡ ＳＥＢ Ｊ．６（１９９２）２７０７、を参照せよ）。 配列番号１の配列に結合する因子の合成に作用する化合物の内でも、これらの 因子もしくはそれらの構成成分に対するアンチセンスヌクレオチド配列を挙げる ことができ、これらのアンチセンスヌクレオチド配列は対応する遺伝子の翻訳を 阻害する。従って、ＦｏｓおよびＪｕｎの場合には、Ｈｏｌｅ ｅｔ ａｌ（Ｐ ＮＡＳ ８３（１９８６）４７９４）もしくはＫｏｖａｒｙおよびＢｒａｖｏ（ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（１９９１）４４６６）により記載されるア ンチセンス配列を用いることが可能である。これらの因子のための遺伝子の発現 の調節に作用する他の化合物も本発明に関連させて記載されることがあり、それ らは例えば具体的には、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）（Ｈｕａｎｇｅｔ ａ ｌ．、ＰＮＡＳ ８８（１９９１）５２９２）、２−アミノプリン（Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（１９８８）２１０）、もしくは別の場 合ではヘパリン（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ８６（１９８９）３ １９９）のようなものであり、これらの化合物はＦｏｓおよびＪｕｎの合成に作 用することが可能である。 本発明に関連させて用いることができる他の種類の化合物は、配列番号１の配 列と相互作用する転写因子の活性の調節の分子メカニズムに作用する化合物を一 まとめに総括している。これらのメカニズムは、具体的には多量体形成およびリ ン酸化−脱リン酸化などの段階を必要とする。因子ＡＰ１に関しては、後者は活 性を示すようになる目的ではリン酸化される必要があり、そのリン酸化は、蛋白 質キナーゼＣもしくは蛋白質キナーゼＡ（先に引用されるＭｃＭａｈｏｎ ａｎ ｄ Ｍｏｎｒｏｅを参照せよ）、ならびにＤＮＡ依存的蛋白質キナーゼ（Ｂａｎ ｎｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（１ ９９３）１２８９）による酵素作用を受ける。従って、本発明の目的のためには ＡＰ１のリン酸化に作用する化合物の中でも、これらの蛋白質キナーゼの活性を 少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物を挙げることができる。 最後には、先に記載されるように、本発明の目的のための他の化合物は、転写 因子と配列番号１の配列との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害することが 可能なものである。このような化合物は具体的には、転写因子拮抗剤、すなわち 転写因子もしくはそれらの構成成分、あるいは配列番号１の配列と相互作用し、 かつそのためにこれらの因子と配列番号１の配列との間の結合の活性を調節する ことが可能な蛋白質である可能性がある。 これに関連して、ファミリーＣＲＥＢ（Ｈａｉ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ、ＰＮ ＡＳ ８８（１９９１）３７２０）、ＬＲＦ−１（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．、ＰＮ ＡＳ ８８（１９９１）３５１１）、およびＩＰ−１（Ａｕｗｅｒｘ ａｎｄ Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ、Ｃｅｌｌ ６ ４（１９９１）９８３）の蛋白質、もしくはステロイドレセプター（Ｍｉｎｅｒ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． １６（１９９１）４２３）を挙げることができる。ＣＲＥＢファミリーの複数の 構成要員がＦｏｓもしくはＪｕｎファミリーの構成要員と相互作用する。異なる ヘテロ二量体は異なる結合特異性を有する。従って、Ｆｏｓ−ＣＲＥＢもしくは Ｊｕｎ−ＣＲＥＢ交差二量体はＴＲＥ部位に結合する可能性があるが、その二量 体の組成に依存して更にＣＲＥ部位（ＤＮＡへのＣＲＥＢ蛋白質の結合の部位） にも結合する可能性がある。より具体的には、それらは一般的にＣＲＥ部位への 優先的結合を示す（先に引用されるＨａｉ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ）。従ってＣ ＲＥＢファミリーの一構成要員の、ＦｏｓもしくはＪｕｎファミリーの一構成要 員との二量体形成は、配列番号１の配列に結合する因子の数の調節を誘導する。 ＬＲＦ−１蛋白質はｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎ−Ｂと二量体を形成する。これらの 二量体はＣＲＥ部位にインビトロで結合することが可能であり、そしてその結果 、配列番号１の配列に結合する多数の因子が妨害する可能性がある（先に引用さ れるＨｓｕ ｅｔ ａｌ．）。ＩＰ−１は数々の種類の細胞の核および細胞質中 に出現する内因性因子である。ＩＰ−１はＤＮＡへのＡＰ−１因子の結合を特異 的に遮断する。これは３０〜４０ｋＤａの蛋白質であり、そしてリン酸化形態を とる際にその活性を発揮する（先に引用されるＡｕｗｅｒｘ ａｎｄ Ｓａｓｓ ｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ）。ステロイド（グルココルチコイド、ミネラルコルチコイ ド、プロゲステロン、およびアンドロゲンなど）のためのレセプターに関しては 、これらは亜鉛フィンガー転写因子のファミリーに属する核レセプターである。 これらは配列番号１とは異 なるＤＮＡとの相互作用の部位を保持する。しかしながらそれらの遺伝子の調節 用領域内には複合応答要素が存在し、これらの応答要素と、ステロイドレセプタ ーファミリーの構成要員およびロイシンジッパー転写因子ファミリーの構成要員 （ＡＰ１、ＣＲＥＢ、およびＬＲＦ−１など）は相互作用を行って（蛋白質−蛋 白質相互作用、もしくは蛋白質−ＤＮＡ相互作用）、これらの因子の内の一つの みの存在下には存在することのない調節効果を生ずることが可能である。これら の理由については、この一連の蛋白質はＡＰ−１因子および／または配列番号１ の配列と直接的もしくは間接的に相互作用することが可能であるため、これらの 蛋白質を本発明に関連させて用いて神経変性の過程を阻害することが可能である 。これらの蛋白質を、そのままか、あるいはインビボでこれらの蛋白質を発現す ることが可能な遺伝子構築物として用いることが可能である。転写因子と配列番 号１の配列との間の相互作用を少なくとも部分的に阻害することが可能な他の化 合物は、ＤＮＡへの転写因子の結合の部位を再生する二本鎖核酸からできており 、すなわちこれは配列番号１の配列もしくは後者のいずれかの活性変異体である 。本出願人は実際に、このような核酸が細胞内に存在する転写因子（および特に 因子ＡＰ１）と複合体形成を行うこと、それらの転写因子を内因性部位への結合 から回避させること、およびそのためそれらの転写活性を遮断することが可能で あることを示した。 好ましい態様においては、本発明に関係して用いられる化合物は配列番号１の 配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含む二本鎖核酸である。 用語「活性変異体」は、本発明の目的のためには、因子ＡＰ１への結 合の特性を保持する配列番号１の配列のいずれかの変異体を意味する。このよう な変異体は、配列番号１の配列上の塩基の突然変異、欠損、置換、および／また は添加、ならびに実施例１および２に記載されるその後のインビトロでの結合活 性の確認により取得することができる。 この二本鎖核酸をそのまま用いて、例えばヒトもしくは動物内への注入後に神 経変性の予防の誘導もしくは治療を行うことができる。具体的には、これを特許 出願である国際公開第９０／１１０９２号に記載される技術に従って、裸のＤＮ Ａの形態で注入することができる。これは、例えばＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐ ａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、核蛋白 質（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９８９）３７５ ）、脂質（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１ ３）との複合体の形態でか、リポソーム（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）などの形態で投与すること も可能である。 本発明に関係して用いられる二本鎖核酸がベクターの一部を形成することが好 ましい。このようなベクターの使用は実際に、治療予定の細胞内への核酸の投与 を改善し、かつ前記細胞内におけるその核酸の安定性を増加することを可能にさ せ、そのことにより持続的な阻害効果を取得することを可能にする。その上同一 ベクター内に、やはり治療効果を増加させる数々の核酸配列を取り込ませること が可能である。 用いられるベクターは様々な起源のものであることができ、動物細胞を形質転 換させることが可能であるとするとそれはヒトの神経細胞であることが好ましい 。本発明の好ましい態様では、アデノウイルス、レト ロウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、およびヘルペスウイルスなどか ら選択することができるウイルス性ベクターが用いられる。 これに関連して本発明の主題は、転写因子とＤＮＡとの相互作用の部位に相当 し、そのゲノム内に挿入される二本鎖核酸を含むいずれかの組換えウイルスでも ある。本発明は実際に、直接その遺伝子もしくは関連遺伝子、あるいはそれらの メッセンジャーＲＮＡ、あるいはそれらの翻訳産物に直接影響を及ぼすことによ るのではなく、それらの発現の原因となる転写因子の活性に影響を及ぼすことに よる、所定の遺伝子の発現から生じる所定の病気の治療の可能性を示す。この研 究方法は多くの遺伝子の発現を制御することを可能にするが、それらの発現とは 例えばアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）性疾患の病因に関連するアミロイ ド蛋白質前駆体（ＡＰＰ）の様々なイソ型をコードする遺伝子の発現である。こ の遺伝子は実際のところ転写開始部位の上流に４００ｂｐを下回る転写因子（Ａ Ｐ１）のための２つの結合部位を含む（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２５（１９８７）３６８）。同様に、カテコールアミン合成における主要酵素 であり、パーキンソ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病に関わるチロシンヒドロキシラー ゼのための遺伝子のプロモーターは因子ＡＰ１のための結合部位を含む（Ｉｃａ ｒｄ−Ｌｉｅｐｋａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．３２（ １９９２）２９０）。他の例はＮＧＦ遺伝子に関連しており、この遺伝子もやは り転写因子のための結合部位を保持する（Ｓ Ｄ’Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｈｅｉ ｎｒｉｃｈ、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１（１９９１）２５５）。 本発明に従う組換えウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、 およびアデノ関連性ウイルスなどから選択することができる。そのウイルスが神 経細胞を感染することが可能なウイルス、例えば具体的にはアデノウイルスのよ うなウイルスであることが好ましい。アデノウイルス、レトロウイルス、もしく はＡＡＶから取得され、異種核酸配列を取り込むベクターが刊行物に記載されて いる［Ａｋｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３（１９９ ３）２２４、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．、Ｈ ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １（１９９０）２４１、欧州特許第１８ ５ ５７３号、Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １０１（１９９１） １９５、Ｌｅ Ｇａｌ ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５９（１９９３）９８８、Ｒｏｅｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｅｕｒ ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８（１９９２）２１１、Ｄｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ ．、Ｎｅｕｒｏｎ ５（１９９０）３５３、Ｃｈｉｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．、Ｎ ｅｗ Ｂｉｏｌ．２（１９９０）７３９、Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ． 、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．４（１９９２）２３８、国際公開第９１／１８０８８号］ 。 本発明の特定の態様では、先に特定されるもののような組換えウイルスは、因 子ＡＰ１とＤＮＡとの相互作用の部位に相当する二本鎖核酸を含む。この二本鎖 核酸が配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含むこ とが更に一層好ましい。 有利なことに、本発明に従う組換えウイルスは欠陥ウイルスである。用語「欠 陥ウイルス」は、標的細胞内で複製することが不可能なウイルスを意味する。従 って一般的には、本発明に関連して用いられる欠陥ウイルスのゲノムは、感染化 細胞内での前記ウイルスの複製に必要とされ る配列を少なくとも欠いている。これらの領域は、除去するか（完全もしくは部 分的に）、あるいは非機能性にさせるか、あるいは他の配列、そして特に二本鎖 核酸により置換するかのいずれかを行うことができる。それにもかかわらず欠陥 ウイルスは、ウイルス粒子の包膜化に必要なそれ自体のゲノムの配列を保持する 。 欠陥組換えアデノウイルス内に取り込まれている形態での本発明の核酸配列を 使用することが特に有利である。 実際には、構造および特性が幾分異なるが、ヒトおよび特に非免疫抑制化被験 者にとっては病原性ではないアデノウイルスの様々な血清型が存在する。その上 これらのウイルスはそれらが感染する細胞のゲノム内への組込みは行わず、かつ 外因性ＤＮＡの巨大断片を取り込むことが可能である。様々な血清型の内でもア デノウイルスタイプ２もしくは５（Ａｄ２もしくはＡｄ５）を本発明に関連させ て用いることが好ましい。Ａｄ５アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列 はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域である。 その上、本発明に従う転写因子のＤＮＡへの結合の部位に相当する核酸の小サ イズのものは、同一ベクター内に数々の核酸を同時に取り込ませることを可能に し、それらの核酸は相同であることも（同一転写因子を遮断することが意図され る）、あるいは異なることも（異なる転写因子を遮断することが意図される）可 能である。従って本発明の特定の態様は、あるベクター、具体的には例えば先に 特定されるもののような少なくとも２つの核酸を含むウイルス性ベクターからで きている。 本発明の欠陥組換えウイルスは、欠陥ウイルスと、中でも例えば先に特定され るもののような核酸配列を保持するプラスミドとの間の相同組 換えにより調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５、Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ．３（１２）（１９８ ４）２９１７）。相同組換えは、前記ウイルスと前記プラスミドとの適切な細胞 株内への同時トランスフェクション後に生じる。用いられる細胞株は、（ｉ）前 記要素により形質転換可能であり、かつ（ｉｉ）欠陥ウイルスのゲノムの部分を 補うことが可能な配列を組換えの危険性を回避する目的では好ましくは組み込ま れた形態で含むべきであることが好ましい。欠陥組換えアデノウイルスの調製に 用いることができる株の例としては、ヒト胎児の腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａ ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げる ことができ、この細胞株は、具体的にはそのゲノムに組み込まれているＡｄ５ア デノウイルスゲノムの左側部分（１２％）を含む。欠陥組換えレトロウイルスの 調製のために使用することができる株の例としては、ＣＲＩＰ株（Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ、ＰＮＡＳ ８５（１９８８）６４６０）を挙げるこ とができる。 その後には、予め増幅させてあるウイルスを分子生物学の標準技術に従って回 収および精製する。 本発明の主題は、少なくとも一つの組換えウイルスもしくは転写因子とＤＮＡ との相互作用部位に相当する一つの核酸（例えば先に特定されるもの）を含む薬 剤学的組成物でもある。本発明が、配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体 の全てもしくは部分を含む少なくとも一つの二本鎖核酸、あるいはそのような核 酸を含む組換えウイルスを含む薬剤学的組成物に関することが一層好ましい。 本発明の薬剤学的組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔 内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および眼内投与などの目的のため に製剤することができる。 これらの薬剤学的組成物が注射用製剤について薬剤学的に許容される賦形剤を 含むことが好ましい。これらの組成物は具体的には、滅菌等張食塩水剤（リン酸 一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、もしくはマグ ネシウムなど、あるいはこれらの塩の混合物を含む）であるか、あるいは脱水、 具体的には凍結乾燥される組成物であることができ、これは適切であれば滅菌水 もしくは滅菌された生理学的食塩水の添加の際に注射用水剤を作成することを可 能にする。 投与のために用いられる核酸（配列もしくはベクター）の用量は、様々なパラ メーターに従って、および特に用いられる投与の様式、問題となる病因、発現予 定の核酸、あるいは別の場合では治療の所望される長さに従って適応させること ができる。一般的に本発明に従う組換えウイルスに関しては、後者を、１０⁴ｐ ｆｕ／ｍｌと１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌとの間、そして好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆ ｕ／ｍｌの用量の形態で製剤および投与される。用語「ｐｆｕ（「プラーク形成 単位」）」はウイルス溶液の感染力に相当し、かつ適切な細胞培養物を感染させ 、そして一般的には４８時間後に感染化細胞のプラーク数を測定することにより 決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の決定技術は刊行物に詳細に記載されて いる。 このような薬剤学的組成物は神経変性性疾患の治療および／または予防のため 、かつ具体的には虚血、低酸素症、低血糖症、および癲癇発作に関連するか、あ るいは別の場合には大脳損傷に関連する神経変性の治療および／または予防のた め、あるいはハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇ ｔｏｎ）型舞踏病もしくはアルツハイマー（Ａｌｔｚｈｅｉｍｅｒ）性疾患の治 療および／または予防のためにヒトに用いることができる。 本発明は以下に示される実施例の手段により一層完全に記載されるであろうが 、ただしこれらの実施例は説明かつ非制限として見なすべきである。 図面の説明文配列番号１ ：ＴＲＥ断片の配列。図１ ：ウワバインの結合の測定によるグルタメート誘導性細胞死の配列番号１の 配列による阻害の証明。この阻害効果は、位置１０（Ｔ→Ｇ）および１５（Ｃ→ Ｔ）で突然変異させた配列番号１の配列の存在下では観察されない。図２ ：細胞外培地中に放出されるＬＤＨの測定によるグルタメート誘導性細胞死 の配列番号１の配列による阻害の証明。この阻害効果は、位置１０（Ｔ→Ｇ）お よび１５（Ｃ→Ｔ）で突然変異させた配列番号１の配列の存在下では観察されな い。図３ ：トリパンブルー染色によるグルタメート誘導性細胞死の配列番号１の配列 による阻害の証明。 一般的クローニング技術 分子生物学において通常用いられる方法（例えば、プラスミドＤＮＡの調製的 抽出、塩化セシウム濃度勾配液内でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロース もしくはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、蛋白 質のフェノールもしくはフェノール／クロロホルム抽出、食塩培地中でのＤＮＡ のエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ）内での 形質転換など）は当業者によく知られており、そして刊行物に詳細に記載されて いる［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｉｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７ ］。 ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、ならびにＭ１３シリーズのフ ァージは商業的起源のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。 ＤＮＡ断片をアガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によりそれらの サイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で 抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後に供給元の推奨事項に従ってファ ージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下でインキュベートして 連結反応を実施することができる。 ５’突出端の充填反応は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて供給元の説明事項 に従って実施することができる。３’突出端の破壊は、用いられるファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で、製造元の推奨事項に従 って実施される。５’突出端の破壊はＳヌクレアーゼでの調節的処理により実施 される。 合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いるインビトロでの部位特異的突然変異 誘発は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法 に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施することがで きる。 いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼ触媒化連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａ ｔａｌｙｓｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４、Ｍｕｌｌｉ ｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５ ５ （１９８７）３３５−３５０］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、「ＤＮ Ａサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を用いて、製造元の説明事項に従って実施することが できる。 ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．ＡＣａｄ．ＳＣｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により 開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実 施することができる。実施例 実施例１：グルタメートへの大脳皮質細胞の露出後に配列番号１の配列と結合 する複合体の証明。 この実施例は、グルタメートへの大脳皮質細胞の露出後に配列番号１の配列に 結合することが可能な細胞内複合体数の増加を証明する。この証明はゲル遅延技 術を使用して実施した（Ｌａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ６６（１９９ １）３０５）。 この目的のためにはウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット胎仔の大脳皮 質の細胞（Ｅ１７）をＤｉｃｈｔｅｒ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１４９（１９７８ ）２７９）の方法に従って単離し、Ｃｏｓｔａｒ社の６ウエルのディシュ内で、 １０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０ｎｇ／ ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎＭのプロゲステロン、および１ｎＭのトリ ヨードチロニンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍｕ）中で培養し（３５分、密度：６×１０⁵細胞／ ディッシュ）、そしてインキュベーター内に保存した（３７℃、５％ＣＯ₂）。 培養中４〜６日後にグルタメートを細胞に添加した。１０分〜４８時間後に細 胞の核抽出物を、先に引用されるＬａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．により記載される 技術に従って取得した。配列番号１の配列に相当する放射活性プローブを実施例 ２に従い、そしてその後にＭａｎｉａｔｉｓにより記載される技術に従ってリン −３２でラベル化することにより調製した（典型的な比活性：５００００ｃｐｍ ／ｎｇ）。このことにより取得された０．２ｎｇのプローブを、その後に５００ ｎｇのポリＤ（ＩＣ）（ＩＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の存在下で０．５〜２ μｇの核抽出物と共にインキュベートして非特異的結合を減少させた。この反応 は氷中で１０分間実施する。形成される複合体をその後に５％のアクリルアミド ゲル上での電気泳動により可視化させる。放射活性バンド（オートラジオグラフ ィーにより示される）の存在は、グルタメートが、配列番号１の配列と結合可能 な複合体の細胞性発現を誘導することを示す。実施例２ ：配列番号１の配列および不活性変異体の合成。 配列番号１の配列に相当する二本鎖核酸を、自動ヌクレオチド合成機の手法に より合成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。 この核酸の不活性突然変異体は同一のプロトコールに従って調製した。この不 活性突然変異体は、配列番号１の配列と比較して、位置１０（Ｔ→Ｇ）および１ ５（Ｃ→Ｔ）での突然変異を保持する。この突然変異体の活性の不在は実施例１ についてのものと同一条件下でこの突然変異体を放射ラベル化後にプローブとし て用いて証明した。この突然変異体の不活性性は配列番号１の配列と比較した場 合のグルタメート存在下での培養後の細胞抽出物への結合曲線中の変化の非存在 により示される。 グルタメート誘導性細胞死を阻害する配列番号１の配列の能力は、以下に示す ３つのパラメーター、すなわち培養物中のニューロンへのトリチウム化ウワバイ ンの結合、細胞外培地中のラクテートデヒドロゲナーゼの検出、およびトリパン ブルー染色後の細胞計数によるパラメーターの測定により決定した。実施例３ ：培養物中のニューロンへのトリチウム化ウワバインの結合の測定（図 １）。 ウワバインは膜ＡＴＰアーゼのためのリガンドである。これは生きているニュ ーロンニのみ結合する。従って結合するウワバインの量が多い程、生きている細 胞の数は多くなる。 ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット胎仔の大脳皮質の細胞（Ｅ１７）をＤｉｃ ｈｔｅｒ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１４９（１９７８）２７９）の方法に従って単 離し、Ｃｏｓｔａｒ社の６ウエルのディシュ（３５分、密度：６×１０⁵細胞／ ディッシュ）もしくは２４ウエルのディッシュ（１６分、密度：３×１０⁵細胞 ／ディッシュ）内で、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランス フェリン、１０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎＭのプロゲステロン 、および１ｎＭのト リヨードチロニンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅ ｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍｕ）中で培養し、そしてインキュベーター内に保 存した（３７℃、５％ＣＯ₂）。培養の４〜５日後に配列番号１の配列もしくは その不活性変異体（実施例２を参照せよ）の２μＭの合成核酸をそれらの培養デ ィッシュに添加した。１５時間のインキュベーションの後にグルタメート（１ｍ Ｍ）を添加した。この培養物へのトリチウム化ウワバインの結合をグルタメート の添加後２４時間目に、Ｍａｒｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ．５３８（１９９１）１）により記載されるプロトコールに従って評定した。 得られる結果を図１に示す。これらの結果は、グルタメートが細胞へのウワバ インの結合の喪失を誘導すること、およびこの喪失が配列番号１の配列の合成核 酸の存在下では阻害されるが、不活化突然変異を施した変異体の存在下では阻害 されないことを明白に示す。実施例４ ：細胞外培地内へのラクテートデヒドロゲナーゼの放出の測定（図２） 。 ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は死につつある細胞によって細胞外培 地中に放出される細胞質酵素である。従って放出されるＬＤＨの量が多い程、死 につつある細胞の数は多くなる。 細胞は実施例３におけるものと同一条件下で培養した。細胞外培地中に存在す るＬＤＨ活性をグルタメートの添加後２４時間目に、ＢｅｒｇｅｒおよびＢｒｏ ｄｉａの方法（Ｓｉｇｍａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ５００）に従ってアッセイし た。 得られる結果を図２に示す。これらは、グルタメートがＬＤＨの細胞外レベル の上昇を誘導すること、およびこの上昇は配列番号１の配列の 合成核酸の存在下では阻害されるが、不活性突然変異を施した変異体の存在下で は阻害されないことを明白に示す。実施例５ ：トリパンブルー染色後の細胞の計数（図３）。 トリパンブルーは、死んだ細胞（これは「青色」になる）に貫入する重要な染 色であり、すなわち死んだ細胞は生きている細胞（これは「白色」のままである ）から排除されるということである。従って「青色」細胞の量が多い程、死んだ 細胞の数が多くなる。 細胞は実施例３におけるものと同一条件下で培養した。この実施例で用いれら れるグルタミン濃度は５ｍＭである。インキュベーション終了時にトリパンブル ーを０．０２％の濃度で添加し、そして細胞を再度１０分間インキュベーターに 入れた。その後に各ウエル（条件当たり６ウエル）をＺｅｉｓｓ社の１３５Ｍ顕 微鏡を用いて５回写真撮影した。その後に青色細胞と白色細胞の数を各写真につ いて盲検様式で計数した。 得られる結果を図３に示す。これらは、グルタメートがかなりの細胞死を誘導 すること、およびこの細胞死は配列番号１の配列の合成核酸の存在下では阻害さ れることを明白に示す。 まとめると、これらの結果は、グルタメート誘導性ニューロン死を阻害する本 発明の核酸の能力を明白に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロベール，ジヤン−ジヤツク フランス国エフ―92330ソ・ブールバール デグランジユ12・レジダンス“レ―ペピニ エール"

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物 の調製のための、配列番号１の配列およびそれと相互作用する転写因子の間の相 互作用を少なくとも部分的に阻害する化合物の使用。 ２． 問題となる化合物が、それらの転写因子および／またはその構成因子の 合成、転写、翻訳もしくは翻訳後のレベルで、および／またはこれらの因子の活 性の調節の分子メカニズム（多量体形成、リン酸化−脱リン酸化）に、および／ または配列番号１の配列へのこれらの因子の結合に作用することを特徴とする、 請求の範囲１に記載の使用。 ３． 配列番号１の配列への因子ＡＰ１の結合に作用する化合物の、請求の範 囲２に記載の使用。 ４． 配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしくは部分を含む 二本鎖核酸の、請求の範囲３に記載の使用。 ５． 二本鎖核酸がベクターの部分を形成することを特徴とする、請求の範囲 ４に記載の使用。 ６． 二本鎖核酸がウイルス性ベクターの部分を形成することを特徴とする、 請求の範囲５に記載の使用。 ７． ＤＮＡとの転写因子の相互作用の部位に相当し、ゲノム中に挿入される 少なくとも一つの二本鎖核酸を含む組換えウイルス。 ８． アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連性ウイルス、もしくはヘ ルペスウイルスであることを特徴とする、請求の範囲７に記載の組換えウイルス 。 ９． アデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲８に記載の組換え ウイルス。 １０． 二本鎖核酸が配列番号１の配列もしくは後者の活性変異体の全てもしく は部分を含むことを特徴とする、請求の範囲７〜９の内の一つに記載の組換えウ イルス。 １１． ＤＮＡとの転写因子の相互作用の部位に相当する数々の相同もしくは異 なる二本鎖核酸を含むことを特徴とする、請求の範囲７〜１０の内の一つに記載 の組換えウイルス。 １２． 欠陥ウイルスであることを特徴とする、請求の範囲７〜１１の内の一つ に記載の組換えウイルス。 １３． 請求の範囲７〜１２の内の一つに記載の少なくとも一つの組換えウイル スを含む薬剤学的組成物。 １４． ＤＮＡとの転写因子の相互作用の部位に相当する少なくとも一つの二本 鎖核酸を、ＤＥＡＥ−デキストラン、核蛋白質、もしくは脂質との複合体形態で 、未精製形態で、あるいは別の場合にはリポソームに取り込まれた形態で含む、 薬剤学的組成物。