JPH08512203A - ４−ヒドロキシシンナミルアルコールを生成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、4-アリルフェノールをバニリルアルコールオキシダーゼを用いて酵素的に酸化することにより4-ヒドロキシシンナミルアルコールを生成する方法に関する。好ましい基質は、それぞれ、コニフェリルアルコール及びクマリルアルコールに導くオイゲノール及びカビコールである。バニリルアルコールオキシダーゼはペニシリウム・シンプリシシマムから得られ得る。

Description

【発明の詳細な説明】 4-ヒドロキシシンナミルアルコールを生成する方法 本発明は、4-ヒドロキシシンナミルアルコール及びその類似化合物（以下では それらをまとめて4-ヒドロキシシンナミルアルコールという）を生成する酵素的 方法に関する。より特定すると、本発明は、4-アリルフェノールを4-ヒドロキシ シンナミルアルコールに変換する酵素的方法に関する。 4-ヒドロキシシンナミルアルコールは重要な中間体である。従って、3-メトキ シ-4-ヒドロキシシンナミルアルコール（コニフェリルアルコール）が、食品工 業で最も広範に用いられている芳香成分の１つであるバニリンの合成における中 間体である。同様に、4-ヒドロキシシンナミルアルコールそれ自体（クマリルア ルコール）は、風味剤工業において興味がもたれている4-ヒドロキシベンズアル デヒドに変換され得る。コニフェリルアルコールをバニリンに変換するための公 知の方法には、欧州特許公開542348号（ＥＰ-Ａ-0542348）に記載されているよ うな直接的変換又は、その他の中間体への変換、その後の、その中間体のバニリ ンへの変換が含まれる。従って、コニフェリルアルコールはコニフェリルアルデ ヒドに化学的に変換され得る。次に、コニフェリルアルデヒドは、ドイツ特許公 開3604874（ＤＥ-Ａ-3604874）に記載されているように、オースロバクター・グ ロビホルミス（Arthrobacter globiformis）変異体を用いてバニリンに変換し得 る。欧州特許公開542348に記載されているように、さらに、コニフェリルアルコ ールは、その安息香酸エステルのような適するエステルに変換され、その後に、 バニリンに変換することができる。 4-アリルフェノールは、種々の生物源から得られる。オイゲノールは、豊富に 入手できる出発原料であり、例えば、丁字の葉及び丁字のつぼみの油から得られ る。他方で、特定のコリンバクテリウム（Corynebacterium）又はシュードモナ ス（Pseudomaonas）種を用いる（例えば、ドイツ特許公開3604874に記載されて いる方法）、オイゲノールをバニリンに直接変換するための種々の微生物による 方法及び、欧州特許公開0405197に記載されている方法が知られている。しかし 、 それらの方法は、入手しがたい微生物を用い、多くの望ましくない副生物を生成 し、非常に低い収量しか得られないという欠点を有している。従って、オイゲノ ールをコニフェリルアルコールに変換するための効率の良い酵素的又は微生物に よる方法が、バニリンを得るための経済的な方法への重要なステップなのである 。 本発明者らは、種々の4-ヒドロキシシンナミルアルコールが、補欠分子団とし て共有結合されたＦＡＤを有する細胞内アリールアルコールオキシダーゼである バニリルアルコールオキシダーゼを用いて、相当する4-アリルーフェノールの酵 素的酸化により生成されることができることを見出だした。 本発明による酵素的酸化法は、下記の反応概要図により記載される： ［式中、Ｒ₁はＨ、ＯＨ又は、３以下の炭素原子を有するアルコキシ基であり、 Ｒ₂は、Ｈ又は、３以下の炭素原子を有するアルキル基である。］ 好ましくは、Ｒ₁はＨ又はＯＣＨ₃である。好ましくはＲ₂はＨである。式IIの 化合物を総括的に4-ヒドロキシシンナミルアルコールであると呼ぶように、本発 明の目的のための式Ｉの化合物を、総括的に4-アリルフェノールと呼ぶ。本方法 は、クマリルアルコール中でオイゲノールをコニフェリルアルコール及びカビコ ールに変換するために特に有用である。 ペニシリウム・シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）を、ベラト リルアルコールにおいて増殖させる場合に、細胞内で誘導される。最近、その単 離及び特徴が、Eur．J．Biochem．208巻、651乃至657頁（1992年）に記載された 。それには、バニリルアルコール及び4-ヒドロキシベンジルアルコールに制限さ れた基質特異性を有し、他の芳香族又は非芳香族アルコール又は芳香族アルデヒ ドを酸化しないことが記載されている。 酵素を含有する種々の微生物の細胞、死細胞、精製されていない無細胞抽出物 又は、Eur．J．Biochem、208巻、651乃至657頁（1992年）に記載されているよう な、細胞抽出物に１回以上の精製工程に付すことにより得られる酵素製剤を用い てその方法は行い得る。好ましくは、細胞又は無細胞抽出物又は、ベラトリルア ルコールにおけるペニシリウム・シンプリシシマムの増殖により得られる酵素製 剤が用いられる。 他の微生物を、バニリルアルコールオキシダーゼを生成することを可能にする 遺伝子操作法に付した後に、適する酵素製剤は他の微生物から得ることができる 。そのような遺伝子操作法の実施においては、ペニシリウム・シンプリシシマム における酵素についての構造の情報が用いられる。 この方法は、７乃至12のｐＨ、好ましくは８乃至11のｐＨ、より好ましくは９ 乃至11のｐＨにおける、そのような微生物的又は酵素的方法に関する通常の溶媒 中で、特に水中で実施される。その反応混合物の温度は、５乃至60℃、好ましく は15乃至45℃、より好ましくは20乃至40℃に保持される。 生細胞を用いる場合、反応混合物における4-アリルフェノール濃度は、望まし いなら流加技術又は同様の技術を用いて、生細胞に対して非毒性であるように選 ばれる。死細胞又は他の酵素製剤では、基質濃度は、好ましくは10ｍＭ未満に、 より好ましくは５ｍＭに選ばれる。反応混合物中の酸素濃度は、好ましくは非制 限（non-limiting）であるレベルで維持される。 4-ヒドロキシシンナミルアルコールは、有機溶媒での抽出によるようなその技 術分野で公知の方法で反応混合物から単離される。その反応は、適する２相系、 好ましくは、反応が起こる（反応相）水性相及び反応生成物が有機相に蓄積する ように選ばれる有機相から成る２相系で行われ得る。その代替法として、非反応 相が、反応相から反応生成物を吸収する、固体の吸収剤であり得る。 実施例 7.5ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ10.0）中の27μモルのオイゲノー ルに、１単位のバニリルアルコールオキシダーゼを添加した。その混合物を空気 で飽和に保ち、35℃で３時間インキュベーションした。その後、混合物をジクロ ロメタンで２回抽出した。その抽出物を蒸発させ、残渣中のコニフェリルアルコ ール含量をガスクロマトグラフィーで分析した。オイゲノールを定量的にコニフ ェリルアルコールに変換した。 基質としてカビコールを用いて、実施例を繰り返した。同様に、カビコールは 、クマリルアルコールに定量的に変換された。 １単位のバニリルアルコールオキシダーゼが、１μモルのバニリルアルコール を30℃でｐＨ10.0で１分間酸化するために必要な酵素の量である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年６月３０日 【補正内容】 翻訳文１頁１行乃至の２頁１行の補正 明細書 4-ヒドロキシシンナミルアルコールを生成する方法 本発明は、4-ヒドロキシシンナミルアルコール及びその類似化合物（以下では それらをまとめて4-ヒドロキシシンナミルアルコールという）を生成する酵素的 方法に関する。より特定すると、本発明は、4-アリルフェノールを4-ヒドロキシ シンナミルアルコールに変換する酵素的方法に関する。 4-ヒドロキシシンナミルアルコールは重要な中間体である。従って、3-メトキ シ-4-ヒドロキシシンナミルアルコール（コニフェリルアルコール）が、食品工 業で最も広範に用いられている芳香成分の１つであるバニリンの合成における中 間体である。同様に、4-ヒドロキシシンナミルアルコールそれ自体（クマリルア ルコール）は、風味剤工業において興味がもたれている4-ヒドロキシベンズアル デヒドに変換され得る。コニフェリルアルコールをバニリンに変換するための公 知の方法には、欧州特許公開542348号（ＥＰ-Ａ-0542348）に記載されているよ うな直接的変換又は、その他の中間体への変換、その後の、その中間体のバニリ ンへの変換が含まれる。従って、コニフェリルアルコールはコニフェリルアルデ ヒドに化学的に変換され得る。次に、コニフェリルアルデヒドは、ドイツ特許公 開3604874（ＤＥ-Ａ-3604874）に記載されているように、オースロバクター・グ ロビホルミス（Arthrobacter globiformis）変異体を用いてバニリンに変換し得 る。欧州特許公開542348に記載されているように、さらに、コニフェリルアルコ ールは、その安息香酸エステルのような適するエステルに変換され、その後に、 バニリンに変換することができる。 4-アリルフェノールは、種々の生物源から得られる。オイゲノールは、豊富に 入手できる出発原料であり、例えば、丁字の葉及び丁字のつぼみの油から得られ る。他方で、特定のコリンバクテリウム（Corynebacterium）又はシュードモナ ス（Pseudomaonas）種を用いる（例えば、ドイツ特許公開3604874に記載されて いる方法）、オイゲノールをバニリンに直接変換するための種々の微生物による 方法及び、欧州特許公開0405197に記載されている方法が知られている。 さらに、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agri cultural and Biological Chemistry）、47巻（1983年）、2639-2640頁には、細 菌が土から単離され、シュードモナス種（Pseudomonus sp.）と仮に同定され、 オイゲノールに対して粗抽出物の形態で作用することが開示されている。オイゲ ノールの存在下でのこの細菌の培養後、いくつかの代謝産物がブイヨンから単離 され、フェルラ酸、バニリン酸、プロカテキュイック酸（procatechuicacid）と 同定された。次に、コニフェリルアルコールも同定された。この文献は、コニフ ェリルアルコールは、非常に少量生成されることを示している。 さらに、本出願の出願前に公開されたのではないが、本出願より早い出願日（ 第一）である２つの特許出願がある。欧州特許公開0583687［ハーマン（Haarman n）及びライマー（Reimer）］には、例えば、寄託番号ＤＳＭ7062及びＤＳＭ706 3を有するシュードモナス種からの酵素物質を用いて又は、それからの遺伝物質 を有する微生物を用いて、オイゲノールからコニフェリルアルコールの生成が開 示されている。報告されているコニフェリルアルコールの収率は、実施例４によ れば理論値の43.5％である。 ダーウェントＡＮ93-316614として入手できる特開平5-227980（特願平4-35338 ）（高砂香料）には、シュードモナス属からの変異株を用いる発酵を含む分解に よりオイゲノールからの少なくとも１つのバニリン、コニフェリルアルコール、 コニフェリルアルデヒド、フルラ酸及びバニリルアルコールの生成について記載 されている。実施例は、変異株ＴＫ-2102をオイゲノールを有する培地で培養し 、バニリルアルコール、バニリン及びフェルラ酸の混合物を得ることを報告して いるが、コニフェリルアルコールを生成したことの記載がないことが注目される 。 しかし、それらの方法は、それらが困難な又は入手しがたいい微生物を用い、 多くの望ましくない副生物を生成 請求の範囲、請求項１乃至６の補正 請求の範囲 １．反応概要図、 における、一般式Ｉ（式中、Ｒ₁は、Ｈ）ＯＨ又は、３以下の炭素原子を有す るアルコキシ基であり、Ｒ₂は、Ｈ又は、３以下の炭素原子を有するアルキル基 である）により表わされる4-アリルフェノールを、補欠分子団として共有結合さ れたＦＡＤを有する細胞外アリールアルコールオキシダーゼであり、ペニシリウ ム・シンプリシシマムから得られるバニリルオキシダーゼを用いて酵素的に酸化 し、一般式II（式中、Ｒ₁及びＲ₂は上記の通りである）により表わされる4-ヒド ロキシシンナミルアルコールを得ることを特徴とする、4-ヒドロキシシンナミル アルコールを製造する方法。 ２．Ｒ₂はＨであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．Ｒ₁はＨ又はＣＨ₃であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の 方法。 ４．酸化反応を７乃至12のｐＨで行うことを特徴とする、請求項１乃至３のいず れか１請求項に記載の方法。 ５．酸化反応を５乃至60℃で行うことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか １請求項に記載の方法。 ６．反応を、反応相及び、反応生成物が蓄積する相から成る２相系で行うことを 特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フラージェ、マルコ・ウィルヘルム オランダ国、6702・シーエル・ワゲニンゲ ン、ソーベックストラート 518 (72)発明者 ディ・ジョン、エザード オランダ国、6702・ビーアール・ワゲニン ゲン、ソーベックストラート 30

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．反応概要図、 における、一般式Ｉ（式中、Ｒ₁は、Ｈ）ＯＨ又は、３以下の炭素原子を有す るアルコキシ基であり、Ｒ₂は、Ｈ又は、３以下の炭素原子を有するアルキル基 である）により表わされる4-アリルフェノールを、バニリルアルコールオキシダ ーゼを用いて酵素的に酸化し、一般式II（式中、Ｒ₁及びＲ₂は上記の通りである ）により表わされる4-ヒドロキシシンナミルアルコールを得ることを特徴とする 、4-ヒドロキシシンナミルアルコールを製造する方法。 ２．Ｒ₂はＨであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．Ｒ₁はＨ又はＯＣＨ₃であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載 の方法。 ４．酸化反応を７乃至12のｐＨで行うことを特徴とする、請求項１乃至３のいず れか１請求項に記載の方法。 ５．酸化反応を５乃至60℃で行うことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか １請求項に記載の方法。 ６．酵素が、ペニシリウム・シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum） から得られることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方 法。 ７．酵素が、ベラトリルアルコールで増殖させたペニシリウム・シンプリシシマ ムから得られることを特徴とする、請求項６に記載の方法。 ８．酵素が生存能力のある微生物細胞中に存在することを特徴とする、請求項１ 乃至７のいずれか１請求項に記載の方法。 ９．酵素が死細胞、無細胞抽出物又はそれらから生成された酵素製剤中に存在す ることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１請求項に記載の方法。