JPH0859697A

JPH0859697A - ペプチド並びにそれを含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤、機能性食品及び動物用飼料

Info

Publication number: JPH0859697A
Application number: JP7079661A
Authority: JP
Inventors: Susumu Maruyama; 進丸山; Hideoki Tanaka; 秀興田中; Takashi Omori; 丘大森
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; NH Foods Ltd
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 1996-03-05
Anticipated expiration: 2021-01-11
Also published as: JP3733376B2

Abstract

(57)【要約】【目的】プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有
し、研究用試薬や代謝改善薬などとして有用なペプチド
並びにそれを含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害
剤、機能性食品及び動物用飼料を提供することを目的と
する。【構成】本発明のペプチドは、牛脳などから取得する
ことができ、特定のアミノ酸配列を有するペプチドであ
り、当該ペプチドはプロリルエンドペプチダーゼ阻害活
性を有する。また、本発明のプロリルエンドペプチダー
ゼ阻害剤、機能性食品及び動物用飼料は上記のペプチド
を含有することからなり、当該ペプチドはプロリルエン
ドペプチダーゼ阻害活性を有するので、本発明の阻害剤
及び食品によれば、プロリルエンドペプチダーゼが関与
する疾患、例えば痴呆症の治療・予防を図ることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規ペプチド並びにそれ
を成分として含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害
剤、機能性食品及び動物用飼料に関する。より詳細に
は、哺乳動物の脳その他の生体内に存在し、プロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害活性を有するペプチド、並びにそ
れを含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤、機能
性食品及び動物用飼料に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内の生理活性ペプチドは、多くの場
合プロリンを含有している。分子内にイミノ基を有する
プロリンは、ペプチド形成の際に他のアミノ酸と酸イミ
ド結合を形成する。ペプチド鎖は一般にプロリンの存在
部位で折れ曲がり、プロリンが多数つながった場合には
特異なヘリックス構造をとることなどから、ペプチドの
プロリン周辺やプロリンを多く含むタンパク質（プロリ
ン・リッチ・タンパク質）は通常のプロテア−ゼによる
分解を受けることが少ない。そのため、プロリンは多く
の生理活性ペプチドに含有されており、また、プロリン
・リッチ・タンパク質は、植物の細胞壁や動物の細胞間
に多量に存在して生体組織の構造維持などに重要な機能
を果たしている。特に哺乳動物においては、組織の構造
維持や細胞接着に関与するコラーゲンが古くから知られ
ていたが、最近になって、神経系において神経伝達物質
の放出を制御するシナプシン（Science, Vol.259, p78
0, 1993）、ヒト転写促進因子CTF1の酸性ドメイン（J.
Biol. Chem., Vol.268, p20866, 1993)、マウスの中枢
神経系の形成時に発現が特異的に制御されるNDPP-1（Bi
ochim. Biophys. Acta, Vol.1132, p240, 1992）など、
重要な機能を持つプロリン・リッチ・タンパク質やプロ
リン・リッチ・ペプチドの発見が相次いでなされてい
る。

【０００３】一方、プロリルエンドペプチダーゼ(EC 3.
4.21.26、以下ＰＥＰという)はペプチド鎖中のプロリン
残基のカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に認識
し、切断するペプチダーゼであり、記憶の固定場所とさ
れている脳の海馬部分に高い酵素活性が観られるほか、
動物臓器に広く分布することが知られている（Science,
Vol.173, p827, 1971、Molecular & Cellular Biochem
istry, Vol.30, p111,1980、日本農芸化学会誌, Vol.5
8, p1147, 1984）。また、同様の酵素が Flavobacteriu
m 属細菌からも発見されている（J. Biol. Chem., Vol.
255, p4786, 1980）。本酵素は神経伝達物質とされてい
るサブスタンスＰ、ＴＲＨ、ニューロテンシンやステッ
プスルー型受動的回避学習法で記憶保持活性があるとさ
れている脳内バソプレシン（Science, Vol.221, p1310,
1983、Nature, Vol.308, p276,1984）に作用し、不活
性化することが知られており、本酵素は脳機能の調節に
おいて重要な役割を果たしていることが示唆されてい
る。実際に、Z-Gly-Pro-CH₂Cl, Z-Pro-prolinal, Z-Val
-prolinal, Boc-Pro-prolinal などの合成ＰＥＰ阻害剤
が抗痴呆作用を示すことが動物試験で確認され（日本農
芸化学会誌, Vol.58,p1147, 1984、化学と生物, Vol.2
5, p554, 1987)、その後、微生物や食品成分から由来す
るＰＥＰ阻害剤も報告されている（1990年薬学会年会講
演要旨集 p.35、Agric. Biol. Chem., Vol.55, p825, 1
991、J. Antibiotics, Vol.44, p956,1991、特開平5-3
31072号公報）。一方、動物由来の内因性ＰＥＰ阻害物
質として、豚膵臓由来の分子量6500の物質及びラット脳
由来の分子量7000の物質が報告されている（J. Pharm.
Dyn., Vol.5, p734, 1982、Chem. Pharm. Bull, Vol.3
3, p2445, 1985)。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、合成Ｐ
ＥＰ阻害剤を用いた痴呆症疾患治療が研究されている
が、新規有用な痴呆症治療薬ひいてはＰＥＰ阻害剤は常
に求められている。また、医薬品としてのみならず、日
常の摂取を通して痴呆症等の症状の予防等を図る機能性
食品も求められる昨今である。このような目的で使用す
るＰＥＰ阻害剤としては、哺乳動物が自ら作り出す内因
性の阻害物質が副作用の軽減などの点から最も望ましい
のであるが、これまでに報告されているＰＥＰ阻害剤の
殆どは化学合成又は植物などから抽出したものであっ
た。内因性の阻害物質としては前述の分子量6500の物質
などが知られているが、未だ構造が明確でなく、分子量
が大きいことから、体内への吸収性、安定性に問題があ
ると考えられる。また、前述のように哺乳動物からのプ
ロリンを多量に含むタンパク質やペプチドの発見が相次
いでいるが、それらの機能はまだ十分に解明されておら
ず、かかる物質の生体内機能、特に脳に対する機能の研
究を目的とする研究用試薬として有用なペプチドや、プ
ロリン・リッチ・タンパク質やプロリン・リッチ・ペプ
チドの機能に関連した疾患の改善を目的とする薬剤が求
められている。本発明はかかる問題を解消するもので、
本発明はＰＥＰ阻害作用を有し、研究用試薬としてのみ
ならず医薬品や機能性食品などとしても利用可能な内因
性ＰＥＰ阻害ペプチドを提供すると共に当該ペプチドを
含有するＰＥＰ阻害剤、機能性食品及び動物用飼料を提
供することも目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、プロリン
を含むペプチドを特異的に加水分解するＰＥＰ（Mol.Ce
ll. Biochem., Vol.30, p111, 1980)やオリゴプロリン
配列を加水分解するアミノペプチダーゼＰ様酵素が脳内
に多く存在することに着目し、脳にはＰＥＰやアミノペ
プチダーゼＰの基質又は阻害物質になり得る未知のペプ
チドが存在するものと考えた。そこで、牛脳を熱水抽出
した液から、ＰＥＰの基質或は阻害物質となるペプチド
を探索し、精製し、その構造を解析し、更に検討を重ね
たところ、ＰＥＰ阻害活性を有する８種類のペプチドを
見出し、本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明のペプチドは、Ｌ体のアミノ
酸からなり、下記のアミノ酸配列の何れかで示されるペ
プチド及びその塩である。 Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-Asp-Phe-Ser
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly
-Arg-Thr-Phe-Pro-Lys Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly
-Arg Glu-Pro-Pro-Pro-Pro-Glu-Pro-Pro-Pro-Ile Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Thr-Arg-Val-Asp-Phe-Ser
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn Met-Thr-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-Asp-Phe-Ser
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro 又、本発明のＰＥＰ阻害剤は、上記の〜のペプチド
又はその塩の少なくとも１種を有効成分として含有する
ことからなる。更に、本発明の機能性食品及び動物用飼
料は、上記の〜のペプチド又はその塩の少なくとも
１種を含有することからなる。

【０００７】本発明のペプチドの塩としては、酸付加塩
及び塩基付加塩が包含され、酸付加塩としては、製薬上
許容される酸（無機酸及び有機酸）との塩、例えば塩酸
塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸
塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、ト
ルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸
塩等が例示される。また、塩基付加塩としては、製薬上
許容される塩基（無機塩基及び有機塩基）との塩、例え
ばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシ
ウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基
との塩、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン
等）との塩などが例示される。

【０００８】本発明のペプチドは、牛等の哺乳動物の脳
又は他の臓器・組織・体液などから単離することもでき
るが、通常、有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段
階的に導入する方法により合成することができる。他
に、遺伝子工学的方法、加水分解酵素の逆反応を利用し
たペプチド合成法、又は天然タンパク質の酵素加水分解
により製造することも可能である。

【０００９】本発明のペプチドは当該ペプチドを含有す
る生体成分から常法に準じて採取することができ、かか
る方法としては、例えば、ウシ脳などのような当該ペプ
チドを含有する生体成分から熱水抽出を行い、得られた
抽出液を、限外濾過膜、ゲル濾過、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相カラムによる高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）などに付して精製することにより得ること
ができる。

【００１０】有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段
階的に導入する方法としては固相ペプチド合成又は液相
ペプチド合成法が知られており、例えば泉屋信夫他著
「ペプチド合成の基礎と実験」丸善発行などに詳細に記
載されている。液相ペプチド合成では、Ｃ末端に位置す
べきアミノ酸のカルボキシル基をベンジル基(Bzl)、t-
ブチル基(t-Bu)等で保護し、Ｃ末端から2番目に位置す
べきアミノ酸のアミノ基をt-ブチルオキシカルボニル基
(Boc)、ベンジルオキシカルボニル基(Z)等で保護し、こ
れらをジメチルホルムアミド(DMF)等の適当な溶媒に溶
解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及び1-ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)の存在下4℃で18時
間程度反応させる。ついで、生成物のアミノ保護基を常
法（トリフルオロ酢酸などによる）により除去し、得ら
れるジペプチドを第３のアミノ酸（これもアミノ基を保
護してある）とともに上記と同様にして反応させる。更
に、同様な手順を繰り返して順次必要なアミノ酸を結合
させ、保護基の結合した状態の目的ペプチドを得る。な
お、反応させるアミノ酸が側鎖官能基を有する場合には
ペプチド合成反応に先だって保護する必要がある。例え
ば、Gluのω-カルボキシル基はベンジルエステル（OBz
l）などにより、アルギニンのグアニジル基はトシル基
(Tos)などにより保護する。最終反応の終了後、これら
の保護基を接触還元やフッ化水素(HF)などにより除去
し、目的とするペプチドを得ることができる。

【００１１】一方、固相ペプチド合成については、ペプ
チドシンセサイザー（例えば、アプライドバイオシステ
ムズ社製430A型）を用いて行うことができる。この方法
においては、目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸が結
合したフェニルアセトアミドメチル(PAM)樹脂、即ちア
ミノ酸-OCH₂-PAMのＮ側にBoc基で保護したアミノ酸を自
動制御により逐次結合させ、目的とするペプチドに保護
基とPAM樹脂の結合した試料を得ることが出来る。次い
で、この試料にアニソールなどのスカベンジャーを添加
した後、ＨＦを導入し-2℃、1時間反応させることによ
り目的ペプチドを遊離させることが出来る。遊離したペ
プチドは無水エーテルなどで洗浄後、酢酸を含む水で抽
出、凍結乾燥後更に、高速液体クロマトグラフィーによ
り精製、減圧乾固することにより粉末として得ることが
出来る。

【００１２】本発明のペプチドは遺伝子工学的方法によ
っても得ることができ、例えば、前記〜のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ断片を合成し、このＤＮＡ断片
を常法により適当な発現ベクターに組み込み、この発現
ベクターで適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換
体を培養し、その培養物から単離・精製することによ
り、目的ペプチドを調製することができる。なお、機能
性食品動物用飼料に供することを目的として、本発明の
ペプチドを細菌及び／又は酵母を宿主として発現した場
合には、培養物から本発明のペプチドを単離・精製して
使用する以外に、細菌及び／又は酵母の死菌又はその粉
末をそのまま使用してもよい。

【００１３】上記の方法で得られた本発明のペプチド
は、必要に応じて、限外濾過膜、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HP
LC）など慣用の手段に付して更に精製してもよい。本発
明のペプチドの塩は、常法に準じて、当該ペプチドに酸
又は塩基を付加させることにより調製することができ
る。

【００１４】本発明のペプチドは、生体機能、特に脳機
能の研究を目的とする研究用試薬として利用することが
できる。また、その機能が十分に解明されれば、生体、
特に脳の疾患の治療・予防に利用できる。更に、本発明
のペプチドはＰＥＰ阻害活性を有するから、ＰＥＰが関
与する疾患、特にヒトの痴呆症（健忘症）を治療・予防
するための医薬、機能性食品に利用でき、更にイヌ、ネ
コ、ウシなどの動物の痴呆症を治療・予防するための機
能性動物用飼料として利用できる。本発明のペプチド
は、本来、動物の脳に存在するペプチド性阻害物質であ
ることから安全性が高いと共に低分子量であるから吸収
性などの問題も少ない。従って、本発明のぺプチドは、
研究用試薬、代謝改善薬（例えば、痴呆症治療剤等）、
機能性食品、動物用飼料などとして広く利用することが
できる。

【００１５】本発明のＰＥＰ阻害剤は、前記の〜の
ペプチド及びその塩の少なくとも１種を有効成分として
含有することからなり、当該ペプチド単独又は通常少な
くとも１つの製薬補助剤とともに一般的な医薬製剤の形
態に調剤され、非経口的（即ち、静脈注射、直腸投与
等）又は経口的に投与される。かかる医薬製剤としては
各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的な
ものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆
粒剤、坐剤、軟・硬カプセル剤、注射剤（液剤、懸濁剤
等）、貼付剤、吸入剤などが挙げられる。これらの製剤
は、通常、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性
剤、吸着剤、滑沢剤などの担体を用いて、慣用の製剤化
手段にて調製することができる。製剤化に際して用いら
れる担体としては、例えば、錠剤の形態に成形する場合
には、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用
でき、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ
糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶
セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロ
パノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラ
チン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メ
チルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリド
ンなどの結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウ
ム、カンテン未、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、
炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モ
ノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ス
テアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制
剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム
などの界面活性剤、グリセリン、デンプンなどの保湿
剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイ
ド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸
塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤な
どが例示できる。更に、錠剤は必要に応じて通常の剤皮
を施した錠剤、例えば、糖衣剤、ゼラチン被包錠、腸溶
被錠、フイルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠
とすることができる。

【００１６】丸剤の形態に成形するに際しては、担体と
してこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例え
ば、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物
油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、
トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラ
ミナラン、カンテンなどの崩壊剤などが例示できる。注
射剤として調製される場合には、液剤、乳剤および懸濁
剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、こ
れら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するのに際し
ては、稀釈剤としてこの分野において慣用されているも
のをすべて使用でき、例えば、水、エチルアルコール、
プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアル
コール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリ
オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げ
ることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製
するに充分な量の塩化ナトリウム、ブドウ糖あるいはグ
リセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常
の緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、溶解
補助剤、無痛化剤などを、更に必要に応じて着色剤、保
存剤などや他の医薬品を該製剤に含有せしめてもよい。
注射剤は凍結乾燥製剤であってもよい。

【００１７】本発明の医薬製剤中に含有されるべき本ペ
プチド又はその塩の量は、特に限定されず広範囲に選択
されるが、通常、全組成物中、５〜１００％、特に１０
〜７０％が適当である。本発明の医薬製剤の投与方法は
特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その
他の条件、疾患の程度などに応じた方法で投与される。
例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカ
プセル剤の場合には経口投与される。また注射剤の場合
には単独であるいはブドウ糖、アミノ酸などの通常の補
液と混合して静脈内投与され、さらには必要に応じて単
独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。本
発明の医薬製剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別そ
の他の条件、疾患の程度などにより適宜選択されるが、
有効成分として１０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重／日程度が
適当であり、該製剤は１日１回ないし数回に分けて投与
することができる。

【００１８】本発明の機能性食品は、前記の〜のペ
プチド又はその塩を含有することからなり、そのまま、
又は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せ
しめて、痴呆症などの治療・予防を目的とする機能性食
品（又は食品素材）として食される。例えば、上述した
適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に
適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、
ペースト等に成形して食用に供してもよく、また種々の
食品（例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、か
まぼこ、ちくわ等の水産加工食品、バター、粉乳等の乳
製品、パン、菓子など）に添加して使用されたり、水、
果汁、牛乳、清涼飲料等の飲物に添加して使用してもよ
い。かかる機能性食品の形態における本発明ペプチドの
摂取量は、年齢、体重、症状、疾患の程度、食品の形態
等により、適宜選択・決定され、例えば、１日当り１０
〜３００ｍｇ／ｋｇ体重程度とされる。

【００１９】本発明の動物用飼料は、前記の〜のペ
プチド又はその塩を含有することからなり、そのまま、
又は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せ
しめて、イヌ、ネコ、ウシなどの動物の痴呆症などの治
療・予防を目的とする機能性飼料として給餌される。当
該飼料は、対象とされる動物に応じて、常法に準じて調
製することができ、例えば、イヌの場合には、固形状、
半練り状、顆粒状などのペットフードやジャーキー状に
調製される。また、飲用水用添加剤の形態としてもよ
い。動物用飼料の形態における本発明ペプチドの摂取量
は、年齢、体重、症状、疾患の程度、飼料の形態等によ
り、適宜選択・決定される。なお、本発明のペプチド
は、動物用飼料として利用するほか、痴呆症などの治療
・予防を目的とする動物用薬剤として利用することもで
きる。

【００２０】

【発明の効果】本発明によれば、ＰＥＰ阻害活性を有す
るペプチドが提供され、当該阻害活性に基づき、脳機能
の研究用試薬、ＰＥＰ阻害剤、機能性食品などとして利
用することができる。また、本発明のＰＥＰ阻害剤、機
能性食品及び動物用飼料は、上記のペプチドを有効成分
とするもので、当該阻害剤、食品及び飼料によれば、Ｐ
ＥＰが関与する疾患、例えば痴呆症の治療・予防を図る
ことができる。特に、有効成分である本発明のペプチド
は、内因性ペプチドであるので安全性が高く、また低分
子物質であるので吸収性に優れるという特長を有する。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例、試験例及び調製例に
基づいて説明するが、本発明はこれらの例に限定される
ものではない。実施例１牛脳からの本発明ペプチドの分離・精製凍結状態で破砕した牛脳 400gを80℃の熱水中に投入
し、10分間加熱した後、ポリトロンを用いてホモジナイ
ズした。7,000 xgで60分間、次いで27,000 xgで30分間
の遠心分離を行い、沈澱を除去した後、分画分子量10,0
00の限外濾過膜PM-10（アミコン社）に付して、通過す
る低分子量の物質を回収した。この試料をセファデック
スLH-20カラム（ファルマシア社、26 x 900mm）に負荷
し、20％メタノールで溶出し、微生物ＰＥＰに対する阻
害活性（測定法については試験例１に記述）を有するフ
ラクション（即ち、204〜252mlのフラクション）を回収
した。次いで、このフラクションを、DEAEトヨパール65
0Mカラム（16 x 650mm、東ソ−社製）に負荷した。そし
て、蒸留水で溶出される素通り画分（113〜115mlに溶
出）と、0〜1Mのギ酸アンモニウムの直線濃度勾配によ
り溶出される画分のうちの4種にＰＥＰ阻害活性が認め
られ、計5種の活性画分を回収した。

【００２２】上記のカラムからギ酸アンモニウムの直線
濃度勾配により溶出された4種の活性画分は、それぞ
れ、μBondapak C18カラム（3.9 x 300mm、ウオーター
ズ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
で、0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセトニト
リルの直線濃度勾配溶出により分画した。この活性画分
は更にイオン交換カラムShim-Pack PA-SP（島津製作所
製）を用いたHPLCで0〜0.5Mの燐酸ナトリウム緩衝液（p
H 6.5）の直線濃度勾配溶出により分画し、更にμBonda
sphere C18カラム（3.9 x 150mm、ウオーターズ社製）
を用いたHPLC（0.1％トリフルオロ酢酸を含む0.7〜63％
のアセトニトリルにより溶出）で分画し、3種の活性画
分を得た(即ち、アセトニトリル濃度：26-34%程度で溶
出される画分Ａ、同20%程度で溶出される画分Ｂ、同17%
程度で溶出される画分Ｃ)。得られた画分は、それぞ
れ、μBondasphere C18カラムによるHPLCを2回繰り返
し、再精製した。回収できた3種のペプチドは、減圧乾
固し最終標品とした。

【００２３】これらの阻害物質の構造は、アプライドバ
イオシステムズ社製プロテインシークエンサー477Aによ
り解析した。その結果、上記の画分Ａ〜Ｃのペプチドの
構造は、それぞれ下記のとおりであった。 Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-Asp-Phe-Ser-Le
u-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn（配列番号１） Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly-Ar
g-Thr-Phe-Pro-Lys（配列番号２） Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly-Ar
g（配列番号３）

【００２４】また、前記のDEAE-トヨパール650Mカラム
から蒸留水で溶出される素通り画分について、この画分
を更に、μBondapak C18カラム（3.9 x 300mm、ウオー
ターズ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HP
LC）で、0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配溶出により分画した。この活性
画分は更にイオン交換カラムShim-Pack PA-SP（島津製
作所製）を用いたHPLCで0〜0.5Mの燐酸ナトリウム緩衝
液（pH 6.5）の直線濃度勾配溶出により分画し、更にμ
Bondasphere C18カラム（3.9 x 150mm、ウオーターズ社
製）を用いたHPLCを2回繰り返し（1回目は0.1％トリフ
ルオロ酢酸を含む0.7〜63％のアセトニトリルの濃度勾
配により溶出、2回目は0.1％トリフルオロ酢酸を含む1
7.5〜22％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出）、
精製した。回収したペプチドは減圧乾固し最終標品とし
た。本ペプチドの構造は、アプライドバイオシステムズ
社製プロテインシークエンサー477Aにより解析した。そ
の結果、下記に示すペプチドであることが明らかになっ
た。 Glu-Pro-Pro-Pro-Pro-Glu-Pro-Pro-Pro-Ile（配列番号
４）

【００２５】実施例２配列番号１（Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-As
p-Phe-Ser-Leu-Ala-Gly- Ala-Leu-Asn）で示されるペプ
チドの化学合成アプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置
（430A型）に、0.5ミリモルのBoc-Asn-O-CH₂-PAM樹脂及
び各2ミリモルのBoc-Met（1本）、Boc-Pro（4本）、Boc
-Leu（3本）、Boc-Ala（3本）、Boc-Arg(Tos)（1本）、
Boc-Val（1本）、Boc-Asp(OBzl)（1本）、Boc-Phe（1
本）、Boc-Ser(Bzl)（1本）、Boc-Gly（1本）カートリ
ッジ装填し、DCCによる無水対称法によりMet-Pro-Pro-P
ro-Leu-Pro-Ala-Arg(Tos)-Val-Asp(OBzl)-Phe-Ser(Bzl)
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn-O-CH₂-PAMを合成した。な
お、Bocはt-ブチルオキシカルボニル基、Tosはトシル
基、OBzlはベンジルオキシ基、Bzlはベンジル基を示
す。また、ここで用いるアミノ酸は全てＬ体である。次
に、ペプチド研究所製フッ化水素装置に上記合成ペプチ
ド樹脂を導入し、アニソール1.5 mlを添加後、フッ化水
素10mlを導入した。-2℃、1時間の反応後、フッ化水素
を減圧下に除去し、ペプチドを無水エーテル、クロロホ
ルムで交互に3回洗浄し、2N酢酸60mlにペプチドを溶解
させ、凍結乾燥した。この方法により、目的とする標記
ペプチドの白色粉末200mgを得た。次いで、本ペプチド
はHPLCにより精製した。HPLCよる精製条件を下記に示
す。カラム：メルク社製 LiChrospher RP-18(e) (10 x 250
mm) 溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む3.5〜67％アセト
ニトリルの直線濃度勾配流速：6ml／min なお、合成したペプチドは、6N塩酸110℃24時間の加水
分解後、日立835型アミノ酸分析装置によりアミノ酸分
析を行うことにより、更に、日本電子製HX-110型質量分
析装置によるFAB-MS法で構造を確認した。合成したペプ
チドの下記条件下でのHPLCによる保持時間は7.45分であ
り、脳から精製したペプチドのそれと一致した。 HPLCの条件カラム：μBondasphere C18（3.9 x 150mm）溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む26〜34％（30
分）アセトニトリルの直線濃度勾配流速：1ml／min

【００２６】実施例３配列番号４（Glu-Pro-Pro-Pro-Pro-Glu-Pro-Pro-Pro-Il
e）で示されるペプチドの化学合成アプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置
（430A型）に0.5ミリモルのBoc-Ile-O-CH₂-PAM樹脂及び
各2ミリモルのBoc-Glu(OBzl)（2本）、Boc-Pro（7本）
を充填し、DCCによる無水対称法によりGlu(OBzl)-Pro-P
ro-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Pro-Pro-Pro-Ile-O-CH₂-PAMを合
成した。次に、ペプチド研究所製フッ化水素装置に上記
合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール3mlを添加後、
フッ化水素30mlを導入した。-2℃、1時間の反応後、フ
ッ化水素を減圧下に除去し、ペプチドを無水エーテル、
クロロホルムで交互に3回洗浄し、2N酢酸60mlにペプチ
ドを溶解させ、凍結乾燥した。この方法により、目的と
する標記ペプチドの粉末130mgを得た。次いで、本ペプ
チドはHPLCにより精製した。HPLCよる精製条件を下記に
示す。カラム：メルク社製 LiChrospher RP-18(e) (10 x 250
mm) 溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む3.5〜67％アセト
ニトリルのグラジエント流速：6ml／min なお、合成したペプチドは、6N塩酸110℃24時間の加水
分解後、日立835型アミノ酸分析装置によりアミノ酸分
析を行うことにより、更に、日本電子製HX-110型質量分
析装置によるFAB-MS法で構造を確認した。また、合成し
たペプチドは下記に示す逆相カラムを用いたHPLCでの保
持時間が4.04分であり、牛脳から抽出したペプチドの保
持時間4.05分とほぼ同一であった。 HPLCの条件カラム：μBondasphere C18（3.9 x 150mm）溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む17.5〜22％（30
分）アセトニトリルの直線濃度勾配流速：1ml／min

【００２７】実施例４配列番号２（Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gl
y-Asp-Gly-Arg-Thr-Phe-Pro-Lys）及び配列番号３（Gly
-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly-Arg）
で示されるペプチドの化学合成実施例２と同様に、アプライド・バイオシステムズ社製
ペプチド合成装置（430A型）を使用したDCCによる無水
対称法により合成し、フッ化水素により保護基と樹脂を
切断することにより、目的とする標記ペプチドを得た。
ペプチドの精製、解析条件は前述と同一である。また、
得られたペプチドのHPLCによる保持時間は、脳から精製
したペプチドのそれらと一致した。

【００２８】試験例１ＰＥＰ阻害活性の測定実施例１におけるＰＥＰ阻害活性の測定は下記の方法
１）により行い、実施例２〜４により得たペプチドのＰ
ＥＰ阻害活性の測定は下記の方法２）により行った。１）微生物由来ＰＥＰに対する阻害活性の測定生化学工業より購入したF. meningosepticum 由来ＰＥ
ＰをpH7.0の0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、0.1unit/mlの
酵素溶液とした。また、2 mM Z-Gly-Pro-pNA（バッケム
社製、Zはベンジルオキシカルボニル基、pNAはパラニト
ロアニリドを示す）を上記リン酸緩衝液（40%ジオキサ
ンを含む）に溶解し基質溶液とした。1.5ml容量のプラ
スチックチューブに、試験ペプチドを含有する試料溶液
40μlを入れ、これにリン酸緩衝液80μl、基質溶液40μ
lを添加し、30℃で10分間保温した後、上記ＰＥＰ溶液4
0μlを加えよく混合して、30℃で10分間の反応を行っ
た。その後、1N-塩酸 200μlを添加することにより反応
を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離してく
るパラニトロアニリンをHPLCにより定量した。HPLC測定
条件は以下の通りである。

【００２９】HPLC測定条件カラム：ウオーターズ社製 μBondasphere 5μ C8-300
A (3.9 x 150mm) 溶出：0.1％トリフルオロ酢酸を含む53％アセトニト
リル検出：410nmの吸収このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出
した。式中、Ａ：阻害剤を含まない場合のパラニトロアニリン
のピーク面積Ｂ：阻害剤添加の場合のパラニトロアニリンのピーク面
積

【００３０】２）牛脳由来ＰＥＰに対する阻害活性の測
定破砕した牛脳 400gに十分冷却（4℃）した10mM EDTA 及
び10mM 2-メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCl緩
衝液（pH 7.0）200mlを加え、容器を氷冷しながらポリ
トロンを用いてホモジナイズした後、4℃、30,000 x g
で20分間の遠心分離を行い、上清を回収した。次いで、
上清を硫安分画（50〜80％）し、更にQ-Sepharoseカラ
ムクロマトグラフィー、PBE94カラムクロマトグラフィ
ー、Superdex 200カラムクロマトグラフィーを順次行
い、脳ＰＥＰを精製し、0.1unit/mlの酵素溶液とした。
また、2mM Z-Gly-Pro-pNAを上記Tris-HCl緩衝液（40%ジ
オキサンを含む）に溶解し基質溶液とした。1.5ml容量
のプラスチックチューブに、試験ペプチドを含有する試
料溶液40μlを入れ、これにリン酸緩衝液80μl、上記Ｐ
ＥＰ溶液40μlを添加し、37℃で5分間保温した後、基質
溶液40μlを加えてよく混合し、37 ℃で10分間反応させ
た。以下、微生物由来ＰＥＰに対する阻害活性の測定の
場合と同様な条件下で測定を行い、阻害率50％のときの
ペプチドの濃度（IC₅₀）と、ペプチドと酵素の複合体の
解離定数（Ki）を求めた。阻害活性の測定結果を表１に
示す。表１に示されるように、配列番号１〜４で示され
る本発明のペプチドはＰＥＰ阻害活性を有することが明
らかになった。

【００３１】

【表１】

【００３２】実施例５配列番号１のペプチドの類似ペプチドのＰＥＰ活性表１に示されるように、配列番号１のペプチドは強
いＰＥＰ阻害作用を有するが、その相同性の検索の結
果、配列番号１のペプチドはglial fibrillary acidic
protein (神経膠筋原線維酸性ペプチド、ＧＦＡＰ)の３
８番（Ｍｅｔ）〜５５番（Ａｓｎ）に相当するペプチド
残基であることが明らかになった。動物種によりＧＦＡ
Ｐの３８番〜５５番のシーケンスは多少異なるので、こ
の相違がＰＥＰ阻害活性に及ぼす影響を調べるために、
ヒトＧＦＡＰの３８番〜５５番のアミノ酸配列を有する
ペプチド（配列番号５、配列番号１の７番目のアラニン
がスレオニンに置換）及びマウスＧＦＡＰの３８番〜５
５番のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号６、配
列番号１の２番目のプロリンがスレオニンに置換）を合
成し、それらのＰＥＰ阻害活性の測定を行った。

【００３３】配列番号５(Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-T
hr-Arg-Val-Asp-Phe-Ser-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn)及
び配列番号６(Met-Thr-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-A
sp-Phe-Ser-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn)で示されるペプ
チドの化学合成並びにＰＥＰ阻害活性の測定実施例２と同様に、アプライド・バイオシステムズ社製
ペプチド合成装置（430A型）を使用したDCCによる無水
対称法により合成し、フッ化水素により保護基と樹脂を
切断することにより、目的とする標記ペプチドを得た。
ペプチドの精製、解析条件は前述と同一である。上記で
得られたペプチドについて、試験例１−２）に準じて、
牛脳由来ＰＥＰに対する阻害活性の測定を行った。その
結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】表２に示されるように、配列番号５及び６
のペプチドには、配列番号１のペプチドとほぼ同等なＰ
ＥＰ阻害活性が認められ、動物種によらずＧＦＡＰの３
８番〜５５番のアミノ酸配列を有するペプチドはＰＥＰ
阻害作用を有することが明らかになった。

【００３６】実施例６配列番号１のペプチドとＰＥＰのプレインキュベーショ
ン表１に示されるように、配列番号１のペプチドはＰＥＰ
阻害活性を有することが示されたが、このペプチドが真
の意味でＰＥＰ阻害作用を有する物質であるか、それと
も実際にはＰＥＰの基質となっており見かけ上阻害作用
を示しているだけであるかを確認するため、牛脳由来Ｐ
ＥＰと配列番号１のペプチドのプレインキュベーション
時間を６０分まで延長して、経時的にその阻害活性を試
験した。その結果を表３に示す。また、この際のペプチ
ドの分解の有無を確認するため、６０分間のプレインキ
ュベーション経過後の反応液を逆相クロマトグラフィー
に付し、各ピークを分取し、それぞれをプロテインシー
ケンサーにより構造解析を行った。

【００３７】

【表３】

【００３８】表３に示されるように、６０分間のプレイ
ンキュベーションを行っても、配列番号１のペプチドの
ＰＥＰ阻害活性には変化が認められなかった。このこと
から、配列番号１のペプチドは、ＰＥＰ阻害作用を有す
るペプチドであることが明らかとなった。一方、インキ
ュベーション後の反応液を逆相クロマトグラフィーに付
した結果、ペプチドの１０〜２０％程度が分解を受けて
おり、配列番号１のペプチドのＮ末端側の６残基からな
るペプチド（配列番号７）が生成していることが判明し
た。このことは、配列番号１のペプチドはＰＥＰの基質
であることを示している。このように、配列番号１のペ
プチドはＰＥＰの基質であり、ＰＥＰにより分解を受け
ることが明らかになったが、上記のように配列番号１の
ペプチドはＰＥＰと６０分間プレインキュベーションし
てもＰＥＰ阻害活性に変化がみられなかったことから、
本発明者らは配列番号７のペプチドにもＰＥＰ阻害作用
があるのではないかと推察した。かかる推察に基づき、
配列番号７のペプチドの合成を行い、そのＰＥＰ阻害活
性の測定を行った。なお、比較のため、配列番号１のペ
プチドのＮ末端側の７残基からなるペプチド（配列番号
８）及びＮ末端側の５残基からなるペプチド（Met-Pro-
Pro-Pro-Leu、以下、比較ペプチドという）についても
合成し、それらのＰＥＰ阻害活性の測定を行った。

【００３９】実施例７配列番号７(Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro)、配列番号８(Me
t-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala)で示されるペプチド及び比
較ペプチドの化学合成並びにＰＥＰ阻害活性の測定実施例２と同様に、アプライド・バイオシステムズ社製
ペプチド合成装置（430A型）を使用したDCCによる無水
対称法により合成し、フッ化水素により保護基と樹脂を
切断することにより、目的とする標記ペプチドを得た。
ペプチドの精製、解析条件は前述と同一である。また、
得られた配列番号７のペプチドのHPLCによる保持時間
は、脳から精製したペプチドのそれらと一致した。上記
で得られたペプチドについて、試験例１−２）に準じ
て、牛脳由来ＰＥＰに対する阻害活性の測定を行った。
その結果を表４に示す。

【００４０】

【表４】

【００４１】表４に示されるように、配列番号７のペプ
チドは配列番号１のペプチドとほぼ同等なＰＥＰ阻害活
性を示した。また、配列番号８のペプチドにも弱いＰＥ
Ｐ阻害活性が認められた。一方、配列番号７のＣ末端の
Ｐｒｏが欠失したペプチドである比較ペプチドにはＰＥ
Ｐ阻害活性が認められなかった。このことから、配列番
号７のペプチドが配列番号１のＰＥＰ阻害活性部位と考
えられた。そこで、配列番号７のペプチドとＰＥＰとの
プレインキュベーションを行い、経時的にその阻害活性
を試験した。その結果を表５に示す。また、この際のペ
プチドの分解の有無を確認するため、６０分間のプレイ
ンキュベーション経過後の反応液を逆相クロマトグラフ
ィーに付し、各ピークを分取し、それぞれをプロテイン
シーケンサーにより構造解析を行った。

【００４２】

【表５】

【００４３】表５に示されるように、配列番号７のペプ
チドはＰＥＰと６０分間プレインキュベーションしても
ＰＥＰ阻害活性の低下は認められなかった。また、イン
キュベーション後の反応液を逆相クロマトグラフィーに
付した結果、配列番号７のペプチドの分解は実質的に認
められなかった。以上のことからして、配列番号７のペ
プチドは基質でなく、真の意味でのＰＥＰ阻害作用を有
するペプチドであることが明らかになった。そして、配
列番号１のペプチドは、ＰＥＰの基質であるが、７番目
からＣ末端側に結合している残基の立体障害作用によ
り、ＰＥＰ阻害作用が発現すると共に分解を受けて生成
した配列番号７のペプチドによりＰＥＰ阻害作用が発現
していると考えられた。

【００４４】調製例１配列番号１のペプチド５ｍｇステアリン酸マグネシウム５ｍｇコーンスターチ２０ｍｇ乳糖１７４．５ｍｇ常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、打錠成型
し、錠剤を得た。

【００４５】調製例２配列番号４のペプチド５ｍｇステアリン酸マグネシウム５ｍｇコーンスターチ２０ｍｇ乳糖１７４．５ｍｇ常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、打錠成型
し、錠剤を得た。

【００４６】調製例３配列番号７のペプチド５ｍｇステアリン酸マグネシウム５ｍｇコーンスターチ２０ｍｇ乳糖１７４．５ｍｇ常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、打錠成型
し、錠剤を得た。

【００４７】調製例４ウインナソーセージ用練り肉に、配列番号１のペプチド
を当該練り肉５０ｋｇ当り１０ｇの割合で混合した後、
常法に準じてソーセージケーシングに充填し、燻煙し、
殺菌し、冷却後に包装し、ウインナソーセージを得た。

【００４８】調製例５ジャーキー・タイプのペットフード用練肉に、配列番号
１のペプチドを当該練肉５０ｋｇ当り５ｇの割合で混合
した後、常法に準じて、押出成形装置を用いて成形し、
燻煙し、加熱殺菌し、乾燥し、水分活性０．８４のペッ
トフード用ジャーキーを得た。

【００４９】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Pro Pro Pro Leu Pro Ala Arg Val Asp Phe Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Ala Leu Asn 18

【００５０】配列番号：２配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys 17

【００５１】配列番号：３配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg 1 5 10 13

【００５２】配列番号：４配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００５３】配列番号：５配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Pro Pro Pro Leu Pro Thr Arg Val Asp Phe Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Ala Leu Asn 18

【００５４】配列番号：６配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Thr Pro Pro Leu Pro Ala Arg Val Asp Phe Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Ala Leu Asn 18

【００５５】配列番号：７配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００５６】配列番号：８配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ１２Ｎ 9/99 (72)発明者田中秀興茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者大森丘茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番日本ハム株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ体のアミノ酸から構成され、下記
のアミノ酸配列で示されるペプチド及びその塩。 Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-Asp-Phe-Ser
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly
-Arg-Thr-Phe-Pro-Lys Gly-Val-Gln-Val-Glu-Thr-Ile-Ser-Pro-Gly-Asp-Gly
-Arg Glu-Pro-Pro-Pro-Pro-Glu-Pro-Pro-Pro-Ile Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Thr-Arg-Val-Asp-Phe-Ser
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn Met-Thr-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala-Arg-Val-Asp-Phe-Ser
-Leu-Ala-Gly-Ala-Leu-Asn Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro-Ala Met-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro
【請求項２】請求項１記載のペプチド又はその塩
の少なくとも１種を有効成分として含有するプロリルエ
ンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項３】請求項１記載のペプチド又はその塩
の少なくとも１種を含有する機能性食品。
【請求項４】請求項１記載のペプチド又はその塩
の少なくとも１種を含有する動物用飼料。