JPH0866189A

JPH0866189A - 新規ｄｎａ断片

Info

Publication number: JPH0866189A
Application number: JP6206883A
Authority: JP
Inventors: Mayo Kurihara; 真代栗原; Masayuki Inui; 将行乾; Koichi Uchida; 康一内田; Miki Kobayashi; 幹小林; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1994-08-31
Publication date: 1996-03-12

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由
来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片の提供。【構成】大きさが約３．３ｋｂであり、両末端にＳａｌ
Ｉ部位を有し、下記表に記載の制限酵素で切断した場
合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大きさを
示すブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来の
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ−２３３（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−１４９７）由来のホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxyl
ase ）（ＥＣ４．１．１．３１）をコードする遺伝子
（以下これを「ｐｐｃ遺伝子」と略称することがある）
を含むＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｐｐｃ遺伝子産物であるホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下これを「ＰＥＰＣ」
と略称することがある）は、解糖系の代謝中間化合物で
あるホスホエノールピルビン酸に二酸化炭素（重炭酸イ
オン）を固定してオギザロ酢酸を生成し、トリカルボン
酸（ＴＣＡ）サイクルに４炭素（Ｃ４）化合物を補充す
る生理的役割を果たすとされている。ＴＣＡサイクルは
アミノ酸等各種有用物質生合成系において重要な代謝経
路である。該遺伝子を利用することにより、ＴＣＡサイ
クルへの物質供給が強化され、アミノ酸等の有用物質生
産能の増強、菌体収率の向上等が期待される。また、二
酸化炭素を有機化合物へ固定する触媒機能を有すること
から、地球環境保全への寄与も期待できる。

【０００３】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼは大部分の細菌、原生動物、すべての植物において存
在が確認されている。該酵素をコードする遺伝子に関し
ては、高等植物に関し多数研究されているものの、細菌
に関しては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
由来の遺伝子〔ジャーナル・オブ・バイケミストリー
（J. Biochem. ）、95、909 〜916 (1984)参照〕及びコ
リネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium gl
utamicum）由来の遺伝子〔ジーン(Gene)、77、237 〜25
1(1989) 〕が単離されているのみである。エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）に関しては、該酵素の反応
機構等の基礎的研究は精力的に行われているものの、工
業的観点からの利用については殆ど検討されていない。
さらに産業上重要な細菌であるブレビバクテリウム属細
菌を含むコリネ型細菌由来のｐｐｃ遺伝子に関する基礎
的研究、工業的応用検討は未だ十分でなく、解明すべき
諸種の課題が山積している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、産業上
重要な細菌であるブレビバクテリウム属細菌が有するｐ
ｐｃ遺伝子の単離および工業的応用を目的とし、鋭意研
究を重ねた結果、ある種のブレビバクテリウム属に属す
る細菌からｐｐｃ遺伝子が単離可能であることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来の
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片が提供される。

【０００６】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）を含むＤＮＡ
断片」とは、ホスホエノールピルビン酸に二酸化炭素を
固定化しオギザロ酢酸を生成する反応を触媒する酵素を
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味するものであ
る。

【０００７】本発明のｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片
は、その塩基配列が決定された後においては合成するこ
とも可能であるが、通常はブレビバクテリウム属細菌か
らクローニングされ、その供給源となるブレビバクテリ
ウム属細菌として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３由来のものが好適である。この供給源細菌から
ｐｐｃ遺伝子を調製するための基本操作の一例を述べれ
ば次のとおりである。

【０００８】ｐｐｃ遺伝子は、上記ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在し、
この染色体の中から、以下に述べる方法で分離・取得す
ることができる。先ず、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。
この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｌＩを
用いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。

【０００９】得られるＤＮＡ断片をクローニングベクタ
ー、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）に挿入し、このベ
クターを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、形質転換体を取得する。得られる形
質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、エシェリヒア
・コリ由来のｐｐｃ遺伝子〔ジャーナル・オブ・バイケ
ミストリー（J. Biochem. ）、95、909 〜916 (1984)参
照〕及びトウモロコシ由来のｐｐｃ遺伝子〔プラント・
モレキュラー・バイオロジー (Plant Mol. Biol.) 、1
2、 579〜 589 (1989) 〕の共通領域配列をプローブと
して用いるサザンハイブリダイゼーションにより、挿入
されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由
来のｐｐｃ遺伝子を確認することができる。

【００１０】上記ｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片の一つ
としては、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで完全分解す
ることによって得られる、大きさが約３．３ｋｂのＤＮ
Ａ断片が挙げられる。この約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を
各種制限酵素で切断したときの認識部位数及び切断断片
の大きさを下記第１表に示す。

【００１１】

【表１】第１表制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（ｋｂ）ＡａｔＩＩ１１．０、２．３ＡｃｃＩ１０．５、２．８ＣｌａＩ２０．９、１．０、１．４ＮｃｏＩ２０．７、１．２、１．４

【００１２】尚、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片またはプラスミドを制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動及び４％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断
片の数から決定した値を採用した。

【００１３】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λ ｐｈ
ａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル
上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェ
リヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φＸ
１７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩ
で切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリ
アクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に
基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断
片の大きさを算出する。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決
定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１
％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用
し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについ
ては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得ら
れる結果を採用した。

【００１４】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで
切断することにより得られる大きさが約３．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ
１１８ベクター（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレ
オチド酵素法〔dideoxy chain termination 法 Sanger
F. et al. 、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・
ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA）、74、5463、(1977)〕により決定することができ
る。このようにして決定した上記約３．３ｋｂのＤＮＡ
断片中の塩基配列のオープンリーデイングフレームの存
在から決定したｐｐｃ遺伝子は、後記配列表の配列番号
１に示す配列を有するものであり、９２０個のアミノ酸
をコードする２７６０塩基対から構成される。

【００１５】上記の塩基配列を包含する本発明のｐｐｃ
遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のブレビバクテリウム
属コリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみな
らず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライ
ド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたもの
であってもよい。

【００１６】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ＰＥＰＣの機能
を実質的に損なうことがない限り塩基配列の一部の塩基
が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されてい
てもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、
さらに塩基配列の一部が転位されているものであっても
よく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のＤＮＡ断
片に包含されるものである。

【００１７】本発明のｐｐｃ遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ
断片は、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含む
プラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細
菌内でＰＥＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得る
ことができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおい
て、ｐｐｃ遺伝子を発現させるためのプロモーターはブ
レビバクテリウム属細菌が保有するプロモーターである
ことができるが、それに限られるものではなく、ｐｐｃ
遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩基配
列であればいかなるプロモーターであっても良い。

【００１８】本発明のｐｐｃ遺伝子を導入することがで
きるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での
複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれ
ば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特
開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲ
Ｙ３０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラス
ミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、
ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特
開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲ
Ｙ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報
に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報
に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号
公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１
８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣ
Ｇ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ
２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４
およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。

【００１９】それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベク
ター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリ
ネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子と
コリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子
とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｘ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。

【００２０】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Brevibacterium stationis）ＩＦＯ１２１４４（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片（複製領域）を切り出し、制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂ
のプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
片（安定化領域）を切り出す。これらの両ＤＮＡ断片を
プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−
ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位にそれぞれ組み込むこと
により、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製するこ
とができる。

【００２１】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のｐｐ
ｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片の導入は、プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０を制限酵素ＸｈｏＩで開裂させ、そこに前記ｐｐ
ｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで連結させ
ることにより行うことができる。このようにして造成さ
れるプラスミドｐＣＲＹ３０に本発明の大きさが約３．
３ｋｂのｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片が導入された組
換えプラスミドをｐＣＲＹ３０−ｐｐｃと命名した。プ
ラスミドｐＣＲＹ３０−ｐｐｃの作製方法の詳細につい
ては、後記実施例で説明する。

【００２２】本発明の組換えプラスミドで形質転換し得
る宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−
１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。

【００２３】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes
）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴ
ＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０；
ブレビバクテルウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum ）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。

【００２４】尚、宿主としてブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３株由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
〔バクテリオロジカル・レビュー（Bact. Rev.) 、36、
361 〜40（1972）参照〕。

【００２５】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように〔ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）、17
0 、2796 (1988); アグリカルチャル・バイオロジカル
・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、52、293 （19
88）参照〕、ＤＮＡ受容菌へのパルス波通電〔ジャーナ
ル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー
（J. Indust. Microbiol. ）、５、159 (1990)参照〕に
よりプラスミドを導入することが可能である。

【００２６】上記の方法で形質転換して得られるコリネ
型細菌は、ＰＥＰＣ産生能を有しており、該コリネ型細
菌を、それ自体既知の通常用いられる培地で培養するこ
とにより、ＰＥＰＣを高含有する菌体を得ることができ
る。

【００２７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施例
は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきもので
あり、本発明の範囲を限定するためのものではないこと
を理解すべきである。

【００２８】実施例１ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株由来のｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片の
クローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出半合成培地Ａ培地１ｌ〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）
₂ＳＯ₄７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０. ５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
０. ５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０. ５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵
母エキス２.５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２
００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２
０ｇ、蒸留水１ｌ〕に、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を白金耳
を用いて植菌し、対数増殖期後期まで３３℃で振盪培養
し、菌体を集めた。

【００２９】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭＮａ
Ｃｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ
（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよう
に添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．５％になるよ
うに添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶
菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、
上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０．
３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮ
Ａをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５）及び１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍ
ｌ（各成分の濃度は最終濃度である）を加え、４℃で一
晩静置し、以後の実験に用いた。

【００３０】（Ｂ）組換え体の創製上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＳａｌＩ
５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃で１時間反応さ
せ完全分解した。このＳａｌＩ分解ＤＮＡに、クローニ
ングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）を制限酵素Ｓａ
ｌＩで切断した後脱リン酸化処理したものを混合し、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオス
レイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し（各成分
の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、
結合させた。

【００３１】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（J. Molecul. Biol. ）、53、159 （1970）〕によ
りエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転
換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天
１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗抹した。

【００３２】この培地上の生育株を常法〔モレキュラー
・クローニング（Molecular cloning)、Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press （1989）〕により液体培養し、
培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミド
を、制限酵素ＳａｌＩにより切断し、０．７％アガロー
スゲルを用いて電気泳動を行った。このアガロースゲル
よりＤＮＡをナイロン膜上に移し取り、エシェリヒア・
コリ及びトウモロコシ由来ｐｐｃ遺伝子の共通領域をプ
ローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。
用いたプローブは、前記エシェリヒア・コリ及びトウモ
ロコシ由来のｐｐｃ遺伝子から推定されるアミノ酸配列
で特に相同性の高い領域に注目し、そのアミノ酸配列よ
り想定される混合オリゴヌクレオチドプローブをアプラ
イド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３
９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成し
た。

【００３３】実際に用いたプローブの塩基配列は、次の
２つのアミノ酸配列：（１）Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu 、（２）Ser
Trp Net Gly Gly Asp より想定される下記の塩基配列：（１）GTI CTI ACI GCI CAY CCI ACI GAR 、（２）TUI
TGG ATG GGI GGI GAY （配列中、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴを示し、こ
こでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔは
チミン、Ｉはデオキシイノシンを示す。）の２４mer と
１８mer （塩基対）である。なお、プローブの合成にあ
たっては、混合の度合いが著しくなりすぎぬようにデオ
キシイノシンを用いた。

【００３４】合成した上記オリゴヌクレオチドプローブ
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）を用いる
手法で、５’末端リン酸基を〔γ-32 Ｐ〕ＡＴＰでラジ
オアイソトープラベルした〔アナリティカル・バイオケ
ミストリー（Anal. Biochem.）、158 、307 〜315 (198
6)〕。サザンハイブリダイゼーションは、常法〔モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning ) 、 Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989) 〕に従って行
った。

【００３５】この結果、制限酵素ＳａｌＩ分解物の大き
さが約３．３ｋｂのＤＮＡ断片のみ上記プローブとハイ
ブリダイズすることが判明し、該ＤＮＡ断片中にｐｐｃ
遺伝子が含まれることが明らかとなった。この大きさが
約３．３ｋｂのＤＮＡ断片を保有する本プラスミドをｐ
ＵＣ１１８−ｐｐｃと命名した。得られた大きさが３．
３ｋｂのＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断した時の、
制限酵素認識部位数及び切断断片の大きさは前記表１に
示した通りであった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点
地図を図１に示す。また、上記で得たプラスミドｐＵＣ
１１８−ｐｐｃを各種制限酵素で切断して、切断断片の
大きさを測定した。その結果を下記の第２表に示す。

【００３６】

【表２】第２表制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ３０．５、１．４、４．６ＨｉｎｄＩＩＩ２１．６、４．９ＫｐｎＩ１６．５

【００３７】以上によりｐｐｃ遺伝子を含む大きさが約
３．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ断片）を得ることが
できた。

【００３８】実施例２ｐｐｃ遺伝子ＤＮＡの塩基配列
の決定実施例１の（Ｂ）項で得られたｐｐｃ遺伝子を含む大き
さが約３．３ｋｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列
をジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termi
nation法）〔Sanger、F. et al. 、プロシーデフィング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Pro
c. Nat. Acad. Sci. USA ）、74、5463（1977）〕によ
り決定した。その塩基配列中のオープンリーデイングフ
レームの存在から、ｐｐｃ遺伝子は、後記配列表の配列
番号１に示す塩基配列を有する９２０のアミノ酸をコー
ドする２７６０塩基対より構成されていることが判明し
た。

【００３９】実施例３コリネ型細菌におけるＰＰＣ遺
伝子産物の発現（Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平３−２１０１８４号公報に記載の方
法に基き次のように調製した。

【００４０】半合成培地Ａ培地に、ブレビバクテリウム
・スタチオニスＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後記まで
培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度にリゾチームを含む緩衝液〔２５ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭＥＤＴＡ、
５０ｍＭグルコース〕２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時
間反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔０．２Ｎ
ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加
し、穏やかに混和して室温にて１５分間静置した。次
に、この反応液に酢酸カリウム溶液〔５Ｍ酢酸カリウム
溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍ
ｌ〕３０ｍｌを添加し、十分混和してから氷水中に１５
分間静置した。

【００４１】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール・クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え，−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。

【００４２】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８に調整〕
２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５倍濃
度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇを溶
解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロ
マイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／ｍｌ
に合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１６，０
００×ｇの遠心分離を行った。

【００４３】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見出される。このバン
ドを注射器で遠心管の側面から抜き取ることにより、プ
ラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこの
分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理してエ
チジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝液
に対して透析を行った。このようにして得られたプラス
ミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶
液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノール
を加え、−２０℃で１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラ
スミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。

【００４４】プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）
０．５μｇに制限酵素ＳａｌＩ（５Ｕ）を３７℃１時間
反応させ、プラスミドＤＮＡを完全分解した。前記で調
製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素Ｘｈ
ｏＩ（１Ｕ）を３７℃で３０分間反応させ、プラスミド
ＤＮＡを部分分解した。両者のプラスミドＤＮＡ分解物
を混合し、制限酵素を不活化するために６５℃で１０分
間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度とし
て各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｕになるように各成分を強
化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエ
シェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造
製）を形質転換した。

【００４５】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４ークロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリ
プトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、
及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７．２）で３７℃にて２４時間培
養し、生育株として得られた。これらの生育株のうち、
白いコロニーで生育してきたものを選択し、各々プラス
ミドをアルカリ−ＳＤＳ法〔T. Maniatis 、E. F. Frit
sch 、J. Sambrook 、モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning ）、90〜91、(1982)参照〕により抽出
した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
切断断片の大きさを測定した。

【００４６】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４ｋｂの
ＤＮＡ断片（複製領域）が挿入されたプラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８−ｏｒｉが得られた。次に同様の方法を用い、
前記プラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ
およびＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂの
ＤＮＡ断片（安定化領域）を上記プラスミドｐＨＳＧ２
９８−ｏｒｉのＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニ
ングし、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。

【００４７】（Ｂ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｐｐｃの
作製及びコリネ型細菌への導入実施例１の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＵＣ１１８
−ｐｐｃ５μｇを制限酵素ＳａｌＩ５Ｕを用い、３７
℃で１時間反応させ分解したものと、上記（Ａ）項で得
られたプラスミドｐＣＲＹ３０１μｇを制限酵素Ｘｈ
ｏＩ１Ｕを用い、３７℃で１時間反応させ分解したも
のを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を
添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃で１
５時間反応させ結合させた。このプラスミドを用いて、
前記方法に従い前記エシェリヒア・コリＪＭ１０９株を
形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗抹した。

【００４８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８．７ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ３．３ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。上記の如く調製されたプラ
スミドＤＮＡを、コリネ型細菌へ形質転換した。形質転
換は、電気パルス法を用いて次の通り行った。

【００４９】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１Ｕ／ｍｌになるように添加し
て、更に２時間振とう培養し、遠心分離により菌体を集
め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭショ
糖、７ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭＭｇＣｌ₂；ｐＨ
７．４）にて洗浄した。更に菌体を遠心分離して集め、
５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞
と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌとを
混合し、水中にて２０分間静置した。全量を３ｍｌの前
記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン
１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ培地に植菌し
３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐
性株を得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチー
ムを含む緩衝液〔２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコー
ス〕２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反
応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔０．２ＮＮａＯＨ、１％
（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、穏やかに混和し
て室温にて１５分間静置した。次に、この反応液に酢酸
カリウム溶液〔５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１
１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌ〕３０ｍｌを添加し、
十分混和してから氷水中に１５分間静置した。

【００５０】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール・クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え，−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
し，プラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の第３表に示す。

【００５１】

【表３】第３表制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ３０．４、３．２、８．４ＫｐｎＩ１１２．０ＢａｍＨＩ３０．２、１．２、１０．６上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ｐｐｃと命名した。このプラスミドｐＣＲＹ３
０−ｐｐｃの制限酵素切断点地図を図２に示す。

【００５２】（Ｃ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｐｐｃで
形質転換されたコリネ型細菌によるｐｐｃ遺伝子産物
（ＰＥＰＣ）の発現上記（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０−ｐｐ
ｃで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株を前記Ａ培地１００ｍｌにて３０℃で２４時
間振とう培養し、該形質転換株の菌体を得た。培養後の
菌体は遠心分離（５，０００×ｇ）により回収し、トリ
ス緩衝液（トリス−ＨＣｌ１００ｍＭ、ＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ１０ｍＭ、ジチオスレイトール１ｍＭ、ｐ
Ｈ８．５）で洗浄後、超音波破砕器により菌体を破砕し
た。該菌体破砕液は１５，０００×ｇで１５分間遠心分
離し、得られた上清を更に１００，０００×ｇで１時間
遠心分離し、粗酵素液とした。

【００５３】得られた粗酵素液につきＰＥＰＣ活性を測
定した。活性測定はリンゴ酸脱水素酵素を共存させ、Ｎ
ＡＤＨの減少速度を分光光学的に測定する方法によった
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Bioche
m. ）、68、747 〜750 (1970）〕。尚、対照として
は、宿主であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３野生株を用い、同様に粗酵素液を調製した。測定結
果は、対照菌（野生株）の活性を１とした相対値とし、
下記の第４表に示した。

【００５４】

【表４】第４表菌株ＰＥＰＣ活性形質転換株６野生株１以上より、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｐｐｃで形質転換
された菌株において、ＰＥＰＣが著量生成されているこ
とが確認された。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２７６０配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体ＤＮＡ起源生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum ）株名：ＭＪ−２３３配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１−２７６０特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG TTC CTC GGT CGA ATC CTC 48 Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Arg Ile Leu 1 5 10 15 GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG GAG GTT TAT GAA CTG GTC 96 Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val 20 25 30 GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC GCC AAG GGC AAC GCC GAA 144 Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu 35 40 45 ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC ATT ACT CCA GCC AAG GCA 192 Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala 50 55 60 ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC GCT CTG CTG GCT AAC CTG 240 Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu 65 70 75 80 GCG GAA GAC CTC CAC GAT GAA GAG CTT CGT GAA CAG GCT CTC GAT GCA 288 Ala Glu Asp Leu His Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala 85 90 95 GGC GAC ACC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT GCC ACC TGG CTG AAA CTC 336 Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu 100 105 110 AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG GCG GAT GTG TTG CGT AAT 384 Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn 115 120 125 GCT GAG GTG GCG CCA GTT CTG ACT GCG CAC CCA ACT GAG ACT CGC CGC 432 Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg 130 135 140 CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC ACC ACC CAC ATG CGT GAA 480 Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu 145 150 155 160 CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCA ACC GCT CGT ACG CAA AGC AAG 528 Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys 165 170 175 TTG GAT GAG ATC GAA AAG AAC ATC CGC CGT CGC ATC ACC ATT TTG TGG 576 Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp 180 185 190 CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA CGT ATC GAG GAC GAG ATC 624 Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile 195 200 205 GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC CTT TTG GAA GAG ATT CCA 672 Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro 210 215 220 CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT CGT GAG CGT TTC GGC GAG 720 Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu 225 230 235 240 GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA GGT TCC TGG ATT GGT GGA 768 Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly 245 250 255 GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG GAA ACA GTT GAG TAT TCC 816 Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser 260 265 270 ACT CCA CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG TAC TAT GCA CGC CAG CTG 864 Thr Pro Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu 275 280 285 CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG GAC CGC ATG AAT AAG GTC 912 His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val 290 295 300 ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC GGG CAC AAC GAC GTG CCA 960 Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro 305 310 315 320 AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC GTC CAT GGC GTT CGC GGA 1008 Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly 325 330 335 CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCT GAG CTG ATC GGC GAG GAC GCC GTT GAG 1056 Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu 340 345 350 GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC GCA TCC CCG GAA GAA TTC 1104 Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe 355 360 365 TTA AAC GAT GCG TTA ACC ATC GAT CAT TCT CTG CGT GAA TCC AAT GAC 1152 Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp 370 375 380 ACT CTC ATC GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG CTG ATT TCT GCC ATC GAG 1200 Thr Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu 385 390 395 400 AGC TTC GGA TTC AAC CTC TAC TCA CTG GAT CTG CGC CAG AAC TCT GAG 1248 Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu 405 410 415 AGC TAC GAA GAC GTA CTC ACA GAG CTT TTC GAG CGT GCC CAA GTC ACC 1296 Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr 420 425 430 GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GAG GAG AAG CTT GAG GTG CTG CTG 1344 Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Glu Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu 435 440 445 AAG GAA CTG CGC AGC CCT CGT CCG TTG ATC CCG CAC GGT TCA GAT GAA 1392 Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu 450 455 460 TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGT ATC TTC CGC ACC GCG TCG 1440 Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser 465 470 475 480 GAA GCT GTC AAG AAA TTC GGC CCA CGC ATG GTG CCT CAC TGC ATC ATT 1488 Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile 485 490 495 TCC ATG ACA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC GAG CCG ATG GTG TTG CTC 1536 Ser Met Thr Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu 500 505 510 AAA GAA TTC GGC CTC ATC GCG GCC AAC GGC GAC AAT CCA CGC GGC ACC 1584 Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr 515 520 525 GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC GAA GAC CTT CGA GCC GGC 1632 Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gly 530 535 540 GCC GGA ATC CTC GGC GAA CTG TGG AAA ATT GAT CTC TAC CGC AAC TAC 1680 Ala Gly Ile Leu Gly Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr 545 550 555 560 CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC ATG CTC GGC TAC TCC GAT 1728 Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp 565 570 575 TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA AAC TGG GCG CTT TAC GAC 1776 Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp 580 585 590 GCG GAA CTG CAG CTT GTC GAA CTA TGC CGA TCA GCC GGG GTC AAC GTT 1824 Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Asn Val 595 600 605 CGC CTG TTC CAC GGC CGC GGT GGC ACC GTT GGA CGT GGT GGC GGA CCT 1872 Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro 610 615 620 TCC TAC GAT GCG ATT CTT GCC CAG CCC AAG GGG GCT GTC CAA GGT TCC 1920 Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Lys Gly Ala Val Gln Gly Ser 625 630 635 640 GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAA ATC ATC TCA GCT AAG TAC GGC AAC 1968 Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn 645 650 655 CCT GAA ACT GCG CGC CGA AAC CTC GAG GCA CTG GTC TCA GCC ACG CTT 2016 Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu 660 665 670 GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCT GAA CTC ACC GAT CAC CAA CGC GCG 2064 Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala 675 680 685 TAT GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC AGC CTG AAG AAG TAC ACC 2112 Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Thr 690 695 700 TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC GAT TAC TTC ACC CAA TCC 2160 Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser 705 710 715 720 ACA ACA CTG CAG GAG ATC GGA TCC CTC AAC ATC GGA TCC AGG CCT TCC 2208 Thr Thr Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser 725 730 735 TCA CGC AAG CAA ACT TCC TCT GTG GAA GAT TTG CGA GCC ATC CCA TGG 2256 Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp 740 745 750 GTT CTT AGC TGG TCA CAG TCT CGT GTG ATG CTG CCA GGA TGG TTT GGT 2304 Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly 755 760 765 GTC GGA ACG GCA CTT GAA CAG TGG ATT GGA GAA GGG GAG CAA GCT ACC 2352 Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr 770 775 780 CAG CGC ATC GCC GAG CTG CAA ACA CTC AAC GAG TCC TGG CCA TTT TTC 2400 Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe 785 790 795 800 ACC TCA GTG TTG GAC AAC ATG GCT CAG GTG ATG TCC AAG GCA GAG CTG 2448 Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu 805 810 815 CGT TTG GCA AAG CTC TAT GCA GAC CTC ATC CCA GAT AGG GAA GTC GCC 2496 Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala 820 825 830 GAG CGC GTC TAT TCC GTC ATC CAC GAG GAA TAT TTC CTG ACT AAA AAG 2544 Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile His Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys 835 840 845 ATG TTC TGC GTG ATC ACC GGC TCC GAT GAT CTC CTT GAT GAC AAC CCA 2592 Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro 850 855 860 CTT CTG GCA CGC TCT GTC CAG CGT CGT TAC CCC TAC CTG CTT CCA CTC 2640 Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu 865 870 875 880 AAT GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC TAC CGA AAA GGC GAC CAA 2688 Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln 885 890 895 AGC GAG CAA GTG TCC CGC AAT ATT CAG CTG ACA ATG AAC GGT CTT TCC 2736 Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser 900 905 910 ACT GCA CTG CGC AAC TCC GGC TAG 2760 Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly *** 915 920

【００５６】

【発明の効果】本発明により、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ−２３３由来の
有用物質生産及び二酸化炭素固定に関与するホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子
（ｐｐｃ遺伝子）を含むＤＮＡ断片が提供される。

【００５７】本発明のＤＮＡ断片を組み込んだ形質転換
株は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐ
ＥＰＣ）活性が向上しており、本菌体あるいは本菌から
調製したＰＥＰＣを利用することにより、アミノ酸等の
有用物質生産効率が向上することが期待される。

【００５８】

【図面の簡単な説明】

【００５９】

【図１】本発明の大きさが約３．３ｋｂのｐｐｃ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図。

【００６０】

【図２】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｐｐｃの制
限酵素切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者小林幹茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
acterium flavum ）ＭＪ−２３３由来のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片。
【請求項２】大きさが約３．３ｋｂであり，両末端に
ＳａｌＩ部位を有し、下記表に記載の制限酵素で切断し
た場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大き
さを示す請求項１に記載のＤＮＡ断片。制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（ｋｂ）ＡａｔＩＩ１１．０、２．３ＡｃｃＩ１０．５、２．８ＣｌａＩ２０．９、１．０、１．４ＮｃｏＩ２０．７、１．２、１．４
【請求項３】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列で示されるホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【請求項４】配列表の配列番号１に記載の塩基配列で
示されるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。