JPH08512215A

JPH08512215A - 二成分フィブリングルー

Info

Publication number: JPH08512215A
Application number: JP6521655A
Authority: JP
Inventors: マーチノヴィッツ、ウリ; バル、フレデリック
Original assignee: オパーバス・ホールディング・ビー・ブイ
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1994-03-27
Publication date: 1996-12-24
Also published as: AU6536394A; CA2159469C; CA2159469A1; DE69422165T2; ES2139740T3; DK0691858T3; EP0691858A1; ATE187651T1; DE69422165D1; EP0691858B1; US6019993A; IL109157A0; WO1994022503A1

Abstract

(57)【要約】全血の寒冷沈降物と、充分な量のトラネキサム酸、すなわち４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、もしくはその生理学的に許容できる塩とからなる成分Ａ、および成分Ａの中に存在するフィブリノーゲンを特異的に切断して、フィブリンポリマーの形成を引き起こすことができる蛋白分解酵素を含む成分Ｂ、からなるフィブリングルー。

Description

【発明の詳細な説明】二成分フィブリングルー本発明は、二成分ＡとＢとからなるフィブリングルー、そのフィブリングルーの製造法、およびそのフィブリングルーに含まれるトラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質あるいはその生理学的に許容できる塩の用途に関するものである。ヨーロッパ特許出願ＥＰ９２１１４９４２号明細書には、外科的な外傷塗布剤や血友病治療に用いられる改良されたフィブリングルーが開示されている。このフィブリングルーは、ＥＰ９２１１４９４２号明細書によれば好ましいプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンを多量に含んでいる。さらにこれには、蛇毒由来の蛋白分解酵素、好ましくはバトロキソビン化合物の使用が開示されている。このようなフィブリングルーは、従来のフィブリングルー中にあるトロンビンに対する免疫反応を起こした人を治療することができるので有利である。ヨーロッパ特許出願ＥＰ９２１１２２９５号明細書には、フィブリングルーのＡ、Ｂ二成分の一方または両方に哺乳類の胎芽細胞を培養するための付加成分が含有されているフィブリングルーが開示されている。また、この試験管内受精に用いられる特殊なフィブリングルーには、好ましい医学的に許容できるプロテアーゼ阻害剤としてアプロチニンが含有されている。ヨーロッパ特許出願ＥＰ−０３３９６０７Ａ２号明細書は、軟骨および骨の修復用組成物と骨格組織の移植の際の骨の形成法に関するものである。この目的のために、軟骨細胞の表現型を示す移植細胞（８０×１０⁶細胞／ｍｌ）、すなわち骨髄由来の同一組織内もしくは同種の起源の軟骨細胞や骨芽細胞、同種の関係する軟骨細胞、同一組織内もしくは同種の筋肉線維芽細胞由来の軟骨細胞、あるいは他の間葉起源から得られる外陰部表面の細胞などが用いられる。これらの細胞は、生物分解性で、かつ生体適合的な、生物学的に再吸収性のある固定賦形剤（BRIV）である粘着性グルーに埋め込まれる。このグルーはフィブリノーゲン、トロンビン、ＣａＣｌ₂、プロテアーゼ阻害剤、そして、少なくとも１０％、好ましくは１５−３０％の血清からなっている。好適なプロテアーゼ阻害剤としてはイプシロン−アミノカプロン酸およびトラネキサム酸が挙げられている。国際特許出願ＷＯ−Ａ−９２／２２３１２号明細書は生体組織処理組成物、特に、フィブリンあるいはフィブリノーゲンを含有する粘着性組成物および粘性のある水溶液を形成できる生物分解・生体適合ポリマーに関するものである。この組織粘着性組成物は、接着することだけでなく、中に含有されている薬剤をゆっくりと放出させるためや、抗癒着のため、外傷の治療などに利用することができる。これらのポリマーの一つは、プロテオグリカン・ヒアルロン酸と同じものである。英国特許出願ＧＢ−Ａ−２１０２８１１号明細書には生体組織接着剤とその製造法について述べられている。この接着剤には第VIII因子、フィブリノーゲンおよび抗生物質が含有されている。国際特許出願ＷＯ−Ａ−８６／０１８１４号明細書には、一人の提供者からの新鮮な血清を濃縮したフィブリン接着剤が開示されている。これは蓄えられている血清成分を取り扱うものではない。国際特許出願ＷＯ−Ａ−９２／１５３４１号明細書は、生物線維組織、特に人体の線維組織をつなぐための接着剤に関するものである。この接着剤には、フィブリノーゲン、カルシウムイオンを供給できる物質、血液凝固第XIIIａ因子、そしてフィブリノーゲン切断物質として蛇毒酵素が含まれている。ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０１６６２６３号明細書には、骨の欠損部や陥没部を埋めるための充填組成物とその充填組成物を製造するための器具・機材が開示されている。この充填組成物はフィブリンとリン酸カルシウム化合物とからなっている。独国特許出願ＤＥ−Ａ−２２０１９９３号明細書には、酵素剤とその製造法が開示されている。ここで開示されている酵素は血栓崩壊活性を有するプロテアーゼで、毒蛇（bothrops）の蛇毒から単離したものである。アプロチニンは極めて一般的なプロテアーゼ阻害剤である。化学的には、この化合物は５８個のアミノ酸のポリペプチドであり、主としてウシの内臓器官のような哺乳類の起源から得られている。アプロチニンは膵臓、肺、肝臓、ヒ臓の細胞で生じ、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンおよびその他のキニノゲナーゼを阻害する。医療面では、アプロチニンは重篤な出血やショックの治療に利用される。しかし、アプロチニンもまた免疫抗原となり得る。さらに、ほとんどのアプロチニンはウシ由来のものであり、ウイルスの混入も報告されているので、アプロチニンをさらに利用していくことが全く無害であるとは言えない。従来技術によるフィブリングルーによって形成されたフィブリンの固まり（クロット）は、年を経るにつれてしばしば乾燥し固くなり、動いたときに組織を傷つける恐れのあるナイフ形になる。従って、本発明の目的は、改良された性質を有するフィブリングルーを提供することにある。さらに、このフィブリングルーは免疫抗原性をほとんど持たないこと、および／または優れた機械的性質あるいは取り扱い性を持つという性質がある。驚くべきことに、請求項１によるフィブリングルーは上記の問題を解決する。さらにトラネキサム酸を添加することで、組織内にクロットができるのを遅らせるという付加的な効用が得られる。４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸であるトラネキサム酸（商品名：ヘキサカプロン）は、従来技術でのアプロチニンの代りとして用いることができる。以下においては『トラネキサム酸』という言葉は、それぞれの生理学的に許容できる塩をも意味するものとする。本発明のフィブリングルーは、全血の寒冷沈降物と充分な量のトラネキサム酸［４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸］もしくはその生理学的に許容できる塩とからなる成分Ａと、成分Ａの中に存在するフィブリノーゲンを特異的に切断することでフィブリンポリマーの形成を引き起こすことができる蛋白分解酵素を含む成分Ｂとからなっている。第１図には、フィブリノーゲンが多く含まれる従来の成分Ａに比べて、本発明に寒冷沈降物を用いることの優れた効果が示されている。市販されているティシュコール（曲線１）とベリプラスト（曲線２）について、引っ張りに対する抗張力を本発明のフィブリングルーと比較して測定した。一方のベリプラストは、最初は、生じたクロットの引っ張りに対して強く抵抗して良好な性質を示したが、さらに強い張力に対しては約３ｍｍの伸びで壊れてしまった。このことは、ベリプラストのクロットが他のものと比べて極めて硬直したものであることを示している。他方、ティシュコールは極めて低い張力でも著しい伸びを示すが、約５０乃至６０ｇの張力によって非常に長く伸びて壊れる。このような性質は比較的小さな力でも重大な障害を引き起こすので不利である。すなわち、このような性質だと、グルーは傷口の壁にピッタリと付かないで、外からの機械的な衝撃によって引っ張られると傷口の壁が互いにズレてしまう。そうなると傷口の壁が固定されないため、傷口がそれ以上は回復できなくなる恐れがある。ベリプラストは壊れてしまうほど柔軟性がないので不便である。そうなれば、やはり傷口は固定されなくなる。従って、従来のグルーは外科医にたった二つの選択肢を与えるだけであった。すなわち、１）ベリプラストは比較的丈夫で硬く、傷口の壁を固定することができる。しかし、わずかな機械的衝撃で壊れてしまう。２）ティシュコールは比較的やわらかく、柔軟で粘性がある。しかし、傷口の壁を固定する力は弱い。しかし、成分Ａとして寒冷沈降物を用いた本発明の生体組織用グルーは優れた性質を示す。本発明のフィブリングルーはより理想的な選択肢を与えるものである。寒冷沈降物とヘキサカプロンからなる成分Ａを用いた本発明の生体組織用グルーは、従来の選択肢の中間をとったものである。驚くべきことに、本発明の生体組織用グルーはベリプラストとティシュコールの長所を組み合せて、しかも、わずかな伸びでクロットが壊れてしまうというベリプラストの欠点と柔らか過ぎて傷口の壁のズレを止められないというティシュコールの欠点を克服したものである。第２図には市販されている『ティシェール』によって生じたクロットの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示し、また第３図には本発明によるもののＳＥＭを示した。市販のものによる第２図が不規則なパターンを示しているのに対して、第３図の本発明のフィブリンポリマーのパターンがより規則的であることは注目すべきことである。本発明のフィブリングルーには、高分子物質が加えられることが好ましい。この物質はゲル化性を有する物質で、傷の回復を促進してフィブリングルーに様々な性質を与えるものである。ゲル化性を有する高分子物質は、好ましくは接合組織の成分であるグリコサミノグリカンのような天然物から得られる有機高分子材料であることが好ましい。二成分フィブリングルー内に存在するゲル化性を有する物質としては、ヒアルロン酸もしくはその生理学的に許容できる塩を用いることが好ましい。好ましいゲル化性を有する物質であるヒアルロン酸は、起源および製法、測定法などによるが、分子量が５００００乃至８×１０⁶の化合物である。この化合物については、メルク・インデックス第１１版７５１ページ、参照番号４６７５に記載されている。このナトリウム塩は市販されていて、眼科手術の際の手術助剤として利用されている。本発明のフィブリングルーを製造するのに市販の寒冷沈降物を用いることができる。しかし、第２因子と第５因子の間、好ましくは第３因子の寒冷沈降物を濃縮するのが有利である。手術に先だって患者から自己の血液を提供してもらい、患者自身から寒冷沈降物を得ることもできる。このようにすると、血液派生物によってウイルス感染が波及する危険を避けることができる。このようなフィブリングルーの調製法は高価で手間がかかり、医療で必要とされる量のフィブリングルーを満たすことはできない。市販できるような製品と製造法を得るには、本発明に使用される寒冷沈降物はウイルス不活性にしなくてはならない。ウイルス不活性化の操作はＰＣＴ／ＥＰ９１／００５０３に記載されている。基本原理は寒冷沈降物を特殊な洗浄剤で処理し、その後に洗浄剤を寒冷沈降物から取り除くことである。トラネキサム酸の好ましい含有量は１０乃至２００ｍｇ／ｍｌで、さらに好ましくは２５乃至１００ｍgである（最終濃度）。この濃度の範囲でのトラネキサム酸は３０００乃至１００００ＫＩＵ／ｍｌの活性を有するアプロチニンと同じ効力を示す。好都合なことに、アプロチニンの代りにトラネキサム酸を含んでいるフィブリングルーは傷を治療するのにより効果的である。トラネキサム酸を含む本発明のフィブリングルーには、接着を解消しなくてはならないと望む時間に応じてトラネキサム酸の濃度を変化させることができるという長所がある。この時間は様々な症状によって変り、グルー内のトラネキサム酸含有量を（初期濃度で）５乃至１００ｍｇ／ｍｌの範囲で変えることで調節できる。トラネキサム酸は、また引っ張り強度を増大させるという良い効果をもたらす。好ましいゲル化性を有する物質として本発明に用いられるグリコサミノグリカン・ヒアルロン酸は、好ましくは分子量が１０⁵乃至３．６×１０⁶であり、１％以下、好ましくは０．５％以下の濃度範囲で用いられる。低分子量のヒアルロン酸はクロットの弾力性と引っ張り強度を維持、増大させるので、低分子量ヒアルロン酸をグルーに用いることが好ましい。一方、高分子量ヒアルロン酸は、それを含むクロットの引っ張り強度を減少させる。低分子量ヒアルロン酸とは、分子量が４０００００乃至１００００００ダルトンの範囲にあるヒアルロン酸である。例えばヒアルロン酸を有する接着剤は、おそらくはヒアルロン酸の高い表面張力と比較的高い粘性のために優れた性質を示す。例えば、手術で従来のフィブリングルーを吹きかけると、グルーは脇に漏れ出すので執刀助手が吸い取ったり、タオルやスポンジに吸わせたりする。しかし、例えばヒアルロン酸を有するフィブリングルーは吹きかけられた所に留まっている。このような成分を含まない接着剤は乾きやすく、硬くなって動いたときに組織を傷つける恐れのあるナイフ形のクロットになることがある。このような従来のフィブリングルーの性質とは対照的に、例えばヒアルロン酸を有する接着剤は、中に含まれているプロテアーゼによって消滅するまでの数日間、湿度と柔軟性を保っている。クロットが消滅するまでの時間は、クロット内にあるトラネキサム酸のようなプロテアーゼ阻害剤の量によって調節できる。さらに、ヒアルロン酸を用いると、生じたフィブリンのクロットが体内の他の部分には目的とする特定の部位ほどの接着性を示さなくなるという利点がある。このことは本発明のフィブリングルーによって生じたクロットそれ自身が、周囲の組織への癒着の接着性を減少させることを意味する。これは実験動物の腹膜腔内にヒアルロン酸を含有するフィブリングルーを注入することで見ることができる。一方、従来のフィブリングルーだと、後で手術をしてみると腸の癒着が拡大しているのが分る。ヒアルロン酸のようなグリコサミノグリカンを例とするゲル化性を有する保湿物質を用いることのもう一つの利点は、接着剤中に様々な抗生物質を添加して、接着剤から抗生物質を放出することができる点である。このような抗生物質の添加の例としては、ゲンタマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、セファメジン、セファジディンなどを４乃至１５μｍもしくはそれ以下の濃度で加えたり、コリラシンを約７０μｍもしくはそれ以下の濃度で添加したりすることが挙げられる。このことは特に、感染した部位を手術する場合や、整形外科手術、腹部の手術、皮膚移植などに極めて好都合である。ゲル化剤としてヒアルロン酸を用いる場合、分子量は３０００００乃至３．６ ×１０⁶が好ましい。ヒアルロン酸の濃度範囲は０．１から２％が好ましい。分子量や濃度は適用する分野によって調節できる。例えば、眼内の用途に使用する場合、ゲル化作用を有する薬剤は、例えば分子量３．６×１０⁶のヒアルロン酸のような高分子量のものを用いる。骨の移植に用いるためにヒドロキシアパタイト粒子を接着剤中に添加する場合は、例えば、分子量１−２×１０⁶のヒアルロン酸を約０．４％の濃度で用いて、接着剤中でヒドロキシアパタイトが均一に分散するようにする。止血の用途にヒアルロン酸のようなゲル化剤を添加する場合は、分子量約５０００００のヒアルロン酸のような低分子量のゲル化作用を有する物質を用いることがより好ましい。このとき、濃度は０．０５−０．１％の低濃度が好ましい。この濃度だと充分な表面張力があるので、吹きかけられた組織と接着剤とがほとんど瞬時に接着し、不必要あるいは望まない部位に接着剤が漏れ出すのを防止できる。本発明のフィブリングルーの第二の成分である成分Ｂは、フェブリノーゲンを特異的に切断する能力のある蛋白分解酵素の溶液によって調製される。通常は、ヒトやウシのような哺乳類の血漿から単離されたトロンビンが用いられてきている。このトロンビンは凍結乾燥した形で入手できる。この凍結乾燥トロンビンは４０ｍｍｏｌの塩化カルシウム溶液でもどす。好ましいトロンビンの濃度は５０乃至２００ｕ／ｍｌである。ウィルス不活性なトロンビンを用いることが好ましい。速効性フィブリングルーを作るには、塩化カルシウム溶液で約１００ｕ／ｍｌのトロンビン溶液を作る。また例えば、抜歯や下垂体切除手術によって生じた穴を埋めるのに用いるような遅効性フィブリングルーを作るには、トロンビンをさらに適当な塩化カルシウム溶液で薄めて２５ｕ／ｍｌの濃度にする。本発明のフィブリングルーのさらにまた別の好ましい態様は、成分Ｂとして蛇毒から単離した蛋白分解酵素を含むものである。この態様は、また、トロンビンに対する抗体を生じている患者を治療することが可能なので好都合である。さらに、ヘパリンで予め治療を受けている患者も、ヘパリンは蛇毒酵素の反応に影響を与えないので本発明によるフィブリングルーで治療できる。南アメリカの毒蛇（pit viper）ボトロポス・マウジーニ（Bothrpos moujeni）から単離できる蛇毒酵素バトロキソビンを用いることが好ましい。トロンビンの代りに蛇毒酵素を用いる場合、成分Ｂには０．５乃至１０ｕ／ｍｌの蛋白分解酵素が含まれることが好ましい。バトロキソビンは化学的には、分子量約３６０００の単鎖のグリコペプチドである。デフィブラーゼ（商品名）はフェブリノーゲンのα 16Arg/17Glyの結合を切断して、その結果、フィブリノペプチドＡの放出とフィブリンＩ単量体の形成が起きる。本発明のフィブリングルーにはまた、精製したフィブリノーン、フィブロネクチンおよび第XIII因子を成分Ａとして使用することができる。こうすると、後出血の危険を減少させることができる。成分Ｂの調製するのに蛇毒から得られる蛋白分解酵素を使用する場合、フィブリノーン、フィブロネクチンおよび第XIII因子を含む「従来の」成分Ａを使うことができる。好ましい態様は、トラネキサム酸と寒冷沈降物から得られる本発明の成分Ａと蛇毒から単離される蛋白分解酵素を含む本発明の成分Ｂとの組合せである。トラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質を含有する本発明のフィブリングルーを製造するプロセスの中には成分Ａを調製する作業があり、この作業の中には寒冷沈降物から寒冷溶液を調製する作業がある。すなわち、 −ウイルス不活性化 −殺ウイルス剤の除去 −トラネキサム酸および／またはゲル化性物質の添加 −適当なプロテアーゼ溶液の調製、である。寒冷パスタは４乃至１０℃で一晩、予備解凍することが好ましい。寒冷パスタは、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウムとグリシンを含むｐＨ７．０乃至７．２の緩衝液に溶かして、３０乃至３５℃に加熱する。寒冷パスタはすぐに溶ける。解凍した後、寒冷パスタを細かく切ることで溶解する時間を短縮できる。溶液を室温にまで冷却し、ｐＨを７．０乃至７．２に調整してから、撹拌しながら水酸化アルミニウムを加える。沈殿物は遠心分離によって除去する。ロ過を行なってもよい。次に塩化カルシウムを所望の濃度になるまで加える。ウイルスを不活性化するために、溶液を３０℃まで加熱して洗浄剤を加える。さらにしばらく撹拌してから、溶液をウイルスで汚染されていない容器に移して僅かに昇温した状態で撹拌せずに数時間放置する。ヒマシ油を加え、数分間おだやかに撹拌して殺ウイルス剤を除去する。油層と水層が分離したら溶液を室温まで冷却する。水層をウイルスで汚染されていない容器に取り、油層を捨てる。水層はロ過によって浄化する。ｐＨが７．０乃至７．２になっていることを必ず確認してから、蛋白溶液をポンプによって室温で逆相カラムに導入する。蛋白含有量（１０乃至６０ｍｇ／ｍｌの範囲）を測定した後、溶出液を限外ロ過によって濃縮し、蛋白含有量を６０乃至１００ｍｇ／ｍｌにする。さらに、塩化カルシウムを比較的高濃度にした以外は上述した緩衝液と同様の緩衝液で透析する。次に、トラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質あるいはその生理学的に許容できる塩を添加する。無菌ロ過を行なってから、試料を適当な容器に満たして完全に凍結させる。抗フィブリン溶解剤であるトラネキサム酸はクロット形成成分と一緒に凍結乾燥してはならないが、別々に添加することはできる。このことは寒冷沈降物が、例えば、少なくとも第３因子について、極めて効果的に濃縮できるので好都合である。抗フィブリン溶解剤は、トロンビンあるいは蛇毒からなる成分Ｂのプロテアーゼの調製の種類とは無関係に添加することができる。成分Ｂは凍結乾燥プロテアーゼであることが好ましい。特に、凍結乾燥トロンビンもしくは南アメリカの毒ヘビ（pit viper）ボトロポス・マウジーニ（Bothr pos moujeni）から得たものを凍結乾燥したものであることが好ましい。この蛋白分解酵素は、レプティラーゼという商品名で知られており、バトロキソビン酵素である。蛋白分解酵素は塩化カルシウム緩衝液に溶解させる。あるいは、ゲル化性を有する物質を成分Ｂに添加する。これは成分Ａと成分Ｂの両方に混入させてもよい。二成分ＡとＢを塗布するには、例えばプラスチック性のコネクターを通した二重注入法を用いることが好ましい。この二成分を混合するとクロットが形成される。塗布は、カニューレを通したり、３本の導路を有するカテーテルを用いて吹きかけたりして行なうことができる。成分のそれぞれを別々の導路から吹き出させ、混合物を吹きかけるために第３の導路に数気圧の空気圧源を接続する。本発明のフィブリングルーは、深刻な血液凝固障害の患者に使用することができ、しかも従来のフィブリングルーより安価であるので好都合である。例えば、重い血友病患者の抜歯を第VIII因子濃縮液の点滴なしに成功率８０％で行なうことができる。このことは抜歯後の出血のために点滴をする必要のある患者が、僅か５分の１にすぎないことを意味する。さらに、予めヘパリンで治療を受けているこのような患者も本発明のフィブリングルーで治療することができる。本発明のさらなる利点は、フィブリングルーの第二成分に含まれるトロンビンに対する抗体を生じてしまった患者でも、トロンビンの代りに蛇毒から得たプロテアーゼ、特にデフィブラーゼ（商品名）を用いた本発明のフィブリングルーで治療できることである。このデフィブラーゼ（商品名）は南アメリカの毒ヘビ（pit vipe r）ボトロポス・マウジーニ（Bothrpos moujeni）から単離したセリン・プロテアーゼ・バトロキソビンである。ヒト・フィブリノーゲン（Ｌ等級）はカビ社（ストックホルム）製、ウシ・トロンビンはメルツ−ダーデ社製を用いた。色素基質Ｎ−アミノ−ａ−ベンゾイル −ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）と分析用試薬はシグマ社（セントルイス、ミズリー州）製であった。試薬および塩は０．０１５Ｍのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で希釈した。フィブリノーゲンはトリス緩衝液で透析し、濃度は換算係数Ｅ^1%２８０＝１５を用いて２８０ｎｍの吸光度によって決定した。ウシ・トロンビンは市販のもの（メルツ−ダーデ社製またはパーク・デイビス社製）を用い、製造者によって決定された活性を採用した。ＦＰＡのみを放出する蛇毒レプティラーゼ（商品名）はペンタファーム社（バーゼル）製を用いた。レプティラーゼ（商品名）の蛋白分解活性はトロンビンの蛋白分解活性にそろえて標準化した。この標準化は、非特異的色素基質ＢＡＰＮＡのトリス／生理的食塩水溶液（０．２５ｍＭ、ｐＨ８．０、３７℃）に対する蛋白分解速度を１５分間４０５ｎｍで測定・比較することで行なった。レプティラーゼの単位活性は、エステル化分解活性を基準にしてトロンビンの単位活性にそろえて標準化した。フィブリングルーは、二重注入法で、一方の注射器に純粋もしくは寒冷沈降物フィブリノーゲン基質を入れ、もう一方の注射器にレプティラーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）もしくはトロンビンとＣａＣｌ₂（２０ｍＭ）を入れて調製した。クロット形成時間（ＣＴ）はＡＣＬ凝固分析器リサーチモデル３００−Ｒ（ＩＬ社、ミラン）によって測定した。粘弾性（ＴＥＧ）は３７℃で３−チャンネルハイリガー・トロンボエラストグラフによって測定した。グルーの破壊強度（ＢＳ）は２枚の粗く編まれた合成繊維のメッシュ（０．５×１ｃｍ）の間でグルーの両成分を混合して、形成されたゲルが２枚の粗いメッシュに挟まれて織り混ぜられたようにし、２４℃で２時間放置した後にメシューゲル−メッシュとなった固まりをアクフォース・カディット張力計（アマテック、マンスフィールド・アンド・グリーン社、アメリカ）によって引っ張って測定した（グラム単位）。無菌寒冷沈降物（ｃｒｙｏ）は、凍結（−３０℃）ヒト血漿を４℃で解凍し、上澄みの血漿を除去して調製した。これを蛋白濃度とフィブリノーゲン濃度を決定するために５ユニット用意して、２Ｕ／ｍLのトロンビンで寒冷沈降物（１：５で希釈されたもの）のクロットを形成する前後で、それぞれの濃度をビュレット法によって測定した。第XIII因子の測定は、試料を４Ｕ／ｍＬのウシ・トロンビンで２２℃、１０分間活性化したのち、ジメチル化されたカゼインに含まれる［³Ｈ］プトレッシンを測定することで行なった。典型的なクロット形成時間（ＣＴ）−フィブリノーゲン曲線の注目すべき特徴は、トロンビンもしくはレプティラーゼのレベルが一定であれば二相的であり、フィブリノーゲンが１−８ｍＭの範囲にあるとき最小に達することである。これはフィブリノーゲンが２０−４０ｍＭの範囲にあるときにピークとなる最大混濁度（１０分間経過後）によって幾分異なる。クロット形成時間（ＣＴ）がトロンビンもしくはレプティラーゼのレベルに依存していることは逆の実験をすることで分る。この曲線は、酵素が低いレベルにある時（２Ｕ／ｍＬ未満）は、ほぼ直線的にゲル化速度に逆依存し、高いレベルにあるときはほぼ一定になる。純粋フィブリンの粘弾性は、混濁度よりも幾分ゆっくりと増大していく。Ｃａ（II）は第XIIIａ因子を通じてゲルを補強する主要な補因子で、蛋白鎖同士の共有結合的な連結を誘引する。このようなゲルの架橋はゲルの機械的強度の原因であり、２０分後にはほぼ一定になる。第XIIIａ因子の活性を誘引するレプティラーゼの能力は好適なものである。蓄えられていた寒冷沈降物の蛋白レベル：５本のユニットから調製した、蓄えられていた寒冷沈降物は以下のような値を示した。蛋白：７５ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン：３６ｍｇ／ｍＬ第XIII因子：４．１０Ｕ／ｍＬ凝固速度：寒冷沈降物のクロット形成時間は、トロンビンもしくはレプティラーゼのレベルに直線的に依存している。しかし、酵素のレベルが３Ｕ／ｍＬを越えるとクロット形成時間にほとんど影響を与えなくなる。酵素のレベルが一定であると、連続した希釈率で希釈した寒冷沈降物を測定したクロット形成時間（ＣＴ）曲線は純粋なフィブリンの系で述べたようなフィブリノーゲンに依存した二相的なものになる。寒冷沈降物グルーの粘弾性（ＴＥＧ）と破壊強度（ＢＳ）寒冷沈降物グルーの粘弾性が増大する様子を、トロンビンとレプティラーゼの両方についてそれぞれ調べた。これは混濁度が増して行くよりも、ずっと時間がかかる。しかし、過剰のＣａＣｌ₂とトロンビンもしくはレプティラーゼの一方とから得られた寒冷沈降物グルーは、どちらも同じ時間でほぼ同じ粘弾性（ＴＥＧ）を示した。ゲル化の最初の開始時から、第XIIIａ因子によって引き起こされた架橋がゲルの繊維構造を支え、そのため両方のグルーともに１時間以内に粘弾性（ＴＥＧ）の値が収束するようである。過剰のＣａＣｌ₂で形成された両方の寒冷沈降物グルーの最終的な破壊強度（ＢＳ）についても同様で、両方とも５０乃至６０ｇで破壊される。これらの実験から、グルー内部のゲル繊維は第XIIIａ因子によって引き起こされる共有結合的な架橋によって補強されていくことが分る。寒冷沈降物溶液の調製市販の寒冷パスタを４乃至１０℃で一晩、予備解凍する。１Ｋｇの寒冷沈降物を２リットルの緩衝液（１２０ｍＭ／１のＮａＣｌ、１０ｍＭ／ｌのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭ／ｌのグリシンでｐＨ７．０−７．２）に溶かし、３０乃至３５℃に予備加熱する。寒冷パスタはすぐに溶けるはずだが、そうでない場合、その寒冷パスタはこの調製には適さない。溶解する時間を短縮するために、解凍した後、寒冷パスタを細かく切る。その後、溶液を２０乃至２２℃にまで冷却し、ｐＨを調べる。場合によっては、希水酸化ナトリウム水溶液または酸性酸を加えて、ｐＨを７．０乃至７．２に調整する。１００ｍｌの水酸化アルミニウムを加え、さらに３０分間撹拌する。沈殿物は遠心分離によって除去し、上澄みを１μｍのフィルターを用いてロ過する。０．１Ｍ／１のＣａＣｌ₂を加えて、Ｃａ²⁺の最終濃度が１ｍＭ／ｌとなるようにする。再びｐＨを調べなくてはならない。ウイルス不活性化溶液を３０℃まで加熱し、１％Ｗ／ｖのＴＮＢＰと１％Ｗ／ｖのトライトンＸ１００を加える。混合物を１／２時間おだやかに撹拌してから、溶液をウイルスで汚染されていない容器に移して３０℃で撹拌せずに３時間半放置する。殺ウイルス剤の除去上記のようにして調製した混合物に１５０ｍｌのヒマシ油を加え、３０分間おだやかに撹拌する。油層と水層とが分離するのを待っている間（３０乃至４５分間）に、溶液を２０℃に冷却する。水層をウィルスで汚染されていない容器に取り、油層を捨てる。水層は１μｍ／０．４５μｍのフィルターで連続的にロ過して浄化する。この蛋白溶液をポンプによって室温で逆相カラム（Ｃ−１８−カラム）に３リットル／時間の速さで導入する。処理量を紫外線で監視し、吸光度が５０％に回復するまで集める。得られたフラクションには約４０ｍｇ／ｍｌの蛋白が含まれていることが検査によって分る。溶出液は限外ロ過によって濃縮し、蛋白含有量を７０乃至８０ｍｇ／ｍｌにして、充分な量の緩衝液Ｂ（１ｍＭ／ｌの塩化カルシウムを加えた以外は、緩衝液Ａと同じ成分）で透析する。次に、トラネキサム酸またはその生理学的に許容できる塩を１０乃至２００ｍｇ／ｍｌ溶液（緩衝液Ａ内での最終濃度）で加える。０．４５μｍとｏ．２μｍのフィルターを使って連続的に無菌ロ過を行なってから、溶液をプラスチック製の袋に満たして完全に凍結させる。場合によって凍結乾燥してもよい。トロンビン溶液の調製凍結乾燥トロンビンを４０ｍＭ／Ｌの塩化カルシウム溶液に溶解させる。グルー内のトロンビンの量は１００Ｕ／ｍｌである。例えば、傷口に吹き付けるのに用いるような速効性グルーの場合、塩化カルシウム溶液内のトロンビンの濃度は１００Ｕ／ｍｌで充分である。一方、例えば、抜歯や下垂体切除手術によって生じた穴を埋めるのに用いるような遅効性フィブリングルーを作るには、トロンビンにさらに多量の塩化カルシウム溶液を加えて最終濃度が３乃至５Ｕ／ｍｌになるようにする。得られたトロンビン溶液は熟練者によって公知の方法でウイルス不活性にする。レプティラーゼの調製もトロンビンの場合と同様であるが、レプティラーゼのの量は約２Ｕ／ｍｌである。ゲル化性を有する物質は、成分Ａと成分Ｂの両方に混入させることができる。このような薬剤の典型的な例であるヒアルロン酸もしくはその生理学的に許容できる塩は、利用する分野に応じて０．１から２％の濃度で成分ＡおよびＢの緩衝液に溶解させる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年３月２８日【補正内容】請求の範囲（補正後）１。請求の範囲第８項記載の方法によって得ることができる濃縮寒冷沈降物と、充分な量のトラネキサム酸、すなわち４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、もしくはその生理学的に許容できる塩とからなる成分Ａ、および成分Ａの中に存在するフィブリノーゲンを特異的に切断して、フィブリンポリマーの形成を引き起こすことができる蛋白分解酵素を含む成分Ｂ、からなるウイルス不活性フィブリングルー。２。傷の治療薬および／またはヒアルロン酸などのムコ多糖類のようなゲル化性を有する物質が付加的に加えられている請求の範囲第１項記載のフィブリングルー。３。前記成分Ｂの蛋白分解酵素が哺乳類もしくはヒトから得られたトロンビンである請求の範囲第１項および／または第２項のいずれか一項記載のフィブリングルー。４。前記成分Ｂが蛇毒から得られた蛋白分解酵素を含有し、その酵素が成分Ａの中に存在するフィブリノーゲンを特異的に切断してフィブリンポリマーの形成を引き起こすことができる酵素である請求の範囲第１項および／または第２項のいずれか一項記載のフィブリングルー。５。前記蛇毒酵素が南アメリカの毒蛇（pitv iper）ボトロポス・マウジーニ（Bothrpos moujeni）から単離されたバトロキソビンである請求の範囲第４項記載の生体組織用グルー。６。前記成分Ａとして、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、第XIII因子およびトラネキサム酸を含有している請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか一項記載のフィブリングルー。７。前記成分Ｂが、請求の範囲第４項および／または第５項による蛋白分解酵素もしくはトロンビンの溶液である請求項第６項記載のフィブリングルー。８。請求の範囲第１項から第７項に記載のフィブリングルーの製造法であって、 −寒冷沈降物から寒冷溶液を調製する工程からなる成分Ａの調製 −ウイルス不活性化 −殺ウイルス剤の除去 −限外ロ過による溶出液の濃縮 −トラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質もしくは、それらの生理学的に許容できる塩の添加、および成分Ｂとしての、適当なプロテアーゼの適当な溶液の調製からなるフィブリングルーの製造法９。トラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質もしくは、それらの生理学的に許容できる塩の、フィブリングルーの成分として用いる用途。１０。中間生成物としての、請求の範囲第１項、第２項および／または請求の範囲第６項のいずれか一つに記載した成分Ａ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１。全血の寒冷沈降物と、充分な量のトラネキサム酸、すなわち４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、もしくはその生理学的に許容できる塩とからなる成分Ａ、および成分Ａの中に存在するフィブリノーゲンを特異的に切断して、フィブリンポリマーの形成を引き起こすことができる蛋白分解酵素を含む成分Ｂ、からなるフィブリングルー。２。前記成分Ａの寒冷沈降物が濃縮されている請求の範囲第１項記載のフィブリングルー。３。傷の治療薬および／またはヒアルロン酸などのムコ多糖類のようなゲル化性を有する物質が付加的に存在している請求の範囲第１項記載のフィブリングルー。４。前記成分Ｂの蛋白分解酵素が哺乳類もしくはヒトから得られたトロンビンである請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項記載のフィブリングルー。５。前記成分Bが蛇毒から得られた蛋白分解酵素を含有し、その酵素が成分Ａの中に存在するフィブリノーゲンを特異的に切断してフィブリンポリマーの形成を引き起こすことができる酵素である請求の範囲第１項乃至第３項の何れか一項記載のフィブリングルー。６。前記蛇毒酵素が南アメリカの毒蛇（pit viper）ボトロポス・マウジーニ（Bothrpos moujeni）から単離されたバトロキソビンである請求の範囲第５項記載の生体組織用グルー。７。前記寒冷沈降物および成分Ｂがウイルス不活性化されている請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか一項記載のフィブリングルー。８。前記成分Ａとして、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、第XIII因子およびトラネキサム酸を含有している請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか一項記載のフィブリングルー。９。前記成分Ｂが、請求の範囲第５項および／または第６項による蛋白分解酵素もしくはトロンビンの溶液である請求の範囲第８項記載のフィブリングルー。１０。請求の範囲第１項乃至第９項に記載のフィブリングルーの製造法であって、 −寒冷沈降物から寒冷溶液を調製する工程からなる成分Ａの調製 −ウイルス不活性化 −殺ウイルス剤の除去 −トラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質もしくは、それらの生理学的に許容できる塩の添加、および成分Ｂとしての、適当なプロテアーゼの適当な溶液の調製からなるフィブリングルーの製造法１１。トラネキサム酸および／またはゲル化性を有する物質もしくは、それらの生理学的に許容できる塩の、フィブリングルーの成分として用いる用途。１２。中間生成物としての、請求の範囲第１項から第３項および／または請求の範囲第８項のいずれか一つに記載した成分Ａ。