JPH085801B2 - 多分散系の天然緑膿菌のべん毛（Ｈ）抗原（ＦＡ▲下ｇ▼）および、それらを製造する方法 - Google Patents
多分散系の天然緑膿菌のべん毛（Ｈ）抗原（ＦＡ▲下ｇ▼）および、それらを製造する方法Info
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- JPH085801B2 JPH085801B2 JP61500683A JP50068386A JPH085801B2 JP H085801 B2 JPH085801 B2 JP H085801B2 JP 61500683 A JP61500683 A JP 61500683A JP 50068386 A JP50068386 A JP 50068386A JP H085801 B2 JPH085801 B2 JP H085801B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、重合体形の、多分散系の天然緑膿菌（Pseu
domonas）のべん毛（Ｈ）抗原（FAg）および、シユード
モナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）の細
菌培養物から、それらを製造する方法に関するものであ
る。
domonas）のべん毛（Ｈ）抗原（FAg）および、シユード
モナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）の細
菌培養物から、それらを製造する方法に関するものであ
る。
シユードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aerugi
nosa）細菌は、主に免疫防衛能が低下している患者（例
えば、火傷を負つている患者、のう胞性線維症の患者、
または欠損性器官機能患者、および癌患者）において院
内感染を引き起こすことの多い、条件的病原菌である。
耐性が生じるために、緑膿菌感染に対して抗生物質は、
限られた範囲でしか活性を持たず、それ故、シユードモ
ナス・アエルギノサに起因する感染症に対抗するには、
免疫学的方法による試みがなされてきた。
nosa）細菌は、主に免疫防衛能が低下している患者（例
えば、火傷を負つている患者、のう胞性線維症の患者、
または欠損性器官機能患者、および癌患者）において院
内感染を引き起こすことの多い、条件的病原菌である。
耐性が生じるために、緑膿菌感染に対して抗生物質は、
限られた範囲でしか活性を持たず、それ故、シユードモ
ナス・アエルギノサに起因する感染症に対抗するには、
免疫学的方法による試みがなされてきた。
感染は、Ｏ−群抗原、およびＨ−抗原を生産する種々
の株によつて引き起こされうる。間接的免疫蛍光法を用
いたアンソルグ（Ansorg）（Zbl.Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.
A242,228−238（1978））によるＨ抗原のパターンによ
ると、シユードモナス アエルギノサに関しては、部分
抗原（a0、a1、a2、a3、a4）を有する、複合的なべん毛
（Ｈ）抗原ａと、均一的べん毛（Ｈ）抗原ｂが識別され
る。部分因子であるa0−a4は、独立した抗原決定基であ
り、それゆえ、いくつかのＨ−型を有するべん毛抗原の
パターンが生じる。Ｏ−群とＨ−型とは自由に組み合せ
をつくる。
の株によつて引き起こされうる。間接的免疫蛍光法を用
いたアンソルグ（Ansorg）（Zbl.Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.
A242,228−238（1978））によるＨ抗原のパターンによ
ると、シユードモナス アエルギノサに関しては、部分
抗原（a0、a1、a2、a3、a4）を有する、複合的なべん毛
（Ｈ）抗原ａと、均一的べん毛（Ｈ）抗原ｂが識別され
る。部分因子であるa0−a4は、独立した抗原決定基であ
り、それゆえ、いくつかのＨ−型を有するべん毛抗原の
パターンが生じる。Ｏ−群とＨ−型とは自由に組み合せ
をつくる。
シユードモナス・アエルギノサの細菌培養物を調製す
るために使用しうる株、およびその株が産生する抗原
を、以下の表に示す。
るために使用しうる株、およびその株が産生する抗原
を、以下の表に示す。
振とうし、ホモジナイズした後、遠心分離して得るこ
とのできるべん毛抗原の単離された繊維（R.アンソルグ
（Ansorg）、W.シユミツト（Schmitt）、（メド・マイ
クロバイオロ・イムノロ）Med.Microbiol.Immunol.（19
80）168:217−226）は、リポ多糖類（LPS）と栄養培地
由来の不純物とから成る複合物と一体化しているべん毛
およびべん毛画分とを含む。そのような調製物は、本質
的に発熱性であり、ヒトに対して利用するのに適さな
い。
とのできるべん毛抗原の単離された繊維（R.アンソルグ
（Ansorg）、W.シユミツト（Schmitt）、（メド・マイ
クロバイオロ・イムノロ）Med.Microbiol.Immunol.（19
80）168:217−226）は、リポ多糖類（LPS）と栄養培地
由来の不純物とから成る複合物と一体化しているべん毛
およびべん毛画分とを含む。そのような調製物は、本質
的に発熱性であり、ヒトに対して利用するのに適さな
い。
緑膿菌感染に対する予防用の緑膿菌ワクチンの製造は
既知であり、シユードモナス・アエルギノサを、表面培
養または混合栄養培地溶液中での液中培養により増殖さ
せて得た該微生物の細菌塊および／または、培養過物
を出発原料として使用する。これらの混合栄養培地に関
しては、炭素源およびエネルギー源（主に炭水化物）お
よび必須栄養塩類の他に、種々の抽出物および／また
は、動物性たんぱく質、微生物たんぱく質、または植物
性たん白質の水解物（いわゆるペプトン）を用いた。こ
のような栄養溶液補充物の組成は厳密に定められておら
ず、ロツト（lot）ごとに変えることができる。栄養溶
液補充物は、アミノ酸の他に、不完全に分解されたたん
白質フラグメントおよびその不確定な混合物をも含み、
実質上、アミノ酸および成長促進物質に対する需要を償
うことができる。それ故、培養上清は常に、非微生物起
源の物質に富んでいるが、このことは、培養段階の後、
べん毛（Ｈ）抗原から、栄養培地に由来する不純物をで
きる限り除くために、いくつかの分離工程を常に必要と
するので、シユードモナス・アエルギノサのべん毛
（Ｈ）抗原の調製には不利である。
既知であり、シユードモナス・アエルギノサを、表面培
養または混合栄養培地溶液中での液中培養により増殖さ
せて得た該微生物の細菌塊および／または、培養過物
を出発原料として使用する。これらの混合栄養培地に関
しては、炭素源およびエネルギー源（主に炭水化物）お
よび必須栄養塩類の他に、種々の抽出物および／また
は、動物性たんぱく質、微生物たんぱく質、または植物
性たん白質の水解物（いわゆるペプトン）を用いた。こ
のような栄養溶液補充物の組成は厳密に定められておら
ず、ロツト（lot）ごとに変えることができる。栄養溶
液補充物は、アミノ酸の他に、不完全に分解されたたん
白質フラグメントおよびその不確定な混合物をも含み、
実質上、アミノ酸および成長促進物質に対する需要を償
うことができる。それ故、培養上清は常に、非微生物起
源の物質に富んでいるが、このことは、培養段階の後、
べん毛（Ｈ）抗原から、栄養培地に由来する不純物をで
きる限り除くために、いくつかの分離工程を常に必要と
するので、シユードモナス・アエルギノサのべん毛
（Ｈ）抗原の調製には不利である。
粗製のべん毛原料を、細菌懸濁物から分離するには、
いわゆる「せん断」、即ち、ミキサー内で、細菌懸濁液
にせん断力をかけた後、15,000xg−18,000xgにて遠心分
離する方法を用いる。その後、ペレツトを捨て、粗製の
べん毛調製物を含む上清を、少なくとも40,000xgにて、
１時間、または、100,000xgにて20分間、遠心加速処理
する。こうして、粗製の抗原をペレツトの形で得る。す
でに言及したように、それは、リポ多糖類（LPS）、核
酸、種々の塩類、多糖類、および、そこから生成するワ
クチンの有効性および適合性に不利な影響を与える非べ
ん毛たん白質を含んでいる。従来は、純粋なべん毛
（Ｈ）抗原を分離することは不可能であつた（T.L.ピツ
ト（Pitt）、（ジヤーナル・オブ・メデイカル・マイク
ロバイオロジイ）J.Med.Microbiol.（1981）、14:251−
260）。
いわゆる「せん断」、即ち、ミキサー内で、細菌懸濁液
にせん断力をかけた後、15,000xg−18,000xgにて遠心分
離する方法を用いる。その後、ペレツトを捨て、粗製の
べん毛調製物を含む上清を、少なくとも40,000xgにて、
１時間、または、100,000xgにて20分間、遠心加速処理
する。こうして、粗製の抗原をペレツトの形で得る。す
でに言及したように、それは、リポ多糖類（LPS）、核
酸、種々の塩類、多糖類、および、そこから生成するワ
クチンの有効性および適合性に不利な影響を与える非べ
ん毛たん白質を含んでいる。従来は、純粋なべん毛
（Ｈ）抗原を分離することは不可能であつた（T.L.ピツ
ト（Pitt）、（ジヤーナル・オブ・メデイカル・マイク
ロバイオロジイ）J.Med.Microbiol.（1981）、14:251−
260）。
本発明は、前記の不利益および困難を避けることを目
的とし、重合体形の、多分散系の天然べん毛（Ｈ）抗原
（FAg）を、高純度で、発熱性物質を含まずに得ること
を目的とする。
的とし、重合体形の、多分散系の天然べん毛（Ｈ）抗原
（FAg）を、高純度で、発熱性物質を含まずに得ること
を目的とする。
これらの本発明に係る高純度のFAg抗原は、単量体成
分から成り、各単量体成分は、 ａ）アミノ酸：アスパラギン酸（Asp）、トレオニン
（Thr）、セリン（Ser）、グルタミン酸（Glu）、グリ
シン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、イソ
ロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、チロシン（Ty
r）、フェニルアラニン（Phe）、リジン（Lys）、アル
ギニン（Arg）、およびおそらくトリプトフアン（Trp）
を含み、 ｂ）Ｎ−末端アミノ酸配列：アラニン（Ala）−ロイ
シン（Leu）−トレオニン（Thr）−バリン（Val）−ア
スパラギン（Asn）−トレオニン（Thr）−アスパラギン
（Asn）−イソロイシン（Ile）−アラニン（Ala）を有
し、 ｃ）43,500〜53,050ダルトンの分子量を有し、さら
に、 ｄ）プロリン、メチオニン、セミ−シスチンおよびヒ
スチジンを含まないものである。
分から成り、各単量体成分は、 ａ）アミノ酸：アスパラギン酸（Asp）、トレオニン
（Thr）、セリン（Ser）、グルタミン酸（Glu）、グリ
シン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、イソ
ロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、チロシン（Ty
r）、フェニルアラニン（Phe）、リジン（Lys）、アル
ギニン（Arg）、およびおそらくトリプトフアン（Trp）
を含み、 ｂ）Ｎ−末端アミノ酸配列：アラニン（Ala）−ロイ
シン（Leu）−トレオニン（Thr）−バリン（Val）−ア
スパラギン（Asn）−トレオニン（Thr）−アスパラギン
（Asn）−イソロイシン（Ile）−アラニン（Ala）を有
し、 ｃ）43,500〜53,050ダルトンの分子量を有し、さら
に、 ｄ）プロリン、メチオニン、セミ−シスチンおよびヒ
スチジンを含まないものである。
さらに詳細に述べると、本発明に従つて、以下に示す
６つの特異なＨ−血清型が特徴づけられる。
６つの特異なＨ−血清型が特徴づけられる。
Ｈ−血清型（a0、a3、a4）のべん毛（Ｈ）抗原、その
単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソ
ロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リ
ジン、およびアルギニンを、64:33:35:42:44:68:29:29:
37:3:10:19:15の割合で含み、分子量は43,500である。
単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソ
ロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リ
ジン、およびアルギニンを、64:33:35:42:44:68:29:29:
37:3:10:19:15の割合で含み、分子量は43,500である。
Ｈ−血清型（a0、a3）のべん毛（Ｈ）抗原、その単量
形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、
グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイ
シン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジ
ン、およびアルギニンを69:35:38:44:47:73:30:30:60:
3:12:21:16の割合で含み、分子量は46,700である。
形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、
グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイ
シン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジ
ン、およびアルギニンを69:35:38:44:47:73:30:30:60:
3:12:21:16の割合で含み、分子量は46,700である。
Ｈ−血清型（a0）のべん毛（Ｈ）抗原、その単量形ア
ミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタ
ミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、
ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジン、およ
びアルギニンを、74:50:49:49:49:89:37:29:44:5:14:1
7:16の割合で含み、分子量は52,720である。
ミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グルタ
ミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、
ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジン、およ
びアルギニンを、74:50:49:49:49:89:37:29:44:5:14:1
7:16の割合で含み、分子量は52,720である。
Ｈ−血清型（ｂ）のべん毛（Ｈ）抗原、その単量形は
アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グル
タミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジン、
およびアルギニンを、74:48:48:49:51:91:38:30:43:4:1
3:18:18の割合で含み、分子量は53,050である。
アミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、グル
タミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジン、
およびアルギニンを、74:48:48:49:51:91:38:30:43:4:1
3:18:18の割合で含み、分子量は53,050である。
Ｈ−血清型（a0、a1、a2）のべん毛（Ｈ）抗原、その
単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソ
ロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リ
ジン、およびアルギニンを、76:44:40:52:50:81:32:32:
41:4:12:20:18の割合で含み、分子量は51,250である。
単量形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソ
ロイシン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リ
ジン、およびアルギニンを、76:44:40:52:50:81:32:32:
41:4:12:20:18の割合で含み、分子量は51,250である。
Ｈ−血清型（a0、a2）のべん毛（Ｈ）抗原、その単量
形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、
グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイ
シン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジ
ン、およびアルギニンを、68:41:37:46:44:73:29:29:3
7:3:10:16:16の割合で含み、分子量は45,900である。
形はアミノ酸：アスパラギン酸、トレオニン、セリン、
グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイ
シン、ロイシン、チロシン、フエニルアラニン、リジ
ン、およびアルギニンを、68:41:37:46:44:73:29:29:3
7:3:10:16:16の割合で含み、分子量は45,900である。
本発明は、さらに、シユードモナス・アエルギノサ細
菌培養物から、列挙した多分散系の天然緑膿菌べん毛
（Ｈ）抗原を製造する方法であつて、該細菌培養物を洗
剤で処理し、培養物から、多分散系の天然べん毛抗原を
分離することを特徴とする。
菌培養物から、列挙した多分散系の天然緑膿菌べん毛
（Ｈ）抗原を製造する方法であつて、該細菌培養物を洗
剤で処理し、培養物から、多分散系の天然べん毛抗原を
分離することを特徴とする。
洗剤を加えることにより、抗原を細菌塊から分離し、
次に、溶液中の抗原を分離することができる。洗剤とし
ては、胆汁酸塩が都合がよく、特にデオキシコレートが
適している。
次に、溶液中の抗原を分離することができる。洗剤とし
ては、胆汁酸塩が都合がよく、特にデオキシコレートが
適している。
この際、洗剤で処理する前に、好ましくは「せん断」
方法により、細菌培養物を分解しておいてもよく、また
は、洗剤の存在下にせん断力をかけてもよい。
方法により、細菌培養物を分解しておいてもよく、また
は、洗剤の存在下にせん断力をかけてもよい。
好ましい実施態様では、細菌培養物からの多分散系の
天然べん毛（Ｈ）抗原の分離を、クロマトグラフイー処
理または、精製により行なうが、不純物として存在して
いる高分子、特にリポ多糖類、核酸、塩類、多糖類、お
よびその他のものは保持されている。
天然べん毛（Ｈ）抗原の分離を、クロマトグラフイー処
理または、精製により行なうが、不純物として存在して
いる高分子、特にリポ多糖類、核酸、塩類、多糖類、お
よびその他のものは保持されている。
本発明に係る方法の勧められる改良法は、分解した微
生物培養物を、クロマトグラフイー処理に先立つて予備
精製し、細菌および顕微鏡的に観察可能な微生物粒子を
培養物から除去しておく方法である。この予備精製は、
遠心加速度5,000xgの遠心分離により行ないうる。分離
した沈殿物を捨て、その上清をさらに処理する。
生物培養物を、クロマトグラフイー処理に先立つて予備
精製し、細菌および顕微鏡的に観察可能な微生物粒子を
培養物から除去しておく方法である。この予備精製は、
遠心加速度5,000xgの遠心分離により行ないうる。分離
した沈殿物を捨て、その上清をさらに処理する。
クロマトグラフイー処理を都合よく行なうためには、
洗剤で平衡化したモレキユラー・シーブを使用する。適
切なモレキユラー・シーブはセフアクリル（Sephacry
l）である。
洗剤で平衡化したモレキユラー・シーブを使用する。適
切なモレキユラー・シーブはセフアクリル（Sephacry
l）である。
本発明方法のさらに好都合な改良法は、クロマトグラ
フイー処理により精製したべん毛抗原をカラムクロマト
グラフイーにかけてさらに精製し、存在している洗剤を
除き、純度90％以上のべん毛（Ｈ）抗原を得ることを特
徴とする。同様に、２回目のクロマトグラフイーによる
処理をモレキユラー・シーブ（例えば、セファデックス
［Sephadex;ファルマシア（Pharmacia）社製；ゲルろ過
用充填剤であり、デキストランをエピクロルヒドリンで
３次元架橋し、ビーズ状に成形した親水性ゲルの登録商
標］）または非極性ポリスチレン吸着ゲル（例えば、BI
O−BEADS SM−4;バイオラツド（Bio−Rad）社製；ポリ
スチロールまたはポリアクリルアミドからなる吸着剤の
登録商標）を用いて行なう。
フイー処理により精製したべん毛抗原をカラムクロマト
グラフイーにかけてさらに精製し、存在している洗剤を
除き、純度90％以上のべん毛（Ｈ）抗原を得ることを特
徴とする。同様に、２回目のクロマトグラフイーによる
処理をモレキユラー・シーブ（例えば、セファデックス
［Sephadex;ファルマシア（Pharmacia）社製；ゲルろ過
用充填剤であり、デキストランをエピクロルヒドリンで
３次元架橋し、ビーズ状に成形した親水性ゲルの登録商
標］）または非極性ポリスチレン吸着ゲル（例えば、BI
O−BEADS SM−4;バイオラツド（Bio−Rad）社製；ポリ
スチロールまたはポリアクリルアミドからなる吸着剤の
登録商標）を用いて行なう。
本発明に係る方法を、以下に具体例を示して、より詳
しく説明する。
しく説明する。
シユードモナス・アエルギノサＭ−２（序文において
例示した細菌株から選択した株）を以下に示す組成： コハク酸２ナトリウム 4.05 g/l、 リン酸１水素２カリウム ７ g/l、 リン酸２水素２カリウム ３ g/l、 リン酸水素アンモニウム １ g/l、 硫酸マグネシウム・7H2O 0.05 g/l、 塩化第２鉄 0.0025 g/l、 の栄養液中にて、細胞密度が２〜３×109細胞/mlに達す
るまで培養し、96時間の発酵期間中攪拌下、酸素分圧
（pO2）10％において希釈率を一定（0.2μ）に保つた。
例示した細菌株から選択した株）を以下に示す組成： コハク酸２ナトリウム 4.05 g/l、 リン酸１水素２カリウム ７ g/l、 リン酸２水素２カリウム ３ g/l、 リン酸水素アンモニウム １ g/l、 硫酸マグネシウム・7H2O 0.05 g/l、 塩化第２鉄 0.0025 g/l、 の栄養液中にて、細胞密度が２〜３×109細胞/mlに達す
るまで培養し、96時間の発酵期間中攪拌下、酸素分圧
（pO2）10％において希釈率を一定（0.2μ）に保つた。
連続的に発酵器から引き出した細菌培養物を、660ml
（0.45kg湿重量）のローター保持容量の発酵器と協同さ
せた超遠心分離機内で、遠心加速度18,000xgにて処理す
ることにより、仕上げる。ここで、希釈率0.2μを用い
ると、96時間後に非常に多量の生物量が集められるの
で、これをミキサー中にてせん断力をかけ、超遠心して
得たペレットを遠心分離（15,000xg−18,000xg）し、細
胞と細胞フラグメントとを分離すると、粗製のべん毛抗
原149mgが得られた。
（0.45kg湿重量）のローター保持容量の発酵器と協同さ
せた超遠心分離機内で、遠心加速度18,000xgにて処理す
ることにより、仕上げる。ここで、希釈率0.2μを用い
ると、96時間後に非常に多量の生物量が集められるの
で、これをミキサー中にてせん断力をかけ、超遠心して
得たペレットを遠心分離（15,000xg−18,000xg）し、細
胞と細胞フラグメントとを分離すると、粗製のべん毛抗
原149mgが得られた。
得られた粗製のべん毛抗原（18mg）を、pH7.0のトリ
ス−HCl緩衝液（30mM、12ml）中に溶解し、デオキシコ
レート（20mg/ml）を加えたトリス−HCl緩衝液（30mM、
pH7.0）で平衡化したセフアクリル（Sephacryl）Ｓ−10
00を充填したカラム（16×16cm）に適用し、デオキシコ
レート（2mg/ml）を加えた。即座に画分（2ml）を集
め、280nmおよび254nmにおける吸光度を観測して、溶出
図を作製した。カラムから流出（run）を添付図面に示
す（第１図）。Ａと表示した曲線は、光路長1mmのキユ
ベツト（セル）を用いた254nmにおける吸光度に基づい
て作成し、Ｂと表示した曲線は、光路長20mmのキユベツ
ト（セル）を用いた280nmにおける吸光度に基づいて作
成した。この吸収曲線において、抗原のピークは、280n
mに明瞭に認められる。
ス−HCl緩衝液（30mM、12ml）中に溶解し、デオキシコ
レート（20mg/ml）を加えたトリス−HCl緩衝液（30mM、
pH7.0）で平衡化したセフアクリル（Sephacryl）Ｓ−10
00を充填したカラム（16×16cm）に適用し、デオキシコ
レート（2mg/ml）を加えた。即座に画分（2ml）を集
め、280nmおよび254nmにおける吸光度を観測して、溶出
図を作製した。カラムから流出（run）を添付図面に示
す（第１図）。Ａと表示した曲線は、光路長1mmのキユ
ベツト（セル）を用いた254nmにおける吸光度に基づい
て作成し、Ｂと表示した曲線は、光路長20mmのキユベツ
ト（セル）を用いた280nmにおける吸光度に基づいて作
成した。この吸収曲線において、抗原のピークは、280n
mに明瞭に認められる。
次に、純化べん毛（Ｈ）抗原を含む溶液を、第１回目
の精製段階から残存しているデオキシコレートを除くた
めに、第２回目の精製工程に付した。この目的のために
は、架橋結合（cross−1inking）の程度がより少ないモ
レキユラー・シーブ、例えば、セフアデツクス（Sephad
ex）Ｇ−25を用いるか、または、BIO−BEADS SM−４の
ような吸着ゲルを用いる。この処理によつて、DOCが分
離され、べん毛抗原が、98％以上の純度で、少量の発熱
性物質（LPS）（１％以下）を伴なつて得られた。
の精製段階から残存しているデオキシコレートを除くた
めに、第２回目の精製工程に付した。この目的のために
は、架橋結合（cross−1inking）の程度がより少ないモ
レキユラー・シーブ、例えば、セフアデツクス（Sephad
ex）Ｇ−25を用いるか、または、BIO−BEADS SM−４の
ような吸着ゲルを用いる。この処理によつて、DOCが分
離され、べん毛抗原が、98％以上の純度で、少量の発熱
性物質（LPS）（１％以下）を伴なつて得られた。
同じ方法で、序文で例示した他の株の細菌培養物を培
養し、類似の方法を用いて、個々のＨ−型抗原を、それ
から純粋な型で得ることができる。FAgの収量は株の選
択に左右されることが示された。ある特定の株、例えば
5933（a0、a1、a2）および1210（a0、a1、a2）を用いる
と、170001（ｂ）およびＭ−２（ｂ）を用いるよりも、
細胞を高収量で得ることができる。
養し、類似の方法を用いて、個々のＨ−型抗原を、それ
から純粋な型で得ることができる。FAgの収量は株の選
択に左右されることが示された。ある特定の株、例えば
5933（a0、a1、a2）および1210（a0、a1、a2）を用いる
と、170001（ｂ）およびＭ−２（ｂ）を用いるよりも、
細胞を高収量で得ることができる。
本発明により特徴づけられた個々のべん毛（Ｈ）抗原
は、単量体化合物から成る重合体化合物であり、その特
性データーを以下に示す方法を用いて決定した。
は、単量体化合物から成る重合体化合物であり、その特
性データーを以下に示す方法を用いて決定した。
Ａ）アミノ酸分析 べん毛（Ｈ）抗原の全アミノ酸組成を分析するため
に、標品を加水分解してペプチド結合を切断した。これ
には、標準的なたん白質加水分解法（6N HCl、110℃、2
2時間）を用いた（C.H.W ヒルス（Hirs）メソーズ・イ
ン・エンザイモロジイ（Methods in Enzymology）、S.
P.コロウイツク（Colowick）、N.O.カプラン（Kapla
n）、編集長、XI巻、エンザイム・ストラクチヤー（Enz
yme Structure）、pp.59−62、C.H.W.ヒルス（Hirs）編
集、1967アカデミツク・プレス（Academic Press））。
に、標品を加水分解してペプチド結合を切断した。これ
には、標準的なたん白質加水分解法（6N HCl、110℃、2
2時間）を用いた（C.H.W ヒルス（Hirs）メソーズ・イ
ン・エンザイモロジイ（Methods in Enzymology）、S.
P.コロウイツク（Colowick）、N.O.カプラン（Kapla
n）、編集長、XI巻、エンザイム・ストラクチヤー（Enz
yme Structure）、pp.59−62、C.H.W.ヒルス（Hirs）編
集、1967アカデミツク・プレス（Academic Press））。
試験はベツクマン（Beckman）・システム6300−アミ
ノ酸分析器内にて行なつた。アミノ酸組成の結果に基づ
いて、単量体サブユニツトの分子量を計算した。
ノ酸分析器内にて行なつた。アミノ酸組成の結果に基づ
いて、単量体サブユニツトの分子量を計算した。
Ｂ）精製および分子量 本発明に係る抗原の純度または不純物の不在性を、ド
デシル硫酸ナトリウム中における、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により調べた（A.L.シヤピロ（Shapir
o）、E.ビヌエラ（Vinuela）、J.マイゼン（Maizel）、
バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ
・コミユニケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.Commu
n.）（1967）、28:815）。
デシル硫酸ナトリウム中における、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により調べた（A.L.シヤピロ（Shapir
o）、E.ビヌエラ（Vinuela）、J.マイゼン（Maizel）、
バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ
・コミユニケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.Commu
n.）（1967）、28:815）。
「銀染色」法（メリル（Merril）、C.R.ゴールドマン
（Goldman）、D.、セドマン（Sedman）、S.A.およびエ
ベルト（Ebert）、M.H.サイエンス（Science）（198
1）、211:1437）を用いて、電気泳動図を染色した。試
験を行なつたすべてのべん毛抗原に関して、以下に記載
した方法に従つて、べん毛抗原の分子量に基づき、ある
一定の距離を移動する単１のバンドが認められた。LPS
に関しては、かすかな微候も見出されなかつた。
（Goldman）、D.、セドマン（Sedman）、S.A.およびエ
ベルト（Ebert）、M.H.サイエンス（Science）（198
1）、211:1437）を用いて、電気泳動図を染色した。試
験を行なつたすべてのべん毛抗原に関して、以下に記載
した方法に従つて、べん毛抗原の分子量に基づき、ある
一定の距離を移動する単１のバンドが認められた。LPS
に関しては、かすかな微候も見出されなかつた。
オスボーン（Osborn）およびウエーバー（Weber）
（ウエーバー（（Weber）、K.およびオスボーン（Osbor
n）、M.（1969）ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリイ（J.Biol.Chem.）224:4406）の改良法に従
つて、ドデシル硫酸ナトリウム中におけるポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ない、精製したべん毛抗原を、
その単量体サブユニツトに分割し、それらの分子量を決
定した。
（ウエーバー（（Weber）、K.およびオスボーン（Osbor
n）、M.（1969）ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリイ（J.Biol.Chem.）224:4406）の改良法に従
つて、ドデシル硫酸ナトリウム中におけるポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ない、精製したべん毛抗原を、
その単量体サブユニツトに分割し、それらの分子量を決
定した。
以下に示す表中に、個々の株と関連したそれぞれのＨ
−血清型のべん毛（Ｈ）抗原を、対応するそれらのアミ
ノ酸組成およびそれらの分子量と共に例示した。トリプ
トフアンは、加水分解の間に完全に、または部分的に分
解するので、存在している場合でも表中には示されてい
ない。
−血清型のべん毛（Ｈ）抗原を、対応するそれらのアミ
ノ酸組成およびそれらの分子量と共に例示した。トリプ
トフアンは、加水分解の間に完全に、または部分的に分
解するので、存在している場合でも表中には示されてい
ない。
Ｃ）Ｎ−末端アミノ酸配列 ベツクマン（Beckman）−システム890たん白質／ペプ
チド配列決定器を用いて、精製した（純化）べん毛
（Ｈ）抗原のＮ−末端から最初の９アミノ酸の配列を、
「固相」法（P.エドマン（Edman）、G.ベツグ（Beg
g）、1967、たん白質シークエネーター（A.Protein seq
uenator）、ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオ
ケミストリイ（Eur.J.Biochem.1:80−91））を用いて決
定した。
チド配列決定器を用いて、精製した（純化）べん毛
（Ｈ）抗原のＮ−末端から最初の９アミノ酸の配列を、
「固相」法（P.エドマン（Edman）、G.ベツグ（Beg
g）、1967、たん白質シークエネーター（A.Protein seq
uenator）、ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオ
ケミストリイ（Eur.J.Biochem.1:80−91））を用いて決
定した。
すべての型に関して、同じ配列が見出された。
Ｍ−２ 5142 5939 Ala−Leu−Thr−Val−Asn−Thr−Asn−Ile−Ala− 1210 170018 5940 Ｄ）べん毛（Ｈ）抗原の粒子密度 本発明に係るべん毛（Ｈ）抗原の粒子密度を、標品液
体（蒸留水中のべん毛（Ｈ）抗原）（1ml）をCsCl−グ
ラジエント（gradient）（ｄ＝1.15−1.45g/cm3）に重
層することにより、決定した。
体（蒸留水中のべん毛（Ｈ）抗原）（1ml）をCsCl−グ
ラジエント（gradient）（ｄ＝1.15−1.45g/cm3）に重
層することにより、決定した。
ベツクマン70Ti−ローター（Rotor）中で、16時間、
遠心分離（50,000rpm）した後、遠心管の底から画分を
取り、ドデシル硫酸ナトリウム中にて、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なうことにより分析した。
遠心分離（50,000rpm）した後、遠心管の底から画分を
取り、ドデシル硫酸ナトリウム中にて、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なうことにより分析した。
試験を行なつたべん毛（Ｈ）抗原調製物のすべてにお
いて、その密度はｄ＝1.28g/cm3であつた。
いて、その密度はｄ＝1.28g/cm3であつた。
Ｅ）擬−弾性光散乱 この測定は、レーザー光線を高分子溶液に作用させる
と、高分子によつてレーザー光線が散乱されるという事
実に基づく。高分子は溶媒中にて決して瞬間的な位置に
停止せず、ブラウンの分子運動によつて移動する。例え
ば、高分子がレーザーから離れていく場合には、（ドツ
プラー効果に従つて）、散乱光の振動数は幾分低下する
であろう。このような振動数の変化から、高分子の拡散
に関する情報を導くことができ、それから「流体力学的
半径」を計算することができる（光子相関性分光学およ
び速度測定法（Photo correlation spectroscopy and v
elocimetry）、H.Z.クミンズ（Cummins）およびE.R.ピ
ツケ（Pike）、プレナム（Plenum）プレス、N.Y.、ロン
ドン（London）、1977）。
と、高分子によつてレーザー光線が散乱されるという事
実に基づく。高分子は溶媒中にて決して瞬間的な位置に
停止せず、ブラウンの分子運動によつて移動する。例え
ば、高分子がレーザーから離れていく場合には、（ドツ
プラー効果に従つて）、散乱光の振動数は幾分低下する
であろう。このような振動数の変化から、高分子の拡散
に関する情報を導くことができ、それから「流体力学的
半径」を計算することができる（光子相関性分光学およ
び速度測定法（Photo correlation spectroscopy and v
elocimetry）、H.Z.クミンズ（Cummins）およびE.R.ピ
ツケ（Pike）、プレナム（Plenum）プレス、N.Y.、ロン
ドン（London）、1977）。
べん毛（Ｈ）抗原の場合には、その流体学半径はその
分子の半径を表わしているのではなく、平均の大きさの
パラメーターを表わしている。しかし、後者は、標品の
年齢に依存することが大変はつきりしている。
分子の半径を表わしているのではなく、平均の大きさの
パラメーターを表わしている。しかし、後者は、標品の
年齢に依存することが大変はつきりしている。
適用した試験条件は以下の通りであつた：散乱角:60
°、波長:632.8nm、温度:20℃。すべてのべん毛抗原に
対して、以下に示す結果を得た:M−２、5142、5940、59
39、1210、170018、拡散係数、Ｄ＝8.5×10-9（cm2／
秒）、流体学半径、Ｒ＝2.5×10-5cm。
°、波長:632.8nm、温度:20℃。すべてのべん毛抗原に
対して、以下に示す結果を得た:M−２、5142、5940、59
39、1210、170018、拡散係数、Ｄ＝8.5×10-9（cm2／
秒）、流体学半径、Ｒ＝2.5×10-5cm。
Ｆ）免疫学的分析 免疫血清の調製： 高度に精製されたべん毛抗原調製物、並びに粗製のべ
ん毛抗原調製物を、ニユー・ジーランド（New Zealan
d）白うさぎを免疫するのに用いた。この免疫パターン
はラゲナウル（Lagenaur）およびアガビアン（Agabia
n）が記載した方法ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
イ（J.Bacteriol.128:435−444、1976）に対応してい
た。べん毛抗原調製物（500μg/ml）と完全フロイント
・アジユバント（Freund′s adjuvans）との混合物（1:
1）を含む1mlを筋肉内注射する。最初の注射の20日後
に、静脈内注射（0.5ml中にアジユバントは含まずに、
たん白質調製物を50μｇ、100μｇ、150μｇ、および25
0μｇ含んでいる）を４回、３日間隔で注射した。最後
の免疫の一週間後に、耳の静脈から血液を採り、４℃で
放置した。4,000xgにて15分間遠心分離して血清を得、
それを0.5mlづつ−70℃にて、凍結した。
ん毛抗原調製物を、ニユー・ジーランド（New Zealan
d）白うさぎを免疫するのに用いた。この免疫パターン
はラゲナウル（Lagenaur）およびアガビアン（Agabia
n）が記載した方法ジヤーナル・オブ・バクテリオロジ
イ（J.Bacteriol.128:435−444、1976）に対応してい
た。べん毛抗原調製物（500μg/ml）と完全フロイント
・アジユバント（Freund′s adjuvans）との混合物（1:
1）を含む1mlを筋肉内注射する。最初の注射の20日後
に、静脈内注射（0.5ml中にアジユバントは含まずに、
たん白質調製物を50μｇ、100μｇ、150μｇ、および25
0μｇ含んでいる）を４回、３日間隔で注射した。最後
の免疫の一週間後に、耳の静脈から血液を採り、４℃で
放置した。4,000xgにて15分間遠心分離して血清を得、
それを0.5mlづつ−70℃にて、凍結した。
免疫拡散： 免疫拡散試験を以下に示した改良点以外はオウクター
ロニイ（Ouchterlony）の方法（O.オウクターロニイ（O
uchterlony）、アクタ・パソロ・マイクロバイオロ・ス
カンド（Acta.Pathol.Microbiol.Scand.）（1949）26:5
07−515）を用いて行なつた。
ロニイ（Ouchterlony）の方法（O.オウクターロニイ（O
uchterlony）、アクタ・パソロ・マイクロバイオロ・ス
カンド（Acta.Pathol.Microbiol.Scand.）（1949）26:5
07−515）を用いて行なつた。
免疫拡散は、リン酸緩衝化生理食塩水中にトリトン
（Triton）Ｘ−100（１％）を含んでいる寒天（１％）
で被覆したガラス板上で行なつた。
（Triton）Ｘ−100（１％）を含んでいる寒天（１％）
で被覆したガラス板上で行なつた。
抗体用のウエル（Wells）には、通常、血清を20μｌ
入れ、抗原用ウエルには各々の標品を１−５μｌ入れ
た。高度に精製したべん毛抗原調製物をドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）（0.1％）中にて分解した。
入れ、抗原用ウエルには各々の標品を１−５μｌ入れ
た。高度に精製したべん毛抗原調製物をドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）（0.1％）中にて分解した。
完全な（無傷の）べん毛が寒天中に入り込むのは困難
であり、洗剤を用いて処理することにより、抗体と単量
体抗原との反応を確実にした。トリトン（Triton）Ｘ−
100は、免疫拡散プレート中で、SDSによつて抗原血清が
沈殿するのを防ぐ。免疫拡散プレートを湿度箱中で、30
℃において24時間、インキユベーシヨンする。
であり、洗剤を用いて処理することにより、抗体と単量
体抗原との反応を確実にした。トリトン（Triton）Ｘ−
100は、免疫拡散プレート中で、SDSによつて抗原血清が
沈殿するのを防ぐ。免疫拡散プレートを湿度箱中で、30
℃において24時間、インキユベーシヨンする。
免疫電気泳動： 免疫電気泳動は、B.ウイーケ（Weeke）による指針
（定量的免疫電気泳動のマニユアル、方法および応用
（A Manual of Quantitative Immunoelectropharesis、
Methods and Application）、アクセルゼン（Axelse
n）、クロール（Kroll）、ウイーケ（Weeke）、編、ユ
ニバーサイテツトスフオルラゲツト（Universitetsforl
aget）、オスロ（Oslo）、1973、pp.15−37）に従つて
行なつた。
（定量的免疫電気泳動のマニユアル、方法および応用
（A Manual of Quantitative Immunoelectropharesis、
Methods and Application）、アクセルゼン（Axelse
n）、クロール（Kroll）、ウイーケ（Weeke）、編、ユ
ニバーサイテツトスフオルラゲツト（Universitetsforl
aget）、オスロ（Oslo）、1973、pp.15−37）に従つて
行なつた。
原則として、本方法は、最初に、たん白質混合物（上
記の場合には、高度に精製したべん毛抗原）を緩衝化し
たアガロースゲル中で、SDSゲル電気泳動にかけて電気
泳動的に分離し、この分離操作の後、沈殿している免疫
血清（この場合においては、粗製の、および高度に精製
したべん毛（Ｈ）抗原に対するうさぎの抗血清）を１つ
の槽内にて、分離したたん白質の移動方向と並行に導入
することを特徴としている。
記の場合には、高度に精製したべん毛抗原）を緩衝化し
たアガロースゲル中で、SDSゲル電気泳動にかけて電気
泳動的に分離し、この分離操作の後、沈殿している免疫
血清（この場合においては、粗製の、および高度に精製
したべん毛（Ｈ）抗原に対するうさぎの抗血清）を１つ
の槽内にて、分離したたん白質の移動方向と並行に導入
することを特徴としている。
続いて、抗原および抗血清がトリトン（Triton）Ｘ−
100（１％）を含むアガロースゲル中で、相関的に拡散
すると、それらが接触した位置でアーチ形の沈降帯が生
成するので、その沈降帯の数、位置、および形により、
抗原混合物の組成を考察する。
100（１％）を含むアガロースゲル中で、相関的に拡散
すると、それらが接触した位置でアーチ形の沈降帯が生
成するので、その沈降帯の数、位置、および形により、
抗原混合物の組成を考察する。
免疫拡散の結果： オウクターロニイ（Ouchterlony）試験においては、
高度に精製したべん毛は各々、それらのホモローガス
（均質）な抗血清に関しては、この抗血清が粗製のべん
毛抗原調製物に対するものであるか、高度に精製したべ
ん毛抗原調製物に対するものであるかには関係なく、１
本の沈降帯を示した。
高度に精製したべん毛は各々、それらのホモローガス
（均質）な抗血清に関しては、この抗血清が粗製のべん
毛抗原調製物に対するものであるか、高度に精製したべ
ん毛抗原調製物に対するものであるかには関係なく、１
本の沈降帯を示した。
免疫電気泳動の結果： シユードモナス・アエルギノサ株（Ｍ−２、1210、59
39、5940、5142、170018）の高度に精製したべん毛抗原
調製物に関する免疫電気泳動は、粗製のべん毛抗原調製
物に対するホモローガスな抗血清を用いた場合と同様
に、それぞれの高度に精製したべん毛抗原調製物に対す
るホモローガスな抗血清を用いた場合にも、１本の沈降
帯を示した。
39、5940、5142、170018）の高度に精製したべん毛抗原
調製物に関する免疫電気泳動は、粗製のべん毛抗原調製
物に対するホモローガスな抗血清を用いた場合と同様
に、それぞれの高度に精製したべん毛抗原調製物に対す
るホモローガスな抗血清を用いた場合にも、１本の沈降
帯を示した。
第２図は、ウイーケの１次元免疫電気泳動による沈降
帯を示し、第３図は、オウクターロニイの免疫拡散によ
る沈降帯を示している。
帯を示し、第３図は、オウクターロニイの免疫拡散によ
る沈降帯を示している。
第２図からわかるように、Ｍ−２株に対応するべん毛
標品１、170018株に対応するべん毛標品２、1210株に対
応するべん毛標品３、5142株に対応するべん毛標品４、
5940株に対応するべん毛標品５、および5939株に対応す
るべん毛標品６を、各々、ゲルストリツプの穴（Ｘ）に
適用し、電気泳動を行なつた後、各々の抗血清ａ−ｆを
溝（スロツト）の中にピペツトで移した。図示したよう
に、ただ１本の沈降帯のみが生成し、従つて、６つのべ
ん毛標品はすべて純品であることがわかつた。
標品１、170018株に対応するべん毛標品２、1210株に対
応するべん毛標品３、5142株に対応するべん毛標品４、
5940株に対応するべん毛標品５、および5939株に対応す
るべん毛標品６を、各々、ゲルストリツプの穴（Ｘ）に
適用し、電気泳動を行なつた後、各々の抗血清ａ−ｆを
溝（スロツト）の中にピペツトで移した。図示したよう
に、ただ１本の沈降帯のみが生成し、従つて、６つのべ
ん毛標品はすべて純品であることがわかつた。
第３図には、Ｍ−２、170018、1210、5142、5940およ
び5939の各べん毛型について、関連の抗血清を用いた１
試験を行つた結果が示されている。寒天平板の穴Ｘの各
々にべん毛標品を適用し、穴Ｚにそれぞれの抗血清を適
用した。この場合にも、単一の強い沈降帯のみが生じて
おり、このことは、全ての６べん毛標品が純粋であるこ
とを証明するものである。
び5939の各べん毛型について、関連の抗血清を用いた１
試験を行つた結果が示されている。寒天平板の穴Ｘの各
々にべん毛標品を適用し、穴Ｚにそれぞれの抗血清を適
用した。この場合にも、単一の強い沈降帯のみが生じて
おり、このことは、全ての６べん毛標品が純粋であるこ
とを証明するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:385） (72)発明者 マクドネル，ジエームズ・エル アメリカ合衆国インデイアナ46616、サウ ス・ベンド、コテージ・グローブ・アベニ ユー814番 (72)発明者 ミツターラー，アーテユアー オ−ストリア国ア−‐2304、オルト／ドナ ウ、アム・マルクト30番 (56)参考文献 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ，ｖｏｌ．35，ｎｏ．１ （1982），ｐｐ．281−288
Claims (15)
- 【請求項１】重合体形の、単量体成分からなる多分散系
の天然緑膿菌べん毛（Ｈ）抗原であって、下記の特性： （ｉ）拡散係数 Ｄ＝8.5x10-9（cm2／秒）； （ii）流体学半径 Ｒ＝2.5x10-5cm; （iii）粒子密度 ｄ＝1.28g/cm3；および （iv）リポ多糖類を含む発熱性物質の含有量が１％以下
である を有し、それを構成する各単量体が、 （ａ）アミノ酸：アスパラギン酸（Asp）；トレオニン
（Thr）；セリン（Ser）；グルタミン酸（Glu）；グリ
シン（Gly）；アラニン（Ala）；バリン（Val）；イソ
ロイシン（Ile）；ロイシン（Leu）；チロシン（Ty
r）；フェニルアラニン（Phe）；リジン（Lys）；アル
ギニン（Arg）を含むと共に、トリプトファン（Trp）を
含むこともあり； （ｂ）式：アラニン（Ala）−ロイシン（Leu）−トレオ
ニン（Thr）−バリン（Val）−アスパラギン（Asn）−
トレオニン（Thr）−アスパラギン（Asn）−イソロイシ
ン（Ile）−アラニン（Ala） で示されるＮ−末端アミノ酸配列を有し； （ｃ）分子量が43,500〜53,050であり：そして （ｄ）プロリン、メチオニン、セミ−シスチンおよびヒ
スチジンを含まないことを特徴とするべん毛（Ｈ）抗
原。 - 【請求項２】単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸；ト
レオニン；セリン；グルタミン酸；グリシン；アラニ
ン；バリン；イソロイシン；ロイシン；チロシン；フェ
ニルアラニン；リジン；およびアルギニンを64:33:35:4
2:44:68:29:29:37:3:10:19:15の割合で含み、分子量が4
3,500であることを特徴とするＨ−血清型がa0、a3、a4
である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項３】単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸；ト
レオニン；セリン；グルタミン酸；グリシン；アラニ
ン；バリン；イソロイシン；ロイシン；チロシン；フェ
ニルアラニン；リジン；およびアルギニンを69:35:38:4
4:47:73:30:30:60:3:12:21:16の割合で含み、分子量が4
6,700であることを特徴とするＨ−血清型がa0、a3であ
る第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項４】単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸；ト
レオニン；セリン；グルタミン酸；グリシン；アラニ
ン；バリン；イソロイシン；ロイシン；チロシン；フェ
ニルアラニン；リジン；およびアルギニンを74:50:49:4
9:49:89:37:29:44:5:14:17:16の割合で含み、分子量が5
2,720であることを特徴とするＨ−血清型がa0である第
１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項５】単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸；ト
レオニン；セリン；グルタミン酸；グリシン；アラニ
ン；バリン；イソロイシン；ロイシン；チロシン；フェ
ニルアラニン；リジン；およびアルギニンを74:48:48:4
9:51:91:38:30:43:4:13:18:18の割合で含み、分子量が5
3,050であることを特徴とするＨ−血清型がｂである第
１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項６】単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸；ト
レオニン；セリン；グルタミン酸；グリシン；アラニ
ン；バリン；イソロイシン；ロイシン；チロシン；フェ
ニルアラニン；リジン；およびアルギニンを76:44:40:5
2:50:81:32:32:41:4:12:20:18の割合で含み、分子量が5
1,250であることを特徴とするＨ−血清型がa0、a1、a2
である第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項７】単量形が、アミノ酸：アスパラギン酸；ト
レオニン；セリン；グルタミン酸；グリシン；アラニ
ン；バリン；イソロイシン；ロイシン；チロシン；フェ
ニルアラニン；リジン；およびアルギニンを68:41:37:4
6:44:73:29:29:37:3:10:16:16の割合で含み、分子量が4
5,900であることを特徴とするＨ−血清型がa0、a2であ
る第１項記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項８】ラゲナーおよびアガビアンによる免疫パタ
ーンに従い、多価の、または単価の抗体をウサギ内で誘
導するものであることを特徴とする第１項〜第７項のい
ずれかに記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項９】オウクターロニイによる免疫拡散試験また
はウイーケによる免疫電気泳動試験において、多価およ
び／または単価の抗体に関して単一の沈降帯を形成する
ものであることを特徴とする第１項〜第８項のいずれか
に記載のべん毛（Ｈ）抗原。 - 【請求項１０】シュードモナス・アエルギノサ細菌培養
物から、純度98％以上の、重合体形の、単量体成分から
なる多分散系の天然緑膿菌べん毛（Ｈ）抗原であって、
下記の特性： （ｉ）拡散係数 Ｄ＝8.5x10-9（cm2／秒）； （ii）流体学半径 Ｒ＝2.5x10-5cm; （iii）粒子密度 ｄ＝1.28g/cm3；および （iv）リポ多糖類を含む発熱性物質の含有量が１％以下
である を有し、それを構成する各単量体が、 （ａ）アミノ酸：アスパラギン酸（Asp）；トレオニン
（Thr）；セリン（Ser）；グルタミン酸（Glu）；グリ
シン（Gly）；アラニン（Ala）；バリン（Val）；イソ
ロイシン（Ile）；ロイシン（Leu）；チロシン（Ty
r）；フェニルアラニン（Phe）；リジン（Lys）；アル
ギニン（Arg）を含むと共に、トリプトファン（Trp）を
含むこともあり； （ｂ）式：アラニン（Ala）−ロイシン（Leu）−トレオ
ニン（Thr）−バリン（Val）−アスパラギン（Asn）−
トレオニン（Thr）−アスパラギン（Asn）−イソロイシ
ン（Ile）−アラニン（Ala） で示されるＮ−末端アミノ酸配列を有し； （ｃ）分子量が43,500〜53,050であり：そして （ｄ）プロリン、メチオニン、セミ−シスチンおよびヒ
スチジンを含まないべん毛（Ｈ）抗原を回収する方法で
あって、シュードモナス・アエルギノサ細菌培養物を分
解し、洗剤を加えて洗剤含有粗抗原溶液を得、得られた
粗抗原溶液を洗剤で平衡化したモレキュラーシーブを用
いてクロマトグラフイー処理した後、再度クロマトフラ
フィー処理して洗剤を除去することを特徴とする回収方
法。 - 【請求項１１】分解を、剪断処理および分画処理によっ
て行うことを特徴とする第10項に記載の方法。 - 【請求項１２】分解した細菌培養物を遠心加速度5,000x
gで遠心分離し、細菌細胞および顕微鏡的に観察可能な
細菌粒子を除去した後、クロマトグラフィー処理に付す
ことを特徴とする第10項に記載の方法。 - 【請求項１３】洗剤が胆汁酸塩であることを特徴とする
第10項に記載の方法。 - 【請求項１４】胆汁酸塩がデオキシコレートであること
を特徴とする第13項に記載の方法。 - 【請求項１５】第２のクロマトグラフィー精製をモレキ
ュラー・シーブまたは吸着ゲルを用いて行うことを特徴
とする第10項記載の方法。
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