JPH08512200A

JPH08512200A - クローニング、発現およびトキソプラズマ・ゴンヂのペプチド抗原に対応するワクチン組成物

Info

Publication number: JPH08512200A
Application number: JP6523864A
Authority: JP
Inventors: ビエマン，ラルフ; ボラン，アレックス; ジャコブ，ポール
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-26
Publication date: 1996-12-24
Also published as: EP0695356A1; WO1994025594A3; WO1994025594A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アミノ酸配列TDPGDVVIEELFNRIPETSVを有するティー・ゴンヂ（T.gondii）の５４kＤa抗原の残基１９７〜２１６に対応するポリペプチドを提供する。また、宿主細胞、例えばワクシニアウイルスよりなる宿主細胞またはＣＨＯ細胞からの発現による、ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはその残基１９７〜２１６に対応するポリペプチドの製造法も本発明の範囲内である。

Description

【発明の詳細な説明】クローニング、発現およびトキソプラズマ・ゴンヂのペプチド抗原に対応するワクチン組成物ＷＯ９２／１１３６６にて同定および記載されている５４kＤaの抗原は、ある個体におけるトキソプラズマ症の発症の原因となる寄生虫であるトキソプラズマ・ゴンヂ（Toxoplasma gondii）による感染症に対する潜在的防御剤を構成する。ＷＯ９２／１１３６６において、ティー・ゴンヂ（T．gondii）に特異的なヒトＴ細胞クローンが得られており、そのうちの１つであるＴ細胞クローン３２（ＴＣＣ３２）と称されるものを用いて５４kＤaの抗原（Ｔg３４としても公知である）が同定された。該５４ＫＤ抗原の同定は重要な進歩を示すが、依然として、天然の経路に可能な限り近い方法でこの抗原を免疫系に提示することが必要とされている。１つの態様において、本発明は該５４ＫＤ抗原についての発現系に関する。もう１つの態様においては、本発明は、ＴＣＣ３２により認識される該５４ＫＤ抗原上のエピトープの同定、およびこのエピトープに対応するポリペプチドの合成に関する。もう１つの態様においては、本発明は、上記エピトープを取り込んだ化学コンジュゲートまたは融合組換えタンパク質に関する。Ｔリンパ球は細胞内病原体に対する防御免疫応答において主要な役割を果たしているため、Ｔ細胞受容体により認識されるタンパク質の領域を同定するためにかなりの労力が注がれている。合成ワクチンを設計するためのアプローチには、免疫優性Ｔ細胞エピトープを含有するペプチドの適切な選択および生産を必要とする。一次配列からかかる抗原セグメントを予想するために幾つかのモデルが工夫されている。本発明をするために、本発明者らは、ヒトＴ細胞クローン３２により認識されるエピトープを含有するトキソプラズマ・ゴンヂ（Toxoplasma gondii）⁽⁷⁾のクローン化Ｔg３４タンパク質の領域を決定するために３個の予想モデルを適用した。以下、詳細に説明するように（実施例１参照）、上記エピトープはＷＯ９２／１１３６６に記載されているティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原のアミノ酸１９７〜２１６に対応することが判明した。したがって、第１の態様において、本発明はティー・ゴンヂ（T．gondii）５４ＫＤ抗原の残基１９７〜２１６に対応するポリペプチド(「Ｔ細胞エピトープ」) を提供する。これと関連する態様において、本発明は、アミノ酸配列TDPGDVVIEELFNRIPETSV （ここで、文字はアミノ酸の標準的な略語を表す）を有するポリペプチドを提供する。これはティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原中のアミノ酸１９７〜２１６の配列に対応する（ＷＯ９２／１１３６６参照）。好ましくは、該ポリペプチドは精製形態、好ましくは６０％以上の純度、より好ましくは７５％以上の純度であること、また９０％以上、例えば９５〜１００％以上の純度であることが有利である。好ましい態様においては、該ポリペプチド（Ｔ細胞エピトープ）は実質的に純粋形態である。該ポリペプチドは通常の技術、例えばメリフィールド固相法により合成してもよい。本発明者らにより同定されたエピトープは、ティー・ゴンヂ（T．gondii）感染症に対する免疫を付与し得る免疫原性分子を形成し得る。１つの態様においては、かかる分子はエピトープを免疫系に正しい方法で「提示」する化学コンジュゲートであってもよい。したがって、別の態様において、本発明は、異種分子に化学的に結合しておりヒトまたは動物への体内投与後にティー・ゴンヂ（T．gondii）に対する抗体を形成する能力を有する本発明のポリペプチドよりなる化合物を提供する。かかる化学コンジュゲートは、よく知られた技術、例えばカーレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー(Current Protocols in Immunology)(１９９１；ワイリー・インターサイエンシーズ(Wiley Intersciences)、ニューヨーク)により形成させてもよい。もう１つの態様においては、組換えＤＮＡ技術により、本明細書中に記載のＴ細胞エピトープを取り込んだハイブリッド分子を形成させることが可能である。文献（マーチノー（Martineau）ら(1991)、バイオ／テクノロジー（Bio/Technol ogy）9，170-179；ルトガーズ(Rutgers)ら(1988)、バイオ／テクノロジー（Bio/ Technology）6，1065-1070参照）に既に記載されているのと類似した技術を用いて、ティー・ゴンヂ（T．gondii）エピトープを免疫系に有効に提示するように粒子状でかかる分子を発現させてもよい。したがって、本発明は、異種抗原と融合した本発明のポリペプチドよりなり、適当な宿主中での発現に際して粒子を形成する能力を有する組換えタンパク質をも提供する。好ましくは、該宿主は酵母、特にサッカロミセス・セリビサエ(Saccharomyces cerivisae)である。特に好ましい態様においては、該異種抗原はＢ型肝炎表面抗原由来である。Ｂ型肝炎表面抗原は、所望によりプレＳ配列が存在する２２６個のアミノ酸のＳタンパク質を意味する（Ｂ型肝炎表面抗原の性質についての議論は、ガネム, ディー（Ganem,Ｄ）およびバルムス,エイチ・イー(Varmus,H.E.)(1987)Ann Rev.B iochem,55,651-693）。本発明の個々の具体例において、開始メチオニンから続く配列TDPGDVVIEELFNR IPETSV、ＨＢsＡgのプレＳ２領域からの１３個のアミノ酸および主ＨＢsＡgコーディング領域(Ｓタンパク質)からの２２６個のアミノ酸よりなる組換えタンパク質が提供される。また、医薬上許容される担体と混合された免疫学的に有効量の本発明のいずれかの化合物よりなるワクチン組成物が提供される。「免疫防御」なる語は、疾患を防ぐまたは軽減し該疾患の伝播を阻止または遅延させるようにティー・ゴンヂ（T．gondii）攻撃に対する免疫応答を誘導するのに必要な量を意味する。ワクチン製造は、一般に、ニュー・トレンズ・アンド・デベロプメンツ・イン・ワクチンズ(New Trends and Developments invaccines)，ボラー（Voller）ら (編)、ユニバーシティー・パーク・プレス（University park Press），メリーランド州ボルチモア，１９７８に記載されている。各ワクチン用量中に存在する本発明のタンパク質の量は、典型的なワクチン中で有意な不利な副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。かかる量は、どの特異的免疫原を用いるかおよび該ワクチンがアジュバント化されているか否かに応じて変化する。一般に、各用量は１〜１０００μg、好ましくは１〜２００μgのタンパク質よりなると予想される。個々のワクチンについての最適量は、対象における抗体力価および他の応答の観察を含む標準的研究により確認することができる。好ましくは、最初のワクチン化の後、対象は約４週間後にブーストを受け、ついで感染の危険が存在する間６カ月毎に反復ブーストを受ける。また、本発明は、ティー・ゴンヂ（T．gondii）感染症を予防する必要のあるヒトまたは動物に免疫学的に有効量の本発明のワクチン組成物を投与することによるヒトまたは動物におけるティー・ゴンヂ（T．gondii）感染症を予防する方法を提供する。以下の実施例でさらに記載するとおり、本発明者らは驚くべきことに、ＷＯ９２／１１３６６中に記載されていない宿主中で本明細書に記載のとおりティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープを発現させることが有利であることを見いだした。個々の宿主としては、ワクシニアウイルスおよびエム・ボビス（M.bovis）−ＢＣＧなどが挙げられる。これらは生ワクチン化ベヒクルであるという利点を有する。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いるのが有利であるかもしれない。これらは安定な形質転換体を与えるという利点を有する。したがって、さらに別の態様において、本発明は、ティー・ゴンヂ(T．gondii )の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープ（アミノ酸１９７〜２１６）をワクシニアウイルスまたはエム・ボビス（M.bovis）−ＢＣＧよりなる宿主細胞から発現させ、ついで該生成物を通常の技術により精製することによる、ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープ（アミノ酸１９７〜２１６）の製造法を提供する。貫膜ドメインを除くために、生成された抗原を処理してもよい。これは、該タンパク質が培養上清中に分泌されるという利点を有する。完全長タンパク質または切形誘導体を酵母中で生成させてもよい。典型的には、貫膜ドメインの除去には、残基４６４〜４８５の大部分の除去が含まれる。関連する態様において、本発明は、ワクシニア感染細胞、またはティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープ（アミノ酸１９７〜２１６）の５４ＫＤ抗原をコードするＤＮＡよりなるベクターでトランスフェクションまたは形質転換されたエム・ボビス（M.bovis）−ＢＣＧ宿主細胞を提供する。下記の、この目的のための個々のベクターも本発明の一部を形成する。以下、実施例および図面（以下に説明する）により本発明を例示説明する。実施例のあとに参考文献を掲げる。実施例１：ヒトＴ細胞クローン３２により認識されるＴg３４エピトープの同定両親媒性ヘリックスモデルと称されるベルゾフスキー（Berzofsky）ら⁽¹⁾の方法は、ヘルパーＴ細胞抗原性とα−ヘリックス両親媒性との間に認められる深い相互関係に基づく。このモデルでは、抗原性部位は極性が優勢な一つの面（これはＴ細胞受容体により認識される）および無極性が優勢な反対面（提示細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩまたはクラスII分子に結合している）とらせん状になっていると仮定される。ロスバードら⁽²⁾の方法は、大部分のヘルパーおよび細胞障害性決定基が、荷電残基またはグリシン（このあと２個または３個の疎水性残基が続き、極性残基またはグリシンで終了する）よりなる直線形態を含有するという観察に基づく。自己ペプチド性モデル（self peptidic model）と称されるコウリルスキーら⁽ ³⁾ の方法は、得られる配列データバンクから評価される、希有テトラペプチドのクラスターから構成されるＴ免疫原性ペプチドの統計学的に有意な傾向に基づく。方法および結果１．Ｔ細胞エピトープの予想ベルゾフスキーのアルゴリズムは、本発明者らのコンピューターに適応性のあるいくらかの変化によりスパウジ（Spouge）ら⁽¹⁾の刊行物から再構成された。該プログラムの一般的体系は、まず、該アミノ酸配列を疎水性価（hydrophobici ty value）の配列に変換する。第２に、疎水性配列を重なり部分（７〜１１残基長）に分割する。第３に、各部分において、規則的な両親媒性ヘリックス構造と一致した疎水性の周期性を調べる。第４に、安定な両親媒性ヘリックス断片と不安定な両親媒性ヘリックス断片を識別する。実際は、もとのプログラムにより、それぞれ７〜１１残基の窓を選ぶことにより分析を行える可能性が示された。本発明者らは、両窓を連続使用し、両窓により予想される領域を、唯一の窓により予想される領域から、および１１残基の窓により予想されるが低い両親媒性得点を有する領域から識別するために異なる記号を用いることにより一次配列に基づいて一列に並んだ両親媒性断片を表す可能性を加えた。ロスバードのアルゴリズムは、提案されている形態を構成する４組のアミノ酸が定義されている上記（２）の刊行物から推定された。本発明者らは該モチーフを含有する公知エピトープを報告する表中に、４残基または５残基のいずれかのモチーフの最終位にTyrが存在し得ることを観察したため、極性残基を含有する第４の組にチロシンを加えた。コウリルスキーのアルゴリズムを実行するために、本発明者らはまず、すべての免疫系関連多形タンパク質配列が除外されている（すなわち免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ分子）ヒト配列のみを含有するタンパク質配列データバンクSWISSPROTのサブセットを作った。第２の段階で、ヒト種の体細胞自己カタログを表すこのデータバンクサブセットを４個の残基の窓を通して読み取り、４次元マトリックスを用いてすべての可能なテトラペプチド配列についての出現数を記録した。最後に、タンパク質配列をこのプログラムにサブミットすることにより、この配列中に見いだされる各テトラペプチドに、該マトリックスにより報告される対応する値を与えた。しかしながら、定められたタンパク質の異なる領域が各モデルにより選択されるかもしれないため、本発明者らは関心のある一次配列のもとで、各予想法から得られた一連の結果を実行するプログラムを書いた。このアプローチは、Ｔ細胞決定基の同定の可能性を増加させ、異なるアルゴリズムにより適合して予想されるそれらの抗原断片に焦点を合わせるのに用いられている。上記のすべてのコンピュータープログラムは、有力な科学プログラム言語であるフォートラン（FORTRAN）で書かれている。Ｔg３４タンパク質の一次配列を３個のプログラムのこの組にサブミットし、得られた分析に基づき、本発明者らは１０個の予想断片のうちの３個のペプチドを化学合成することを選択した。 - 断片１９７〜２１６は、７個の残基の窓について２３.９および１１個の残基の窓について２８.９の両親媒性得点を有する両方の窓により予想される両親媒性α−ヘリックスを含有する。また、それはロスバードの２個の隣接モチーフ（下線部）を含有し、第一のものは五量体、第二のものは四量体である。 - 断片３０３〜４１０は、８.６および４.３の両親媒性得点を有する１１個の残基の窓により予想される２個の重複した予想両親媒性α−ヘリックスを含有する。また、それはロスバードの２個の非隣接モチーフ（下線部）、およびテトラペプチドの自己ペプチドヒト組においてゼロ発生の３個の連続テトラペプチドを含有する。 - 断片５０１〜５２４は、７個の残基の窓について４７.４、１１個の残基の窓について５４.７の両親媒性得点を有する両方の窓により予想される両親媒性α −ヘリックスを含有する。また、それはロスバードの３個のモチーフ（下線部）をも含有し、それらの２個は隣接していて、第一のものは五量体であり第二のものは四量体である。さらに、この断片のアミノ末端部は、ヒトサブセットデータバンク中の低出現値のテトラペプチドを与える。２．ペプチドおよびコンジュゲートの合成完全自動ペプチド合成装置（ＡＢＩモデル４３０Ａ、カルフォルニア州フォスターシティー（Foster City））を用いてメリフィールド固相法⁽⁴⁾により、tert −ブチルオキシカルボニル／トリフルオロ酢酸（tBoc/TFA）戦略に従いペプチドを合成した。該tBoc-N-a保護アミノ酸を、tBoc-Ala-OCH₂-フェニルアセトアミドメチル（Pam）樹脂、tBoc-VAl-OCH₂-Pam樹脂およびtBoc-トシル-Arg-OCH₂-Pam樹脂に順次カップリングさせた。三官能基性アミノ酸を以下のとおり保護した：Ar g(トシル),AspおよびGlu(ベンジルエステル),SerおよびThr(ベンジルエーテル), Lys(2-クロロベンジルオキシカルボニル),Tyr(ジ-クロロ-ベンジル),Trp(ホルミル),Cys(メチルベンジル)およびHis(ジニトロフェニル)。合成の終了時に、開裂および脱保護（「低−高(low-high)」フッ化水素法による）の前にチオーリシスによりHis残基の保護基を除去した。粗製ペプチドをＴＳＫＨＷ４０s(メルク(Me rck)、ニュージャージー州ラーウェイ(Rahway))上のゲル濾過およびヌクレオジル(Nucleosil)Ｃ₁₈上の逆相ＨＰＬＣにより精製した。ついで、バイダック(Vyda C)Ｃ₁₈上のＲＰ−ＨＰＬＣおよび薄層クロマトグラフィーにより等質性について、および完全酸加水分解後にアミノ酸分析により同一性についてペプチドを調べた。ペプチド１９７〜２１６、３９３〜４１０および５０１〜５２４は、それぞれ、ジメチルスベルイミダート、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミドおよびグルタルアルデヒド⁽⁵⁾によりウシ血清アルブミン(ＢＳＡ )に共有結合している。いずれかのカップリングしていないペプチドを除くために透析した後、ペプチド／担体の割合を決定するために該コンジュゲートを特徴づけした。バイオ−ラッド・プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Protein Assay)によりタンパク質の量を評価した。ペプチド合成の間、本発明者らは、該精製コンジュゲートの全放射活性を測定することにより結合ペプチドの数を決定するために、³Ｈ−標識Boc-Leu(ドュポン(Dupont)、ＮＥＮリサーチ・プロダクツ(Resear ch Products)、マサチューセッツ州ボストン)を使用した。３．Ｔ細胞増殖検定記載のとおり⁽⁶⁾、同種異系の照射ＰＢＭＣ、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ) および組換えＩＬ−２の存在下、２〜３週間毎に刺激することにより、ヒトＴ細胞クローン３２を培養中に維持した。増殖検定のために、抗原提示細胞⁽⁶⁾としてのオートロガスＢリンパ芽球細胞系の凍結保存細胞の存在下、適当な濃度の抗原と共にＴ細胞をインキュベートした。３日後、既に記載されている⁽⁶⁾とおりに[³Ｈ]チミジン取り込みにより増殖を評価した。図１は、３個のペプチドで得られたＴ細胞クローン３２の用量−反応曲線を示す。それに示されるとおり、残基１９７〜２１６に対応するペプチドにより有意な増殖が検出され、１０^-2〜３×１０^-2μg／mlの最大反応が得られた。他の２個のペプチドでは全く反応が観察されなかった。画分Ｆ３またはＴg３４溶原菌( 陽性対照)の抽出物の存在下にて有意な増殖が観察され、野生ラムダgt１１溶原菌(陰性対照)の抽出物では有意な増殖が全く観察されなかった。また、該増殖検定において該コンジュゲートも試験した。本発明者らは、ペプチド１９７〜２１６のみに対応するコンジュゲートの存在下にて反応を観察した（データは示していない）。Ｔg３４タンパク質のアミノ酸配列１９７〜２１６はＴ細胞クローン３２により認識されるエピトープを含有すると結論づけることができる。実施例２完全またはＴ細胞エピトープ(アミノ酸(aa)197-216)に制限された５４kＤa抗原(Ｔg３４)を保持する組換えベクターの構築Ａ．ワクシニアウイルスへの転移のためのベクターの構築５４kＤa抗原(pNIV3401)をコードする±１８００塩基対のEcoRI ＤＮＡ断片を保持するpブルースクリプト(pBluscript)ＫＳ⁺ベクターがＷＯ９２／１１３６６の実施例５に記載されている。そこから、抗原についてのコーディング配列のほとんどを包囲する１５５６塩基対のＮheＩ-ＮcoＩＤＮＡ断片を回収し、Ｔg３４ＤＮＡ配列の５'末端をコードする５９塩基対のＢglＩＩ-ＮheＩ合成二本鎖オリゴヌクレオチド(ＯＬ１)(図２Ａ)と共に、多目的クローニングビークルpＪＲＤ１８４(ヒュータースプリュート(Heuterspreute)ら、ジーン（Gene）59,299-304、1980)のＢglＩＩ-ＮcoＩ部位に連結した。ついで、得られた中間構築物をＥcoＲＶおよびＮcoＩで切断して、ＥcoＲＶ(５'-末端)およびＮcoI(３'-末端)に隣接しＴg３４ＤＮＡ配列の３' −末端をコードする第二の３３塩基対の合成二本鎖オリゴヌクレオチド(ＯＬ２) (図２Ａ)を挿入した。したがって、最終構築物pＮＩＶ３４０４は、５'開始共通配列(コザック，エム(Kozak，M)，Cell 44，283-292，1986)、ＡＴＧ開始コドンおよび停止コドン(図２Ｂ)を含む５４kＤa抗原についてのコーディング配列を保持する。ついで、最終的にワクシニア転移プラスミドpＵＬＢ５２１３(標準的ワクシニアベクターpＳＣ１１の誘導体；チャクラバチ(Chakrabati)ら，Mol.Cell.Biolog y 5,3404-3409,1985)中にクローニングされる５４kＤa抗原をコードする１６４８塩基対のＤＮＡモジュルを回収するために、ＢglIIおよびＥcoＲＶでpＮＩＶ３４０４を切断した。得られたプラスミドpＮＩＶ３４０２を図２Ｃに示す。それはＰ_7.5ワクシニアプロモーターの制御下、Ｔg３４抗原についての配列を保持する。Ｂ．マイコバクテリウムボビス−ＢＣＧ中への発現のための転移プラスミドの構築１．出発物質の調製ａ）プラスミドpＮＩＶ２２２９ pＲＩＢ１０００(ソール(Thole)ら、Infection and Immunity 50，800-806，1 985)から７６３塩基対のＭluＩ-ＢamＨＩ断片を単離した。それは、Ｐ６４(ＨＳＰ６０)マイコバクテリウムの抗原の推定プロモーターを含有する。それをpＵＣ１９プラスミドのＨincＩＩ部位中にクローニングしてpＮＩＶ２２２９を得た。ｂ）プラスミドpＮＩＶ３４０３ pＵＣ１９のＢamＨＩ部位とＨincＩＩ部位との間にpＮＩＶ３４０４からＴg３４の完全コーディング配列を１６００塩基対のＢglＩＩ−ＥcoＲＶ断片として転移させてpＮＩＶ３４０３を得た。２．pＮＩＶ３４０６の構築ＰstＩ−ＭscＩＤＮＡ断片をpＮＩＶ２２２９から単離した。それは翻訳開始ＡＴＧの後の最初の塩基(Ｂ)までのＰ６４プロモーターを含有する。それをpＮＩＶ３４０３のＥcoＲＩ部位とＮheＩ部位との間で、Ｔg３４の最初のアミノ酸をコードする合成ＤＮＡアダプター(NATBCG1/NATBCG2，図３Ａ)と連結した。ついで、Ｔn９０３(ファルマシア(Pharmacia))からのＫan^R遺伝子を含有する１３００塩基対のＤＮＡを、得られたプラスミド(pＮＩＶ３４０５)の唯一のＰstＩ部位に挿入してpＮＩＶ３４０６を得た。以下の図面（図３Ｂ）にこの構築物を記載する。３．pＮＩＶ３４０７の構築テンペレートマイコバクテリオファージＦＲＡＴ１（本発明者らの研究室で以前単離されたもの、ハエセレー(Haeseleer)、チム(Timm)およびジャコブス(Jaco bs)，1989，Acta Leprologica 7（前掲１）252-253)由来の１５００塩基対の平滑化ＢamＨＩ断片のpＮＩＶ３４０６の唯一のＳmaＩ部位に挿入することにより、プラスミドpＮＩＶ３４０７が得られる。Ｃ．Ｔg３４Ｔ細胞エピトープ(aa１９７〜２１６)とＢ型肝炎ウイルス(ＨＳＶ )のプレＳ２−Ｓ抗原との融合により得られる粒子としての酵母中で発現させるためのベクターの構築Ｔg３４Ｔ細胞エピトープの免疫系に対する提示のための担体としてＨＢsＡg 粒子を使用するために、Ｔg３４Ｔ細胞エピトープ(aa１９６〜２１６)をコードする配列をプレＳ２遺伝子(aa１３５〜１４５)をコードするＤＮＡの上流およびＨＢＶのＳタンパク質についての完全配列(aa１７５〜４００)と融合させた（図４Ａ）。プレＳ２タンパク質のアミノ酸残基１３３〜１４５およびＨＢＶのＳタンパク質のアミノ酸残基１７５〜４００に対応する７２２塩基対のＤＮＡ断片を回収するために、プラスミドＴＣＲ５０(pＲＩＴ１３２２０)をＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消化した(カベゾン(Cabezon)ら、Vaccines 90，199-203，1990)。Ｔg ３４Ｔ細胞エピトープについての配列（aa１９６〜２１６）をコードするＤＮＡ配列を再構築し、上記で得られた断片とＮcoＩおよびＥcoＲＩにより切断されたプラスミドＦＦ６（pＲＩＴ１３７１７）との間の結合を与えるために、合成オリゴヌクレオチド(６４マー)を使用した。該pＲＩＴ１３７１７ベクターは、ＡＲＧ３転写ターミネーターを保持する酵母ＤＮＡ断片に続く酵母グリセルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーター断片を含有する（図４Ｂ）。該２９８０塩基対の発現カセットをＢglＩＩ−ＳalＩ断片として切り出し、酵母シャトルベクターＯＪ１０（pＲＩＴ１２７４１）に挿入してpＮＩＶ３４０９を得た（図４Ｃ）。該pＲＩＴ１２７４１ベクターは酵母２−ミクロンＤＮＡおよび酵母における選択マーカーとしての酵母ＬＥＵ２よりなる（ハーフォードら、Postgrad．Med．J．63，65-70，1987）。pＮＩＶ３４０９に挿入されているカセットは２６０個のアミノ酸のタンパク質を発現すると予想される。該ハイブリッドタンパク質は、開始メチオニンから始まるＴg３４Ｔ−細胞エピトープの２０個のアミノ酸、プレＳ２領域からの１３個のアミノ酸および主ＨＢsＡgコーディング領域からの２２６個のアミノ酸よりなる。Ｄ．ＣＨＯ細胞における発現のためのベクター構築 a）５４ＫＤa抗原プラスミドpＮＩＶ３４０４（実施例２Ａ参照）から始め、消化により１６４８塩基対のＨindＩＩＩ−ＥcoＲＶＤＮＡ断片を回収し、ＨindＩＩＩおよびＳm aＩで切断されたpＥＥ１４（コケット(Cockett)ら、1990，Bio/Technology，8， 662-667）由来のpＲＩＴ１４０７３真核発現ベクターに挿入した。得られた発現プラスミドpＮＩＶ３４１２（図５）は、ヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ− ＭＩＥ）の主要即時型プロモーターの制御下、実施例２Ａに記載されている５４ＫＤaの抗原をコードする配列を含有する。 b）切形５４ＫＤa抗原５４ＫＤa抗原のアミノ酸配列は、残基４６４〜４８５に及ぶ推定膜−足場ドメインを含有し、これは宿主細胞による組換えタンパク質の分泌を抑制するかもしれない。本発明者らは、残基４６４〜４８５に対応する配列が欠失している切形型の５４ＫＤa抗原をコードするＤＮＡを構築した。その構築は以下のとおり行った。１３５６塩基対のＨindＩＩＩ−ＳfcＩＤＮＡ断片をプラスミドpＮＩＶ３４０２（実施例２Ａ参照）から回収し、４９塩基対のＳfcＩ−ＳmaＩ合成ＤＮＡ断片（図６ａ）と共に、ＨindＩＩＩおよびＳmaＩで切断されたpＲＩＴ１４０７３発現ベクターに導入して即時構築物を得た。ついでこの構築物をＳmaＩで消化して、ポリメラーゼ連鎖反応（プライマー１および２、鋳型としてのpＮＩＶ３４０２のＤＮＡ、図６b）により得た１５１塩基対のＨpaＩ−ＥcoＲＩＤＮＡ断片をこの部位に、連結させることにより収容した。最終構築物pＮＩＶ３４１４は、hＣＭＶプロモーターの制御下、残基４６４〜４８５を欠く切形型の５４ＫＤaの抗原をコードする（図６ｃ）。実施例３宿主細胞における完全なまたはＴ細胞エピトープ（aa１９７〜２１６）に制限された５４kＤa抗原の発現Ａ．ワクシニアウイルス組換え体を経由する真核細胞における発現組換え転移プラスミドpＮＩＶ３４０２をワクシニア−感染ＣＶ−１細胞にトランスフェクションし、ブロモ−ウリジン選択およびＸ−ガルの存在下の青色に基づくプラーク精製の後、組換えウイルスを単離した。それらはＶＶ３４０２と称される。プラーク検定にはヒトＨ１４３繊維芽細胞ＴＫ株を使用するのが好ましい。細胞に感染させるのに使用したワクシニアウイルスはＷＲ型のもの（起源：ボリシーウィクズ（Borysiewicz）、英国）であった。その操作はワクシニアウイルス組換え体の取得について既に記載されている方法（マケットエム（Mac kett M）およびスミスジー・エル（Smith G.L.）,J．Gen．Virology 67，2067- 2082，1986；マケットエム（Mackett M）、スミスジー・エル（Smith G.L.）およびモスビー（Moss B.）、J．Virology 49，857-864，1984）に従った。組換えワクシニアウイルスＶＶ３４０２を使用して、感染多重度１の培養中でＣＶ−１細胞に感染させた。感染の１８〜４８時間後、感染細胞（約３.１０⁵／検定）および消費培地（約２ml）を集めた。１２％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に移し、イムノディテクションに付した後に、５４kＤa抗原の存在を確認した。これらの手法の詳細はＷＯ９２／１１３６６に記載されている。Ｂ．エムボビス（Ｍ．bovis）−ＢＣＧにおける発現プラスミドpＮＩＶ３４０６およびpＮＩＶ３４０７をエムボビス（Ｍ．bovis ） −ＢＣＧ中にエレクトロポレーションした。その第一のプラスミドはその直線形態として使用し（ＳcaＩ消化を介する）、第二のプラスミドは環状分子として使用した。ＷＯ９２／１１３６６のサブタイトルＡ１３およびＡ１５に記載されているイムノディテクション法で発現させるために、形質転換操作から回収したエムボビス（Ｍ．bovis）−ＢＣＧ組換え体を分析した。Ｃ．酵母における発現１．プラスミドpＮＩＶ３４０９を使用して、エス・セレビシアエ（S．cerevi siae）株ＤＣ５（his３−５、leu２−３、leu２−１１２、can１−１１cir°、ハーフォード（Harford）およびピーターズ（Peeters）、Curr．Genet．11：315 -319，1987）をLeu⁺表現型に形質転換した。該形質転換体をＹ４２０と命名した。それらのうちの１つを２％グルコースを炭素源とする４０mlの酵母窒素基礎最小培地中で中指数的成長相まで増殖させた。細胞を洗浄し、遠心分離により収集し、３００mlのトリス−ＨＣl ２５mＭ pＨ８、４mＭＥＤＴＡ、１％ツイーン（Tween）２０、４mＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０％プロパノール−２中でガラスビーズで粉砕した。該ホモジネートを３０,０００×gで３０分間遠心分離して粗製抽出物を得た。上清（全タンパク質の±５０μg）を１２.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ついで、分離されたタンパク質をニトロセルロース（タウビン（Towbin）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 7 6：4350-4354，1979）上にブロッティングし、ＨＢsＡg（mＡb ＨＢＳ１、スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham））またはプレＳ２領域（mＡb Ｓ２.５、スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham））に対して向けられたモノクローナル抗体と共に該シートをインキュベートした。一次抗体の検出はアルカリホスファターゼ法により行った。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗ＩgＧ第二抗体をＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）およびＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート）により検出した。陰性対照（Ｙ１０１７）中に存在しない約２８kＤaのタンパク質がmＡbのＨＢＳＩおよびＳ２.５と共に出現した。これらの結果から、酵母株Ｙ４２０は、開始メチオニンから始まるＴg３４Ｔ細胞エピトープの２０個のアミノ酸、プレＳ２領域からのアミノ酸１３３〜１４５および主ＨＢsＡgコーディング領域からの２２６個のアミノ酸よりなる分子量２８kＤaの融合タンパク質を発現する。２）粒子の形成選択培地（８００ml＋８０μg／mlヒスチジン）中で後期対数期まで株Ｙ４２０を増殖させた。遠心分離で細胞を集め、冷ＰＢＳで洗浄し、５mlの５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ８.１）、４mＭＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸および二ナトリウム塩）、１％ツイーン（Tween）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、４mＭＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）および１０％イソプロパノール中に再懸濁した。フレンチプレッシャーセルに２０,０００psiで２度通過させることにより細胞を分離した。該懸濁液を３０,０００×gで３０分間遠心分離した。上清液の全タンパク質濃度をブラッドフォード色素-結合法(Bradford dye-binding procedure)(ブラッドフォード，エム(Bradford M.)(１９７６)Anal．Biochem．72，248)に基づくバイオ−ラッドプロテインアッセイ(Bio-Rad protein assay)(n°５００−０００１)により測定した。ベーリングヴェルケ(Behringwerke)（ドイツマールブルグ(Marburg)）より商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（エンザイグノスト−ＨＢsＡgミクロ (Enzygnost-HBsAg micro)）を使用してＨＢsＡgの存在を検定した。粗製細胞抽出物の７mlを、ベックマン（Beckman）６０Ｔiローター中、１.５ＭＣsＣl、２５mＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７.４）中、４０,０００×gで６８時間、平衡になるまで遠心分離した。集めた画分を上記のＥＬＩＳＡ法によりＨＢsＡgの存在について検定した。ＨＢsＡgは１.２２g／cm³まで平衡化することが判明した。勾配画分のイムノブロット分析によりＥＬＩＳＡの結果が確認された（図７Ａ）。ＰＢＳに対して透析したＣsＣl最大画分からの０.５mlの物質を、ＳＷ４０ローター中、３８,０００gで１３時間、速度ショ糖勾配に付した。ＥＬＩＳＡ(エンザイグノスト−ＨＢsＡgミクロ(Enzygnost-HBsAg micro))およびmＡb ＨＢＳ１でのイムノブロットにより、それぞれ、ＨＢsＡg抗原性およびハイブリッドタンパク質の存在について各画分を分析した（図７Ｂ）。結果は、ハイブリッドタンパク質がリポタンパク質粒子に集合することを示した。Ｃ．酵母中の発現３）プラスミドpＮＩＶ３４１７、pＮＩＶ３４２１およびpＮＩＶ３４２３を用いてエス・セレビシエ(S．cerevisiae)株ＤＣ５をLeu⁺表現型に形質転換した。該形質転換体をそれぞれＹＮ４７９、ＹＮ４７８およびＹＮ４８１と命名した。培養および粗製抽出物の分析を上記のとおり行った。培地中のタンパク質をＴＣＡ（トリクロロ酢酸）により沈殿させた。Ｄ．ＣＨＯ細胞（安定形質転換体）中での発現ａ）５４kＤa抗原１.２５×１０⁶細胞につき２０μgのＤＮＡを使用して、プラスミドpＮＩＶ３４１２をリン酸カルシウム共沈殿によりＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクションした。該ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＧＭＥＭ−Ｓ培地（ギブコ(Gibco)）中で増殖させた。トランスフェクションの２日後、２５μＭメチオニンスルホキシミンを加えることによりトランスフェクタントを選択した。１０〜１４日後、耐性コロニーを拾い上げ、９６ウェルの平板、ついで２４ウェルの平板、ついで８０cm² フラスコへ移した。細胞が約８０％密集に達した時に５４ＫＤa抗原についてＧＳトランスフェクタントを検定した。コケット（Cockett）ら、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）8，662-667(1990)に記載されている方法に従った。ｂ）切形５４ＫＤa抗原切形５４ＫＤa抗原の発現の方法は上記の方法に従った。Ｅ．酵母における５４ＫＤ抗原の発現のためのベクター構築 pＮＩＶ３４０２から１６４８塩基対ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩＤＮＡ断片を回収し、発現ベクターpＲＩＴ１３１４５（ＴＣＭ９７）の平滑末端にされたＢam ＨＩ部位に、発現のために正しい配向で平滑末端で導入した（図７）。得られたプラスミドpＮＩＶ３４１７は、ＡＲＧ３プロモーターの制御下、実施例２Ａに記載の５４ＫＤ抗原をコードする配列を含有する。酵母エス・セレビシエ(S．cerevisiae)からのそれ自身のシグナル配列による異種タンパク質の分泌が、いくつかの場合（すべての場合というわけではない）に観察された。しかし、酵母分泌タンパク質のシグナル配列を外来タンパク質のコーディング領域に融合することにより、その分泌は最もよく達成された（ロマノス（Romanos）ら（１９９２）Yeast 8：423-488）。酵母フェロモンＭＦα−１のシグナル配列はこの点で特に生産的であることを証明した（ブレイク(Brake)( １９８９)、Yeast Genetic Engineering 269-280参照）。このようにして、本発明者らは、Ｔg５４のアミノ酸残基２８〜５３８へ続くＭＦα−１のシグナル配列をコードするＤＮＡを構築した。該構築は以下のとおり行った。プラスミドpＮＩＶ３４０２をＲsalおよびSal１で消化して４７０塩基対のＤＮＡ断片を回収した。ＭＦα−１（１９アミノ酸）のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を再構成し上記で得られた断片とＨindＩＩＩ−Ｓal１により切断されたプラスミドpＵＣ１９との間の結合を付与するために、合成オリゴヌクレオチド（６５マー）を使用した（図８a）。ついで、pＮＩＶ３４０２からのＳall−ＢglＩＩＤＮＡ断片を挿入するために、得られた中間構築物をＳall およびＢamＨＩで切断してpＮＩＶ３４１６を得た（図８b）。これをＨindＩＩＩおよびＥcoＲＩにより切断して１６２６塩基対のＤＮＡ断片を回収し、平滑末端化し、pＲＩＴ１３１４５（ＴＣＭ９７）の平滑末端化ＢamＨＩ部位に導入した。したがって、最終構築物pＮＩＶ３４２１は、ＡＲＧ３プロモーターの制御下、５４ＫＤ抗原の残基２８〜５３８に融合したＭＦα−１のシグナル配列をコードする（図８c）。５４ＫＤ抗原の推定膜−足場ドメイン（残基４６４〜４８５）は組換えタンパク質の分泌を抑制するため、本発明者らは、Ｔg５４抗原の残基４６４〜４８５に対応する配列が欠失している切形型のＭＦα−１−Ｔg５４抗原をコードするＤＮＡを構築した。このようにして、pＮＩＶ３４１４からのＳal１−ＢglＩＩＤＮＡ断片を、Ｓal１およびＢamＨＩで切断されたpＮＩＶ３４１５に導入してp ＮＩＶ３４２２を得た（図９a）。ついで、得られたプラスミドをＨindＩＩＩおよびＥcoＲＩにより消化して１４００塩基対のＤＮＡ断片を回収し、平滑末端化し、pＲＩＴ１３１４５（ＴＣＭ９７）の平滑末端化されたＢamＨＩ部位に導入した。得られた発現プラスミドpＮＩＶ３４２３は、ＡＲＧ３プロモーターの制御下、５４ＫＤ抗原の残基２８〜４６５および４８６〜５３８へ続くＭＦα−１のシグナル配列をコードする配列を含有する（図９b）。参考文献１．マーガリトエイチ（Margalit H.）、スパウジジェイ・エル（Spouge J. L.）、コルネッテジェイ・エル（Cornette J.L.）、シースケイ・ビー（Cease K.B.）、デリシシー（Delisi C.）およびベルゾフスキージェイ・エイ（Ber zofsky J.A.）（1987）一次配列からの免疫優性ヘルパーＴ細胞抗原性部位の予想（Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence）J．Immunol．138，pp 2213-2229．２．ロースバードジェイ・ビー（Rothbard J.B.）およびテイラーダブリュー・アール（Taylor W.R.）（1988）Ｔ細胞エピトープに共通な配列パターン(As equence pattern common to T cell epitopes)EMBO J.，7，pp 93-100．３．クラベリージェイ・エム（Claverie J-M.）、コウリルスキーピー（Kou rilsky P.）、ラングレイド−デモイエンピー（Langlade-Demoyen P.）、チャルフォー−プロチニカエイ（Chalufour-Prochinicka A.）、ダダグリオジー（ Dadaglio G.）、テカイアエフ（Tekaia F.）、プレイタエフ（Plata F.）およびボーグエアレットエル(Bouguerlet L.)(1988) Ｔ免疫原性ペプチドは希有配列パターンよりなる．ヒト免疫不全ウイルスgagタンパク質中のＴエピトープの同定における使用(T-immunogenic peptides are constituted of rare sequence patterns．Use in the indentification of T epitopes in the human imunode ficiency virus gag protein)Eur．J．Immunol．18，pp 1547-1553)．４．ケントエス・ビー(Kent S.B.)（1988）ペプチドおよびタンパク質の化学合成（Chemical synthesis of peptides and proteins）Annu．Rev．Biochem.， 57，pp 957-985．５．バン・レゲンモーテルエム・エイチ・ブイ（Van Regenmortel M.H.V.）、ブライアンドジェイ・ピー（Briand J.P.）、ミューラー・エス（Muller S. ）およびプローエス（Plaue S.）（1988）抗原としての合成ポリペプチド（Synt hetic polypeptides as antigens）、エルセビアー（Elsevier）編、pp 95-130． 1991）トキソプラズマ・ゴンヂに対するヒトＴ細胞クローン：インターフェロン −ガンマ、インターロイキン２の産生および株交差反応性(Human T-cell clones against Toxoplasma gondii：production of interferon-gamma，interleukin 2,and strain cross-reactivity)Parasitol．Res.，77，379-385．７．サーベドラアール(Saarvedra R.)、デ・モーターエフ(De Meuter F.)、トＴ細胞クローンは、イー・コリ中でクローニングされ発現されたトキソプラズマ・ゴンヂの潜在的に保護的な５４キロダルトンのタンパク質抗原を同定する（ Human T-cell clone identifies a potentially protective 54-kilodalton pro tein antigen of Toxoplasma gondii cloned and expressed in E．coli.）J.Im munol．147，1975-1982(1991)．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 8828−4ＢＣ１２Ｎ 1/19 5/10 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ボラン，アレックスベルギー国ベー―1440ニーベル、リュ・デュ・ランディストリ24番、セルヴィス・デュ・ジェネティク・アプリケ、ファキュルテ・デ・スィヤンス、ユニベルシテ・リブレ・デュ・ブリュッセル (72)発明者ジャコブ，ポールベルギー国ベー―1440ニーベル、リュ・デュ・ランディストリ24番、セルヴィス・デュ・ジェネティク・アプリケ、ファキュルテ・デ・スィヤンス、ユニベルシテ・リブレ・デュ・ブリュッセル

Claims

【特許請求の範囲】１．ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原の残基１９７〜２１６に対応するポリペプチド。２．配列TDPGDVVIEELFNRIPETSVを有するポリペプチド。３．実質的に精製形態である請求項１または請求項２記載のポリペプチド。４．貫膜ドメインを欠くことを特徴とするティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原に対応するポリペプチド。５．異種分子に化学結合しておりヒトまたは動物への体内投与後にティー・ゴンヂ（T．gondii）に対する抗体を形成する能力を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドよりなる化合物。６．異種抗原と融合した請求項１、２、３または４記載のポリペプチドよりなり、適当な宿主中での発現に際して粒子を形成する能力を有する組換えタンパク質。７．異種抗原がＢ型肝炎表面抗原由来である請求項６記載の組換えタンパク質。８．酵母中で発現される請求項６または請求項７記載の組換えタンパク質。９．開始メチオニンから続く請求項２記載の配列、ＨＢsＡgのプレＳ２領域からの１３個のアミノ酸および主ＨＢsＡgコーディング領域からの２２６個のアミノ酸よりなる請求項８記載の組換えタンパク質。１０．医薬上許容される担体と混合された免疫学的に有効量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物よりなるワクチン組成物。１１．ティー・ゴンヂ（T．gondii）感染症を予防する必要のあるヒトまたは動物に免疫学的に有効量の請求項１０記載のワクチン組成物を投与することによるヒトまたは動物におけるティー・ゴンヂ（T．gondii）感染を予防する方法。１２．ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープ（アミノ酸１９７〜２１６）をワクシニアウイルスまたはエム・ボビス（Ｍ．bovis）−ＢＣＧよりなる宿主細胞から発現させ、ついで該生成物を通常の技術により精製することによる、ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープ（アミノ酸１９７〜２１６）の製造法。１３．ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤ抗原またはそのＴ細胞エピトープ（アミノ酸１９７〜２１６）をコードするＤＮＡよりなるベクターでトランスフェクションまたは形質転換されたワクシニア感染細胞またはエム・ボビス（Ｍ．bovis）−ＢＣＧ宿主細胞。１４．ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤa抗原またはその切形形態をＣＨＯ宿主細胞から発現させ、ついで該生成物を通常の技術により精製することによるティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤa抗原またはその切形形態の製造法。１５．ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤa抗原またはその切形形態をコードするＤＮＡよりなるベクターでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。１６．ティー・ゴンヂ（T．gondii）の５４ＫＤa抗原またはその切形形態をコードするベクターでトランスフェクションされた酵母細胞。