JPH0854396A - クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤 - Google Patents
クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤Info
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- JPH0854396A JPH0854396A JP19883795A JP19883795A JPH0854396A JP H0854396 A JPH0854396 A JP H0854396A JP 19883795 A JP19883795 A JP 19883795A JP 19883795 A JP19883795 A JP 19883795A JP H0854396 A JPH0854396 A JP H0854396A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 非特異的反応の問題点を解消したクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコ
マティス感染症診断用製剤を提供する。 【解決手段】 （ａ）クラミジア・トラコマティス精製
基本小体を固相担体に固定化し、 （ｂ）該固相担体をクラミジア・トラコマティスに対す
る抗体を含有している疑いのある検体試料と接触させ、 （ｃ）未反応の該検体試料成分を除去し、 （ｄ）生成したクラミジア・トラコマティス抗原とクラ
ミジア・トラコマティス抗体からなる抗原抗体複合体を
検体試料に由来する抗体に対する標識抗体と接触させ、 （ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、 （ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質量を測定するこ
とによって検体試料中のクラミジア・トラコマティス抗
体の存在又は量を測定する各段階を含むことを特徴とす
るクラミジア・トラコマティス抗体測定方法及び診断用
製剤。
・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコ
マティス感染症診断用製剤を提供する。 【解決手段】 （ａ）クラミジア・トラコマティス精製
基本小体を固相担体に固定化し、 （ｂ）該固相担体をクラミジア・トラコマティスに対す
る抗体を含有している疑いのある検体試料と接触させ、 （ｃ）未反応の該検体試料成分を除去し、 （ｄ）生成したクラミジア・トラコマティス抗原とクラ
ミジア・トラコマティス抗体からなる抗原抗体複合体を
検体試料に由来する抗体に対する標識抗体と接触させ、 （ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、 （ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質量を測定するこ
とによって検体試料中のクラミジア・トラコマティス抗
体の存在又は量を測定する各段階を含むことを特徴とす
るクラミジア・トラコマティス抗体測定方法及び診断用
製剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、クラミジア・トラ
コマティス感染症を診断するための特異性の高いクラミ
ジア・トラコマティス抗体測定方法およびそれに用いら
れる診断用製剤に関するものである。
コマティス感染症を診断するための特異性の高いクラミ
ジア・トラコマティス抗体測定方法およびそれに用いら
れる診断用製剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】クラミジア・トラコマティス（Chlamydi
a trachomatis）は、宿主の細胞内でのみ生存可能な偏
性細胞内寄生体である。その増殖サイクルは特殊で、形
態学的には細胞外にあるクラミジア基本小体（elementa
ry body：ＥＢ）が食菌作用により細胞内に取り込まれ
て空胞封入体を形成し、網膜体（reticulate body：Ｒ
Ｂ）に変化する。ＲＢは増殖力はあるが感染力を欠いて
おり、細胞内で増殖したＲＢはやがてＥＢに変化し、封
入体を破り細胞膜を破壊して細胞外に出る。ＥＢは増殖
力を欠くが感染力を持つ。人がこのＥＢに感染すると、
眼のトラコーマ、性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）、非リ
ン菌性尿道炎（ＮＧＵ）や子宮頚管炎などの眼や生殖器
の病気を発症する。
a trachomatis）は、宿主の細胞内でのみ生存可能な偏
性細胞内寄生体である。その増殖サイクルは特殊で、形
態学的には細胞外にあるクラミジア基本小体（elementa
ry body：ＥＢ）が食菌作用により細胞内に取り込まれ
て空胞封入体を形成し、網膜体（reticulate body：Ｒ
Ｂ）に変化する。ＲＢは増殖力はあるが感染力を欠いて
おり、細胞内で増殖したＲＢはやがてＥＢに変化し、封
入体を破り細胞膜を破壊して細胞外に出る。ＥＢは増殖
力を欠くが感染力を持つ。人がこのＥＢに感染すると、
眼のトラコーマ、性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）、非リ
ン菌性尿道炎（ＮＧＵ）や子宮頚管炎などの眼や生殖器
の病気を発症する。
【０００３】近年、性行為感染症（sexually transmitt
ed diseases）の原因微生物の１つとしてクラミジア・
トラコマティスが注目を集めており、アメリカではクラ
ミジア・トラコマティス感染症の新患者数が年間３００
万人から１，０００万人（熊本悦明ら：クラミジア感染
症、Medic、２０、1-8、1985による）と言われており、
わが国でもクラミジア・トラコマティス感染症の実態が
徐々に明らかにされるにつれて関心が高まってきてい
る。
ed diseases）の原因微生物の１つとしてクラミジア・
トラコマティスが注目を集めており、アメリカではクラ
ミジア・トラコマティス感染症の新患者数が年間３００
万人から１，０００万人（熊本悦明ら：クラミジア感染
症、Medic、２０、1-8、1985による）と言われており、
わが国でもクラミジア・トラコマティス感染症の実態が
徐々に明らかにされるにつれて関心が高まってきてい
る。
【０００４】クラミジア・トラコマティス感染症の最も
感度の高い血清診断法はワング（Wang）およびグレイス
トン（Grayston）（Trachoma and related disorders c
aused by chlamydial agents、Excerpta Medica、Amster
dam、pp.273-288、1971参照）の間接ミクロ免疫蛍光抗
体測定法（マイクロ−ＩＦ法）である。しかしながらマ
イクロ−ＩＦ法はその試験手技が困難なため臨床検査室
では診断法としては採用されていない。標準的なマイク
ロ−ＩＦ法は１５種のクラミジア・トラコマティス血清
型の精製基本小体（ＥＢ）を必要とする。マイクロ−Ｉ
Ｆ法は、免疫蛍光反応を行うために同定微生物の完全な
形態又は構造を必要とする。したがってＥＢの形態又は
構造を変えたり破壊したりする方法は使用できない。こ
のＥＢは伝染性があり、かつ毒性をもっているため、そ
のまま抗原材料として使用するためには感染防禦を施し
た特別な施設を必要とする。従って、通常はホルムアル
デヒドやアセトンなどの固定化剤処理した抗原を用いて
いる。
感度の高い血清診断法はワング（Wang）およびグレイス
トン（Grayston）（Trachoma and related disorders c
aused by chlamydial agents、Excerpta Medica、Amster
dam、pp.273-288、1971参照）の間接ミクロ免疫蛍光抗
体測定法（マイクロ−ＩＦ法）である。しかしながらマ
イクロ−ＩＦ法はその試験手技が困難なため臨床検査室
では診断法としては採用されていない。標準的なマイク
ロ−ＩＦ法は１５種のクラミジア・トラコマティス血清
型の精製基本小体（ＥＢ）を必要とする。マイクロ−Ｉ
Ｆ法は、免疫蛍光反応を行うために同定微生物の完全な
形態又は構造を必要とする。したがってＥＢの形態又は
構造を変えたり破壊したりする方法は使用できない。こ
のＥＢは伝染性があり、かつ毒性をもっているため、そ
のまま抗原材料として使用するためには感染防禦を施し
た特別な施設を必要とする。従って、通常はホルムアル
デヒドやアセトンなどの固定化剤処理した抗原を用いて
いる。
【０００５】一方、近年開発された酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる
利点を有している。このＥＬＩＳＡを用いたクラミジア
・トラコマティス抗体の測定に関する報告がなされてい
るが、そのほとんどがクラミジア・トラコマティスＬ２
株の未精製ＥＢ（宿主細胞やその断片等を多く含むも
の）をそのまま、又は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム、sodium dodecyl sulfate）処理してＥＬＩＳＡ用の
抗原材料として用いる。そのため、精製純度の低い抗原
を用いることによるクラミジア・ニューモニエ抗体及び
クラミジア・シタシ抗体との交叉反応を含む非特異的反
応の存在が知られている。これは、主としてクラミジア
・トラコマティスの複雑な抗原性に起因している。クラ
ミジア・トラコマティスの抗原性には、属（genus）特
異的抗原、種（species）特異的抗原および血清型（bio
bar）特異的抗原があると考えられている。代表的な属
特異的抗原として、リポポリサッカライド（lipopolysa
ccharide：ＬＰＳ）が知られており、これは一部腸内細
菌のＲｅミュータントＬＰＳと共通抗原性を有してい
る。
ＬＩＳＡ）は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる
利点を有している。このＥＬＩＳＡを用いたクラミジア
・トラコマティス抗体の測定に関する報告がなされてい
るが、そのほとんどがクラミジア・トラコマティスＬ２
株の未精製ＥＢ（宿主細胞やその断片等を多く含むも
の）をそのまま、又は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム、sodium dodecyl sulfate）処理してＥＬＩＳＡ用の
抗原材料として用いる。そのため、精製純度の低い抗原
を用いることによるクラミジア・ニューモニエ抗体及び
クラミジア・シタシ抗体との交叉反応を含む非特異的反
応の存在が知られている。これは、主としてクラミジア
・トラコマティスの複雑な抗原性に起因している。クラ
ミジア・トラコマティスの抗原性には、属（genus）特
異的抗原、種（species）特異的抗原および血清型（bio
bar）特異的抗原があると考えられている。代表的な属
特異的抗原として、リポポリサッカライド（lipopolysa
ccharide：ＬＰＳ）が知られており、これは一部腸内細
菌のＲｅミュータントＬＰＳと共通抗原性を有してい
る。
【０００６】一方、代表的な種特異抗原、血清型特異抗
原としては、クラミジア・トラコマティス主要外膜ペプ
チド（Major Outer Membrane Protein：ＭＯＭＰ）が知
られており、これはクラミジア・トラコマティス外膜タ
ンパク質の約６０％を占めるといわれている。しかしな
がらこのＭＯＭＰにも属特異的抗原性の存在が知られて
いる（Collett ら、Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.、Was
hington.D.C.、Abstract No.D-159、1986）。ＭＯＭＰ
以外のクラミジア・トラコマティス外膜抗原は主として
属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の存在す
るものもある。サルコシル不溶性の分子量約５９．５ダ
ルトンペプチドはこの範疇にはいる。
原としては、クラミジア・トラコマティス主要外膜ペプ
チド（Major Outer Membrane Protein：ＭＯＭＰ）が知
られており、これはクラミジア・トラコマティス外膜タ
ンパク質の約６０％を占めるといわれている。しかしな
がらこのＭＯＭＰにも属特異的抗原性の存在が知られて
いる（Collett ら、Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.、Was
hington.D.C.、Abstract No.D-159、1986）。ＭＯＭＰ
以外のクラミジア・トラコマティス外膜抗原は主として
属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の存在す
るものもある。サルコシル不溶性の分子量約５９．５ダ
ルトンペプチドはこの範疇にはいる。
【０００７】上述したようにクラミジア・トラコマティ
スのもつ抗原性は非常に複雑である。クラミジア・トラ
コマティス感染者の有するクラミジア・トラコマティス
抗体は、クラミジア・トラコマティスの複雑な抗原性に
対応した多様性を示し、感染者によってそのパターンは
異なる。そのため特定の１種類のクラミジア・トラコマ
ティス蛋白を用いて、クラミジア・トラコマティス抗体
を測定することは事実上不可能である。従って、クラミ
ジア・トラコマティス感染者の有するクラミジア・トラ
コマティス抗体を高精度かつ高感度で、クラミジア・ニ
ューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との交叉反
応を含む非特異的反応を抑えて測定するためには、用い
る抗原材料の適切な選択が必要となる。
スのもつ抗原性は非常に複雑である。クラミジア・トラ
コマティス感染者の有するクラミジア・トラコマティス
抗体は、クラミジア・トラコマティスの複雑な抗原性に
対応した多様性を示し、感染者によってそのパターンは
異なる。そのため特定の１種類のクラミジア・トラコマ
ティス蛋白を用いて、クラミジア・トラコマティス抗体
を測定することは事実上不可能である。従って、クラミ
ジア・トラコマティス感染者の有するクラミジア・トラ
コマティス抗体を高精度かつ高感度で、クラミジア・ニ
ューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との交叉反
応を含む非特異的反応を抑えて測定するためには、用い
る抗原材料の適切な選択が必要となる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した未
精製ＥＢそのもの又はＳＤＳ処理したＥＢを抗原材料と
してクラミジア・トラコマティス抗体を測定する従来の
ＥＬＩＳＡ法におけるクラミジア・ニューモニエ抗体及
びクラミジア・シタシ抗体との交叉反応性を含む非特異
的反応の問題点を解消したクラミジア・トラコマティス
抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診
断用製剤を提供するものである。
精製ＥＢそのもの又はＳＤＳ処理したＥＢを抗原材料と
してクラミジア・トラコマティス抗体を測定する従来の
ＥＬＩＳＡ法におけるクラミジア・ニューモニエ抗体及
びクラミジア・シタシ抗体との交叉反応性を含む非特異
的反応の問題点を解消したクラミジア・トラコマティス
抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診
断用製剤を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、
（ａ）クラミジア・トラコマティス精製基本小体を固相
担体に固定化し、（ｂ）該固相担体をクラミジア・トラ
コマティスに対する抗体を含有している疑いのある検体
試料と接触させ、（ｃ）未反応の該検体試料成分を除去
し、（ｄ）生成したクラミジア・トラコマティス抗原と
クラミジア・トラコマティス抗体からなる抗原抗体複合
体を検体試料に由来する抗体に対する標識抗体と接触さ
せ、（ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、（ｆ）結合し
た該標識抗体上の標識物質量を測定することによって検
体試料中のクラミジア・トラコマティス抗体の存在又は
量を測定する各段階を含むことを特徴とするクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法に関する。また本発明
は、クラミジア・トラコマティス精製基本小体を固相担
体に固定化した固定化抗原と、標識抗体を組み合わせて
なるクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤に関
する。
（ａ）クラミジア・トラコマティス精製基本小体を固相
担体に固定化し、（ｂ）該固相担体をクラミジア・トラ
コマティスに対する抗体を含有している疑いのある検体
試料と接触させ、（ｃ）未反応の該検体試料成分を除去
し、（ｄ）生成したクラミジア・トラコマティス抗原と
クラミジア・トラコマティス抗体からなる抗原抗体複合
体を検体試料に由来する抗体に対する標識抗体と接触さ
せ、（ｅ）未反応の該標識抗体を除去し、（ｆ）結合し
た該標識抗体上の標識物質量を測定することによって検
体試料中のクラミジア・トラコマティス抗体の存在又は
量を測定する各段階を含むことを特徴とするクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法に関する。また本発明
は、クラミジア・トラコマティス精製基本小体を固相担
体に固定化した固定化抗原と、標識抗体を組み合わせて
なるクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤に関
する。
【００１０】以下に本発明を詳細に述べる。本発明に用
いるクラミジア・トラコマティス精製ＥＢは、既に公知
の方法を組合せ用いて調製することができる。例えば、
次の方法による。クラミジア・トラコマティス菌株を感
染培養した感染培養細胞懸濁液を超音波破砕した後、感
染培養上清を得、この上清液を例えば、ショ糖を含むト
リス（Tris）−ＨＣｌ緩衝液に重層して遠心し、得た遠
心沈渣を例えばリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）を加
えて懸濁し、この懸濁液をウログラフイン（diatrizoat
e meglumine and trizatesodium）及び食塩を含むＨＥ
ＰＥＳ（N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulf
onic acid）溶液に重層し、再び遠心し、得た沈渣を再
度リン酸ナトリウム緩衝液に懸濁し、ウログラフィン不
連続密度勾配に重層し、遠心する。濃度の異なるウログ
ラフィンの界面に生じるＥＢの沈降帯を回収し、ＳＰＧ
で希釈し、遠心を繰り返すことにより残留するウログラ
フィンを除去して精製ＥＢとすることができる。
いるクラミジア・トラコマティス精製ＥＢは、既に公知
の方法を組合せ用いて調製することができる。例えば、
次の方法による。クラミジア・トラコマティス菌株を感
染培養した感染培養細胞懸濁液を超音波破砕した後、感
染培養上清を得、この上清液を例えば、ショ糖を含むト
リス（Tris）−ＨＣｌ緩衝液に重層して遠心し、得た遠
心沈渣を例えばリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）を加
えて懸濁し、この懸濁液をウログラフイン（diatrizoat
e meglumine and trizatesodium）及び食塩を含むＨＥ
ＰＥＳ（N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulf
onic acid）溶液に重層し、再び遠心し、得た沈渣を再
度リン酸ナトリウム緩衝液に懸濁し、ウログラフィン不
連続密度勾配に重層し、遠心する。濃度の異なるウログ
ラフィンの界面に生じるＥＢの沈降帯を回収し、ＳＰＧ
で希釈し、遠心を繰り返すことにより残留するウログラ
フィンを除去して精製ＥＢとすることができる。
【００１１】ここで、精製ＥＢとは、宿主細胞、その構
成断片（蛋白質、その他の内容物等）などのＥＢ以外の
夾雑物を実質的に含まないものである。一般に従来使用
されている未精製ＥＢでは、それらの夾雑物を５０容量
％程度含む。本発明の精製ＥＢは、ＥＢを９０容量％以
上含むものが好ましい。その容量割合は、電子顕微鏡写
真に写る細胞等の面積比から測定することが可能であ
る。なお、本発明では、前述のようにクラミジア・トラ
コマティス精製ＥＢを抗原として用いることが重要であ
り、仮にどれか１つのポリペプチド、例えば約３９．５
Ｋダルトンペプチド（ＭＯＭＰ）に精製したものを用い
たのでは、臨床上非常に大きな問題である凝陰性反応が
生じ、また、十分な種特異性が得られるものとも言い難
い。
成断片（蛋白質、その他の内容物等）などのＥＢ以外の
夾雑物を実質的に含まないものである。一般に従来使用
されている未精製ＥＢでは、それらの夾雑物を５０容量
％程度含む。本発明の精製ＥＢは、ＥＢを９０容量％以
上含むものが好ましい。その容量割合は、電子顕微鏡写
真に写る細胞等の面積比から測定することが可能であ
る。なお、本発明では、前述のようにクラミジア・トラ
コマティス精製ＥＢを抗原として用いることが重要であ
り、仮にどれか１つのポリペプチド、例えば約３９．５
Ｋダルトンペプチド（ＭＯＭＰ）に精製したものを用い
たのでは、臨床上非常に大きな問題である凝陰性反応が
生じ、また、十分な種特異性が得られるものとも言い難
い。
【００１２】このようなクラミジア・トラコマティス精
製ＥＢをクラミジア・トラコマティス抗体測定のための
抗原原料として用いる本発明の製剤では、該抗原を固相
担体としてポリスチレンや塩化ビニールなどのプラスチ
ック材料、ニトロセルロースやナイロンなどの繊維材料
及びガラスやシリカゲルなどの無機材料等に固定化する
ことができ、その形状は、タイタープレート、ビーズ、
磁性ビーズ、ペーパーディスク、糸などあらゆる形が可
能である。中でも特にポリスチレンビーズ又はポリスチ
レンマイクロタイタープレートが好ましいものとして使
用される。また、本発明の製剤は、上記した固相担体に
物理的吸着に基づく方法で固相化させる方法に限らず、
原理的には抗原材料をＢｒＣＮ2等を用いた共有結合法
によって担体に固相化したものでもかまわない。
製ＥＢをクラミジア・トラコマティス抗体測定のための
抗原原料として用いる本発明の製剤では、該抗原を固相
担体としてポリスチレンや塩化ビニールなどのプラスチ
ック材料、ニトロセルロースやナイロンなどの繊維材料
及びガラスやシリカゲルなどの無機材料等に固定化する
ことができ、その形状は、タイタープレート、ビーズ、
磁性ビーズ、ペーパーディスク、糸などあらゆる形が可
能である。中でも特にポリスチレンビーズ又はポリスチ
レンマイクロタイタープレートが好ましいものとして使
用される。また、本発明の製剤は、上記した固相担体に
物理的吸着に基づく方法で固相化させる方法に限らず、
原理的には抗原材料をＢｒＣＮ2等を用いた共有結合法
によって担体に固相化したものでもかまわない。
【００１３】本発明の製剤を使用するヒトのクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法は、検体試料として主に
ヒト血清が用いられる。しかしながら本発明の方法によ
れば、非特異的反応性が低いためにクラミジア・トラコ
マティス抗体価の低い検体試料にも適用できる。従っ
て、ヒト涙、ヒト子宮頚管内膜分泌物及び，尿道より圧
出した前立腺液ヒト精液も検体試料として用いることが
できる。
・トラコマティス抗体測定方法は、検体試料として主に
ヒト血清が用いられる。しかしながら本発明の方法によ
れば、非特異的反応性が低いためにクラミジア・トラコ
マティス抗体価の低い検体試料にも適用できる。従っ
て、ヒト涙、ヒト子宮頚管内膜分泌物及び，尿道より圧
出した前立腺液ヒト精液も検体試料として用いることが
できる。
【００１４】上述の抗原固定化固相担体を、適当な希釈
を施したクラミジア・トラコマティスに対する抗体を含
有している疑いのある検体試料と接触させ、一定時間保
温し、反応させた後、未反応の検体試料成分を除去し
て、担体上にクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリ
ペプチド抗原とクラミジア・トラコマティス抗体の複合
体を得る。次に、この抗原／抗体複合体に、検体試料に
由来する抗体に対する標識抗体、好ましくは酵素標識抗
ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体と接触させ、反応さ
せる。その後、未反応の標識抗体を除去し、結合した標
識抗体上の標識物質量を測定することによって、検体試
料中に存在するＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ性のクラミジ
ア・トラコマティス抗体を測定する。
を施したクラミジア・トラコマティスに対する抗体を含
有している疑いのある検体試料と接触させ、一定時間保
温し、反応させた後、未反応の検体試料成分を除去し
て、担体上にクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリ
ペプチド抗原とクラミジア・トラコマティス抗体の複合
体を得る。次に、この抗原／抗体複合体に、検体試料に
由来する抗体に対する標識抗体、好ましくは酵素標識抗
ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体と接触させ、反応さ
せる。その後、未反応の標識抗体を除去し、結合した標
識抗体上の標識物質量を測定することによって、検体試
料中に存在するＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ性のクラミジ
ア・トラコマティス抗体を測定する。
【００１５】標識物質は放射性同位元素、蛍光色素など
でもよく、酵素に限定されるものではない。また、標識
酵素としてはマレートデヒドロゲナーゼ（酵素番号1.1.
1.37）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（同1.1.1.
49）、グルコースオキシダーゼ（同1.1.3.4）、西洋ワ
サビパーオキシダーゼ（同1.11.1.7）、アセチルコリン
エステラーゼ（同3.1.1.7）、アルカリフォスファター
ゼ（同3.1.3.1）、グルコアミラーゼ（同3.2.1.3）、リ
ゾチーム（同3.2.1.17）、β−ガラクトシダーゼ（同3.
2.1.23）などを用いることができるが、好ましくはアル
カリフォスファターゼ又は西洋ワサビパーオキシダーゼ
を用いる。なお、標識物質の定量は、標識物質の種類に
応じて選択される常法に従って行うことができる。
でもよく、酵素に限定されるものではない。また、標識
酵素としてはマレートデヒドロゲナーゼ（酵素番号1.1.
1.37）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（同1.1.1.
49）、グルコースオキシダーゼ（同1.1.3.4）、西洋ワ
サビパーオキシダーゼ（同1.11.1.7）、アセチルコリン
エステラーゼ（同3.1.1.7）、アルカリフォスファター
ゼ（同3.1.3.1）、グルコアミラーゼ（同3.2.1.3）、リ
ゾチーム（同3.2.1.17）、β−ガラクトシダーゼ（同3.
2.1.23）などを用いることができるが、好ましくはアル
カリフォスファターゼ又は西洋ワサビパーオキシダーゼ
を用いる。なお、標識物質の定量は、標識物質の種類に
応じて選択される常法に従って行うことができる。
【００１６】このようにして測定された検体試料中のク
ラミジア・トラコマティス抗体価は、クラミジア・トラ
コマティス感染症の臨床像をよく反映することが明らか
になっている。即ち、クラミジア・トラコマティスによ
る体表面への感染によりＩｇＭ抗体は感染後１〜２週間
で出現し、ＩｇＧ抗体も比較的早期に認められ時間とと
もに減少するが長時間持続すると考えられている。一
方、分泌型のＩｇＡ抗体は細胞性免疫と同様に再感染防
禦に役立っていると考えられている。クラミジア・トラ
コマティスのヒト性器感染に関しては、特に女性の場
合、血清中と子宮頚管内膜分泌物中にＩｇＧ、ＩｇＡ、
ＩｇＭ抗体が検出され、ＩｇＡ抗体量は病原体クラミジ
ア・トラコマティスの減少と逆比例の関係にあり病原体
の排出拡散を規制していることが知られている（Brunha
mら、Infect.Immun.、39、1491-1494、1983）。
ラミジア・トラコマティス抗体価は、クラミジア・トラ
コマティス感染症の臨床像をよく反映することが明らか
になっている。即ち、クラミジア・トラコマティスによ
る体表面への感染によりＩｇＭ抗体は感染後１〜２週間
で出現し、ＩｇＧ抗体も比較的早期に認められ時間とと
もに減少するが長時間持続すると考えられている。一
方、分泌型のＩｇＡ抗体は細胞性免疫と同様に再感染防
禦に役立っていると考えられている。クラミジア・トラ
コマティスのヒト性器感染に関しては、特に女性の場
合、血清中と子宮頚管内膜分泌物中にＩｇＧ、ＩｇＡ、
ＩｇＭ抗体が検出され、ＩｇＡ抗体量は病原体クラミジ
ア・トラコマティスの減少と逆比例の関係にあり病原体
の排出拡散を規制していることが知られている（Brunha
mら、Infect.Immun.、39、1491-1494、1983）。
【００１７】
【実施例】以下の実施例により、本発明のクラミジア・
トラコマティス抗体の測定方法についてより詳細に記述
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
トラコマティス抗体の測定方法についてより詳細に記述
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】Ａ）クラミジア・トラコマティス基本小体
（ＥＢ）の精製 クラミジア・トラコマティス菌株はＬ２／４３４／Ｂｕ
ｂｏを用いた。上記菌株を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）
添加イーグル（Eagle）ＭＥＭ培地中で増殖したマッコ
イ（McCoy）細胞に接種した。クラミジア・トラコマテ
ィスの接種には培養３日の細胞を用い、１５０×ｇ、５
分間遠心分離で収集しハンクス（Hank's）ＢＳＳで３回
遠心洗浄した。吸着は宿主細胞あたり１０個のクラミジ
ア・トラコマティスを反応させ、宿主細胞濃度１０7/ml
で３７℃、２時間温水中で振とうしつつ行った。吸着後
ＦＢＳ添加培地に細胞濃度が５〜７×１０5/mlになるよ
うに再浮遊させ３７℃で２日間培養した。培養後、その
一部を採取し遠心により感染細胞を集め塗抹標本を作成
し、ギムザ（Giemsa）染色によりＥＢが十分に増殖して
いることを確認した。
（ＥＢ）の精製 クラミジア・トラコマティス菌株はＬ２／４３４／Ｂｕ
ｂｏを用いた。上記菌株を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）
添加イーグル（Eagle）ＭＥＭ培地中で増殖したマッコ
イ（McCoy）細胞に接種した。クラミジア・トラコマテ
ィスの接種には培養３日の細胞を用い、１５０×ｇ、５
分間遠心分離で収集しハンクス（Hank's）ＢＳＳで３回
遠心洗浄した。吸着は宿主細胞あたり１０個のクラミジ
ア・トラコマティスを反応させ、宿主細胞濃度１０7/ml
で３７℃、２時間温水中で振とうしつつ行った。吸着後
ＦＢＳ添加培地に細胞濃度が５〜７×１０5/mlになるよ
うに再浮遊させ３７℃で２日間培養した。培養後、その
一部を採取し遠心により感染細胞を集め塗抹標本を作成
し、ギムザ（Giemsa）染色によりＥＢが十分に増殖して
いることを確認した。
【００１９】上記感染培養細胞懸濁液を超音波破砕機
（(株)日本精機製作所ＵＳ−３００）で２０ＫＨｚ、６
０秒間超音波破砕した後、２０℃、２０分間遠心し感染
培養上清を得た。この上清液５容を３０％ショ糖（ｗ／
ｖ）を含む０．０３３Ｍトリス（Tris）−ＨＣｌ緩衝液
（pH７．２）１容に重層し、１０，０００×ｇ、４℃、
６０分間遠心した。この遠心沈渣に０．１４Ｍ食塩を含
む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）（pH
７．２）を加えて懸濁し、この懸濁液を３５％ウログラ
フイン（diatrizoate meglumine and trizatesodium）
及び０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（N-
2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic aci
d）溶液に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、６０分間
遠心した（日立工機(株)分離用超遠心機７０Ｐ−７２、
スイングロータＳＰＲ２８ＳＡ）。沈渣を０．２５Ｍシ
ョ糖及び５ｍＭグルタミン酸を含む０．０１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ＳＰＧ、pH７．２）に懸濁し、ウログ
ラフィン不連続密度勾配（４０％／４４％／５２％）に
重層し、４３，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心した。
４４％と５２％ウログラフィンの界面に生じるＥＢの沈
降帯を回収し、ＳＰＧで希釈し、３０，０００×ｇ、４
℃、３０分間の遠心を繰り返すことにより残留するウロ
グラフィンを除去して、精製ＥＢとした（ＥＢを全細胞
及びその断片の９０容量％以上含む）。
（(株)日本精機製作所ＵＳ−３００）で２０ＫＨｚ、６
０秒間超音波破砕した後、２０℃、２０分間遠心し感染
培養上清を得た。この上清液５容を３０％ショ糖（ｗ／
ｖ）を含む０．０３３Ｍトリス（Tris）−ＨＣｌ緩衝液
（pH７．２）１容に重層し、１０，０００×ｇ、４℃、
６０分間遠心した。この遠心沈渣に０．１４Ｍ食塩を含
む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）（pH
７．２）を加えて懸濁し、この懸濁液を３５％ウログラ
フイン（diatrizoate meglumine and trizatesodium）
及び０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（N-
2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic aci
d）溶液に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、６０分間
遠心した（日立工機(株)分離用超遠心機７０Ｐ−７２、
スイングロータＳＰＲ２８ＳＡ）。沈渣を０．２５Ｍシ
ョ糖及び５ｍＭグルタミン酸を含む０．０１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ＳＰＧ、pH７．２）に懸濁し、ウログ
ラフィン不連続密度勾配（４０％／４４％／５２％）に
重層し、４３，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心した。
４４％と５２％ウログラフィンの界面に生じるＥＢの沈
降帯を回収し、ＳＰＧで希釈し、３０，０００×ｇ、４
℃、３０分間の遠心を繰り返すことにより残留するウロ
グラフィンを除去して、精製ＥＢとした（ＥＢを全細胞
及びその断片の９０容量％以上含む）。
【００２０】Ｂ）クラミジア・トラコマティス抗体測定
方法 前記の方法により得られた精製ＥＢを抗原として担体固
定用緩衝液（１リットル中にＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ2
各々２．９３ｇ、１．５９ｇを含む）で０．５μg/mlに
調製し９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの
各ウェルに１００μｌずつ分注し４℃で１晩反応した。
０．０５％トウエーン（Tween）２０を含むＰＢＳ（pH
７．２）（０．０５％トウエーン２０−ＰＢＳ）３００
μｌで３回洗浄し未吸着抗原を除去した。次に５％ＢＳ
Ａを含むブロッキング緩衝液（ＫＰＬ社製）（ブロッキ
ング／検体希釈用緩衝液）２５０μｌを各ウェルに加え
３７℃、１時間反応し、０．０５％トウエーン２０−Ｐ
ＢＳ ３００μｌで２回洗浄して抗原固定化プレートを
作成した。
方法 前記の方法により得られた精製ＥＢを抗原として担体固
定用緩衝液（１リットル中にＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ2
各々２．９３ｇ、１．５９ｇを含む）で０．５μg/mlに
調製し９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの
各ウェルに１００μｌずつ分注し４℃で１晩反応した。
０．０５％トウエーン（Tween）２０を含むＰＢＳ（pH
７．２）（０．０５％トウエーン２０−ＰＢＳ）３００
μｌで３回洗浄し未吸着抗原を除去した。次に５％ＢＳ
Ａを含むブロッキング緩衝液（ＫＰＬ社製）（ブロッキ
ング／検体希釈用緩衝液）２５０μｌを各ウェルに加え
３７℃、１時間反応し、０．０５％トウエーン２０−Ｐ
ＢＳ ３００μｌで２回洗浄して抗原固定化プレートを
作成した。
【００２１】ブロッキング／検体希釈用緩衝液で希釈し
た希釈検体血清１００μｌを上記抗原固定化プレートに
加えて３７℃、１時間反応後０．０５％トウエーン２０
−ＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄した。西洋ワサビパー
オキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を０．０５％
トウエーン２０−ＰＢＳで１μl/mlに希釈し各ウェルに
１００μｌずつ分注し３７℃で１時間反応後、０．０５
％トウエーン２０−ＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄し
た。次に、パーオキシダーゼの基質ＡＢＴＳ試薬（ＫＰ
Ｌ社）１００μｌを各ウェルに加え室温で５分間反応
後、２％シュウ酸２５μｌを加えて反応を停止し、マイ
クロタイタープレートリーダー（コロナ電気(株)、ＭＴ
Ｐ−２２形）で吸光度（λ1：４１５nm、λ2：４９２n
m）を測定した。
た希釈検体血清１００μｌを上記抗原固定化プレートに
加えて３７℃、１時間反応後０．０５％トウエーン２０
−ＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄した。西洋ワサビパー
オキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を０．０５％
トウエーン２０−ＰＢＳで１μl/mlに希釈し各ウェルに
１００μｌずつ分注し３７℃で１時間反応後、０．０５
％トウエーン２０−ＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄し
た。次に、パーオキシダーゼの基質ＡＢＴＳ試薬（ＫＰ
Ｌ社）１００μｌを各ウェルに加え室温で５分間反応
後、２％シュウ酸２５μｌを加えて反応を停止し、マイ
クロタイタープレートリーダー（コロナ電気(株)、ＭＴ
Ｐ−２２形）で吸光度（λ1：４１５nm、λ2：４９２n
m）を測定した。
【００２２】Ｃ）ヒト患者血清に対する感度及び特異性
（クラミジア・トラコマティスＩｇＧ抗体の測定）、ク
ラミジア・トラコマティス菌分離が確認されているクラ
ミジア・トラコマティス感染患者血清２０検体（抗原陽
性）、クラミジア・トラコマティス抗体陽性者血清９検
体（抗原陰性）及び正常ヒト血清２３検体を用いてＢ）
に記載の測定方法（ＥＬＩＳＡ法）に従って感度及び特
異性試験を行った。対照試験法としてマイクロ−ＩＦ法
を行った。ヒト血清は１％ＢＳＡを含む検体希釈用緩衝
液で８０倍に希釈し、クラミジア・トラコマティス抗体
測定用試料液とした。
（クラミジア・トラコマティスＩｇＧ抗体の測定）、ク
ラミジア・トラコマティス菌分離が確認されているクラ
ミジア・トラコマティス感染患者血清２０検体（抗原陽
性）、クラミジア・トラコマティス抗体陽性者血清９検
体（抗原陰性）及び正常ヒト血清２３検体を用いてＢ）
に記載の測定方法（ＥＬＩＳＡ法）に従って感度及び特
異性試験を行った。対照試験法としてマイクロ−ＩＦ法
を行った。ヒト血清は１％ＢＳＡを含む検体希釈用緩衝
液で８０倍に希釈し、クラミジア・トラコマティス抗体
測定用試料液とした。
【００２３】また本発明の効果をより一層に明らかにす
るために、クラミジア・トラコマティス抗体測定のため
に対照抗原として精製クラミジア・トラコマティス主要
外膜ペプチド（精製ＭＯＭＰ）を用い、本発明で用いた
クラミジア・トラコマティスＬ２株精製ＥＢと感度及び
特異性を比較した。結果を表１に示す。また、精製ＭＯ
ＭＰは、カルドウェル（Caldwell）Ｈ、Ｄらの方法（特
開昭５７−１５８７２５号公報）に従って調製した部分
精製ＭＯＭＰ画分をさらに調製用ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により免疫学的に均一な状態にした
標品を用いた。尚、各試験のカットオフ値は正常ヒト血
清２３検体の吸光度の平均値に標準偏差を２倍したもの
を加えた値とした。
るために、クラミジア・トラコマティス抗体測定のため
に対照抗原として精製クラミジア・トラコマティス主要
外膜ペプチド（精製ＭＯＭＰ）を用い、本発明で用いた
クラミジア・トラコマティスＬ２株精製ＥＢと感度及び
特異性を比較した。結果を表１に示す。また、精製ＭＯ
ＭＰは、カルドウェル（Caldwell）Ｈ、Ｄらの方法（特
開昭５７−１５８７２５号公報）に従って調製した部分
精製ＭＯＭＰ画分をさらに調製用ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により免疫学的に均一な状態にした
標品を用いた。尚、各試験のカットオフ値は正常ヒト血
清２３検体の吸光度の平均値に標準偏差を２倍したもの
を加えた値とした。
【００２４】表１の結果はクラミジア・トラコマティス
精製ＥＢを用いた本発明の方法が対照抗原として試験し
た精製ＭＯＭＰに比して、マイクロ−ＩＦ法との一致率
が非常に優れていることを示している。即ち、凝陽性
（false positive）はなく（陰性一致率（特異性）のデ
ータから判断）、特に、臨床上問題になる凝陰性（fals
e negative）が精製ＭＯＭＰに比べても非常に低く臨床
的有用性が高いことを示している。
精製ＥＢを用いた本発明の方法が対照抗原として試験し
た精製ＭＯＭＰに比して、マイクロ−ＩＦ法との一致率
が非常に優れていることを示している。即ち、凝陽性
（false positive）はなく（陰性一致率（特異性）のデ
ータから判断）、特に、臨床上問題になる凝陰性（fals
e negative）が精製ＭＯＭＰに比べても非常に低く臨床
的有用性が高いことを示している。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【発明の効果】本発明のクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法によれば、未精製ＥＢや精製ＭＯＭＰを用い
る測定方法に比較して、臨床上問題となる凝陰性がほと
んどなく、凝陽性がなく、またクラミジア・ニューモニ
エ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との非特異的反応の
低い、種特異性の高い測定を行うことができ、臨床的有
用性が高いものである。また、本発明のクラミジア・ト
ラコマティス感染症診断製剤は、臨床上問題となる凝陰
性がほとんどなく、凝陽性がなく、またクラミジア・ニ
ューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との非特異
的反応の低い、種特異性の高いクラミジア・トラコマテ
ィス抗体の測定を行うことができ、臨床的有用性が高い
ものである。
体測定方法によれば、未精製ＥＢや精製ＭＯＭＰを用い
る測定方法に比較して、臨床上問題となる凝陰性がほと
んどなく、凝陽性がなく、またクラミジア・ニューモニ
エ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との非特異的反応の
低い、種特異性の高い測定を行うことができ、臨床的有
用性が高いものである。また、本発明のクラミジア・ト
ラコマティス感染症診断製剤は、臨床上問題となる凝陰
性がほとんどなく、凝陽性がなく、またクラミジア・ニ
ューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との非特異
的反応の低い、種特異性の高いクラミジア・トラコマテ
ィス抗体の測定を行うことができ、臨床的有用性が高い
ものである。
Claims (11)
- 【請求項１】 （ａ）クラミジア・トラコマティス精製
基本小体を固相担体に固定化し、（ｂ）該固相担体をク
ラミジア・トラコマティスに対する抗体を含有している
疑いのある検体試料と接触させ、（ｃ）未反応の該検体
試料成分を除去し、（ｄ）生成したクラミジア・トラコ
マティス抗原とクラミジア・トラコマティス抗体からな
る抗原抗体複合体を検体試料に由来する抗体に対する標
識抗体と接触させ、（ｅ）未反応の該標識抗体を除去
し、（ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質量を測定す
ることによって検体試料中のクラミジア・トラコマティ
ス抗体の存在又は量を測定する各段階を含むことを特徴
とするクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項２】 検体試料がヒト涙、ヒト子宮頚管内膜分
泌物、ヒト精液及びヒト血清のいずれかである請求項１
記載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項３】 標識抗体が抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩ
ｇＭ抗体である請求項１又は２記載のクラミジア・トラ
コマティス抗体測定方法。 - 【請求項４】 標識抗体が酵素標識抗体である請求項
１、２又は３記載のクラミジア・トラコマティス抗体測
定方法。 - 【請求項５】 酵素標識抗体がアルカリフォスファター
ゼ又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体である請求
項４記載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項６】 クラミジア・トラコマティス精製基本小
体を固相担体に固定化した固定化抗原と、標識抗体を組
み合わせてなるクラミジア・トラコマティス感染症診断
用製剤。 - 【請求項７】 固相担体がプラスチック材料、繊維材料
及び無機材料から選択されるものである請求項６記載の
クラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤。 - 【請求項８】 固相担体がポリスチレンビーズ又はポリ
スチレンマイクロタイタープレートである請求項６又は
７記載のクラミジア・トラコマティス感染症診断用製
剤。 - 【請求項９】 標識抗体が、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ又は
ＩｇＭ抗体である請求項６、７又は８記載のクラミジア
・トラコマティス感染症診断用製剤。 - 【請求項１０】 標識抗体が酵素標識抗体である請求項
６、７、８又は９記載のクラミジア・トラコマティス感
染症診断用製剤。 - 【請求項１１】 酵素標識抗体がアルカリフォスファタ
ーゼ又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体である請
求項１０記載のクラミジア・トラコマティス感染症診断
用製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19883795A JPH0854396A (ja) | 1995-08-03 | 1995-08-03 | クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19883795A JPH0854396A (ja) | 1995-08-03 | 1995-08-03 | クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03091808A Division JP3018553B2 (ja) | 1990-05-08 | 1991-04-23 | クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0854396A true JPH0854396A (ja) | 1996-02-27 |
Family
ID=16397750
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19883795A Pending JPH0854396A (ja) | 1995-08-03 | 1995-08-03 | クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0854396A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008532007A (ja) * | 2005-02-25 | 2008-08-14 | ケンブリッジ セラノスティックス リミテッド | サンプル中の脂質酸化性アブザイムの検出 |
| CN100489529C (zh) | 2004-10-30 | 2009-05-20 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 一种以阵列形式免疫检测特定免疫球蛋白类型抗体的方法 |
-
1995
- 1995-08-03 JP JP19883795A patent/JPH0854396A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100489529C (zh) | 2004-10-30 | 2009-05-20 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 一种以阵列形式免疫检测特定免疫球蛋白类型抗体的方法 |
| JP2008532007A (ja) * | 2005-02-25 | 2008-08-14 | ケンブリッジ セラノスティックス リミテッド | サンプル中の脂質酸化性アブザイムの検出 |
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