JPH08512205A

JPH08512205A - アルコール、アルデヒド及びカルボン酸を生物工学的に製造する方法

Info

Publication number: JPH08512205A
Application number: JP7503792A
Authority: JP
Inventors: プレスラー，ウヴェ; バルケン−ホール，フリートヘルム; ハウアー，ベルンハルト; ラドナー，ヴォルフガング; シュネル，ウルズラ; ラルフシュタウデンマイアー，ホルスト
Original assignee: ビーエーエスエフアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1993-07-05
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 1996-12-24
Also published as: EP0707656B1; ATE170565T1; EP0707656A1; WO1995002061A1; CA2166563C; DK0707656T3; ES2120055T3; US5753471A; CA2166563A1

Abstract

(57)【要約】微生物を用いる、式Ｒ¹−Ｃ（ＣＨ₃）＝ＣＲ²Ｒ³（式中Ｒ¹及びＲ²は明細書中に記載のものを表す）の化合物の酸化によりアルコール、アルデヒ及びカルボン酸を生物工学的に製造する方法が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】アルコール、アルデヒド及びカルボン酸を生物工学的に製造する方法本発明は、アルコール、アルデヒド及びカルボン酸を生物工学的に製造する方法に関する。高官能性のアルコール、アルデヒド及びカルボン酸は、医薬品、ポリマー、ファインケミカル等の製造のための重要かつ所望の生成物であり、これらは、屡々、相応する前駆物質の酸化により合成されうる。化学的酸化は、一般に、僅かな領域特異性を示す。更に、酸化のために屡々有害かつ／又は取り扱い困難な試薬を必要とする。細菌によるメチル基の酸化の可能性が原則的に公知である。例えば、Ｒａｙｍｏｎｄ等（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５．８５７−８６５（１９６７））は、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属によるｎ−パラフィンとの共酸化によるメチル基の酸化を記載している。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属によるｐ−シメンをアルコール及びアルデヒドを経る３工程で酸化して、ｐ−イソプロピル安息香酸にすることは公知である（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２９，１３５６−１３６４及び１３６５−１３７４（１９７７）及び同書１７１，５１５５−５１６１（１９８９））。ベンジル性メチル基のこの酸化と並んで、一連の微生物を用いるアリル性メチル基の酸化も公知である。例えば、Ｎｏｍａ等は、アスペルギルスセルロザエ（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＣｅｌｌｕｌｏｓａｅ）によるリモネンの酸化による特にペリルアルコールの取得を記載している（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，２７２５−２７２７（１９９２））。シュードモナスインコグニタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｉｎｃｏｇｎｉｔａ）はリナロールを酸化して、特に８−ヒドロキシリナロールにしている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１，５１５５−５１６１（１９８９））。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ等は、一連の研究で（ＩｎｄｉａｎＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５，７９−９１及び９２−１０１（１９６８）、Ｉｎｄｉａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３，１４４−１５７（１９６６）及びＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９．Ｎｏ．３，２７５−２７９（１９６７））、シュードモナスＰＬ−菌株によるテルペン（例えばリモネン、α−及び β−ピネン）の酸化を試験している。このＰＬ−菌株は、ｐ−シメンをも酸化してクミン酸にする（ＩｎｄｉａｎＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５，１６１−１６７（１９６８））。しかしながら、記載の研究は、微生物によるベンジル性及びアリル性位置での所望のメチル基の酸化と並んで、使用出発化合物（例えばリモネン、ｐ −シメン等）の所で付加的な一連の酸化が起こることを示している。ＣＨ−ＰＳ６７７７９１及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８，６６８１−６６８８（１９９２）に記載のバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カニングハメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）等の属の微生物を用いるテルペン類のアリル性メチル基の酸化は、同様に副反応の問題を伴っている。従って、そこに記載の反応は、工業的には使用できない。欧州特許（ＥＰ−ＯＳ）４４２４３０号、同４６６０４２号及び同４７７８２８号明細書は、工業的に利用可能なメチル基酸化を記載している。しかしながら、この反応の欠点は、固有の炭素−及びエネルギー源としての、例えばｐ−キシロールによる微生物の誘導である。更に、記載の反応が５−及び６員のヘテロ環上でのみに限られている。芳香族、ヘテロ芳香族及び脂肪族物質の広い範囲におけるベンジル性でも及びアリル性でもメチル基位置で選択的に酸化する微生物を用いる工業的方法は、従来未知である。ところで、アルコール、アルデヒド及びカルボン酸を微生物的に製造する工業的に使用可能な方法を発見した。本発明の課題は、式Ｉ：［式中、Ｒ¹は、水素原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−又は置換又は非置換のアリール基であり、Ｒ²は、水素原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−又は置換又は非置換のアリール基を表すか、又は、Ｒ¹とＲ²はそれらに結合している炭素原子と一緒になって、ａ）１個又は２個の他の二重結合を有し、及び／又は１、２又は３個のハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アシル−、Ｃ₁〜Ｃ_4-アルコキシ基及び／又は１又は２個のシアノ−、アミノ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ− 又はジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ基及び／又は１個のニトロ基で置換されていてよく、かつ／又はもう一つの芳香族又はヘテロ芳香族６−員環のところで縮合して、１〜４個のＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄ −アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−、ニトリル−、ニトロ−、カルボキシ− 、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシカルボニル−、アミノ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ− 、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ−及び／又は置換又は非置換のベンゾイル基及び／又は１〜４個のハロゲン原子で置換されていてよい環系になっていてもよい６員環、又はｂ）１、２又は３個のヘテロ環を有し及び／又はもう一つの二重結合を有していてよく、１〜４個のＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル −、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−、ニトリル−、ニトロ−、カルボキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄ −アルコキシカルボニル−、アミノ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ−、ジ−Ｃ₁ 〜Ｃ₄−アルキルアミノ−及び／又は置換又は非置換のベンゾイル基及び／又は１〜４個のハロゲン原子で置換されて入れよい芳香族又はヘテロ芳香族環に縮合されていてよいヘテロ環式５−員環を表し、Ｒ³は、水素−又はハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−又はＣ₂〜Ｃ₄−アルケニル基又は非置換の又はハロゲン置換されたアリールオキシ−又はベンゾイル基を表し、Ｒ⁴は、−ＣＨ₂ＯＨ−、−ＣＨＯ−又は−ＣＯＯＨ−基を表す］の化合物を製造する方法に関し、これは、式ＩＩ：［式中、Ｒ¹〜Ｒ³は前記のものを表す］の化合物を、微生物を用いて選択的に酸化することよりなる。Ｒ¹及びＲ²のアルキル基としては、次のものが挙げられる：メチル−、エチル −、ｎ−プロピル−、１−メチルエチル−、ブチル−、１−メチルプロピル−、２−メチルプロピル−及び１，１−ジメチルエチル基。有利なアルキル基は、メチル−、エチル−及びプロピル基である。アルケニル基としては、ビニル−、１ −メチルビニル−、シス−１−ブテニル−、トランス−１−ブテニル−、シス− ２−ブテニル、トランス−２−テニル、３−ブテニル−、２−メチル−１−プロペニル−、２−メチル−２−プロペニルー、１−メチル−１−プロペニル−、１ −メチル−２−プロペニル−及び１−エチルビニル基が挙げられる。２−メチル −１−プロペニル基が有利である。Ｒ¹が置換アリール基である場合には、これはＣ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄ −アルケニル−及び／又はハロゲン基を有しているのが有利である。アルキル基としては次のものが挙げられる：メチル−、エチル−、ｎ−プロピル−、１− メチルエチル−、ブチル−、１−メチルプロピル−、２−メチルプロピル−及び１，１−ジメチルエチル基。有利なアルキル基はメチル−、エチル−及びｎ−プロピル基である。アルケニル基としては、ビニル−、１−メチルビニル−、シス−１−ブテニル−、トランス −１−ブテニル−、シス−２−ブテニル−、トランス−２−ブテニル−、３−ブテニル−、２−メチル−１−プロペニル−、２−メチル−２−プロペニル−、１ −メチル−１−プロペニル−、１−メチル−２−プロペニル−及び１−エチルビニル基が挙げられる。２−メチル−１−プロペニル基が有利である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素又は臭素が挙げられる。塩素が有利である。アリール基に付く置換基の数は、通常１〜３個である。１又は２個の基が有利である。Ｒ¹のアリール基としては、特に、フェニル−及びナフチル基が挙げられる。Ｒ²が置換アリール基である場合には、これは、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−及び／又はハロゲン基を有する。アルキル基としては、次のものが挙げられる：メチル−、エチル−、ｎ−プロピル−、１−メチルエチル− 、ブチル−、１−メチルプロピル−、２−メチルプロピル−及び１，１−ジメチルエチル基。有利なアルキル基は、メチル−、エチル−及びプロピル基である。アルケニル基としては、次のものが挙げられる：ビニル−、１−メチルビニル− 、シス−１−ブテニル−、トランス−１−ブテニル−、シス−２−ブテニル−、トランス−２−ブテニル−、３−ブテニル−、２−メチル−１−プロペニル−、２ −メチル−２−プロペニル−、１−メチル−１−プロペニル−、１−メチル−２ −プロペニル−及び１−エチルビニル１−メチルエチル−、ブチル−、１−メチルプロピル−、２−メチルプロピル−及び１，１−ジメチルエチル基。有利なアルキル基は、メチル−、エチル−及びプロピル基である。アルケニル基としては、次のものが挙げられる：ビニル−、１−メチルビニル−、シス−１−ブテニル −、トランス−１−ブテニル−、シス−２−ブテニル−、トランス−２−ブテニル−、３−ブテニル−、２−メチル−１−プロペニル−、２−メチル−２−プロペニル−、１−メチル−１−プロペニル−、１−メチル−２−プロペニル−及び１−エチルビニル基。２−メチル−１−プロペニル基が有利である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素又は臭素が挙げられる。塩素が有利である。アリール基に付く置換基の数は、通例１〜３個である。１又は２個の基が有利である。Ｒ²の有利な基は、フェニル、メチル、ｐ−メトキシフェニル、１、３−ジオキサニル及び５，５−ジメチル−１，３−ジオキサニルである。Ｒ²のアリール基としては、特にフェニル−、及びナフチル基が挙げられる。Ｒ¹及びＲ²が環又は環系の一部である場合には、次のものが有利に挙げられる：フェニル、ベンゾイル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフリール及びベンズオキサジル。環系の置換基としては、次のものが挙げられる：アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル（殊にメチル、エチル及びフェニル）；アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、１−メチルエトキシ、ブチルオキシ、１−メチルプロピルオキシ、２−メチルプロピルオキシ、１，１ −ジメチルエトキシ（殊にメトキシ及び１−メチルエトキシ）；アルケニル、例えばビニル、１−メチルビニル、シス−１−プロペニル、トランス−１−プロペニル、２−プロペニル、シス−１−ブテニル、トランス−１−ブテニル、シス− ２−ブテニル、トランス−２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−エチルビニル（殊に、２−メチル−１−プロペニル）；ハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素及び沃素（殊にフッ素及び塩素）；アルコキシカルボニル、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、１−メチルエトキシカルボニル、ブチロキシカルボニル及び１，１− ジメチルエトキシカルボニル（殊に、メトキシカルボニル及び１−メチルエトキシカルボニル）。環につく置換基の数は、通例１〜３、有利には１又は２である。Ｒ¹及びＲ²の環系中のアミノ基に付くＣ₁〜Ｃ₄−アルキル基としては、次のものが挙げられる：エチル、プロピル、１−メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル及び殊にメチル。Ｒ³には、殊に次のものが挙げられる：メチル、エチル、ｎ−プロピル、１− メチルエチル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ビニル、１−メチルビニル、シス−１−プロペニル、トランス− １−プロペニル、２−プロペニル、シス−１−ブテニル、トランス−ブテニル、シス−２−ブテニル、トランス−２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−１ −プロペニル、２−メチルー２ープロペニル、１−メチル−１−プロペニル、１ −メチル−２−プロペニル、１−エチルビニル、フッ素、塩素及び臭素。Ｒ³の有利なものは、メチル、エチル、ｎ−プロピル及び２−メチル−１−プロペニルである。この新規方法は、アルコール及び殊にカルボン酸の製造のために特に好適である。Ｄｒｅｗｓの先行文献（Mikrobiologisches Prakti ｋum，3 Auflage、Springer Verlag,47〜48頁(1976)）によるスクリーニングにより、土壌試料及び菌株寄託局から、本発明による酸化を実施する細菌を単離又は同定することができる。本発明の反応のためには、例えば属名アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、プレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プロアクチノマイセス（Ｐｒｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｙｌｉｃｏｃｃｕｓ）、セラテイア（Ｓｅｒｒｓｔｉａ）及びツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、殊にアルトロバクターｓｐ．、バシルスルブロペルチンクツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、バシルスミコイデスロゼウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｕｍｙｃｏｉｄｅｓｒｏｓｅｕｓ）、バシルスルブリクス（Ｂ．ｒｕｂｒｉｃｕｓ）、コリネバクテリウムルブルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｒｕｂｕｒｕｍ）、ゴルドナレンチフラグメンタ（Ｇｏｒｄｏｎａｌｅｎｔｉｆｒａｇｍｅｎｔａ）、ゴルドナルブロペルチンクツス（Ｇ．ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ゴルドナルブラ（Ｇ．ｒｕｂｒａ）、マイクロコッカスロゼウス（Ｍ．ｒｏｓｅｕｓ）、マイクロコッカスロゼウスロゼオフルブス（Ｍ．ｒｏｓｅｕｓｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ）、マイクロコッカステトラゲヌスルベル（Ｍ．ｔｅｔｒａｇｅｎｕｓｒｕｂｅｒ）、マイクロコッカスルベンス（Ｍ．ｒｕｂｅｎｓ）、マイクロコッカスフラボロゼウス（Ｍ．ｆｌａｖｏｒｏｓｅｕｓ）、マイクロコツカスコラリヌス（Ｍ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、マイクロコッカスアギリス（Ｍ．ａｇｉｌｉｓ）、ミコバクテリウムルブロペルチンクツス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ノカルデイアコラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ノカルデイアルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａｒｕｂｒａ）、ノカルデイアｓｐ．、ノカルデイアサルモニコロア（Ｎ．ｓａｉｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ノカルデイアペレグリノ（Ｎ．ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ）、プロアクチノマイセスルベル（Ｐｒｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｒｕｂｅｒ）、プロアクチノマイセスルブロペルチンクツス（Ｐ．ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ）、ロドコッカスロドクロウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカスエリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカスルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）、ロドコッカスルブルス（Ｒ．ｒｕｂｒｕｓ）、ロドコッカスｓｐ．、ロドコッカスロゼウス、ロドコッカスレンチフラグメンツス、ロドコッカスアギリス、セラテイアルブロペルチンクタ（Ｓｅｒｒａｔｉａｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔａ）及びスタフィロコッカスロゼウスなる属種名で管理されている細菌が好適である。反応に使用される細菌の多くは、科名ミコバクテリアツエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルデイアツエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）及びマイクロコカツエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は、それらの属名ミコバクテリウム、ノカルデイア、ロドコッカス、ツカムレラ、マイクロコッカス、スタフィロコッカス及びプラノコッカスと非常に変化に富んだ分類学的履歴を演じる。詳細は次の文献に記載されている：The Prokaryotes(ed.Balows A.et al)1992、 Vol.II.、Bergey's Manualof Determinating Bacteriology、9th.Edition(ed.Cow an S.et al)1974、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(ed.Seneath,P. H.A.et al)1986、vol.II、ATCC-Catalogue of Bacteria&Bacteriophages 17th Edi tion 1989、Kocur,M.et al、lnt.J.Syst.Bacterlol.20、 233-240(1970)及びTsukamura,M.et al,Int.J.Syst.Bacteriol.25,377-382(1975) 及びJ.Gen.Mlcrobiol.68,15-26(1971),80,553-555(1974)及び125,205-208(1981) 。記載の属の分類学的位置は、最近著しく変動し、なお、流動している、それというのも、誤った属及び科名は修正され、現存する菌株を新たな属内に分類されるからである。この属及び科内で狭い類縁関係がある。本発明の反応を実施する細菌は、前記の属及び科内に良好な確実性で存在する。メチル基酸化のためには、特に次の菌株が好適である：ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｒｕｓ；Ｎｏｃａｒｄｉａｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ）ＤＳＭ４３２３２、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｒｕｓ；Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．）ＤＳＭ４３２５０、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｒｕｓ；Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．）ＤＳＭ４３２５１、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｒｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．）ＤＳＭ４３２５２、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｒｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．）ＤＳＭ４３３３５、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｒｕｓ，Ｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．）ＤＳＭ４３３３８、ロドコッカスルベル（Ｎｏｃａｒｄｉａｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ）ＩＭＥＴ７３０８、ロドコッカスルベルＩＭＥＴ７３３７、ロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｌｅｎｔｉｆｒａｇｍｅｎｔｕｓ、Ｇｏｒｄｏｎａｌｅｎｔｉｆｒａｇｍｅｎｔａ）ＩＭＥＴ７４３７及びロドコッカスルベル（Ｇｏｒｄｏｎａｌｅｎｔｉｆｒａｇｍｅｎｔａ）ＩＭＥＴ７４７７、ロドコッカスルベル（Ｎｏｃａｒｄｉａｒｕｂｒａ）ＩＭＧ５３６６、マイクロコッカスロゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒｏｓｅｕｓｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｔｅｔｒａｇｅｎｕｓｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ１７８、マイクロコッカスロゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒｏｓｅｕｓｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｔｅｔｒａｇｅｎｕｓｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ１８６、マイクロコッカスロゼウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｏｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ５１６、マイクロコッカスロゼウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ５３４及びマイクロコッカスロゼウスＡＴＣＣ９８１５。括弧内の記載は、従来の菌株名を示している。酸化のためには、ロドコッカスルベルＤＳＭ８３１６菌株並びにこれから誘導された突然変異体が特に好適である。この菌株は、後に記載のデータで特性付けられている。ロドコッカスルベルＤＳＭ８３１６は、土壌試料からの単離体である。相応するアルコール、アルデヒド又はカルボン酸に酸化可能なためには、メチル基は、ベンジル−又はアリル位にあるべきである。出発化合物中に数個のベンジル−又はアリル位メチル基が存在する場合には、一般に、１個のメチル基のみが選択的に酸化される。まれな場合（＜５％）に、もう１個のメチル基が酸化される。この出発化合物は、このシーケンスを経て、アルコール、アルデヒド及びカルボン酸に分解され、記載の野生型菌株を炭素源−及びエネルギ−源として役立てるので、所望の生成物を得るためには、アルコールのみ、又はアルデヒドのみ又はカルボン酸のみをもたらす酸化を伴う。、記載の細菌のブロック突然変異体を用いて作業するのが有利である。このようなブロック突然変異体を得るためには、公知の微生物学的技術を使用することができる。突然変異生成の開始のためには、慣用の全ての方法、例えば突然変異生成物質、例えばニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸ナトリウムの使用又は電磁線、例えばＵＶ−、ガンマ−又はエックス線の作用を使用することができる。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジンの製造のための相応する処方は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８，７８８（１９６５）に記載されている。更に、突然変異生成のためには、形質変換可能な遺伝的要素を使用することができる。突然変異体の単離のために、例えば酸化の生成物上では特有のＣ−源としてはもはや成長しない特性を利用することができる。このようなブロック突然変異体を用いる作業は、本発明の有利な１実施形である。縮合及び非縮合芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物及び脂肪族化合物に付いているベンジル性及びアリル性メチル基の酸化のための本発明の方法は、細菌又はその突然変異体を適当な炭素−及びエネルギー源を有する適当な培地中で、相応する出発物質の存在で培養するか又は出発物質を２４〜７２時間培養の後に栄養液に加えるような方法で実施するのが好適である。難溶性の出発物質は、市販の乳化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、登録商標）を用いて乳液として栄養培地に加えるのが有利である。発酵は、連続的に又は断続的に１〜１４日間行う。一般に、活性細菌を用いて酸化を行うが、これは静細菌を用いても実施でき、その場合は著しく反応速度が遅い。炭素源、窒素源、無機塩及び場合によっては少量の微量元素及びビタミンを含有する栄養培地が好適である。窒素源としては、無機又は有機の窒素化合物又はこの化合物を含有する物質を使用することができる。例は、アンモニウム塩、硝酸塩、トウモロコシ源水、ビール酵母自己分解物、大豆粉末、トウモロコシグルテン、酵母エキス、酵母、尿素及び馬鈴薯澱粉である。炭素源としては、例えば、糖類、例えばグルコース、ボリオール、例えばグリセリン又は脂肪、例えば大豆油を使用することができる。無機塩の例は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、亜鉛、銅及び鉄の塩である。塩のアニオンとしては、ホスフェートイオンが挙げられる。場合によっては、この栄養培地に成長因子、例えばビオチン、リボフラビン及び／又は他のビタミンを添加する。前記栄養物質の混合割合は、発酵の方法に依存し、個々の場合に応じて決められる。一般に、本発明の方法の実施のためには、約１〜１００ｇ／ｌの最終濃度、有利には約３〜５０ｇ／ｌの濃度、特に有利には、約５〜２０ｇ／ｌの濃度が好適である。発酵条件は、最良の収率が達成されるように決める。有利な発酵温度は、１５〜４０℃である。２５〜３５℃の温度が特に有利である。３〜９の範囲のｐＨ値を保持するのが有利である。特に、５〜８のＰＨ値が有利である。一般に、１５〜１２０時間の恒温保持で充分である。この時間の間に、所望の生成物の最大量が培地中に達成される。反応変換率は、容易に、試料取り出し、及びそれを、例えばガスクロマトグラフィによる又はＨＰＬＣ−分析を用いる検査により追跡し、管理することができる。培養液からの生成物の単離及び精製は、公知方法で行うことができる。固体バイオマスを栄養培地から分離し、有効物質を、例えば、場合によっては、培地の予めの酸性化の後の有機溶剤を用いて抽出し、この有効物質を抽出相から単離するのが有利である。後処理のために、カラムクロマトグラフィ法も好適である。実施例次の例で本発明を詳述する。記載の実施例では２種の培地を使用した：培地Ａ（複合培地）酵母エキス１０．０ｇ／ｌグルコース２０．０ｇ／ｌ硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／ｌ燐酸二水素カリウム１．５ｇ／ｌ燐酸水素二カリウム３．６ｇ／ｌ硫酸鉄（ＩＩ）−１水和物２ｍｇ／ｌチトリプレックスＩＩＩ（Ｒ）５ｍｇ／ｌ硫酸亜鉛（ＩＩ）−４水和物１００ μｇ／ｌほう酸３００ μｇ／ｌ塩化コバルト（ＩＩ）−６水和物２００ μｇ／ｌ塩化銅（ＩＩ）−２水和物１０ μｇ／ｌ塩化ニッケル（ＩＩ）−６水和物２０ μｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム−２水和物３０ μｇ／ｌ培地Ｂ（最少培地）グルコース５．０ｇ／ｌ燐酸二水素カリウム２．０ｇ／ｌ硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ／ｌ塩化カルシウム−７水和物０．２ｇ／ｌ塩化ナトリウム２．０ｇ／ｌ尿素０．５ｇ／ｌ硫酸鉄（ＩＩ）−１水和物２ｍｇ／ｌチトリプレックス（Ｒ）ＩＩＩ５ｍｇ／ｌ硫酸亜鉛（ＩＩ）−４水和物１００ μｇ／ｌほう酸３００ μｇ／ｌ塩化コバルト（ＩＩ）−６水和物２００ μｇ／ｌ塩化銅（ＩＩ）−２水和物１０ μｇ／ｌ塩化ニッケル（ＩＩ）−６水和物２０ μｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム−２水和物３０ μｇ／ｌビオチン２ μｇ／ｌ葉酸２ μｇ／ｌｐ−アミノ安息香酸２００ μｇ／ｌリボフラビン２００ μｇ／ｌパントテン酸Ｃａ４００ μｇ／ｌニコチン酸１４００ μｇ／ｌピリドキシン／ＨＣｌ４００ μｇ／ｌメソ−イノシット２０００ μｇ／ｌチアミン／ＨＣｌ４００ μｇ／ｌこの培地のｐＨ値を５Ｎ苛性ソーダ又は苛性カリを用いて調節した。グルコース及び燐酸塩を、それぞれ分離して、１２１℃で２０分間オートクレーブ中で処理した。尿素、ビタミン並びに相応する出発物質を滅菌した。濾過不可能であった出発物質を自己滅菌物（ａｕｔｏｓｔｅｒｉｌ）として採用した。生じた培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理をした。例１相応する培地各々２０ｍｌを無菌で、滅菌綿栓を備えた１００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中に充填した。培養液に、接種ループを用いてそれぞれＤＳＭ８３１６を接種した。第１表に記載の出発物質を、培地Ｂ中５ｇ／ｌの濃度で使用した。フラスコを、２８℃及び１５０回／ｍｉｎ（ＵｐＭ）で３〜１０日間振動下に恒温保持した。引き続き、培養液（第１表及び第３表参照）を後処理し、分析した（例４参照）。生成物を、ＧＣ、ＧＣ／ＭＡＳ及び¹Ｈ−ＮＭＲで同定した。参照としては、真性の化学的に合成された試料を用いた。３−ホルミル−２−メチル−２−プロペン酸（２，２−ジメチルプロピレン）アセタール（式ＩＩＩ）は、ポリオール及びカロチノイドの製造のために好適な新規化合物である。例２例１と同様に、第２表に記載の微生物を培地Ａ中に接種した。この培地に、それぞれ第３表に記載の出発物質５ｇ／ｌを添加した。第３表に、例１と同様に検出された生成物を記載した。例３例１と同様に、ＤＳＭ８３１６を、５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中の培地Ａ１００ｍｌ中で培養した。この培地に２−（４−メチルーフェノキシ）− プロパン５ｇ／ｌを加えた。２４時間及び４８時間の恒温保持の後に、再度出発物質２．５ｇ／ｌを加えた。１２０時間の恒温保持の後に培養液を後処理した。生成物として、主生成物としての４−イソプロボキシ安息香酸と共に少量の４− イソプロボキシベンズアルデヒド及び４−イソプロボキシベンジルアルコールが同定できた。生成物の同定は、例１に記載と同様に行った。例４ａ）ブロック突然変異体の製造Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８，７８８（１９６５）に記載のように、ＤＳＭ８３１６から出発して、突然変異体を選択した。このために、ＤＳＭ８３１６を培地Ｂ２０ｍｌ中で１晩（３０℃、１２０Ｕｐｍ、１６時間）培養した。引き続き、細胞を取得し（遠心分離：１０分間、４０ ℃、５０００ｇ）、１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。こうして得た細胞を、緩衝液で６００ｎｍでの光学密度０．７５まで調節した。この細胞懸濁液０．５ｍｌを、１％Ｔｒｉｓマレイン酸緩衝液の存在下で、ＤＭＦ中の１％Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの添加により突然変異生成させた（３０分、室温、１２０Ｕｐｍ）。このバッチの容量は５ｍｌであった。突然変異生成の後に、細胞を１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄し、１０分の１の段階で−１０^-7までの希釈率で、培地Ｂ−寒天（＝培地Ｂ＋寒天２０ｇ／１）上で平面培養した（＝マスター平板）。室温で４日間の恒温保持の後に、生じたコロニーを選択のために、グルコース不含の培地Ｂ−寒天−平板（＝レプリカー平板）上で、特有のＣ−源としての相応する出発物質及び生成物（０．５ｇ／ｌ）で、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＨａｒｐｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，１９８０に記載のように、刻印した。レプリカ−平板とマスター平板との比較により、ブロック突然変異体を同定することができた。ブロック突然変異体の選択限度は、固有のＣ−源としての出発物質及び生成物上で成長しないことであった。こうして得たブロック突然変異体の一つ（＝４ａ１）を、培地Ａ１００ｍｌ中で、２−（４−メチルフェノキシ）−プロパン５ｇ／ｌの存在下に、例１の記載と同様に培養した。７日の恒温保持の後に、発酵液１０００μｌを取り出し、１ＮＨＣｌ１００μｌ及びＭＴＢ（メチル三級ブチルエーテル）５００μｌを加え、激しく１分間撹拌した。有機相の４００μｌを注意深く取り出し、真空下に濃縮させた。残分をＭＴＢ１００μｌ中に入れ、試験管内で定量的にガスクロマトグラフィ試験をした。この試料にＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセタミド５０μｌを加えた。特有の生成物としてガスクロマトグラフィで４−イソプロポキシ安息香酸が検出された。これは、ＧＣ／ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲ及び真の参照生成物との比較により確認した。他のブロック突然変異体（４ａ２及び４ａ３）と一緒に恒温保持を繰り返すと、突然変異体（４ａ２）の場合には、４−イソプロポキシベンジルアルコールが、かつ突然変異体（４ａ３）の場合には、４−イソプロポキシベンズアルデヒドが固有の生成物として検出された。例５ｂ）４−イソプロポキシ−安息香酸の製造培地Ａ１００ｍｌを、接種ループでブロック突然変異体４ａ１を接種し、４８時間恒温保持した。この培養物５０ｍｌを、培地Ａ１リットル及び出発物質としての２−（４−メチルフェノキシ−）プロパン５ｇに接種した。２４時間及び４８時間の恒温保持の後に、再度２−（４−メチルフェノキシ−）プロパン各々２．５ｇを加えた。１６８時間の恒温保持の後に、発酵を停止した。差し当たり、バイオマスを遠心分離（３０分、４℃、１００００ｇ）により分離し、残りの細胞を濾過により分離除去した。引き続き、培養液を濃Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨ１．０に調節し、ＭＴＢ各２５０ｍｌで２回抽出した。有機相を取り出し、回転蒸発器中で濃縮させた。化学的に純粋な形で４−イソプロポキシ−安息香酸７．１ｇが単離できた。これは、約６０％の収率に相当する。例６ｃ）４−イソプロポキシベンジルアルコールの製造培地Ａ１００ｍｌに接種ループでブロック突然変異体４ａ２を接種し、３０ ℃及び１２０Ｕｐｍで４８時間恒温保持した。この培養液５０ｍｌを培地Ａ及び出発物質としての２−（４−メチルフェノキシ−）プロパン５ｇを有する１リットル実験室用発酵器に接種した。１６８時間恒温保持の後に、発酵を停止した。差し当たりバイオマスを遠心分離（３０分、４℃、１００００×ｇ）により除去し、残りの細胞を濾過により分離した。引き続き、培養液をＭＴＢ各々２５０ｍｌで２回抽出した。有機相を取り出した（ＭＴＢ−相１）。ｐＨ１．０までの濃Ｈ₂ＳＯ₄の添加の後に、再度、ＭＴＢ各２５０ｍｌで２回後抽出した。有機相を再び取り出した（ＭＴＢ−相２）。この有機相を集め、回転蒸発器中で濃縮させ分析した（例１参照）。化学的に純粋な形で、４−イソプロポキシベンジルアルコール９４２ｇが固有の生成物として単離される。これは約２０％の収率に相当する。微生物ＤＳＭ８３１６に関する記載：この菌株ＤＳＭ８３１６は、ＤＳＭ(Deutsche Sammlung von Mickroorganisme n und Zellkulturen GmbH)によりＲｏｈｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒとして同定された。この特定プロトコルは次の通りである：１．色型：７０パステルオレンジ〜純オレンジ２．ペプチドグリカン：メソ−ジアミノピメリン酸３．ミコール酸：鎖長Ｃ₃₀〜Ｃ₅₀ ４．脂肪酸型：非分枝で飽和又は不飽和の脂肪酸＋ツベルクロステアリン酸。この脂肪酸型はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｅｎ及びその近縁体に関する診断性である。５．メナキノン（Ｍｅｎａｃｈｉｎｏｎ）：ＭＫ−８（Ｈ₂）６．テスト３５更なる基質テスト結果：テスト数：３５／３５計算−関数：９９／１１６試験菌株からのクラスターＤＳＭ８３１６は、９０％のウイルコックスプロバビリテイ（ＷｉｌｌｃｏｘＰｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を有するロドコッカスルベル（Ｒｈｏｄｏｃｉｃｃｕｓｒｕｂｅｒ）菌株である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 17/10 7432−4ＢＣ１２Ｐ 17/10 17/12 7432−4Ｂ 17/12 17/14 7432−4Ｂ 17/14 //(Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:265） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:44） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ハウアー，ベルンハルトドイツ連邦共和国Ｄ―67136 フースゲンハイムメーロヴィンガーシュトラーセ１ (72)発明者ラドナー，ヴォルフガングドイツ連邦共和国Ｄ―67136 フースゲンハイムインデンベレン５ (72)発明者シュネル，ウルズラドイツ連邦共和国Ｄ―33175 バートリップシュピリンゲイムアステルンヴェーク１ (72)発明者シュタウデンマイアー，ホルストラルフドイツ連邦共和国Ｄ―67134 ビルケンハイデヘルマン―レーンス―シュトラーセ 13デー

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：［式中、Ｒ¹は、水素原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−又は置換又は非置換のアリール基を表し、Ｒ²は、水素原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−又は置換又は非置換のアリール基を表すか又は、Ｒ¹とＲ²はそれらに結合している炭素原子と一緒になって、ａ）１個又は２個以上の二重結合を有し、及び／又は１、２又は３個のハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アシル−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ基及び／又は１又は２個のシアノ−、アミノ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ− 又はジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ基及び／又は１個のニトロ基で置換されていてよく、かつ／又はこれにもう一つの芳香族又はヘテロ芳香族６一員環が縮合していてよく、１〜４個のＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂ 〜Ｃ₄−アルケニル−、ニトリル−、ニトロ−、カルボキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシカルボニル−、アミノ −、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ−、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ−及び／又は置換又は非置換のベンゾイル基及び／又は１〜４のハロゲン原子で置換されていてよい、環系になっていてもよい６員環を表すか、又はｂ）１、２又は３個のへテロ原子を有し、及び／又はもう一つの二重結合を有していてよく、これに、１〜４個のＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル−、ニトリル−、ニトロ−、カルボキシ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシカルボニル −、アミノ−、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ−、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ− 及び／又は置換又は非置換のベンゾイル基及び／又は１〜４個のハロゲン原子で置換されていてよいもう一つの芳香族又はヘテロ芳香族環が縮合されていてよい、ヘテロ環式５一員環を表し、Ｒ³は、水素−又はハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル−又はＣ₂〜Ｃ₄−アルケニル基又は非置換の又はハロゲン置換されたアリールオキシ−又はベンゾイル基を表し、Ｒ⁴は、−ＣＨ₂ＯＨ−、−ＣＨＯ−又は−ＣＯＯＨ−基を表す］の化合物を製造する場合に、式ＩＩ：［式中、Ｒ¹〜Ｒ³は前記のものを表す］の化合物中で、微生物を用いて選択的にメチル基を酸化することを特徴とする、式Ｉの化合物の製法。２．アルトロバクター、バシルス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、カセオバクター、ゴルドナ、マイクロコッカス、ミコバクテリウム、ノカルデイア、プラノコッカス、プロアクチノマイセス、ロドコッカス、スタフイロコッカス、セラテイア又はツカムレラ属の細菌を使用する、請求の範囲１に記載の方法。３．細菌として、属種名マイクロコッカスロゼウス又はこれから選択されたブロック突然変異体からの１種を使用煤、請求の範囲１に記載の方法。４．細菌として、属種名ロドコッカスルベル又はこれから選択されたブロック突然変異体からの１種を使用する、請求の範囲１に記載の方法。５．細菌として、ロドコッカスルベルＤＳＭ８３１６又はこれから選択されたブロック突然変異体を使用する、請求の範囲１に記載の方法。６．３−ホルミル−２−メチル−２−プロペン酸（２，２−ジメチルプロピレン）アセタール。