JPH08512139A

JPH08512139A - プロトロンビン時間（ｐｔ）アッセイ用のキャリブレーター

Info

Publication number: JPH08512139A
Application number: JP7528369A
Authority: JP
Inventors: ウッダムス，バーリー，ジェイ; バーゲス・ウィルソン，マイケル，イー
Original assignee: デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1996-12-17
Also published as: DE69521470D1; ES2160708T3; DE69521470T2; WO1995030154A1; AU2397995A; ATE202633T1; CA2165412A1; US5866425A; EP0706658A1; AU696924B2; EP0706658B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、約100％の値を有するPTキャリブレーション曲線の作成を可能とし、新鮮な正常血漿を用いて得られたものと同様の結果を与える、組換えFVIIまたは組換えFVIIaのごとき凝固因子を含めた、PTアッセイキャリブレーターおよびPTアッセイキャリブレーターの製法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】プロトロンビン時間(PT)アッセイ用のキャリブレーター発明の背景発明の分野本発明は、約100％の値を有するPTキャリブレーション曲線の作成を可能とし、新鮮で正常なプールした血漿を用いて得られたものと同様の結果を与える商業的血漿製剤の製法に関する。関連技術の記載プロトロンビン時間(PT)は血液凝固因子の欠損についてのスクリーニングテストとして、また例えばクマジンを用いる経口抗凝固剤療法をモニターするのに使用される。トロンボプラスチン試薬は凝固の「外因性」経路を活性化し、PTテストに対する基礎である。トロンボプラスチンは、外因性経路のアクチベーターである脂質付加組織因子(TF)を含有する。この活性化は第VII因子(FVII)および活性化された第VII因子（第VIIa因子）を中心とし、TF-FVII複合体は第Ｘ因子を活性化し、これは第Ｖ因子と共に第II因子を活性化してトロンビンを生じ、これはフィブリン血餅を生じる。 PTテストの結果を表す数種類の方法がある。１つのシステムであるINRシステムは世界保健機構によって推奨されている。しかしながら、多くの国はPTの結果を表すのにこのシステムを採用しなかった。さらに、INRシステムは経口抗凝固剤制御中の患者についてのみ有効であったが、肝臓病のごとき他の疾患状態を持つ患者からの結果を表すのに使用されるべきでない。米国で通常使用されているもう１つのシステムは、血液が凝固を開始する時間を秒で表す。さらにもう１つのシステムはパーセントPT（「％PT」）で結果を表し、これは、新鮮な正常プール血漿（「FNP」）を0.9％生理食塩水中に希釈することによって作成した標準的なキャリブレーション（または希釈）曲線から読んだものである。（他の希釈剤も使用が可能だが、慣用的に、生理食塩水のみが使用されている）。該曲線は、秒で表した時間からの結果を正常活性のパーセント（％PT）に変換することができる。不幸なことには、用いるべきこのシステムのために、ほとんどの研究所は、自己のプール血漿を調製し、通常は液体窒素中でそれを凍結状態に保ち、あるいは-80℃で凍結しなければならなかった。さらに、異なる血漿プールで見い出される固有の変動のため、異なる研究所の血漿プール間を標準化できない。さらに、血漿のプールを調製した場合に、該プールから得られた平均％PT値は、プールを作成するのに使用した個々の試料から得られた平均％PT値とは異なることが示されてきた。また、血液のバルク収集物の収集（凍結乾燥標品を商業的に調製するのに必要となるであろうような）は、静脈穿刺によって収集した血液と比較した場合に測定された％PTの低下を引き起こすことが示されている。Important Di fferences Encountered in the Normal Plasma Pools used for the Control of Oral Anticoagulation，M．Burgess-Wilson，R．Burri and B．Woodhams，Thro mb．Haemost．69 Abstract 2081(1993)参照。さらに、FNPは凍結乾燥するまで販売できない。凍結乾燥は、復元した場合に血漿の正常な病院プールで見い出されるものよりも低い％PT値を有する血漿をもたらす。次いで、この復元したFNPが、標準曲線を作成するのに用いられる。標準キャリブレーション曲線に通常使用される希釈は、未希釈、１：１、１：２および１：４である。復元したFNPを使用する場合、未希釈試料に100％PTの値が割り当てられる。PTアッセイを行い、（秒で表した）結果を（％で表した）希釈に対して双曲線もしくは逆数グラフ紙にプロットする。図１参照。患者の試料は未希釈でテストし、次いで、この標準曲線から読む。しかし、復元したFNPをキャリブレーターとして使用することは、正常試料についての値が復元したFNPを用いて作成した標準曲線の頂部キャリブレーション点よりも上方であることを意味する。（定義によって、すべての正常値の50％は標準曲線の頂部点の上方となろう。）％PT曲線は直線ではない。多項式プロットはデータを通じて最も現実的な曲線を与えるが、多くの研究所および使用者はかかる手法に要求されるコンピューターソフトウェアを有しない。従って、複数の点を通る直線的曲線が通常用いられる。結果を曲線の100％領域の辺りでより正確にするため、線を強制的に100％点に通す。アッセイ機器のタイプの１つであるMedical Laboratory Automation（「MLA」）Electra自動化コアギュロメーター(coagulometer)は、ある範囲の外部（約125％より上方および約12％PTより下方）の％PTを計算しない。％PTを計算する推奨される方法は機器の製造者間で変わる。普遍的に使用される標準的な方法はない。MLAのごときいくつかの装置製造者は、強制的に100％を通す直線を推奨した。他の者は多項線または強制的ではない直線を推奨した。これは、特にキャリブレーション血漿が100％よりかなり低い％PT値を有する場合には当該方法に変動性を導入する。図２参照。後記する実施例では、％PTを計算する方法は、SigmaPlot変形を用いて100％点を通す強制的な直線的曲線を用いるものであった。発明の概要本発明は、約100％の％PT値を有し、FNPで得られたものと同様の結果を与える、キャリブレーション曲線の作成を可能とする商業的血漿製剤の製法に関する。要約すると、本発明は、組換えヒトFVIIまたはFVIIa（または他のFVII源、但し、それは高い十分な純度を有し、かつヒトFVIIと同様に挙動するものとする）を正常なヒト・クエン酸塩加血漿に添加して必要なPT％を得ることを含む。組換えヒト第VII因子の精製を記載する文献については、Kemball-Cook，McVey，Garner ，Martin，O'Brien and Tuddenham，Stable High Level Expression of Recombi nant Human Factor VII In Mammalian Cell Culture ，Thromb．Haemostatis 69 （6）1993，Abstract 253参照。得られた血漿を凍結乾燥し、キャリブレートする。rFVIII、rFＶまたはrFXIのごとき他の組換え因子の添加を、他の凝固アッセイ、例えば、FVIII、FＶ、FXI、誘導されるフイブリノーゲン、FIX、FII、FＸ、プロテイン-C、プロテイン-S、およびAPTT（凝固および発色）アッセイのためのキャリブレーターとして作用する血漿に対してなすこともできることは予測される。例えば、rFＶは利用可能な入手源から得られ、約100％rFＶのレベルが達成されるように血漿に添加できる。本発明のキャリブレーターは、トロンボプラスチンIS（カルシウムPT試薬を含むBaxterの乾燥したウサギ脳）、トロンボプラスチンＣ、およびトロンボプラスチンＣ＋のごときトロンボプラスチン試薬で使用できる。特に、本発明のキャリブレーターは、PT測定およびPTをベースとしたアッセイで試薬として用いる、カルシウムを含むBaxter Diagnostics Inc.のDade Innovin^TM乾燥組換えヒト組織因子のごとき組換え組織因子PT試薬および高度に精製したリン脂質試薬で再脂質付加したOrtho Diagnostics Systems Ortho^R RecombiPlastin^TM組換え組織因子で用いるために設計されている。組換え組織因子試薬、特にInnovin^TM試薬は、種々の因子欠損および経口抗凝固剤処理患者の試料に対して、PT測定およびPTをベースとしたアッセイで用いる他の試薬と比較して、増大した感度を有することが判明した。この試薬感度増大は、（動物又はヒト組織抽出物から調製した）伝統的なトロンボプラスチンに比し、シリンジによってまたは血液バッグによって収集したFNPの間をずっとよく区別するようなものである。キャリブレーション血漿は臨床試料と同様に、すなわち、シリンジで引いて収集すべきである。しかしながら、本発明のキャリブレーターまでは、100％のPTを持つキャリブレーション血漿の商業的製剤は不可能ではないにせよ調製するのが困難であった。凍結乾燥した正常血漿は、Innovin^TM試薬で測定した場合、85％又はそれ未満の％PT を有する。かかる低％PT値を持つ血漿試料の使用は、正常試料の％PTの計算を困難とし、更に後記するごとく、％PTを計算するのに使用する方法により大きな量の変動を導入する。図２に示す如く、箱で囲った領域は、描くことができる２つの曲線（多項式およびおよび外挿した）を示す。図３に示す拡大した箱領域は、２つの曲線がそれらが離れるにつれて非常に異なる結果を与えるであろうことを示す。相違は頂部キャリブレーション点上方で増加する。頂部キャリブレーション点が85％であると、正常な結果のキャリブレーション（130〜70％PT）は、曲線の85〜100％PT部分を外挿しなければならないので、曲線の選択によって強く影響されるであろう。本発明のキャリブレーターの使用は、100％に近い％PTを保ち、曲線の離れる領域の使用を回避する。得られたキャリブレートした血漿製剤は、器具のMLA Electra，KCおよびACLの範囲にて使用できる。図面の詳細な記載図１は、生理食塩水中でのFNPの希釈物についての、凝固時間（秒）対1/PR％のキャリブレーション曲線を示す。図２は、テスト血漿の凝固時間がキャリブレーション血漿のそれよりも短い場合にPT希釈曲線を用いて％PTを計算することによってもたらされる問題を示す。図３は、図２の拡大部分を示す。図４は、表１aのデータからの秒で表したPT凝固時間に対する、異なる濃度の rFVIIaの添加の影響を示す。図５は、表１bのデータからの、FNP単独、およびrFVIIa（1/10³希釈）を添加したFNPのPTキャリブレーション曲線を示す。発明の詳細な記載組換えFVIIaは血漿プールの％PTを上昇させた。また、組換えFVIIは％PTを上昇させた。血漿の大プールに添加して約100％の％PTを生じるのに必要な組換え物質の量を決定した。（１段階凝固アッセイを用いて測定して）達成されたFVIIレベルは、通常、PT ％の上昇とは平行しなかった。２ロットのrFVIIはPT％とFVIIレベルの上昇との間でかなり異なる関係を示した。差異はより活性なrFVIIaによるrFVIIの「汚染」によるものと考えられた。後記するごとく、rFVIIa物質はこの問題を有していなかった。本発明の範囲を限定するものではないが、「汚染」因子は存在しないので、rFVIIaはキャリブレーターとして好ましいと信じられる。 rFVIIまたはrFVIIaいずれかをHEPES緩衝化クエン酸塩加血漿のプールに添加した。HEPES緩衝液は十分凍結乾燥されるのでこれをこれらの実施例について選択したが、リン酸塩タイプの緩衝液を除き、生理学的pH範囲で働くほとんどの緩衝液を使用できるであろうと考えられる。働く緩衝液の例はグッドの緩衝液：PIPE S、ACES、BES、MOPS、TES、およびTRICINEを包含する。得られた血漿＋組換え物質を凍結乾燥に先立ってPT％についてテストした。２ロットの血漿＋rFVIIは凍結乾燥に先立って約100％のPT％を有していた。凍結乾燥後は、PT％は約85％であった。かかる復元した血漿からのPT％キャリブレーション曲線を用いてPT％結果を計算した。値は、Coag Cal N（「CCN」）血漿、すべての凝固因子を含有する凍結乾燥正常血漿からのキャリブレーション曲線を用いて得られたものと非常に似ていた。 HEPES緩衝化クエン酸塩加血漿のプールにrFVIIaを添加することによって、３ロットのキャリブレーター血漿を得た。実験した加速安定性は、37℃における35 日後（４℃における２年と同等）に、結果はCCN血漿のものと同様であることを示し、これは、それらが同様の安定性を有することを示す。２つのロットにおいて、凍結乾燥前にPT％をほぼ100％に調整した。凍結乾燥はPT％を90〜95％の間に低下させるようであった。第３ロットについての凍結乾燥前目標値を、105％および108％の間（両端を含む）で変化させた。凍結乾燥後には第３のロットは約100％のPT％を有していた。復元した第３ロットは４℃および室温で８時間安定であった。かかるロットからのPT％キャリブレーション曲線は30分間安定であった。実施例で詳しく説明するごとく、１つ以上の以下の試薬を実施例で用いた。（これらの実施例は本発明の説明目的を意図するもので、本発明を限定するものではない）。例えば、HEPESの添加は、実施例では「滴下」という。本発明は、明らかに、HEPES緩衝液またはその滴下添加の使用に限定されるものではない）。他の試薬： TIS トロンボプラスチンISロットTPS−46および59 （カルシウムPTアッセイ試薬を含むBaxterの乾燥ウサギ脳） Innovin^TM Innnovin^TM試薬ロットTFS-12、13、14および24 生理食塩水 NaCl（O.9％）ロットH1-75 0Wrens緩衝液 Owrens緩衝液ロット550.029、550.030および550.032 第VII因子 Immuno Absorbed Plasma（「IAP」）第VII因子IAPロットIAP7-25Aおよび26A FVII(a) −トリス緩衝液トリス緩衝液pH7.４ロットH1-85 rFVIIを希釈するのに用いた緩衝液（トリス緩衝液をこれらの実施例で用いたが、同一のpH のいずれの緩衝液も用いることができると考えられる。） O.O5Mトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、 0.15M NaCl いくつかのロットのCCN血漿、すべての凝固因子を含有する凍結乾燥正常血漿を、TISおよびInnovin^TM試薬を用いてPT％についてテストした。また、それらを FVII％レベルについてテストした。結果を以下の表にまとめる。５つのロットの CCN血漿を合してFNP870.003を作成した。機器およびソフトウェア： MLA Electra 1OOOC：No.572−ソフトウェアバージョン3 Rev.E MLA Electra 900C：No.1753−ソフトウェアバージョン4 Rev.1 MLA Electra 1000C：ソフトウェアバージョン5.0：Munchen 方法：プロトロンビン時間(PT) PTテストアッセイは、TISおよびInnovin^TM試薬、およびMLA Electra 900Cまたは1000C操作マニュアルについてのBox Insertsにより行った。第VII因子アッセイ第VII因子アッセイは、FVII IAPおよびMLA Electra 900CまたはI000C操作マニュアルのBox Insertにより行った。血漿または濃縮物の希釈は、得られる凝固時間がキャリブレーション曲線希釈を用いて得られる範囲内になるように選択した。一般に、1/10希釈を100％の第VII因子として割り当てた。実施例１組換えFVIIaロット29491をOwrens緩衝液に1/10²、1/10³、1/10⁴、1/10⁵、1/10⁶ および1/10⁷希釈した。FNP870.003の５つの500μlアリコットを調製した。FNP8 70.003のアリコットの各々に１つのrFVIIa希釈の１つの2Oμlアリコットを添加した。MLA Electra 900Cを用い、得られた血漿のPT％をテストした。 TISおよびInnovin^TM試薬を用いて測定する場合、FNPのPT凝固時間を低下させ、かくして、％PTを増加させることが可能であった。（表１a参照）。rFVIIaの1 /10⁴希釈を用い、FNP中の第VII因子の％レベルは13〜20％上昇した。FNPおよびF NP＋rFVIIaのキャリブレーション曲線（凝固時間、秒、対１/PT％）はほとんど平行であり、これは、修飾された血漿（FNP＋rFVIIa）をキャリブレーターとして用いることができることを示す。表１bおよび図５参照。実施例II 濃縮したrFVIIaの50μlをCCN血漿５mlに添加することによって、組換えFVIIa ロット8293をCCN血漿ロット049中に希釈し、1/100希釈を得た（10 2と記載）。次いで、得られた血漿500μlをCCN血漿4.5mlに添加することによって、一連の1/ 10希釈を得た。３つのさらなる希釈をなし、1/10³、1/10⁴および1/10⁵希釈を得た。TISおよびInnovin^TM試薬を用いてCCN血漿ロットおよび４つの希釈物をテストした。結果を以下に記載する。実施例III テストはrFVII物質について行った。試薬はFNP870.003およびCCN血漿ロット04 2を含むものであった。テストはMLA Electra 1000Cについて行った。異なる容量の３ロットのrFVIIをCCN血漿ロット042に添加した。rFVII調製物は rFVIIa調製物よりも低いFVII活性を有していたので、FVII調製物の希釈および実施例１におけるごとき血漿への希釈物の添加の代わりに、異なる方法を後記するごとく用いた。これは、添加したrFVIIの容量によってCCN血漿を復元するために添加した蒸留水の量を減少させることによって行った。例えば、100μlのrFVII を添加する場合、CCN血漿のバイアルを900μlの蒸留水のみで復元した。 100％PT活性として割り当てたFNPキャリブレーション曲線を用いて、復元した CCN血漿ロット042試料の％PTおよびFVII％を計算した。すべてのキャリブレーション曲線希釈についての平均％PTを用いた。すべてのロットのrFVIIは％PTおよび第VII因子の％レベルを上昇させた。％PTに対する効果はFVII活性の上昇に比例しなかった。「rFVII」のロットは、割り当てた第VII因子のレベルには関係しなかった％PTに対する変化し得る効果に導く可変量で存在する活性化rFVIIを有し得ると考えられた。rFVIIの変動性のため、rFVIIaの使用はより首尾一貫した試薬であるので好ましいであろう。実施例IV 濃縮物中の第VII因子を測定する方法を調べ、CCN血漿中の第VII因子レベルおよびPT％と添加した異なる量のrFVIIaとの関係を調べた。試薬は、rFVIIaロット 21593、CCN血漿ロット042および049ならびにIAP7-26Aを含むものであった。テストはMLA Electra 1000Cにて行った。rFVIIa調製物の第VII因子レベルは、該調製物をCCN血漿に添加し、Owrens緩衝液中1/100ないし1/1000の希釈物をアッセイすることによって、２つの方法で測定した。 CCN血漿中のrFVIIaの第一希釈を作成し（CCN血漿５ml＋20μlのrFVIIa）、これは「血漿＋rFVIIa」ともいう。次いで、以下の希釈物を血漿＋rFVIIaおよびCC N血漿から作成した。表４参照。「＊」をマークした表４の10μl希釈物は表５で使用した同一の10μl希釈物である。結果は表８および９に見い出される。以下の式を用いて、U/mlで表したFVII％濃度を計算した。結果は前記した式を用いて血漿+rFVIIaについて計算した。表６は、rFVIIを血漿に添加した場合に、濃FVIIレベルは2243U/mlであったことを示す。表７は、濃FVIIレベルは、緩衝液中に希釈したrFVIIをテストした場合に、約6 00および1000U/mlの間であったことを示す。血漿中のrFVIIaを測定する場合、得られた結果(2243U/ml)はHarrowからの引用濃度(2500U/ml)と同様であった。希釈した濃縮物を用いた見積もりは低く(600〜 1000U/ml)、本発明者らはこの方法は有用でないと結論した。漸進的上昇が、血漿に対するrFVIIaの添加容量の増加と共に、％PTおよびFVII レベルで起こる（表８および９）。表９のデータから分かるように、第VII因子レベルの上昇とPT％の上昇との間に相関があった。ｒ＝0.9661 実施例Ｖ PT％テストでキャリブレーターとして使用すべく添加した組換え第rFVII因子を有していた安定な凍結乾燥血漿は以下のごとくに調製した。用いた試薬は、rFVIIロット28193および9393、表11aに記載した血漿、およびH EPES緩衝液H1-83であった。必要なrFVIIの容量は以下のように計算した。凍結乾燥後にPT％は約85〜90％と予測され；かくして、10〜15％のPT％の上昇が必要であった。ロット28193についての予備実験は、血漿５ml当たり20〜30μlのrFVIIはPT％の所望の上昇を生じ；血漿５ml当たり25μlのrFVIIを用いた。ロット9393は低い第VII因子レベルを有し、５ml血漿当たり約400μlのrFVIIがPT％を上昇させるのに必要であった。 10ユニットの各々ほぼ200mlの血漿を、表11aに記載した血漿バッグの各々から選択した。すべての血漿を抗凝固剤CPD-Aに収集した。37℃の大きな水浴中で血漿を注意深く解凍した。すべての氷が消失するまで、バッグの内容物を混合し、該血漿は未溶解沈殿を含まなかった。一旦溶解すると、バッグを破砕した氷中に保った。各バッグの全内容物をプールし、破砕した氷によって冷却しつつ徹底的に撹拌した。４つのプールを表10に記載したごとくに凍結乾燥用に調製した。 HEPESを撹拌した血漿に滴下した。組換えFVIIを最後に添加し、最終の混合物を徹底的に撹拌した。得られた血漿を別の1.1mlのバイアルにピペットで入れ、凍結乾燥前に４〜８℃で約１時間貯蔵した。凍結乾燥後、バイアルを４〜８℃に保った。各ロットからのいくつかのバイアルは凍結乾燥しなかったが、-70℃保存にて貯蔵した。凍結乾燥に先立ち、MLA Electra 1000Cを用いて異なるプールの血漿、CCN血漿ロット042およびCCN血漿ロット049（両者は新たに復元したものである）をテストした。PT％およびFVII％レベルアッセイ双方を行った。血漿試料をキャリブレーション曲線モードおよびテストモードでテストした。プールＰを作成するのに用いた10の血漿はすべて正常であった（表11a参照）。新鮮なプールのテストは、両プール（P1および28193、P1および9393）でほぼ100％のPT％を示す。FVIIの上昇は、各々、140％および190％であった。ほぼ100％PTを持つ対照を調製するのに必要なrFVIIの量は予測できるというのが結論である。凍結乾燥に先立ち、HEPES緩衝液の添加は約５％だけPT％を低下させた。凍結乾燥後、凍結乾燥前のそのテストにおけるのと同一の器具および方法を用いて、異なるプールの血漿、CCN血漿ロット042およびCCN血漿ロット049をテストした。凍結乾燥後、HEPESを含まないプールは11％のPTの喪失を示し、一方、HEPESを含むプールは差異を示さなかった。rFVIIを含む２つのプールは％PTをわずかに（２％）喪失した。HEPESを含まないプールにおいてさえ凍結乾燥後にF VII％レベルで変化は観察されなかった。（表12a〜12b参照）「テストモード」は、試料を、当該試料が希釈したものかまたは純物血漿としてのものかを問わずキャリブレーターとしてテストできることを意味する。実施例VI PT％テストでキャリブレーターとして使用するためにrFVIIaを添加した安定な凍結乾燥血漿は以下のごとくに調製した。使用した試薬はrFVIIaロット21593、プール２（凍結乾燥の丁度前のCCN血漿ロット053）、およびトリス緩衝液ロットH1-85であった。（HEPESを含有する）使用準備のできた血漿プールの400ミリリットルを用いてCCN血漿ロット053を調製した。バイアルを1.1mlのプールした血漿で満たし、-70℃で５日間貯蔵し、次いで、凍結乾燥した。ある数のバイアルは70℃に保ち、凍結乾燥しなかった。凍結乾燥に先立ち、４つのプールをMLA Electra 1000Cにてテストした。凍結乾燥の後、凍結乾燥前と同一の機器および方法を用いて、４つのプールを、対応する４つの凍結したプールに対してテストした。前記CCN血漿ロット049キャリブレーション曲線（表11b：85％PTとして割り当てられた12.2、18.0、32.7および69.0秒）を用いて、表14および15で見い出される結果を計算した。２つのロット（プールP2/20およびプールP2/10）についての新鮮な結果は、各々、102％および98％である。凍結乾燥後、PT％で５〜８％の降下があるようであり、これはrFVIIでは起こらなかった。凍結した試料はこの降下を示さなかった。rFVIIaを用いてPT％を増加させた血漿において、凍結乾燥の間にPT％の５〜８％喪失がある。これは製造過程の間に補う必要がある。実施例VII：添加したrFVIIaでの（実施例VIで調製した）プールP2の加速安定性をテストし、２ロットのCCN血漿と比較した。用いた試薬はプールP2、P2/13、P2/10、P2/20 、CCN血漿ロット050および053であった。血漿の数個のバイアルを37℃で貯蔵し、Box InsertおよびMLA E1ectra 1000C Handbookに従い、MLA Electra 1000Cにて10、14、26および35日後にテストした。４℃で貯蔵した同一血漿のバイアルを同一時間周期でテストした。テストしたすべての血漿は37℃でのインキュベーションに際してPT％が徐々に降下した。rFVIIaを含有する血漿はrFVIIaを含有しないものとは異なり降下しなかった。rFVIIaの添加は、PT％アッセイを用いて測定した37℃でインキュベートした血漿の安定性を変化させなかった。表17参照。アレニウス安定性テストでのさらなるロットの続いての分析は、２年を超える予測された寿命を与えた。実施例VIII −20℃で貯蔵した10人のドナー（表６a参照）からのクエン酸塩加血漿の予め調製したプールを37℃の水浴中で解凍し、次いで、４℃で貯蔵した。解凍血漿の温度が４℃に達すると、HEPES溶液をゆっくりと添加した。 HEPES粉末40mgを100mlの蒸留水に添加することによってHEPES溶液を調製した。5M NaOHを用いてpHをほぼ7.3ないし7.5に調整した（約5mlの5M NaOHが必要であった）。この結果、40％HEPES溶液（ロットH1-83）が得られた。プール中の血漿各１リットルにつき、30mlの40％HEPES溶液を添加した。泡を生じないように注意しつつ、プールした血漿およびHEPES溶液を10分間混合した。すべてのテストはMLA Electra 1000Cを用いて行った。プール＋HEPES緩衝液（「緩衝化プール」）のPT％を測定した。次いで、組換え第VIIa因子を、緩衝化プール＋rFVIIaのPT％が105％および108％の間になるまで、前記したごとくに、段階的に緩衝化プールに添加した。それを100％を超えて５〜８％に調整して凍結乾燥の間に５〜８％のPT％の喪失とした。rFVIIaは（実施例IVに記載したように）希釈物を血漿に添加することによって測定されたその活性を従前に有しており、この活性を以下の式で用いて、緩衝化プール１ml当たりに添加したrFVIIの量( ml)を決定した。 rFVIIa量(ml)＝（緩衝化プール１mlの容量(ml)×必要なrFVIIのU/ml）／（rFVIIa濃度(U/ml)） 105〜108％のPT％を達成するために緩衝化プールに添加すべきrFVIIaの合計量は、血漿１ml当たり約O.6ユニットである。PT％がもし以下のようであれば、必要なrFVIIaの量は以下のようになる：＜90％ 0.6U/mlを添加＜100％ 0.3U/mlを添加＜105％ 0.15U/mlを添加一旦rFVIIaを含む血漿プールの目標PT％活性を達成したならば、混合物を、再度、少なくとも２分間徹底的に撹拌した。混合物の２つのアリコットをテストし、すべての８つの結果の平均を計算した。平均結果が105〜108％（包括的）の間であれば、当該物質は凍結乾燥用に許容された。必要であれば、それに添加されたrFVIIaを有しないさらなる緩衝化血漿を緩衝化プールに添加してPT％を低下させて、必要な値を達成することができる。表18〜20参照。パイロット生産サイズ実験からのデータを表18、19および20に示す。血漿プールのテスト：測定された容量(ml) 1200 貯蔵された血漿容量(ml) 200 ドナーユニットの数 10 凍結乾燥生成物のテストはMLA E1ectra 1000Cを用いて行った。FNPに対してキャリブレートした凍結乾燥血漿をキャリブレーターとして用いた（「キャリブレーター」）。凍結乾燥生成物のPT％は（未希釈血漿からの結果のみを用いて）計算した。これは生成物のPT％として割り当てた。次いで、凍結乾燥生成物を用いてキャリブレーション曲線を得た。凍結乾燥生成物のイン−プロセス制御チェックとして、一連のテスト結果（表21〜24参照）は凍結乾燥生成物およびキャリブレーターを用いて計算し、パーセント差異を計算した。凍結乾燥生成物は、15％を超える差異がなければ許容されると見なした（表25参照）。実施例IX 復元した場合、第１のパイロット生産（ロットP4という）の安定性は、Innovi n^TM試薬ロットTFS-12および生理食塩水H1-86を用いてテストした。希釈安定性テストは、プログラムバージョン4.1を用い、MLA Electra 900Cで行った。テストは希釈物を調製した直後（ｔ＝０）および調製後正確に30分（ｔ＝30）に行った。すべての復元した安定性テストはプログラムバージョン3Eを用いて E1000Cを使用して行った。６つのバイアルを復元した。３つを室温で８時間放置し、３つを４℃で８時間放置した。８時間後、さらに３つのバイアルを新たに復元し、すべての９つのバイアルでキャリブレーション曲線を作成した。Innovin^T ^M 試薬を新たに復元し、直ちにテストし、各時点に新たに復元した試薬を用いてE 1000C（８℃）にて４時間および８時間貯蔵した後にテストした。当該物質は、もし秒で表した凝固時間が、復元後に新たにテストした４℃貯蔵の凍結乾燥物質から得られた凝固時間から10％以下異なれば安定性テストを不成功としたとは見なさなかった。血漿希釈物は30分間安定であった。表26参照。時間０と時間30の間に有意な変動はなかった。また、Electra 1000CにてのInnovin^TM 試薬の安定性は８℃において８時間良好である（表27）。結果は時間ｔ＝０からｔ＝８時間まで変動を与えない。また、PTキャリブレーター復元安定性を８時間測定した。変化は、４℃（２％）または室温（４％）におけるｔ＝０およびｔ＝８時間の間でほとんどない。表28参照。テストにより、希釈物の安定性、Innovin^TMTFS-12の安定性およびパイロットロットP4の復元安定性が確認される。実施例Ｘさらに安定性テストをロットP4で行った。不成功の基準は、平均ベースライン値と比較して凝固時間（秒）の10％の変化と定義した。 SigmaPlotプログラムを用い、アレニウス法での加速安定性計算を以下のごとくに行った：１．各温度について、時間（この場合一日）（Ｘ軸）に対し濃度（この場合− 秒で表した凝固時間）（Ｙ軸）の常用対数をプロット（表29）２．各温度につき（グラフ）、回帰式Ｙ＝mX＋ｂを計算３．生成物がもはや許容されないパーセント変化を定義し（この場合−凝固時間の＋10％；平均ベースライン＋10％＝10.69＋10％＝11.76（秒）、ゼロ時間分析の値を常用対数濃度（この場合−凝固時間(s)のLog＝11.76−1.070のlog）に変換４．各温度についての回帰式を用いて、常用対数を置き換え、日不成功を計算５．１／絶対温度に対して、セクション４からの日の常用対数をプロット（表 30）６．セクション５におけるグラフにつき、回帰式Ｙ＝mX＋ｂを計算７．セクション６からの回帰式を用い、４℃で予測される寿命を計算表31は、ロットP4の異なるバイアル間の再現性を表すベースラインデータを示す。表32および33は安定性テストの間の対照のテスト結果を示す。表34は、ロットP4の安定性は室温（25℃）での45日後に不成功だったことを示す。表35は30℃ におけるロットP4の安定性を示し；表36は37℃におけるロットP4の安定性を示し；表37は50℃におけるロットP4の安定性を示す。結論として、ロットP4は４℃で18年間安定である。

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）クエン酸塩加血漿およびクエン酸塩ベースの抗凝固剤血漿よりなる群から選択される正常プール血漿と；ｂ）該血漿に添加された場合に、該正常プール血漿および添加した凝固因子の凍結乾燥に先立って、血漿の％PT値を約100％まで増加させるのに十分な量の凝固因子と；を含む、プロトロンビン時間アッセイのためのキャリブレーター。２．該凝固因子がヒトrFVII、ヒトrFVIIa、少なくとも１のヒト血漿源から精製したrFVII、少なくとも１のヒト血漿源から精製したrFVIIa、いずれかの種の血漿源から精製したrFVII、いずれかの種の血漿源から精製したrFVIIa、いずれかの種の血漿源からのrFVIIa、いずれかの種の血漿源からのrFVII、および前記した凝固因子と実質的に同一の機能的活性を持ついずれかの試薬、ならびにかかる凝固因子のいずれかの希釈物および突然変異も含めた群から選択されるものである、請求項１のキャリブレーター。３．該血漿および添加した凝固因子の増大した％PTが凍結乾燥後に約100％PT である、請求項２のキャリブレーター。４．PT試薬と共に用いられるものである、請求項３のキャリブレーター。５．組換え組織因子PT試薬と共に用いられるものである、請求項３のキャリブレーター。６．該組換え組織因子PT試薬がInnovin^TM試薬およびOrtho^R RecomboPlastin^TM 試薬よりなる群から選択されるものである、請求項５のキャリブレーター。７．ａ）クエン酸塩加血漿およびクエン酸塩ベースの抗凝固剤血漿よりなる群から選択される正常プール血漿を収集するステップと；ｂ）凍結乾燥に先立って、該血漿および添加した凝固因子の％PTを約100％PT まで増加させるのに十分な量の凝固因子を添加するステップと；を含む、プロトロンビン時間アッセイで用いるキャリブレーターの製造方法。８．該凝固因子がヒトrFVII、ヒトrVIIa、少なくとも１のヒト血漿源から精製したrFVII、少なくとも１のヒト血漿源から精製したrFVIIa、いずれかの種の血漿源から精製したrFVII、いずれかの種の血漿源から精製したrFVIIa、いずれかの種の血漿源からのrFVIIa、いずれかの種の血漿源からのrFVII、および前記した凝固因子と実質的に同一の機能的活性を持ついずれかの試薬、ならびにかかる凝固因子のいずれかの希釈物および突然変異も含めた群から選択されるものである、請求項７の方法。９．該血漿および添加した凝固因子の増大した％PTが凍結乾燥後にほぼ100％である、請求項８の方法。 10．該キャリブレーターがInnovin^TMPT試薬と共に用いられるものである、請求項８の方法。 11．該キャリブレーターが組換え組織因子PT試薬と共に用いられるものである、請求項９の方法。 12．該組換え組織因子PT試薬がInnovin^TM試薬およびOrtho^R RecomboPlastin^TM 試薬よりなる群から選択されるものである、請求項11の方法。 13．ａ．クエン酸塩加血漿およびクエン酸塩ベースの抗凝固剤血漿よりなる群から選択される正常プール血漿と；ｂ．該血漿に添加された場合に、該正常プール血漿および添加した凝固因子の凍結乾燥に先立って、血漿の該凝固因子のパーセントを約100％まで増加させるのに十分な量の凝固因子と；を含む、凝固因子アッセイのためのキャリブレーター。 14．ａ．クエン酸塩加血漿およびクエン酸塩ベースの抗凝固剤血漿よりなる群から選択される正常プール血漿を収集するステップと；ｂ．該血漿に添加された場合に、該正常プール血漿および添加した凝固因子の凍結乾燥に先立って、血漿の該凝固因子のパーセントを約100％まで増加させるのに十分な量の凝固因子を添加するステップと；を含む、凝固因子アッセイで用いるキャリブレーターの製造方法。