JPH08512291A

JPH08512291A - 血栓溶解の増強方法

Info

Publication number: JPH08512291A
Application number: JP6524399A
Authority: JP
Inventors: ガーフィンケル、レオナルド; ゴレキ、マリアン; パネット、アモス
Original assignee: バイオ−テクノロジー・ジェネラル・コーポレーション
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 1996-12-24
Also published as: EP0701606A1; EP0701606A4; AU677659B2; ZA942818B; WO1994025582A1; CA2159508A1; IL109383A0; AU6667694A

Abstract

(57)【要約】血小板糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）結合ドメインを含むフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）の断片を公知の治療方法と併用して、血栓に対する防御の増強、血栓溶解の向上、血栓溶解治療後の再閉塞などの症状の低減を達成する方法が提供される。加えて、該ｖＷＦ断片およびアスピリンの使用により、外傷性血管損傷後の合併症を防止する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】血栓溶解の増強方法〔発明の背景〕本出願は、血栓に対する防御の増強、血栓溶解の改善および血栓溶解治療後の再閉塞傾向の低減を達成するために、公知の治療法と組合わせて、血小板糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）結合ドメインを含むフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）の断片を使用することを志向するものである。括弧内のアラビア数字で参照される参照文献は、本明細書の末尾、請求の範囲の直前に記されている。フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は、血管壁の内側表面の裏打ち層を形成する内皮細胞内において、血小板の前駆体である巨核球により合成される大きな血漿タンパク質である。成熟したｖＷＦは、数種類のタンパク質への結合部位を構成するドメインを含んだ多価分子である。ドメインの一つは、血小板糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）への結合部位を構成する。タンパク質の分解消化を用いることによって、この部位は成熟したｖＷＦのアミノ酸残基４４９から７２８の間の領域の位置と決定された。加えて、ｖＷＦは、少なくとも２つのコラーゲン結合部位、少なくとも２つのヘパリン結合部位、一つの第ＶＩＩＩ因子結合部位、および血小板ＧＰ・ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターに結合する一つのＲＧＤ部位を有している。フォン・ビルブラント因子は、止血において重要な役割を果たし（２４）、その欠如は遺伝性出血性障害のフォン・ビルブラント病（ＶＷＤ）をもたらす。最近の研究により、フォン・ビルブラント因子は、特に狭窄冠状動脈において発生するような強い剪断応力を特徴とする血流条件の下での血小板血栓の形成に必須であることが分かった（２４）。フォン・ビルブラント因子は、血小板膜上の糖タンパク質であるＩｂレセプターと相互作用して血小板粘着を開始させ（１３− １５）、血小板凝集および血栓形成を起こさせるＡＤＰ、トロンボキサンおよびセロトニンの血小板からの放出を活性化させる（１６−２０）。このため、血小板糖タンパク質であるＩｂレセプターをブロックすることによって、血小板粘着および血栓形成を防止する努力がなされてきた。例えば、アウリントリカルボン酸は、フォン・ビルブラント因子の血小板糖タンパク質Ｉｂ認識部位をブロックし、抗血栓治療に有益ではある（２５）。ｖＷＦ（特にｖＷＦのＧＰＩｂレセプターへの結合）が正常な血小板粘着にとって必須であることの根拠は、臨床上の観察および試験管内での研究の両方に基づいている。フォン・ビルブラント病（ｖＷＤ）の出血性障害の患者は、ｖＷＦのレベルが低いか、またはｖＷＦを完全に欠損している。或いは、それらの患者は欠陥のあるｖＷＦを有しているのであろう。別の障害である、ベルナールースーリエ症候群(Bernard-Soulier Syndrome:BSS)は、ＧＰＩｂレセプターを欠失している血小板を特徴とする。止血は、動的かつ継続的なプロセスである。このプロセスは、一方では出血を防止するための凝血塊形成が含まれ、他方では全身の血流を維持するためには望ましくないフィブリン沈着および血小板凝集の溶解および分解が含まれる。研究により、ほとんどの急性経壁心筋梗塞は、アテローム硬化症の冠状動脈内の血栓形成により引き起こされることが分かっている（１−４）。血管壁を覆う保護内皮の断裂は、血小板粘着、血小板凝集および血栓をもたらし、これにより心筋への血液供給がブロックされる（５−７）。組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびストレプトキナーゼのような血栓溶解剤は、急性経壁心筋梗塞（「Ｑ波梗塞」）の患者の血栓の治療に有効であることが示されており（８−１０）、例えばヘパリンおよびアスピリンなどの抗凝固剤のような補助薬と共にしばしば投与される。しかしながら、患者の１５−２０％は再灌流に至らない。加えて、冠状動脈の再閉塞によって、ある数の患者においては血栓溶解治療の効果が制限あれている（１１−１２）。したがって、血栓溶解に至る時間を短くし、かつ血栓溶解後の再閉塞の発生を減少させることにより血栓溶解治療法を強化することは、血栓溶解治療の分野において著しい進歩であろう。冠状動脈の血栓症および再閉塞の両方において、血小板粘着は開始事象である。血小板粘着において、多価タンパク質のフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は、内皮下の細胞外マトリックスと循環している血小板表面上の糖タンパク質Ｉｂとの間に架橋を形成する（１３−１５）。内皮下層への血小板の粘着は血小板の活性化をもたらし、またアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、トロンボキサンおよびセロトニンの放出を導く。これらのことが今度は、さらに別の血小板を活性化する。最終的に、血小板の栓が形成される（１６−２０）。従って、血小板粘着を防止することは、冠状動脈の血栓および再閉塞を防止する上で有益であろう（２１）。フォン・ビルブラント因子から単離された数種のペプチドは、血小板膜糖タンパク質Ｉｂレセプターに結合して、フォン・ビルブラント因子と糖タンパク質Ｉｂレセプターとの相互作用を阻害する。この阻害によって、血小板粘着および血小板凝集の阻害が導かれている（２２，２３）。その様なペプチドの一つで、ＶＣＬと称するものは、単鎖内でのジスルフィド結合により連結するＣｙｓ⁵⁰⁹残基およびＣｙｓ⁶⁹⁵残基を有する、フォン・ビルブラント因子の組換え断片Ｌｅｕ⁵⁰⁴−Ｌｙｓ⁷²⁸である（２３）。ＶＣＬは、本出願とともに譲渡された国際特許出願公開番号ＷＯ９１／１３９０３号に開示されており、これにも、患者が血管形成術、血栓溶解治療または冠状動脈バイパス手術をうける前または後に、ｖＷＦ断片を単独で用いることにより、該患者における血小板凝集を阻害して望ましい効果を得る方法が開示されている。今回、ＧＰＩｂ結合ドメインを含むｖＷＦのポリペプチド断片を血栓溶解療法と併用して投与することにより、著しい治療上の改善が得られることが発見されたことは驚くべきことであり、かつ予期し得ないことであった。一つの側面において、再灌流までの時間短縮から明らかなように、血栓溶解に要する時間は著しく短くなる。別の側面では、血栓溶解治療後の再閉塞の発生は顕著に少なくなる。例えば心臓血管手術等の外科手術のように、血栓発生が予測される場合には、ｖＷＦのポリペプチド断片による予備治療によって血栓の発生を減少させ得るであろう。加えて、ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドおよびアスピリンは、外傷性血管損傷後の合併症を相乗的に防止することが発見された。〔発明の概要〕本発明は、血栓溶解までの時間を短縮し、かつ血栓溶解後の再閉塞の発生を低減する血栓溶解剤および抗凝固剤と併用して、ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを投与することを具備した、血栓溶解を増強する方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、患者における外傷性血管損傷後の合併症を防止するための方法であって、協同して前記合併症の防止に有効である、所定量のｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドと、所定量のアスピリンとを併用して、前記患者に対して投与することを具備した方法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１：ｐｖＷＦ−ＶＣ３プラスミドこの図は、ｄｅｏＰ₁Ｐ₂プロモーターの制御の下でｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを発現する、ｐｖＷＦ−ＶＣ３プラスミドを示す。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｓφ９３０株に導入して、ＡＴＣＣ受付番号６８２４１号として寄託された。図２：ｐｖＷＦ−ＶＣＬプラスミドこの図は、λＰ_Lプロモーターおよびｄｅｏリボゾーム結合部位の制御下にあり、ｐｖＷＦ−ＶＣ３の場合と同じｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを発現するｐｖＷＦ−ＶＣＬプラスミドを示す。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）４３００（Ｆ^-）株に導入して、ＡＴＣＣ受付番号６８２４２号として寄託された。図３Ａ−３Ｃ：ｐｖＷＦ−ＶＣ３プラスミドおよびｐｖＷＦ−ＶＣＬプラスミドにより発現されたｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの翻訳された配列この図は、ｐｖＷＦ−ＶＣ３プラスミド（ＡＴＣＣ受付番号６８２４１号）およびｐｖＷＦ−ＶＣＬプラスミド（ＡＴＣＣ受付番号６８２４２号）により発現された、フォン・ビルブラント因子のＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの翻訳された配列を示す。この配列は、Ｎ末端メチオニンを含む２２６アミノ酸からなる。１から始まるヌクレオチドおよびアミノ酸の番号表示は欄外に示される。Ｍｅｔ¹はイニシエーターのメチオニンである。配列Ｌｅｕ²−Ｌｙｓ²²⁶は、国際特許出願公開番号Ｗ０９１／１３９０３号の図１２に示された、フォン・ビルブラント因子の配列Ｌｅｕ⁵⁰⁴−Ｌｙｓ⁷²⁸と同一である。図４：前処置した犬における閉塞時間生理食塩水、ＶＣＬおよびアスピリン（ＡＳＡ）の静脈内投与により前処置した動物の冠状動脈において、電気的な傷害から閉塞型血栓が形成されるまでの経過時間（プロトコー０．００１。図５：前処置した犬における血栓溶解時間生理食塩水、ＶＣＬおよびアスピリン（ＡＳＡ）の静脈内投与により前処置した動物の冠状動脈において、ｔ−ＰＡ投与から血栓溶解に至るまでの経過時間（プロトコール１）。図６：前処置しない犬における血栓溶解時間前処置しない動物の冠状動脈において、血栓溶解剤の静脈内投与から血栓溶解に至るまでの経過時間（プロトコール２）。図７：前処置した犬における再閉塞時間生理食塩水、ＶＣＬおよびアスピリンにより前処置した動物の冠状動脈において、血栓溶解から再閉塞が生じるまでの経過時間（プロトコール１）。生理食塩水にｔ−ＰＡを組合わせたもの、およびアスピリンにｔ−ＰＡを組合わせたもの図８：前処置しない犬における再閉塞時間ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリンにより処置した動物の冠状動脈において、血栓溶解から再閉塞が生じるまでの経過時間（プロトコール２）。ｔ−ＰＡにヘパリンを組合わせたもの、並びにｔ−ＰＡにヘパリンおよびアスピリ０．００１。図９：血栓溶解治療後のヘマトクリット値ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリンによる治療の前後でのヘマトクリット値の変化（プロトコール２）。図１０：血栓溶解治療後の凝固時間ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリン（ＡＳＡ）による処置の前（時間０）、並びに５、６０、１２０および１８０分後の活性化凝固時間（activate d clotting time;ＡＣＴ）（プロトコール２）。それぞれの処置以前の対照のレ図１１：ＶＣＬ治療後の血小板凝集ＶＣＬの静脈内投与による治療前（対照）および治療後の間の、ＡＤＰに誘導された体外での血小板凝集の変化（分図Ａ）およびボトロセチン(botrocetin)に誘導された血小板凝図１２：アスピリン治療後の血小板凝集アスピリンの静脈内投与による治療前（対照）および治療後の間の、ＡＤＰに誘導された体外での血小板凝集の変化（分図Ａ）およびアラキドン酸に誘導された体外での血小板図１３：ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドとアスピリンとの相乗作用この図は、例３に記載された実験の結果を、経時的な血小板沈着量として示す。■−アスピリン＋ＶＣＬ＠１ｍｇ／ｋｇ＋２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ；●−ＶＣＬ単独＠４ｍｇ／ｋｇ＋８ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ；▲−対照；▼−ＶＣＬ単独＠１ｍｇ／ｋｇ＋２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ；◆−アスピリン単独。〔発明の詳細な説明〕本発明は、患者における血栓溶解治療を増強する方法であって、血栓溶解剤および抗凝固剤と併用して、前記血栓溶解治療の増強に有効な量の、フォン・ビルブラント因子の血小板糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインポリペプチドを患者に投与することを具備した方法に向けられている。血栓溶解治療を増強するとは、本明細書中では、血栓溶解および再灌流までの時間を短縮すること、並びに血栓溶解後の再閉塞の発生を減少させることとして定義される。「併用して(in conjunction)」の語は、『事前』、『最中』または『事後』の併用を意味することとして定義される。血栓溶解剤は、当業者に公知のいずれの血栓溶解剤であってもよい。血栓溶解剤の例には、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびストレプトキナーゼが含まれる。本発明の複合治療もまた、封鎖された血管を血管再生するため、および血管の開放性を維持するための他の公知の方法（例えば血管形成術）と併用して用い得ると考えられる。本発明の血栓溶解治療には、血栓溶解剤に加えて他の薬学的物質、例えば、別々にまたは併用して用いるヘパリンおよびアスピリンのような抗凝固剤が含まれる。当業者が血栓溶解治療のために投与する、上記以外の公知の抗凝固剤を用いてもよい。本発明の特別の態様においては、当該ポリペプチドは静脈内投与される。本発明の好ましい態様においては、静脈投与は、１回の注射、継続的点滴、または１回の注射に続く継続的点滴によりなされる。本発明の特別の態様においては、当該ポリペプチドは、１回当り０．４−４０ｍｇ／ｋｇ体重の適用量で静脈内に投与される。本発明のさらに好ましい態様においては、当該ポリペプチドは、１回当り１− ２０ｍｇ／ｋｇ体重の適用量で静脈内に投与される。本発明の特に好ましい態様においては、当該ポリペプチドは、１回当り２−１０ｍｇ／ｋｇ体重の適用量で静脈内に投与される。本発明の特定の態様においては、当該ポリペプチドは、毎時０．２−２０ｍｇ／ｋｇ体重の速度で継続的点滴により静脈内に投与される。本発明の特に好ましい態様においては、当該ポリペプチドは、毎時１−１０ｍｇ／ｋｇ体重の速度で継続的点滴により静脈内に投与される。本発明の最も好ましい態様においては、当該ポリペプチドは、０．４−４ｍｇ／ｋｇ体重の適用量で１回の静脈内に投与の後、毎時０．２−２０ｍｇ／ｋｇ体重の速度で継続的点滴される。別の側面において、本発明は、例えば心臓血管手術のような外科手術の間に起こり得るように、血栓症の発生が予見される状況にも関連する。この様な状況下で、ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドによる予備治療は、血栓症の発生を減少させ得るであろう。他の側面において、本発明は、患者における外傷性血管損傷後の合併症を防止するための方法であって、所定量のｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを、所定量のアスピリンとともに、両者合わせて合併症の防止に有効な量で、患者に対して投与することを具備する方法を提供する。外傷による血管破損の原因の例としては、冠状動脈バイパス手術、血管形成術、血栓溶解または不安定狭心症が例としてあげられるが、これらに限定されるものではない。その他の治療的または臨床的作為を原因とする、外傷性血管損傷もまた包含される。外傷性血管損傷の結果としてもたらされる合併症の例としては、心筋梗塞、虚血症、冠状動脈バイパス手術、血管形成の反復または死が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の外傷性血管損傷の結果としての合併症もまた包含される。ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの有効量は、注射１回の適用量で約０．１−２０ｍｇ／ｋｇおよび継続的点滴で０．１−２０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲にあり、また、アスピリンの有効量は約０．１−５０ｍｇ／ｋｇ範囲にある。正確な投与量は、治療の当該事例の詳細に基づいて、当業者が容易に決定することであろう。ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドは、当業者に公知のいずれかの適切な臨床的手段により投与され得るが、静脈投与が本発明の好ましい態様である。アスピリンは、経口的または非経腸的投与のような、いずれかの臨床上許容し得る方法により投与することができ、単回投与、多回投与または継続的投与により投与することができる。非経腸的投与には、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与が該当する。フォン・ビルブラント因子の糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）結合ドメインは、天然のフォン・ビルブラント因子または、例えば細菌、真菌、植物、昆虫または哺乳類の細胞内での組換えタンパク質の産生のような多くの供給源から得ることができる。「フォン・ビルブラント因子の糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインポリペプチド」という術語は、ＧＰＩｂ結合機能を有するという条件で、本発明の方法に用い得るＧＰＩｂ結合ドメインの同族体(homolog)をも包含する。ここで用いる場合、ポリペプチドの同族体とは、当該ポリペプチドと実質的に等しいアミノ酸配列および実質的に等しい生物学的活性を有するポリペプチドである。従って、もし結果として得られる同族体ポリペプチドが本発明のポリペプチドの生物学的作用を保持しているのであれば、前記同族体は、１以上の非本質的なアミノ酸残基の付加、欠失または置換により、本発明のポリペプチドとは異なるものであり得る。当業者であれば、例えば、問題のポリペプチドのポリペプチド同族体のバクテリアによる発現をコードするＤＮＡ配列の設計及び製造、部位指向性突然変異誘発技術(site-directed mutagenesis techniques)によるｃＤＮＡおよびゲノム配列の改変(modification)、組換えタンパク質及び発現ベクターの構築、ポリペプチドのバクテリアによる発現、および従来の生化学的定量法を用いたポリペプチドの生化学的活性の測定について従来の方法を含む確立された周知の手法を用いて、どのアミノ酸残基が付加、欠失または置換（いずれのアミノ酸で置換され得るかも含めて）され得るかを容易に決定できる。本発明のポリペプチドの同族体の例は、本発明のポリペプチドにおいて特定された全てのアミノ酸残基よりも少ないアミノ酸残基を含む欠失同族体、１またはそれ以上の特定の残基が他の残基で置き換えられている置換同族体、および１以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中間の位置に付加されている付加同族体であって、それら同族体はすべて、本発明のポリペプチドの生物学的活性を同様に有するものである。実質的に同じアミノ酸配列とは、ここでは、当該ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端において４アミノ酸未満の付加または欠失を包含するものとして定義される。さらに、当該タンパク質の生物学的活性を欠落させない、配列における置換および／または欠失も存在し得る。置換の例は、ｃｙｓ（システィン）の代りにｓｅｒ（セリン）およびｇｌｙ（グリシン）の代りにａｌａ（アラニン）である。その他の置換は、当業者に公知である。置換は、例えば、次の文献に記載された相同基または等価基に従って、１０残基までを包含し得る。(Lehninger，Biochemistry,lnd ed. Worth Pub.,N.Y.(1975);Creighton,Protein Structure，a Pratical Approach， IRL Press al Oxford Univ．Press,Oxford,England(1989);and Dayhoff，Atlas of Protein sequence and structure 1972 ,National Biomedical Research Foun dation,Maryland(1972)) 実質的に同じ生物学的活性とは、当業者が同じ生物学的活性と認める程度にわずかに異なり得るような、当該ポリペプチドの生物学的活性と同じ活性をいう。「フォン・ビルブラント因子の糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインポリペプチド」という術語には、異なるアミノ酸配列を有するけれども実質的に同じ生物学的活性を有する、ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインの様々な変異体および変種(mutants and variants)をもまた包含される。本発明の意味するポリペプチドの生物学的活性とは、血小板の糖タンパク質Ｉｂへの結合能力または内皮下マトリックスへの血小板粘着を阻害する能力である。ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインを含んでいる組換えポリペプチドを産生するためのプラスミドおよび宿主の例は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、且つこれを満たして、ＺＩＰ番号２０８５２、メリーランド州ロックビルのパークローン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、それぞれ、ＡＴＣＣ受付番号６８２４１号および６８２４２号の下に１９９０年２月２６日に寄託された、Escherichia coli（大腸菌）Ｓφ９３０株中のｐｖＷＦ−ＶＣ３プラスミドおよびEscherichia coli（大腸菌）４３００（Ｆ^-）株中のｐｖＷＦ−ＶＣＬプラスミドである。実施例下記の例は、本発明の理解を助けるために記載されており、いかなる意味においても、その範囲を限定することを意図したものではなく、かつそのように解釈されるべきではない。以下の例には、ベクターの構築、問題のポリペプチドをコードする遺伝子の該ベクターへの挿入、または得られたプラスミドのバクテリア宿主への導入に採用されている従来の方法についての詳細な記載は含まれていない。その様な方法は当業者に周知であり、かつ、次の文献を含む多くの出版物に記載されている。(Sambrook,Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning：A Lab olatory Manual ，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA(19 89)）一般にはｖＷＦ、特にＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドに関する種々の方法および他の側面は、本出願と共に譲渡され、共に係属中の、１９９１年９月３日に出願された米国特許出願第７５３，８１５号、および共に譲渡されたＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／１３０９３号に開示されており、両者はともに参照として本出願に組み込まれている。 λＰ_Lプロモーターにより制御されたプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）による組換えタンパク質の発現に関係する方法は、特に本出願と共に譲渡され、１９９２年６月３０日に特許された米国特許５，１２６，２５２号に開示されており、これは参照として本出願に組み込まれている。例１：酸化され、かつ折り畳まれた生物学的に活性なｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの産生および精製ｐｖＷＦ−ＶＣＬプラスミド（図２）は、本出願と共に譲渡され共に係属中の、１９９１年９月３日に出願された米国特許出願第７５３，８１５号に記載されたように構築され、かつＡＴＣＣ受付番号６８２４２号の下に、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）４３００（Ｆ^-）株に維持されている。この宿主／プラスミド系は、λ Ｐ_Lプロモーターの制御の下で発現される遺伝子を保有するベクターについて、基本的に当該技術で知られているようにして培養される。すなわち、基本的に米国特許５，１２６，２５２号に記載されているように、対数増殖中間段階(mid-l og stage)まで３０℃で増殖させ、次いで４２℃で約２時間、ペプチドの誘導を行った。培養および誘導に続いて、培地は遠心分離され、得られた細胞塊(cel l cake)は、さらに後の処理を行うまで凍結保存された。これ以降の手順の一般的図式は、下記の工程Ａから工程Ｈからなっている。Ａ．封入体の単離上記の培養に続いて、細胞塊を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８），５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＤＴ，１ｍＭのＰＭＳＦ，および１０％グリセロールを含有する緩衝液中に再懸濁する。次いで、懸濁液に、超音波処理を施して細胞を破砕し、遠心分離して、不溶性の封入体(inclusion bodie s)を含むペレットを得る。封入体を含む得られたペレットは、最終濃度が８Ｍ尿素，２０ｍＭのＤＤＴ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），および１００ｍＭのＮａＣｌであるような溶液に、約１０％（ｗ／ｖ）となるように溶解する。この溶液は、下記のようにしてイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製され得る。或いは、封入体を、６Ｍ塩酸グアニジンを含む緩衝液中で可溶化し、続いて尿素への緩衝液交換を行ってもよい。また、封入体は異なる濃度の尿素、塩酸グアニジンもしくは他のいずれかの変性剤の存在下で、または変性剤の非存在下、例えば極端なｐＨにおいて溶解してもよい。Ｂ．陽イオン交換クロマトグラフィーこの工程で汚染物質のほとんどを除去し、９０％より高い純度のｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを調製する。例示すれば、ＣＭ（カルボキシメチル;carboxymethyl）−セファロース高速(fast flow)クロマトグラフィー（ファルマシア社製）のような、いかなる陽イオン交換クロマトグラフィーもこの工程で用いることができる。その官能基は、カルボキシメチル基、リン酸基、またはスルホプロピル基のようなスルホン酸基が可能である。そのマトリックスは、無機化合物、合成樹脂、多糖、または有機高分子を基材とすることができ、使用可能な素材としては、アガロース、セルロース、トリスアクリル(trisacryl)、デキストラン、ガラスビーズ、オキシランアクリルビーズ(oxirane acrylic beads )、アクリルアミド、アガロース／ポリアクリルアミド・コポリマー（ウルトロジェル;Ultrogel）または親水性ビニルポリマー（フラクトジェル;Fractogel）がある。具体的な態様において、該ポリペプチドは、８Ｍ尿素，１ｍＭのＤＤＴ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液にて平衡にされたＣＭ−セファロースＦＦカラムにロードされる。純粋なポリペプチドは、８Ｍ尿素，１ｍＭのＤＤＴ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），２００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に溶出する。ｍｌあたりのＣＭ−セファロースＦＦに、ＯＤ₂₈₀が約３０単位までの量として可溶化封入体をロードできる。この比率では、溶出するポリペプチドは、典型的には４−５ＯＤ₂₈₀／ｍｌの濃度を有する。Ｃ．酸化／再生(Refolding) 上記の陽イオン交換工程で溶出されたポリペプチド溶液は、いかなる凝集体をも破壊するために、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＣｌ）で処理される。次いで、このポリペプチドは、好ましくは２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），０．１ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）を含有するｐＨ５−１１の２ＭのＧｕＣｌ水溶液にて、０．０５ＯＤ₂₈₀／ｍｌに希釈される。この混合液を室温で１夜放置する。その生成物は処理の前に、シューペローズ(Superose)１２のような高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用いたゲル濾過により分析される。この分析により、このタンパク質濃度では、約３０％の正確に(correctly) 酸化された単量体と、約７０％の、Ｓ（スルフィド）結合した二量体および多量体並びに還元された単量体および不正確に(incorrectly)酸化された単量体が再現性をもって得られることが示される。より高いタンパク質濃度にすれば、より大きな絶対産生量で正確に酸化された単量体を得られるが、Ｓ結合した二量体および多量体の形成が増加することにより、正確に酸化された単量体の生成パーセンテージはより低いものとなる。たとえば、０．１ＯＤ₂₈₀／ｍｌ濃度のタンパク質からは、収率２０％でしか正確に酸化された単量体は生成されない。濃度を０．０２５ＯＤ₂₈₀／ｍｌに低下させることにより、正確に酸化された単量体の収率は３５−４０％となるが、１リットルの酸化当りの絶対生成量はより低くなる。酸化は、ＧｕＣｌの代りに尿素もしくは他のいずれかの変性剤中で行ってもよく、或いは変性剤の非存在化、例えばｐＨ、イオン強度および疎水性を様々に設定した適切な緩衝液条件の下で行ってもよい。尿素の好ましい濃度は、０．５Ｍから１０Ｍの範囲、好ましくは４Ｍであり、また好ましい酸化剤はＧＳＳＧであり、その使用濃度範囲は０．０１ｍＭから５ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭである。ＣｕＣｌ₂のような上記以外の酸化剤を用いることもでき、或いは酸化剤を添加せずに空気酸化だけを利用してもよい。スケールアップをするためには、現在のところ、４Ｍ尿素がこの酸化工程にとって好ましい酸化溶液である。Ｄ．濃縮酸化生成物は、ミリポア(Millipore)社の「ミニタン（MINITAN）」または「ペリコン(PELLIC0N)」装置のような、カットオフ値が３０Ｋの膜を備えた接線流(t angential flow)限外濾過システムにより、好ましくは約ＯＤ₂₈₀＝１まで濃縮される。濾液は全く透明である。というのは、物質は比較的純粋であり、汚染物質のほとんどは、３０Ｋ膜を通過できないくらいに大きいからである。従って、この濾液は酸化を行うために再使用することができる。新たに調製された２ＭのＧｕＣｌを用いた酸化と、再使用品を用いた酸化とでは、両者の酸化生成物において、ＦＰＬＣ分析による差異は検出されなかった。Ｅ．透析ＧｕＣｌまたは尿素の濃度を１０ｍＭ未満に低くするために、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に対する透析が、緩衝液を２− ３回交換して、透析チューブ内で行われ、或いは、１０ＫのＭＷカットオフ値を有する膜を備えた接線流限外濾過装置内において、上記と同じ緩衝液に対する透析濾過(diafiltration)により行われる。透析の間に、ＧｕＣｌ（もしくは尿素またはその他の変性剤）の濃度は減少し、白色沈殿が形成される。この沈殿には、陽イオン交換工程でともに溶出したジスルフィド結合二量体、還元された単量体、不正確に酸化された単量体および幾らかの汚染物質が含まれる。上清は、０．２ＯＤ₂₈₀／ｍｌの濃度の、ほとんど１００％正確に酸化されて再生された(relolded)単量体であり、これは、Ｄ工程のタンパク質収量の約２０％である。Ｆ．ペレットの回収正確に酸化された単量体の収率は、沈殿から、正確に酸化された単量体をさらに回収することにより、飛躍的に増大することができる。正確に酸化された単量体を含む溶液は、遠心分離によって清澄化される。正確に酸化された単量体を含む上清は貯蔵される。ジスルフィド結合二量体、還元された単量体、および不正確に酸化された単量体を含むペレットをＤＴＴ処理して、ジスルフィド結合を還元する。続いて、ペレットを最小容量の６ＭのＧｕＣｌ，２０ｍｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１５０ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのＤＤＴ緩衝液に溶解する。この溶解液は、ＤＴＴを（２０ｍＭの代りに）１ｍＭしか含まないこと以外は上記の溶解用緩衝液と同様の緩衝液中のセファデックス(Sephadex)Ｇ２５に通される。次いで、その溶出液はＯＤ₂₈₀＝０．０５まで希釈され、工程Ｃ、工程Ｄおよび工程Ｅのように処理される。この操作は、追加の精製単量体が得られるかぎり、２回以上繰り返してもよい。次いで、上清すべてを一緒に合わせても良い。Ｇ．陽イオン交換工程Ｅおよび工程Ｆの透析物(dialysate)の上清を集めて一緒にしたものを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中において、ＣＭセファロースに結合させて濃縮する。溶出は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），４００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で行う。溶出液は、高い塩濃度にもかかわらず、全く単量体で占められる。この方法により、濃度は３ｍｇ／ｍｌにまで達したが、これが上限ではない。この工程は、上記とは別にヘパリン−セファロースでも行うことができ、これもまた、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４），１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中において精製単量体と結合する。ヘパリン−セファロースからの溶出は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて行われる。Ｈ．透析前工程の精製物は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に対して透析される。Ｉ．保存この段階で、精製されたｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを凍結乾燥してもよい。凍結乾燥前の液量と等しい量の水に再溶解すると、得られる溶液は専ら単量体タンパク質のみを含み、ＦＰＬＣ上には二量体またはその他の多量体の微量残留は見られない。上記方法の特定の態様において、下記の操作がなされた。ａ）１０ｇｍ（正味乾燥重量０．４３ｇ）の封入体を、最終容積が１００ｍｌとなるように８Ｍ尿素，２０ｍＭのＤＴＴ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に溶解した。ｂ）タンパク質を、８Ｍ尿素，１ｍＭのＤＴＴ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で平衡化されたＣＭセファロースカラム上にロードした。２００ｍＭのＮａＣＬを含む８Ｍ尿素，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１ｍＭのＤＴＴ緩衝液で溶出されたタンパク質は貯蔵された。ｃ）貯蔵された前工程の溶出液は、凝集体を除去するために６ＭのＧｕＣｌで処理され、次いで２ＭのＧｕＣｌ，２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），０．１ｍＭのＧＳＳＧ緩衝液で、０．０５ＯＤ₂₈₀／ｍｌにまで希釈された。酸化は室温で一夜行われた。（酸化工程は、ＧｕＣｌの代りに尿素の存在下でも実施できることに留意されたい。）ｄ）酸化生成物は、３０Ｋ膜を含んでいる「ミニタン」ユニット上で限外濾過により、ＯＤ₂₈₀＝１まで濃縮された。ｅ）前工程の濃縮物は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に対して、３回の緩衝液交換を行いながら透析された。透析の間に、ＧｕＣｌ濃度の低下に伴って白色沈殿が形成され、これは遠心分離で除かれ、もう一度上記のように再処理された。上清は一緒にされた。ｆ）一緒にされた上清は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中において、ＣＭセファロースに結合させることにより濃縮された。ポリペプチドは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），４００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で溶出され、４℃で保存された。ｇ）前工程の保存された溶出液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８），１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に対して４℃で透析された。ｈ）透析後、ＶＣＬと称する精製されたｖＷＦ−ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドは凍結乾燥された。ＶＣＬの分析１．上記のように精製されたＶＣＬのアミノ酸配列分析から、Ｎ末端配列が、図３Ａ−３Ｃに従って予測された配列であるＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ− Ｐｈｅであることが明らかとなった。２．ポリアクリルアミドゲルによるＶＣＬの検討から、ＶＣＬは、還元状態（ β−メルカプトエタノール）の下でよりも、非還元状態の下での方が、より低い見掛けの分子量の位置に移動することが明らかとなった。コンパクトな形状からよりコンパクトでない形状へのこの変化は、ジスルフィド結合の還元に一致する。この様な分子内結合は、５０９および６９５の位置のシスティンの間に形成される。（分子量の変化は十分に大きくなく、分子間結合の還元には一致しない。）例２：再閉塞防止のための、血栓溶解治療と共同させたｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインの使用概要ｖＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチド断片の、再灌流までの時間を短縮することによる血栓溶解強化能力および血栓溶解後の再閉塞防止能力が研究された。試験されたＧＰＩｂ結合ドメイン断片は、例１に記載されたＶＣＬポリペプチドであった。イヌモデルにより、（１）冠状動脈内血栓の形成、（２）血栓溶解の持続時間、および（３）ｔ−ＰＡによる血栓溶解後の冠状動脈再閉塞の発生に対するＶＣＬの効果が評価された。その結果は、ＶＣＬが血栓形成を遅らせ、血栓溶解の持続時間を短縮し、血栓溶解後の冠状動脈再閉塞の発生を減少させることを示唆している。このイヌモデルにおいて、血栓形成は、電気的刺激により冠状動脈内に誘発される。血栓形成に続いて、血栓溶解が組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の注入により誘発される。血栓形成の防止、および血栓溶解後の再閉塞の発生減少におけるＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの影響が試験された。それによれば、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドは、電気的刺激による血栓形成の開始を遅延させることに有効であることが立証された。加えて、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドは、血栓溶解に際して再灌流までの時間を短縮し、ヘパリンおよびアスピリンと併用して血栓溶解治療に用いたときに再閉塞の発生を減少させた。方法この研究に用いられた手順はすべて、アメリカ生理学会(American Physiologi cal Society)の原理にしたがって指導されたものであり、且つテキサス州ヒューストンのテキサス心臓学会の動物の管理および使用制度委員会(the Instltution al Animal Care and Use Committee at the Texas Heart Institute)により公認されたものであった。外科的準備体重が２５ｋｇから３５ｋｇの雑種犬（ｎ＝５７）にペントバルビタールナトリウムによる麻酔（静脈内に３０ｍｇ／ｋｇ）をかけ、挿管し、かつ機械的人工呼吸装置（マサチューセッツ州ナティック(Natick)、ハーバードモデル(Harvard Model)６０）に接続した。プラスチックカテーテルが、大動脈圧を監視するために頚動脈に設置され、且つ、薬物および流体の投与のために頚部および末梢の静脈に設置された。左第５肋間隙開胸術が施術され、心臓は心膜離被架に掛けられた。左前方下行冠状動脈の１ｃｍから２ｃｍの部分が注意深く露出され、且つ付近の分枝血管が結紮された。超音波ドプラ型血流プローブ（テキサス州ヒューストン、ハートリー．インストルメンツ(Hartley Instruments)社製）を、露出された左前方下行冠状動脈の近位に設置して、血流速度を計測した。心拍数、収縮期および弛緩期の大動脈圧、並びに位相性及び平均冠状動脈血流速度を含む、基準血液動力学値が、８チャンネル・レコーダー（オハイオ州クリーブランド、グールド(Gould)、モデル３０００）に記録された。針状電極（テフロンで絶縁化された１０ｃｍ長の３０番(gauge)銀ワイヤの終端にひだ付けされた２５番針の８ｍｍの針端(tip)）が、ドプラ型血流プローブに対して遠位の部位において、露出された左前方下行冠状動脈の管腔に斜めに約４ｍｍ挿入された。この針状電極を、６−０絹縫合糸で血管上に固定した。電流が周囲の組織に傷害を与えないように、熱収縮管を針／ワイヤの半田接続部に対して用いた。アース線(ground wire)を内皮下組織に接続して電気回路を完成させた。血栓症を誘発するため、１５０μＡの電流を電極を通して通電した。この電極は、９Ｖバッテリーの陽極、５０ｋΩポテンシオメーター、マルチメーター(a multimeter)、およびアース線に直列に連結されたものであった。血栓形成は、冠状動脈血流速度の減少から測定され、この減少は、外部に位置するドプラ型血流プローブによりモニターされた。電流は、持続的な血栓性閉塞の発生後３０分間まで維持された。実験的手法２つの別個のプロトコールが、ＶＬＣに関する本研究に採用された。そのうちの一つにおいては冠状動脈の血栓形成に対する効果が試験され、もう一方では血栓溶解および再閉塞に対する効果が試験された。プロトコール１．冠状動脈内の血栓形成に対するＶＬＣの効果を評価するために、治療は、上記のイヌに対して、それらの冠状動脈への電気的刺激の３０分前に開始された。３種類の異なる動物群で研究が行われた。対照群（ｎ＝１２）においては、生理食塩水が１ｍｌ／ｍｉｎで静脈内に投与された。被験群の一つ（ｎ＝７）においては、ＶＬＣを、１回の注射で４ｍｇ／ｋｇ体重を投与し、また研究の終了まで継続的点滴で２ｍｌ／（ｋｇ−ｈ）の量を静脈内に投与した。もう一つの被験群（ｎ＝８）においては、アスピリンが、１回の注射により、５ｍｌ／ｋｇ体重の量で静脈内に投与された。電気的刺激の前後の冠状動脈血流の変化が注意深くモニターされた。電気的刺激の開始から、冠状動脈の完全な閉塞までに経過した時間の総計が記録された。冠状動脈の完全な閉塞の３時間後、実験動物すべてに対して、１回の注射により８０μｇ／ｋｇ体重のｔ−ＰＡ（カリフォルニア州サンフランシスコ、ジェネンテック社製）を静脈内投与し、また継続的点滴により８μｇ／（ｋｇ−ｍｉｎ）の量でｔ−ＰＡを９０分間静脈内に投与した。この処置は、冠状動脈に形成された血栓の溶解誘発を意図したものである。冠状動脈の血流速度が血栓形成前に示した値の少なくとも７０％まで回復した時点をもって、血栓は溶解し（、かつ動脈は再灌流し）たものとみなされた。ｔ −ＰＡ投与から再灌流までに経過した時間の総計は、血栓溶解時間すなわち再灌流時間として記録された。ｔ−ＰＡ点滴の９０分後に再灌流が起きなかったイヌは、その後の研究から除外した。再灌流が起きたイヌは、冠状動脈が再閉塞するか、または再閉塞せずに１８０分が経過するまでさらにモニターされた。再灌流から再閉塞までの時間は、再閉塞時間として記録された。再灌流の１８０分後に冠状動脈が再閉塞しなかったイヌは、再閉塞しないものとみなされた。再閉塞が起きたイヌについては、それが持続的な再閉塞であることを確かめるために３０分間モニターした。プロトコール２．血栓溶解および再閉塞に対するＶＣＬの効果をさらに詳しく検討するため、実験動物を追加して研究し、冠状動脈の閉塞３時間後に治療を行った。それらの動物は次の追加の４群の１つに振り分けられた。４群はそれぞれ、ｔ−ＰＡおよびヘパリン（ｎ＝７）；ｔ−ＰＡ、ヘパリンおよびＶＣＬ（ｎ＝７）；ｔ−ＰＡ、ヘパリンおよびアスピリン（ｎ＝８）；ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬ、およびアスピリン（ｎ＝８）である。ヘパリンは、１回の静脈注射で２００Ｕ／ｋｇが投与された。ｔ−ＰＡ、ＶＣＬ、およびアスピリンは、プロトコール１．と同様の処方で投与された。血栓溶解および再閉塞の追跡調査もまたプロトコール１．と同様に行われた。ヘマトクリット、凝固および血小板凝集の研究ヘマトクリット値は、プロトコール２．のすべてのイヌについて、ｔ−ＰＡ投与の終了時及びその前に検査された。活性化全血凝固時間が、それらのイヌについて、自動血液凝固時間測定装置（コロラド州エングルウッド(Englewood)のヘモテック(HemoTec)社製２００１３７０）を用いて、ｔ−ＰＡ投与前および５分後、６０分後、１２０分後および１８０分後に測定された。プロトコール１．のイヌにおけるＶＣＬおよびアスピリンの投与前および投与１０分後に、体外での血小板凝集が分析された。血液試料を、クエン酸ナトリウムの３．８％溶液を含むプラスチック管に採集した（血液９容：クエン酸ナトリウム１容）。血液試料を２００×ｇで２０分間遠心分離して富血小板血漿(plate let-rich plasma)を得、その残りの血液を３０００×ｇで１０分間遠心分離して貧血小板血漿(platelet-poor plasma)を得た。富血小板血漿中の血小板数は、３００，０００／ｍｍ³に調整された。４チャンネル血小板凝集計（ペンシルバニア州ホーシャム(Horsham)のバイオデータ(Bio-Data)社製、ＰＡＰ−４モデル）を定量に用いた。作用薬（アゴニスト）およびその最終濃度は、ＡＤＰ（ミズーリ州セントルイス、シグマ社製）では５μＭ、１０μＭおよび２０μＭ；ボトロセチン（botrocetin;Fujimuraら、Biochemistry 30:1957-1964(1991)の記載に従って調製された）では１．１μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌおよび４．４μｇ／ｍｌ；並びにアラキドン酸（ミズーリ州セントルイス、シグマ社製）では１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌであった。イヌの血小板はアラキドン酸に反応して凝集しないので、アラキドン酸の前に、１０μｍｏｌ／ｌ濃度のエピネフリンが血小板懸濁液に加えられた。血小板凝集の程度は、富血小板血漿で増加した光透過の、貧血小板血漿での光透過に対するパーセンテージの最大値として報告された。統計的解析すべての値は、「平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ;standard error of mean）」として表現される。フイッシャーの完全検定(Fisher′s exact test)が、異なる動物群における再灌流および再閉塞の頻度の比較に用いられた。反復測定についての一方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ;analysis of variance）が、異なる動物群における再灌流および再閉塞までの、異なる時間間隔及び異なる持続時間で得られた血液動力学値および活性化凝固時間を比較するために用いられた。スチューデントのｔ検定が、それぞれの動物群における治療前後の血小板凝集およびヘマトクリット値のパーセンテージを比較するために用いられた。０．０５未満のｐ値は、有意であるとみなされた。結果冠状動脈内の血栓形成基準レベルの約６５％まで血流速度が減少したことから判定されるように、冠状動脈への電極針の挿入が原因となって実験動物すべての動脈に何等かの狭窄症が発生した（表１および表２）。電気的刺激の後、すべての実験動物において、傷害を受けた冠状動脈に完全な閉塞が発生した。プロトコール１において、電気的刺激から冠状動脈の完全な閉塞までの経過時間は、生理食塩水で処置されたイヌにおけるよりも、ＶＣＬで処置されたイヌ（ｐ＜０．００１）およびアスピリンで処置されたイヌ（ｐ＜０．０５）における方が有意に長かった（図４）。すべての実験動物において、冠状動脈の閉塞の後に大動脈血圧および心拍数が僅かに変化した。しかしながら、アスピリンで処置した実験動物においては、心拍数及び平均大動脈血圧がそれぞれの計測時点で増加した（表１）。血栓溶解プロトコール１において、冠状動脈閉塞の３時間後に、ｔ−ＰＡのみが実験動物に投与された。ｔ−ＰＡの投与により、生理食塩水処置したイヌ１２個体の中の４個体（３３％）、ＶＣＬ処置したイヌ７個体の中の５個体（７１％）、およびアスピリン処置したイヌ８個体の中の４個体（５０％）に血栓溶解が起きた。ｔ−ＰＡ処置から血栓溶解までの平均経過時間（血栓溶解時間）は、生理食塩水処置したイヌにおいてよりも、ＶＣＬ処置したイヌにおいての方が有意に短かった（ｐ＜０．０５、図５）。プロトコール２においては、イヌは、冠状動脈が閉塞する前に前処置を施されず、冠状動脈閉塞の３時間後に血栓溶解治療を受けた。ｔ−ＰＡおよびヘパリンは、イヌ７個体の中の５個体（７１％）で血栓溶解を誘発し；ｔ−ＰＡ、ヘパリンおよびＶＣＬは、イヌ７個体の中の６個体（８６％）で血栓溶解を誘発し；ｔ −ＰＡ、ヘパリンおよびアスピリンは、イヌ８個体の中の７個体（８５％）で血栓溶解を誘発し；並びにｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリンは、イヌ８個体の中の８個体（１００％）で血栓溶解を誘発した。ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリンで処置したイヌの平均血栓溶解時間は、ｔ−ＰＡおよびヘパリンのみで処置したイヌにおける平均血栓溶解時間の半分よりも僅かに大きかった（２３．５±４分ｖｓ４５±１２分）。しかしながら、その差異は、統計的には有意ではなかった（図６）。再閉塞血栓溶解後、３時間のモニタリング時間の間に、多くの実験動物で冠状動脈の再閉塞が発生した。プロトコール１において、再閉塞の頻度は、生理食塩水で前処置したイヌ（４個体の中の４個体）、アスピリンで前処置したイヌ（４個体の中の４個体）またはＶＣＬで前処置したイヌ（５個体の中の４個体）の間で有意に異ってはいなかった。しかしながら、血栓溶解から再閉塞までの平均時間（再閉塞時間）は、生理食塩水、およびアスピリンで前処置したイヌにおいてよりも、ＶＣＬで事前処置したイヌにおいて有意に長かった（図７）。プロトコール２において、冠状動脈の再閉塞は、ｔ−ＰＡおよびヘパリンで処置したイヌ５個体の中の５個体において発生し、また、それらにアスピリンを追加したものでも再閉塞の頻度（７個体の中の７個体）は変化しなかった。ｔ−ｐＡおよびヘパリンにＶＣＬを加えることにより、イヌの再灌流された冠状動脈における再閉塞の頻度が有意に減少した（６個体の中の２個体；ｔ−ＰＡおよびヘパリンの群と比較して、ｐ＜０．０５）。ＶＣＬおよびアスピリンを加えることによってもまた、再閉塞の頻度が有意に減少した（８個体の中の１個体；ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬの群と比較して、ｐ＜Ｏ．０１）。平均再閉塞時間もまた、ＶＣＬ処理受けなかったイヌにおいてよりも、ＶＣＬで処置したイヌにおいて有意に長かった（図８）。ヘマトクリット、凝固および血小板凝集の研究ｔ−ＰＡ単独で処置されたイヌにおいて、手術部位周辺の出血は顕著ではなかった。ＶＣＬまたはアスピリンを加えることによって、切開部に沿って軽度の(mild)出血が起きた。ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリンを組み合わせた結果、手術部位周辺に中程度から重度の(moderate to sev ere)出血が起きた。しかしながら、ヘマトクリット値は、ｔ−ＰＡ、ヘパリン、ＶＣＬおよびアスピリンによる処置の後、いかなる群においても有意に変化しなかった（図９）。活性化凝固時間は、ｔ−ＰＡおよびヘパリンの投与直後に顕著に延長した（図１０）。この値は、処置の１ｈ後には基準値の１．５倍に、また処置の３ｈ後には基準値より若干大きい値にまで回復した。アスピリンもしくはＶＣＬ、またはアスピリンとＶＣＬとの組み合わせを加えても、活性化凝固時間には影響がなかった。ＡＤＰにより誘発された体外での血小板凝集は、ＶＣＬ点滴の影響を受けなかった（図１１Ａ）が、アスピリン注射により僅かに減少した（図１２Ａ）。ボトロセチンで誘発された血小板凝集は、ＶＣＬ処置により完全に阻害され（図１１Ｂ）、且つアラキドン酸で誘導された血小板凝集は、アスピリン注射により完全に阻害された（図１２Ｂ）。結論本発明における研究から得られたデータは、ＶＣＬが、冠状動脈内血栓形成の時間を延長し、ｔ−ＰＡにより誘発される血栓溶解を強化し、且つ冠状動脈再閉塞を遅延することを例証している。冠状動脈への電気的傷害の前にＶＣＬを静脈投与することにより、体内での閉塞性血栓の形成に必要な時間は顕著に長くなる。ボトロセチンで誘発された体外での血小板凝集は、該処置により完全に阻害された。これらのデータは、フォン・ビルブラント因子と血小板糖タンパク質Ｉｂとの間の相互作用をブロックすることにより、冠状動脈の狭窄部位及び内皮の傷害部位のいずれにおける血小板凝集をも減少させ、また閉塞性血栓の形成をも低減することを示唆する。閉塞性血栓が冠状動脈内に形成された後で、ｔ−ＰＡ点滴をすると血栓溶解が起きる。血栓溶解時間は、対照の実験動物においてよりもＶＣＬで前処置した実験動物において有意に短く、このことは、ＶＣＬでの前処置により、冠状動脈におけるｔ−ＰＡで誘発される血栓溶解が増強され得ることを示唆する。しかしながら、血栓の形成の後に投与されたＶＣＬは、ｔ−ＰＡによる血栓溶解を有意には促進しなかった。冠状動脈の再閉塞は、急性心筋梗塞患者の血栓溶解治療の有効性を制限してきた（１１、１２、２９−３１）。ほとんどの臨床試験では、再閉塞を防ぐための抗血小板治療薬（例えばアスピリン）による補助的な治療が採用されてきた（３２−３３）。本発明における研究では、ＶＣＬとｔ−ＰＡ、またはＶＣＬとｔ− ＰＡおよびヘパリンの投与の際に、血栓溶解から冠状動脈再閉塞までの時間が有意に延長され、場合によっては再閉塞が防止された。ＶＣＬは、同一条件においてはアスピリンよりも有効であった。これらのデータは、ＶＣＬが、冠状動脈再閉塞に対する将来の血栓溶解治療において、ｔ−ＰＡに対する補助剤として有益であろうことを示唆する。出血は、血栓溶解治療の一般的な合併症である。本発明における研究では、ＶＣＬにｔ−ＰＡおよびヘパリンを併用した治療により、手術の切開部位周辺に軽度から中程度の出血がおきた。また、ＶＣＬ、アスピリン、ｔ−ＰＡおよびヘパリンの組み合わせでは、幾つかの症例において重度の出血が起きる結果に至った。したがって、血小板糖タンパク質ＩｂレセプターをＶＣＬでブロックすることは、損傷を受けた冠状動脈における血栓の形成を低減させる上で有効であろう。血栓溶解後の冠状動脈の再閉塞を遅延させることについては、ＶＣＬは、ｔ−ＰＡおよびヘパリンについての補助的な治療法として、アスピリンに匹敵するか、それよりも優れている。ｔ−ＰＡおよびヘパリンに加えて、ＶＣＬおよびアスピリンで治療することのよって、再閉塞を完全に防止できるであろう。例３：ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドのアスピリンとの相乗作用ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの効果が、外傷性血管損傷のモデルを用いて研究された。このモデルは、基本的にはケリーら(Kelly et al.)が記載したもの（３４）である。このモデルでは、２ｍｍのコラーゲンで被覆されたポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＦＴＥ）チューブの断片が、伸長片(extension pie ces)として、ヒヒの慢性動静脈導通短絡路に挿入された。ヒヒには、¹¹¹Ｉｎでラベルされた自己由来の血小板が注射され、それから研究対象である治療薬の一つが投与された。特定の時点で、沈着した(deposited)血小板の量が、シンチレーション・カメラを用いて測定された。３個体の実験動物における一連の研究が、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチド（ＶＣＬ）単独、及びアスピリンの存在下でのＶＣＬの作用の研究を目的として行われた。ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドは、例１に記載されたようにして調製された。最初の一組の研究は、該モデルにおけるＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチド単独の効果についてのものであった。この研究のための基準は、先に実施された投与量に対する応答の研究で得た最低投与量、すなわち１回の注射で１ｍｇ／ｋｇ、継続的点滴では２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒで１時間であった。図１３にみられるように、この投与量によるチューブの閉塞は、対照においては約２０分であるのに比べて、約６０分にまで遅延した。第２の一組の研究は、該モデルにおけるアスピリン単独の効果を測定することに向けられた。３個体の実験動物が試験された。３５ｍｇ／ｋｇのアスピリンが研究の２時間前に経口投与された。全ての検体が研究開始から３０分未満で閉塞を生じた。定性的にも定量的にも、アスピリンでの曲線は、抗凝固剤処理をされていない純粋な血液を用いて得られた対照曲線に近似していることが分かった。血小板の計数は両群で同様であった。最後の一組の研究には、アスピリンの存在下での、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの活性の研究が含まれる。３個体の実験動物で研究された。実験動物には、３５ｍｇ／ｋｇのアスピリンが研究の２時間前に経口投与された。ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの投与に用いられた量は、１回の注射による１ｍｇ／ｋｇ、及び継続的点滴による２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒで１時間であった。ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの継続的点滴の間は、装置はすべて開放状態を維持した。その期間が過ぎると閉塞し始める。研究開始８０分後には２つの装置が閉塞し、４つは開放状態のままであった。継続的点滴を停止したとき、血小板沈着速度の増加が観察された。こうして、予想されなかったことだが、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドおよびアスピリンは、血小板沈着の遅延及び／または防止に関して相乗作用を示す。血小板沈着におけるＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドおよびアスピリンの相乗効果は、単独で投与した場合のＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの投与量の４倍、即ち１回の注射による４ｍｇ／ｋｇ、および継続的点滴による８ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの投与量に等しいことが分かった。追加のパラメーターとして、出血時間が上記の実験において測定された。それを表３に示す。出血時間は、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの最低投与量での６分間から、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの最高投与量での２２．５分間まで投与量に依存する形で増加する。アスピリン単独では、出血時間は６分間の結果が得られた。アスピリンに、低投与量のＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドを組み合わせると、７分間まで僅かに増加する結果が得られた。しかしながら、この組み合わせは、出血時間が１６．５分であるような、４倍高いＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドの投与量（１回の注射当り４ｍｇ／ｋｇおよび点滴８ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ）の場合と同等の抗血小板沈着効果を有する。かくして、ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドにアスピリンを組み合わせることによって、出血時間の増加を伴うこと無く有効性の劇的な向上が得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 9/64 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 15/09 ＺＮＡ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者パネット、アモスイスラエル国、エルサレム、ハラブ・シュリム・ストリート 11

Claims

【特許請求の範囲】１．患者における外傷性血管損傷後の合併症を防止するための方法であって、協同して前記合併症の防止に有効な、所定量のフォン・ビルブラント因子の糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインポリペプチドと、所定量のアスピリンとを併用して、前記患者に対して投与することを具備する方法。２．前記の外傷性血管損傷が、冠状動脈バイパス手術、血管形成術、血栓溶解または不安定狭心症を原因とする請求項１に記載の方法。３．前記の外傷性血管損傷後の合併症が、心筋梗塞、虚血症、冠状動脈バイパス手術、血管形成の反復または死である請求項１に記載の方法。４．有効量が、１回の注射による０．１−２０ｍｇ／ｋｇおよび継続的点滴による０．１−２０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒのｖＷＦ・ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドと、０．１−５０ｍｇ／ｋｇのアスピリンである請求項１に記載の方法。５．前記のｖＷＦ・ＧＰＩｂ結合ドメインポリペプチドが静脈内投与される請求項４に記載の方法。６．前記のアスピリンが経口的または非経腸的に投与される請求項５に記載の方法。７．前記のアスピリンが単回投与、多回投与または継続的投与により投与される請求項６に記載の方法。８．前記の非経腸的投与が静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与である請求項７に記載の方法。９．患者における血栓溶解治療を増強する方法であって、血栓溶解剤および抗凝固剤と併用して、血栓溶解治療の増強に有効な所定量のフォン・ビルブラント因子の血小板糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインポリペプチドを患者に投与することを具備する方法。１０．前記の血栓溶解剤がｔＰＡである請求項９に記載の方法。１１．前記の抗凝固剤がヘパリンである請求項１０に記載の方法。１２．前記の血栓溶解治療剤が、更に、アスピリンをも含んでいる請求項１１に記載の方法。１３．フォン・ビルブラント因子の糖タンパク質Ｉｂ結合ドメインポリペプチドが静脈内投与される請求項９に記載の方法。１４．前記の静脈内投与が注射である請求項１３に記載の方法。１５．前記の静脈内投与が継続的点滴による請求項１３に記載の方法。１６．前記の静脈内投与が１回注射に続いて継続的点滴により行われる請求項１３に記載の方法。１７．前記の１回注射の適用量が０．４−４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量である請求項１４に記載の方法。１８．前記の１回注射の適用量が１−２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量である請求項１７に記載の方法。１９．前記の１回注射の適用量が２−１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量である請求項１８に記載の方法。２０．前記の点滴が毎時０．２−２０ｍｇ／ｋｇ体重の速度である請求項１５に記載の方法。２１．前記の点滴が毎時１−１０ｍｇ／ｋｇ体重の速度である請求項２０に記載の方法。２２．前記の１回注射の適用量が０．４−４０ｍｇ／ｋｇ体重であり、且つ前記の継続的点滴が毎時０．２−２０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項１６に記載の方法。２３．前記のポリペプチドが手術に先立って投与される請求項１３に記載の方法。２４．前記の手術が心臓血管系の手術である請求項２３に記載の方法。