JPH0851997A

JPH0851997A - 化学発光測定試薬及び化学発光測定方法

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Publication number: JPH0851997A
Application number: JP16163894A
Authority: JP
Inventors: Masako Iwata; 理子岩田; Takashi Hayashi; 隆志林; Mitsuo Yamaki; 光男山木
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 1996-02-27
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: JP3632990B2

Abstract

(57)【要約】【構成】酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発
光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応によ
り、酵素の活性を検出・定量する測定試薬であって、化
学発光基質、酸化剤及び増感剤を酸化剤溶液、化学
発光基質・増感剤混液の２液として保存してなる化学発
光測定試薬並びにこの試薬を用いる化学発光測定方法。【効果】この化学発光測定試薬は、試薬キットの構成
が簡素化されると共に保存安定性に優れる。また、この
測定試薬を用いる化学発光測定方法は、発光量が高く、
高感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測定法、
ＤＮＡプローブ法等による生体微量成分の定量・分析
等、臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物学的に特異的な結
合反応、例えば抗原抗体反応の検出・定量等に有用な化
学発光測定試薬及び化学発光測定方法に関する。特に、
臨床検査及び臨床化学の分野等で生体微量成分の高感度
な分析・定量に有用な化学発光測定試薬及び化学発光測
定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】測定対象物質を高感度に検出・定量する
ために、抗原、抗体、受容体等の特異的捕捉剤を用いた
特異的な結合反応を利用することが知られており、代表
的な測定方法にサンドイッチ型免疫測定法が知られてい
る。前記結合反応の検出用物質としては、ラジオアイソ
トープ、酵素、蛍光性物質、発光性物質等を利用するこ
とができる。これらのうち、酵素を検出用物質として用
いる免疫測定法（ＥＩＡ）は、ラジオアイソトープを用
いる免疫測定法（ＲＩＡ）のような危険性はなく、特異
的な結合反応を増幅することができ、一般にその酵素の
触媒活性を定量することによって、特異的に結合した測
定対象物質量を間接的に測定することができるため、広
く用いられている。酵素としてペルオキシダーゼを使用
し、この酵素活性をルミノール及び過酸化水素による化
学発光反応を利用して測定する方法は、通常発光が短寿
命であるが、増感剤の添加により、発光量の増加及び発
光持続時間の長期化が図れ、この反応を用いるとＲＩＡ
に匹敵する高感度な測定が可能となることが知られてい
る。そのために種々の増感剤が検討されている（特開昭
５９−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２
号公報、特開平２−２９１２９９号公報等）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】試薬の構成及び反応時
の混合順序として、上記特開昭５９−１７１８３９号公
報、特表昭５９−５００２５２号公報等には、ペルオキ
シダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の４つを別々
の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反
応を開始させることが記載される。さらに具体的には、
使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶
液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダ
ーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始さ
せる方法が記載されている。また、上記特開平２−２９
１２９９号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使
用の約２時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加
えて混合した混合液を、反応系に添加する方法が記載さ
れている。一般に、これらの化学発光反応を利用する測
定方法が適用される測定対象物質は超微量であることが
多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに
高感度でかつ安定な測定法及び保存安定性の高い試薬の
開発が望まれている。本発明は、これらの課題を解決す
るものであり、試薬の構成及び添加順序の点から、鋭意
検討を行った結果なし得た、さらに高感度でかつ安定な
測定方法及び保存安定性が高くかつ試薬キットの簡素化
も図れる測定試薬及び測定方法を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ち本発明は、下記の
（１）〜（４）に関する。（１）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基
質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵
素の活性を検出・定量する測定試薬であって、化学発光
基質、酸化剤及び増感剤を酸化剤溶液、化学発光基
質・増感剤混液の２液として保存してなる化学発光測定
試薬。（２）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基
質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵
素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め酸
化剤溶液、化学発光基質・増感剤混液の２液を調製
し、ペルオキシダーゼを含む反応系に、酸化剤溶液、
化学発光基質・増感剤混液の順に添加することを特徴
とする化学発光測定方法。（３）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基
質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵
素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め酸
化剤溶液、化学発光基質・増感剤混液の２液を調製
し、これらを別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む
反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。（４）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基
質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵
素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め酸
化剤溶液、化学発光基質・増感剤混液の２液を調製
し、使用直前にこれらを混合して、ペルオキシダーゼを
含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方
法。

【０００５】本発明における化学発光測定試薬及び化学
発光測定方法は、酵素としてペルオキシダーゼを用い、
酵素活性の検出・定量に化学発光基質、酸化剤及び増感
剤を用いるものであれば、測定対象及び測定手法に特に
制限はない。例えば、ペルオキシダーゼを標識酵素とし
て用いる特異的結合反応系として、酵素免疫測定法の一
抗体法、二抗体法、競合分析法、サンドイッチ分析法、
ホモジーニアス分析法、ヘテロジーニアス分析法、ウエ
スタン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用
できる。

【０００６】本発明で用いられるペルオキシダーゼは特
に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダー
ゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高
い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ
及びＥの各型が知られているが、これらの中ではＣ型が
ＲＺ値（ヘミンとタンパク質の比を示す）及び酵素活性
の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡（株）から
市販され入手可能である。

【０００７】化学発光反応に用いる化学発光基質として
は、ルミノール類、ルシゲニンなどがあるが、ルミノー
ル類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノ
ール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブ
チル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ
−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール
等が挙げられる。中でもルミノール又はイソルミノール
が好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノール
は、通常入手できる試薬グレードのものには、製造原料
であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合
が多いので、再結晶を繰返し精製したものを用いるのが
好ましい。

【０００８】化学発光反応に用いる酸化剤としては、過
酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが挙げられる
が、過酸化水素が好ましい。化学発光反応に用いる増感
剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば
特に限定するものではないが、ｐ−ヨードフェノール、
ｐ−ブロムフェノール、フェノールインドフェノール、
４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール
等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾ
ール、４−（４−ハイドロキシフェニル）チアゾール等
のベンゾチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジ
ル）−プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニル
プロピオン酸、ジエチルアニリン等が好ましいものとし
て用いられる。特に好ましいものは、Ｓ／Ｎ比（シグナ
ルとノイズの比）が高い点で４−［４′−（２′−メチ
ル）チアゾリル］フェノールである。

【０００９】本発明の化学発光測定試薬は、化学発光に
関与する物質を酸化剤溶液、化学発光基質・増感剤
混液の２液として保存してなる。このように保存する
と、従来のような化学発光基質を酸化剤溶液、化学
発光基質溶液、増感剤溶液の３液系として保存する必
要がないので、試薬キットの構成を簡素化でき、測定機
器付属の自動分注装置に適用できる試薬数が少ない場合
は便利である上、保存安定性も３液系と同等以上であ
り、優れる場合もある。酸化剤溶液は安定性又は発光反
応のＳ／Ｎ比を高めるために、緩衝液に防腐剤や界面活
性剤やタンパク質等を添加した溶液を溶媒として用いる
のが好ましい。酸化剤の濃度は、高発光が得られ、基質
阻害がかからない濃度であれば特に限定するものではな
いが、溶液中０．１〜１０ｍＭが好ましい。化学発光基
質・増感剤溶液は、安定した発光を得るためにpH８〜１
３のアルカリ性であることが好ましい。増感剤濃度は、
Ｓ／Ｎ比の高い発光が得られれば特に限定するものでは
ないが、溶液中０．０１〜５ｍＭの範囲が好ましい。発
光基質濃度は高発光が得られ、基質阻害がかからない濃
度であれば特に限定するものではないが、溶液中０．０
１〜５０ｍＭの範囲が好ましい。

【００１０】本発明の化学発光測定方法は、予め化学発
光に関与する物質を酸化剤溶液、化学発光基質・増
感剤混液の２液として調製し、（ａ）ペルオキシダーゼ
を含む反応系に、の溶液、の混液の順に添加する
か、（ｂ）の溶液及びの混液を、別々にかつ同時に
ペルオキシダーゼを含む反応系に添加するか、（ｃ）
の溶液及びの混液の２液を使用直前に混合して、ペル
オキシダーゼを含む反応系に添加するものである。これ
らの方法をとることにより、従来の方法に比べて化学発
光量の大きい、高感度な測定をすることができる。これ
らのうち、（ｃ）の方法より（ａ）、（ｂ）のほうが感
度が高く好ましく、さらに（ｂ）の方法より（ａ）の方
法のほうが、感度がより高く好ましい。なお、これらの
測定方法には、前記の本発明の化学発光測定試薬を用い
ることができる。

【００１１】の溶液との混液は、等量ずつ用いられ
るように、酸化剤、発光基質、増感剤の濃度をあらかじ
め調整しておくと、使用時に制約が少なく便利である。
また、低温では、化学発光反応が遅いので、反応は室温
（１５〜３０℃）で行うのが好ましい。そのためにの
溶液、の混液を低温で保管している場合には、これら
の試薬を反応前に室温に戻しておくことが好ましい。反
応時間は、用いる増感剤の種類等により異なるが、経時
的に安定した発光が得られる時間を選択する方が良い。
通常は、１時間以内が好ましく、特にフェノール誘導体
を増感剤に用いた場合は、２０分以内が好ましい。本発
明を利用できる測定対象物は、ペルオキシダーゼを直接
又は標識物として用いる反応を利用するものであれば特
に限定するものではないが、酵素免疫測定法との組み合
わせによりａｍｏｌオーダーまでの高感度測定が可能と
なるので、成長ホルモンやエンドセリンの測定にも好ま
しい方法として適用できる。また、化学発光反応はpHが
高いほど発光量は増大するが、同時にペルオキシダーゼ
の触媒能に依存しない発光量も増大するので、両者を考
慮してpH７〜１１の範囲で反応が行えるように試薬のpH
を調整することが好ましい。

【００１２】

【実施例】本発明をさらに実施例により詳述する。実施例１化学発光測定試薬の組成が保存安定性に及ぼす影響化学発光測定試薬の組成が保存安定性に及ぼす影響を検
討するため、以下の実験を行った。すなわち、化学発光
基質の構成試薬の数を１〜３とし、それぞれを３７℃で
一週間保管し、保管した試薬を用いた化学発光反応で発
光量の変化を見ることにより、試薬の保存安定性を調べ
た。まず、次の４構成の試薬を調製した。（１）３液系過酸化水素溶液（４ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液(pH１０)）増感剤溶液（２ｍＭ４−［４′−（２′−メチル）チ
アゾリル］フェノールを含むジメチルスルホキシド）ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．５
ｍＭＮａＯＨ）（２）２液系Ａ過酸化水素・増感剤混液（上記３液系試薬のとを
体積比５０：８の割合で混合）ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．５
ｍＭＮａＯＨ）（３）２液系Ｂ（本発明の試薬）過酸化水素溶液（４ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液(pH１０)）ルミノール・増感剤混液（上記３液系試薬のとを
体積比８：５０の割合で混合）（４）１液系過酸化水素・ルミノール・増感剤混液（上記３液系試薬のととを体積比５０：８：５０
の割合で混合）

【００１３】化学発光量の測定は次の通り行った。黒色
のマイクロフルオロリモーバウェル（ダイナテク社製）
にペルオキシダーゼ標識抗エンドセリン抗体液（ヤマサ
醤油社製）を０．１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１％
（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭホウ酸ナトリウ
ム緩衝液（pH１０）で１０万分の１に希釈した溶液）１
００μｌを添加した。次に、上記の３液系試薬を用いる
場合にはを５０μｌ、を８μｌ、を５０μｌの順
に約１分間隔で添加、２液系Ａ試薬を用いる場合には
を５８μｌ、を５０μｌの順に約１分間隔で添加、２
液系Ｂ試薬を用いる場合にはを５０μｌ、を５８μ
ｌの順に約１分間隔で添加、１液系試薬を用いる場合に
はを１０８μｌ添加した後、混合撹拌し１０分後に、
化学発光測定装置（コロナ電気社製(ＭＬＲ−１００)）
を用いて発光量を測定した。上記で１〜３液系に調製し
た４構成の試薬を３７℃で保存し、そのうちの一定量を
経時的にサンプリングし、上記と同様に化学発光量を測
定した。図１に化学発光測定試薬の保存日数と発光量と
の関係を示したが、１液系と２液系Ａでは保存２日でほ
とんど発光が得られなくなったので、過酸化水素と増感
剤、さらにルミノールとの混合により、化学発光測定試
薬が急激に劣化することがわかった。一方、３液系と２
液系Ｂは保存安定性は良好であり、過酸化水素溶液、ル
ミノール・増感剤混液の形で保存した場合（２液系Ｂ）
は、過酸化水素、増感剤、ルミノールを分けて保存した
場合（３液系）と同等以上であることがわかった。

【００１４】実施例２化学発光測定試薬の添加方法が発光量に及ぼす影響実施例１で保存安定性が良好な化学発光測定試薬（３液
系及び２液系Ｂ）の化学発光反応系への添加方法につい
て検討した。抗エンドセリンモノクローナル抗体（ヤマ
サ醤油社製(ＭＣＡＥＴ−０１)）を固定化した黒色の
マイクロフルオロリモーバウェル（ダイナテク社製）
に、リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）でエンドセリ
ン−１を種々の濃度（０〜１００ng／ml）に希釈した溶
液２００μｌを注入し、２４時間反応後ウェルを洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識抗エンドセリン抗体（ヤマサ
醤油社製）の１００倍希釈液を２００μｌ注入し３時間
反応させることにより、抗原抗体反応によりウェルに固
定したエンドセリン−１と結合させた。洗浄後、ペルオ
キシダーゼを触媒とするルミノール／過酸化水素の化学
発光を測定した。

【００１５】測定に用いた化学発光測定試薬を次に示
す。（１）３液系過酸化水素溶液（２ｍＭ過酸化水素、０．１％(ｗ／
ｖ)脱脂粉乳、０．１％(ｖ／ｖ)ツイーン２０を含む５
０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(pH１０)）増感剤溶液（２ｍＭ４−［４′−（２′−メチル）チ
アゾリル］フェノールを含むジメチルスルホキシド）ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．５
ｍＭＮａＯＨと５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(pH１
０)の体積比１：１の混合液）（２）２液系過酸化水素溶液（２ｍＭ過酸化水素、０．１％(ｗ／
ｖ)脱脂粉乳、０．１％(ｖ／ｖ)ツイーン２０を含む５
０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液(pH１０)）ルミノール・増感剤混液（上記３液系試薬のとを
体積比８：１００の割合で混合）

【００１６】測定ａは３液系試薬のを１００μｌ、
を８μｌ、を１００μｌの順に約１分間隔で添加、測
定ｂは３液系試薬のを８μｌ、を１００μｌ、を
１００μｌの順に約１分間隔で添加、測定ｃは２液系試
薬のを１００μｌ、を１０８μｌの順に約１分間隔
で添加、測定ｄは２液系試薬の１００μｌと１０８
μｌを別々にかつ同時に添加、測定ｅは２液系試薬の
とを体積比１００：１０８の割合で使用直前に混合し
たものを２０８μｌ添加した後、混合撹拌し１０分後
に、化学発光測定装置（コロナ電気社製(ＭＬＲ−１０
０)）を用いて発光量を測定した。図２にエンドセリン
−１濃度と発光量との関係を示したが、増感剤溶液を第
一番目に添加した測定ｂではほとんど発光が得られなか
った。その他の測定では、エンドセリン−１３０ng／
ml以上で発光量は一定となるが矛盾のない良好な発光量
が得られた。また、化学発光量は測定ｃ、測定ｄ、測定
ｅ、測定ａの順で大きかった。

【００１７】

【発明の効果】本発明の化学発光測定試薬は、試薬キッ
トの構成が簡素化されると共に保存安定性に優れる。ま
た、この測定試薬を用いる本発明の化学発光測定方法
は、発光量が高く、高感度の測定が可能である。従っ
て、酵素免疫測定法、ＤＮＡプローブ法等による生体微
量成分の定量・分析等、臨床検査や臨床化学の分野で広
範囲に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】横軸に化学発光測定試薬の保存日数、縦軸にそ
れぞれの試薬を用いた化学発光反応で定量された発光量
を示し、化学発光測定試薬の保存安定性を表すグラフで
ある。発光量の１カウントは、１．２×１０^-16Ｗであ
る。

【図２】横軸にエンドセリン−１濃度、縦軸に発光量を
示し、化学発光試薬の添加方法と発光量との関係を表す
グラフである。発光量の１カウントは、１．２×１０
^-16Ｗである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素としてペルオキシダーゼを用い、化
学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応に
より、酵素の活性を検出・定量する測定試薬であって、
化学発光基質、酸化剤及び増感剤を酸化剤溶液、化
学発光基質・増感剤混液の２液として保存してなる化学
発光測定試薬。
【請求項２】化学発光基質がルミノール類である請求
項１記載の化学発光測定試薬。
【請求項３】酸化剤が過酸化水素である請求項１又は
２記載の化学発光測定試薬。
【請求項４】酵素としてペルオキシダーゼを用い、化
学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応に
より、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、
予め酸化剤溶液、化学発光基質・増感剤混液の２液
を調製し、ペルオキシダーゼを含む反応系に、酸化剤
溶液、化学発光基質・増感剤混液の順に添加すること
を特徴とする化学発光測定方法。
【請求項５】酵素としてペルオキシダーゼを用い、化
学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応に
より、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、
予め酸化剤溶液、化学発光基質・増感剤混液の２液
を調製し、これらを別々にかつ同時にペルオキシダーゼ
を含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定
方法。
【請求項６】酵素としてペルオキシダーゼを用い、化
学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応に
より、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、
予め酸化剤溶液、化学発光基質・増感剤混液の２液
を調製し、使用直前にこれらを混合して、ペルオキシダ
ーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光
測定方法。
【請求項７】化学発光基質がルミノール類である請求
項４、５又は６記載の化学発光測定方法。
【請求項８】酸化剤が過酸化水素である請求項４、
５、６又は７記載の化学発光測定方法。