JPH0866198A - 肺炎球菌の表面タンパクａのエピトープ領域 - Google Patents
肺炎球菌の表面タンパクａのエピトープ領域Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は防御作用を誘導するエピトープを含
み、交差反応性を有し、肺炎球菌の感染によって起こる
疾患に対するワクチンに組み込むことのできるＰｓｐＡ
タンパクフラグメントを提供するものである。 【構成】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ Ｒｘ１株の肺炎球菌表面タンパクＡ（Ｐｓｐ
Ａ）は、防御作用誘発エピトープを含んでいる。タンパ
クの一方の領域は６８アミノ酸配列からなり、Ｒｘ１
ＰｓｐＡ株のアミノ酸残基１９２から２６０まで延び、
他端はＣ−末端アミノ酸配列からなり、アミノ酸残基１
９２から５８８まで延び、第３の領域はＲｘ１ Ｐｓｐ
Ａ株のアミノ酸残基２９３から５８８まで延びている。
記載したオリゴニュクレオチドプライマーおよびプロー
ブは特異的な対として、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多
くの株からの肺炎球菌ＤＮＡの検出または増幅のための
肺炎球菌ＤＮＡの増幅に使用することができる。また、
完全長ＰｓｐＡも各種肺炎球菌株に対する干渉効果を提
供することができる。
み、交差反応性を有し、肺炎球菌の感染によって起こる
疾患に対するワクチンに組み込むことのできるＰｓｐＡ
タンパクフラグメントを提供するものである。 【構成】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ Ｒｘ１株の肺炎球菌表面タンパクＡ（Ｐｓｐ
Ａ）は、防御作用誘発エピトープを含んでいる。タンパ
クの一方の領域は６８アミノ酸配列からなり、Ｒｘ１
ＰｓｐＡ株のアミノ酸残基１９２から２６０まで延び、
他端はＣ−末端アミノ酸配列からなり、アミノ酸残基１
９２から５８８まで延び、第３の領域はＲｘ１ Ｐｓｐ
Ａ株のアミノ酸残基２９３から５８８まで延びている。
記載したオリゴニュクレオチドプライマーおよびプロー
ブは特異的な対として、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多
くの株からの肺炎球菌ＤＮＡの検出または増幅のための
肺炎球菌ＤＮＡの増幅に使用することができる。また、
完全長ＰｓｐＡも各種肺炎球菌株に対する干渉効果を提
供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の主たる病
原性因子である肺炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）の
エピトープ領域の識別に関する。
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の主たる病
原性因子である肺炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）の
エピトープ領域の識別に関する。
【０００２】
【発明の背景】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅは、中耳炎、髄膜炎、菌血症および肺炎の
重要な病原菌である。抗生物質やワクチンの使用にもか
かわらず、肺炎球菌感染の流行は過去２５年間ほとんど
減少していない。
ｍｏｎｉａｅは、中耳炎、髄膜炎、菌血症および肺炎の
重要な病原菌である。抗生物質やワクチンの使用にもか
かわらず、肺炎球菌感染の流行は過去２５年間ほとんど
減少していない。
【０００３】一般に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫の獲得は肺炎球菌の多
糖類性莢膜に対して特異的な抗体によって起こると考え
られている。しかし、新生児や幼児は多糖類抗原に対す
る免疫反応を起こすことができず、同じ莢膜の抗原型が
関与する感染を繰り返す。
ｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫の獲得は肺炎球菌の多
糖類性莢膜に対して特異的な抗体によって起こると考え
られている。しかし、新生児や幼児は多糖類抗原に対す
る免疫反応を起こすことができず、同じ莢膜の抗原型が
関与する感染を繰り返す。
【０００４】多くの莢膜性細菌に対する乳幼児の免疫化
の方法として、タンパクに莢膜多糖類を共役させること
によって多糖類抗原に免疫を付与することができる。こ
の方法は、例えばインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂで成功している（Go
rdon、米国特許第4,496,538およびAnderson、米国特許
第4,673,574参照）。しかし、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅの莢膜抗原型には８０種以上が知られており、そのう
ち２３種類が疾患のほとんどを占めている。肺炎球菌多
糖類−タンパクの共役に成功するためには、ほとんどの
肺炎球菌の感染に関与する莢膜型に十分な免疫性を与え
る必要がある。現在のワクチンに含まれる２３種類の多
糖類は十分に免疫化されていないので、成人においても
この方法は困難である。さらに、このようなワクチン
は、一般的に使用されているいずれの幼児用ワクチンと
比較しても製造コストが高くつく。
の方法として、タンパクに莢膜多糖類を共役させること
によって多糖類抗原に免疫を付与することができる。こ
の方法は、例えばインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂで成功している（Go
rdon、米国特許第4,496,538およびAnderson、米国特許
第4,673,574参照）。しかし、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅの莢膜抗原型には８０種以上が知られており、そのう
ち２３種類が疾患のほとんどを占めている。肺炎球菌多
糖類−タンパクの共役に成功するためには、ほとんどの
肺炎球菌の感染に関与する莢膜型に十分な免疫性を与え
る必要がある。現在のワクチンに含まれる２３種類の多
糖類は十分に免疫化されていないので、成人においても
この方法は困難である。さらに、このようなワクチン
は、一般的に使用されているいずれの幼児用ワクチンと
比較しても製造コストが高くつく。
【０００５】子供、さらには大人を含めて、肺炎球菌の
感染を防ぐ第二の方法は、防御免疫反応を誘発すること
のできるタンパク抗原を同定することである。このよう
なタンパクはそれ自体ワクチンとして利用することもで
き、多糖類−タンパク共役体として、または多糖類の担
体として使用することができる。
感染を防ぐ第二の方法は、防御免疫反応を誘発すること
のできるタンパク抗原を同定することである。このよう
なタンパクはそれ自体ワクチンとして利用することもで
き、多糖類−タンパク共役体として、または多糖類の担
体として使用することができる。
【０００６】McDanielら(1)、J. Exp. Med.160: 386-39
7, 1984、はＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞表面タン
パクを識別する雑種細胞抗体の製造および当該抗体を用
いた莢膜肺炎球菌のいくつかの株によるマウスの感染防
御を記載している。この表面タンパク抗原は「肺炎球菌
表面タンパクＡ」と呼ばれているので、ここでは当該抗
原をＰｓｐＡと略記する。
7, 1984、はＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞表面タン
パクを識別する雑種細胞抗体の製造および当該抗体を用
いた莢膜肺炎球菌のいくつかの株によるマウスの感染防
御を記載している。この表面タンパク抗原は「肺炎球菌
表面タンパクＡ」と呼ばれているので、ここでは当該抗
原をＰｓｐＡと略記する。
【０００７】McDanielら(II)、Microbial Pathogenesis
1: 519-531, 1986、はＰｓｐＡの特性について行った
試験を報告している。McDaniel(II)、McDasniel (II
I)、J.Exp. Med. 165: 381-394, 1987、Waltmanら、Mic
rob. Pathog. 8: 61-69, 1990、およびCrainら、Infec
t. Immu. 58: 3293-3299, 1990の結果から、株が異なれ
ばＰｓｐＡもそのエピトープおよび見かけ分子量も著し
く異なることが知られている。
1: 519-531, 1986、はＰｓｐＡの特性について行った
試験を報告している。McDaniel(II)、McDasniel (II
I)、J.Exp. Med. 165: 381-394, 1987、Waltmanら、Mic
rob. Pathog. 8: 61-69, 1990、およびCrainら、Infec
t. Immu. 58: 3293-3299, 1990の結果から、株が異なれ
ばＰｓｐＡもそのエピトープおよび見かけ分子量も著し
く異なることが知られている。
【０００８】McDanielら(III)は、ＰｓｐＡ表現非莢膜
肺炎球菌（ただし、ＰｓｐＡを欠く同一遺伝子肺炎球菌
ではない）をＸ−リンク免疫欠失（ＸＩＤ）系マウスに
免疫投与するとその後の肺炎球菌による致命的な感染か
らマウスを防御できることを開示している。
肺炎球菌（ただし、ＰｓｐＡを欠く同一遺伝子肺炎球菌
ではない）をＸ−リンク免疫欠失（ＸＩＤ）系マウスに
免疫投与するとその後の肺炎球菌による致命的な感染か
らマウスを防御できることを開示している。
【０００９】McDanielら(IV), Infect. Immun., 59: 22
2-228, 1991は、肺炎球菌の莢膜型６Ａおよび３に対す
る防御を誘導することのできる遺伝子組換えＰｓｐＡの
完全長フラグメントをマウスに免疫投与することを記載
している。
2-228, 1991は、肺炎球菌の莢膜型６Ａおよび３に対す
る防御を誘導することのできる遺伝子組換えＰｓｐＡの
完全長フラグメントをマウスに免疫投与することを記載
している。
【００１０】Crainら（上記）は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅの臨床的および実験的分離株のＰｓｐＡを１００
％（ｎ＝９５）検出するウサギの抗血清を記載してい
る。７種類のモノクロナール抗体をＰｓｐＡと反応させ
ると、５７種類のＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ分離株が
３１種類の反応パターンを示した。したがって、多くの
血清学的に異なったＰｓｐＡが存在するにもかかわら
ず、ＰｓｐＡ間に広範な交差反応が認められている。
ｉａｅの臨床的および実験的分離株のＰｓｐＡを１００
％（ｎ＝９５）検出するウサギの抗血清を記載してい
る。７種類のモノクロナール抗体をＰｓｐＡと反応させ
ると、５７種類のＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ分離株が
３１種類の反応パターンを示した。したがって、多くの
血清学的に異なったＰｓｐＡが存在するにもかかわら
ず、ＰｓｐＡ間に広範な交差反応が認められている。
【００１１】ＰｓｐＡのタンパク型は、莢膜型に依存し
ている。環境中での遺伝子の突然変異または交換によっ
て、莢膜、ＰｓｐＡおよび多分その他の各種分子構造の
大きく異なる株の大きなプールが発現するものと考えら
れる。株が異なればＰｓｐＡの分子量も６７から９９ｋ
Ｄの範囲で異なることが知られている。これらの差は遺
伝的に安定であり、タンパクの分解によるものではな
い。
ている。環境中での遺伝子の突然変異または交換によっ
て、莢膜、ＰｓｐＡおよび多分その他の各種分子構造の
大きく異なる株の大きなプールが発現するものと考えら
れる。株が異なればＰｓｐＡの分子量も６７から９９ｋ
Ｄの範囲で異なることが知られている。これらの差は遺
伝的に安定であり、タンパクの分解によるものではな
い。
【００１２】McDanielら(IV), Infect. Immun. 59: 222
-228, 1991が記載しているように、遺伝子組換えλ ｇ
ｔ１１クローンから部分的に精製したＰｓｐＡを免疫投
与すると、莢膜およびＰｓｐＡ型が異なる数種のＳ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の攻撃誘発に対して防御作用が
認められる。ＰｓｐＡ表現クローンは彼らの報告にした
がって構築することができるが、得られた製品は不安定
で、溶融後の細胞フラグメントからの分離が困難であっ
た。
-228, 1991が記載しているように、遺伝子組換えλ ｇ
ｔ１１クローンから部分的に精製したＰｓｐＡを免疫投
与すると、莢膜およびＰｓｐＡ型が異なる数種のＳ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の攻撃誘発に対して防御作用が
認められる。ＰｓｐＡ表現クローンは彼らの報告にした
がって構築することができるが、得られた製品は不安定
で、溶融後の細胞フラグメントからの分離が困難であっ
た。
【００１３】タンパクの構造は肺炎球菌の種類によって
異なるが、全てのＰｓｐＡの間に多様な交差反応がみら
れるので、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株に対
して単一または少なくとも少数のＰｓｐＡが防御作用を
発揮できるような共通のエピトープが存在しているもの
と考えられる。
異なるが、全てのＰｓｐＡの間に多様な交差反応がみら
れるので、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株に対
して単一または少なくとも少数のＰｓｐＡが防御作用を
発揮できるような共通のエピトープが存在しているもの
と考えられる。
【００１４】上記の参照文献の他に、本発明者らは共同
研究者らとともに、ＰｓｐＡに関しさらに詳細を以下の
ように報告している。 １． American Society for Microbiology第89回年次
大会、125頁D-257項、1989年5月 ２． American Society for Microbiology第90回年次
大会要旨、98頁D-106項、1990年5月 ３． 第3回国際ASM肺炎球菌遺伝学会要旨、11頁12項、
1990年6月 ４． Talkingtonら、Infect. Immun. 59:1285-1289, 1
991 ５． Yotherら(I)、J. Bacteriol. 174:601-609, 1992 ６． Yotherら(II)、J. Bacteriol. 174:610-618, 199
2 ７． McDanielら(V)、Microbiol. Pathogenesis, 13:
261-268, 1992 すでに出願した米国特許出願シリーズ番号07/656,773お
よび07/835,698（国際特許公開公報WO 92/1448に対応）
ならびにYotherら(I)および(II)は、ＰｓｐＡタンパク
の免疫性トランケート型を分泌するＳ． ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ変異株の調製および分泌されたタンパクの単
離、精製を記載している。ＰｓｐＡのトランケート型
は、免疫防御作用を有し、ＰｓｐＡの防御性エピトープ
を有していることが明らかとなった。ここに記載されて
いるＰｓｐＡタンパクは生理食塩水に可溶性であり、少
なくとも機能性細胞膜アンカー領域を欠いている。
研究者らとともに、ＰｓｐＡに関しさらに詳細を以下の
ように報告している。 １． American Society for Microbiology第89回年次
大会、125頁D-257項、1989年5月 ２． American Society for Microbiology第90回年次
大会要旨、98頁D-106項、1990年5月 ３． 第3回国際ASM肺炎球菌遺伝学会要旨、11頁12項、
1990年6月 ４． Talkingtonら、Infect. Immun. 59:1285-1289, 1
991 ５． Yotherら(I)、J. Bacteriol. 174:601-609, 1992 ６． Yotherら(II)、J. Bacteriol. 174:610-618, 199
2 ７． McDanielら(V)、Microbiol. Pathogenesis, 13:
261-268, 1992 すでに出願した米国特許出願シリーズ番号07/656,773お
よび07/835,698（国際特許公開公報WO 92/1448に対応）
ならびにYotherら(I)および(II)は、ＰｓｐＡタンパク
の免疫性トランケート型を分泌するＳ． ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ変異株の調製および分泌されたタンパクの単
離、精製を記載している。ＰｓｐＡのトランケート型
は、免疫防御作用を有し、ＰｓｐＡの防御性エピトープ
を有していることが明らかとなった。ここに記載されて
いるＰｓｐＡタンパクは生理食塩水に可溶性であり、少
なくとも機能性細胞膜アンカー領域を欠いている。
【００１５】上記の米国特許出願シリーズ番号07/656,7
73および07/835,698には、成熟Ｒｘ１ＰｓｐＡタンパク
の特徴も記載されている。この成熟タンパクは５８８個
のアミノ酸からなり、６５ｋＤの分子量を持っている。
Ｎ−末端の２８８個のアミノ酸は高度に荷電し、α−螺
旋状のコイルタンパク構造が予想される。Ｃ−末端の２
１７個のアミノ酸はＰｓｐＡの表面アンカーを含み、α
−螺旋構造を有するとは考えられない。分子の中央に
は、細胞膜を横切っていると考えられるプロリンリッチ
の領域が存在する。これらの米国特許出願には、ニュク
レオチド配列解析によってＬＳＭ１およびＬＳＭ２と同
定されたある種のニュクレオチドプラーマーとプローブ
が記載されている。
73および07/835,698には、成熟Ｒｘ１ＰｓｐＡタンパク
の特徴も記載されている。この成熟タンパクは５８８個
のアミノ酸からなり、６５ｋＤの分子量を持っている。
Ｎ−末端の２８８個のアミノ酸は高度に荷電し、α−螺
旋状のコイルタンパク構造が予想される。Ｃ−末端の２
１７個のアミノ酸はＰｓｐＡの表面アンカーを含み、α
−螺旋構造を有するとは考えられない。分子の中央に
は、細胞膜を横切っていると考えられるプロリンリッチ
の領域が存在する。これらの米国特許出願には、ニュク
レオチド配列解析によってＬＳＭ１およびＬＳＭ２と同
定されたある種のニュクレオチドプラーマーとプローブ
が記載されている。
【００１６】すでに出願した米国特許出願シリーズ番号
08/048,896（1993年4月20日出願）およびその公開公報E
P 622 081には、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
株のＰｓｐＡタンパクのアミノ酸残基１９２〜２６０の
全てまたはその一部に相当するＰｓｐＡフラグメントの
同定が記載されている。この特異的フラグメントは、モ
ノクロナール抗体を用いたマッピングによって同定され
た。このフラグメントは防御作用誘導エピトープを含
み、別のＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株のＰｓｐＡと交
差反応性を有することが認められている。
08/048,896（1993年4月20日出願）およびその公開公報E
P 622 081には、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
株のＰｓｐＡタンパクのアミノ酸残基１９２〜２６０の
全てまたはその一部に相当するＰｓｐＡフラグメントの
同定が記載されている。この特異的フラグメントは、モ
ノクロナール抗体を用いたマッピングによって同定され
た。このフラグメントは防御作用誘導エピトープを含
み、別のＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株のＰｓｐＡと交
差反応性を有することが認められている。
【００１７】さらに、米国特許出願シリーズ番号08/04
8,896には、ニュクレオチド配列解析によってＬＳＭ３
およびＬＳＭ４と同定されたある種のニュクレオチドプ
ラーマーとプローブが記載されている。
8,896には、ニュクレオチド配列解析によってＬＳＭ３
およびＬＳＭ４と同定されたある種のニュクレオチドプ
ラーマーとプローブが記載されている。
【００１８】以下の規格およびそれに添付した図面に
は、アミノ酸を一般的に使用されている略号で表示す
る。表Iにこれらの略号を示す。
は、アミノ酸を一般的に使用されている略号で表示す
る。表Iにこれらの略号を示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【発明の要約】上記のように、従来の発明者らはある種
のオリゴニュクレオチドプライマーまたはプローブおよ
び肺炎球菌ＤＮＡを製造または試料中の肺炎球菌ＤＮＡ
を検出するために肺炎球菌ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）増幅へのそれらの利用について開示してい
る。これらの開示には、ＬＳＭ１、ＬＳＭ３およびＬＳ
Ｍ４として同定されたＮ−末端プライマーまたはプロー
ブおよびＣ−末端プライマーＬＳＭ２が含まれる。
のオリゴニュクレオチドプライマーまたはプローブおよ
び肺炎球菌ＤＮＡを製造または試料中の肺炎球菌ＤＮＡ
を検出するために肺炎球菌ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）増幅へのそれらの利用について開示してい
る。これらの開示には、ＬＳＭ１、ＬＳＭ３およびＬＳ
Ｍ４として同定されたＮ−末端プライマーまたはプロー
ブおよびＣ−末端プライマーＬＳＭ２が含まれる。
【００２１】本発明は、その１側面において、ＰＣＲ反
応に利用できるある種の別のオリゴニュクレオチドプラ
イマーまたはプローブを提供するものである。したがっ
て、本発明は、その第１の側面において、肺炎球菌ＤＮ
Ａの製造または試料中の肺炎球菌ＤＮＡの検出において
肺炎球菌ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
に利用できる一対のオリゴニュクレオチドプライマーま
たはプローブを提供するものである。一対のプライマー
またはプローブは、（ａ）ＬＳＭ１、ＬＳＭ３、ＬＳＭ
４、ＬＳＭ７、ＬＳＭ８、ＬＳＭ１０、ＬＳＭ１２およ
びＬＳＭ１３から選んだＮ−末端プライマーまたはプロ
ーブと、（ｂ）ＬＳＭ２、ＬＳＭ６、ＬＳＭ９、ＬＳＭ
１１およびＬＳＭ１４から選んだＣ−末端プライマーま
たはプローブとからなるが、ＬＳＭ１とＬＳＭ２、ＬＳ
Ｍ３とＬＳＭ２、およびＬＳＭ４とＬＳＭ２の組み合わ
せは除く。各種プライマーまたはプローブのニュクレオ
チド配列は、表IIIに示す。ＰｓｐＡ分子に対するプロ
ーブの位置は、図５に示す。通常使用されるプライマー
の特定の対は、 （ａ）ＬＳＭ９とＬＳＭ２ （ｂ）ＬＳＭ４とＬＳＭ６ （ｃ）ＬＳＭ３とＬＳＭ１４ （ｄ）ＬＳＭ８とＬＳＭ２ これらの対によって増幅されるＤＮＡをコード化したＰ
ｓｐＡタンパクの一部ならびにＰｓｐＡフラグメントの
大きさ、ならびに各対によって増幅される核酸を含むプ
ラスミッドの同定を図５に示す。さらに、本発明は、こ
こに示した一対のプライマーによって増幅される肺炎球
菌のＤＮＡならびに当該増幅肺炎球菌ＤＮＡによってコ
ード化されたＰｓｐＡフラグメントを含む。
応に利用できるある種の別のオリゴニュクレオチドプラ
イマーまたはプローブを提供するものである。したがっ
て、本発明は、その第１の側面において、肺炎球菌ＤＮ
Ａの製造または試料中の肺炎球菌ＤＮＡの検出において
肺炎球菌ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
に利用できる一対のオリゴニュクレオチドプライマーま
たはプローブを提供するものである。一対のプライマー
またはプローブは、（ａ）ＬＳＭ１、ＬＳＭ３、ＬＳＭ
４、ＬＳＭ７、ＬＳＭ８、ＬＳＭ１０、ＬＳＭ１２およ
びＬＳＭ１３から選んだＮ−末端プライマーまたはプロ
ーブと、（ｂ）ＬＳＭ２、ＬＳＭ６、ＬＳＭ９、ＬＳＭ
１１およびＬＳＭ１４から選んだＣ−末端プライマーま
たはプローブとからなるが、ＬＳＭ１とＬＳＭ２、ＬＳ
Ｍ３とＬＳＭ２、およびＬＳＭ４とＬＳＭ２の組み合わ
せは除く。各種プライマーまたはプローブのニュクレオ
チド配列は、表IIIに示す。ＰｓｐＡ分子に対するプロ
ーブの位置は、図５に示す。通常使用されるプライマー
の特定の対は、 （ａ）ＬＳＭ９とＬＳＭ２ （ｂ）ＬＳＭ４とＬＳＭ６ （ｃ）ＬＳＭ３とＬＳＭ１４ （ｄ）ＬＳＭ８とＬＳＭ２ これらの対によって増幅されるＤＮＡをコード化したＰ
ｓｐＡタンパクの一部ならびにＰｓｐＡフラグメントの
大きさ、ならびに各対によって増幅される核酸を含むプ
ラスミッドの同定を図５に示す。さらに、本発明は、こ
こに示した一対のプライマーによって増幅される肺炎球
菌のＤＮＡならびに当該増幅肺炎球菌ＤＮＡによってコ
ード化されたＰｓｐＡフラグメントを含む。
【００２２】特に、一対のオリゴニュクレオチドプライ
マーまたはプローブ、すなわちＬＳＭ４とＬＳＭ６を用
いて、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐ
Ａ遺伝子から増幅肺炎球菌ＤＮＡを調製し、さらにそれ
をプラスミッド（ｐＢＡＲ４１６）に組み込み、Ｒｘ１
ＰｓｐＡのアミノ酸１９２〜２９９、すなわち上記の
米国特許出願シリーズ番号08/048,896で同定された領域
を包含する領域に相当するＰｓｐＡフラグメントを表現
させる。Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多くの株（試験
した１６株全て）から調製した肺炎球菌ＤＮＡがこの特
定のプライマー対で増幅されることが明らかとなった。
したがって、プライマー対ＬＳＭ７とＬＳＭ２はプラス
ミッドｐＢＡＲ ５０１の調製に用いることができる。
マーまたはプローブ、すなわちＬＳＭ４とＬＳＭ６を用
いて、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐ
Ａ遺伝子から増幅肺炎球菌ＤＮＡを調製し、さらにそれ
をプラスミッド（ｐＢＡＲ４１６）に組み込み、Ｒｘ１
ＰｓｐＡのアミノ酸１９２〜２９９、すなわち上記の
米国特許出願シリーズ番号08/048,896で同定された領域
を包含する領域に相当するＰｓｐＡフラグメントを表現
させる。Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多くの株（試験
した１６株全て）から調製した肺炎球菌ＤＮＡがこの特
定のプライマー対で増幅されることが明らかとなった。
したがって、プライマー対ＬＳＭ７とＬＳＭ２はプラス
ミッドｐＢＡＲ ５０１の調製に用いることができる。
【００２３】したがって、本発明は、別の側面で、表II
Iに示す各ニュクレオチド配列を有するオリゴニュクレ
オチドプライマーＬＳＭ４およびＬＳＭ６によるポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅される肺炎球菌ＤＮＡでコ
ード化されたアミノ酸配列を有する単離された肺炎球菌
表面タンパクＡフラグメントを提供するものである。新
しいプラスミッドを調製し、それを用いて遺伝子組換え
ＰｓｐＡフラグメントを調製することができる。特に、
本発明は別の側面によればプラスミッドｐＢＡＲ４１６
およびｐＢＡＲ５０１を提供する。プラスミッドｐＢＡ
Ｒ４１６は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のＰ
ｓｐＡのアミノ酸１９２〜２９９を包含するＰｓｐＡフ
ラグメントをコード化した核酸フラグメントを含む。プ
ラスミッドｐＢＡＲ５０１は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ Ｒｘ１株のＰｓｐＡのアミノ酸２９３〜５８８を包
含するＰｓｐＡフラグメントをコード化した核酸フラグ
メントを含む。
Iに示す各ニュクレオチド配列を有するオリゴニュクレ
オチドプライマーＬＳＭ４およびＬＳＭ６によるポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅される肺炎球菌ＤＮＡでコ
ード化されたアミノ酸配列を有する単離された肺炎球菌
表面タンパクＡフラグメントを提供するものである。新
しいプラスミッドを調製し、それを用いて遺伝子組換え
ＰｓｐＡフラグメントを調製することができる。特に、
本発明は別の側面によればプラスミッドｐＢＡＲ４１６
およびｐＢＡＲ５０１を提供する。プラスミッドｐＢＡ
Ｒ４１６は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のＰ
ｓｐＡのアミノ酸１９２〜２９９を包含するＰｓｐＡフ
ラグメントをコード化した核酸フラグメントを含む。プ
ラスミッドｐＢＡＲ５０１は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ Ｒｘ１株のＰｓｐＡのアミノ酸２９３〜５８８を包
含するＰｓｐＡフラグメントをコード化した核酸フラグ
メントを含む。
【００２４】さらに、本発明は表IIIに示す各オリゴニ
ュクレオチドプライマーまたはプローブを含む。したが
って、本発明は、別の側面において、ＬＳＭ５、ＬＳＭ
６、ＬＳＭ７、ＬＳＭ８、ＬＳＭ９、ＬＳＭ１０、ＬＳ
Ｍ１１、ＬＳＭ１２、ＬＳＭ１３、ＬＳＭ１４、ＬＳＭ
１５（Ｓ）、ＬＳＭ１６（Ｓ）、ＬＳＭ１７およびＬＳ
Ｍ１８から選んだオリゴニュクレオチドプライマーまた
はプローブを提供する。選んだオリゴニュクレオチドプ
ライマーまたはプローブは、それぞれ表IIIに示すニュ
クレオチド配列を有する。
ュクレオチドプライマーまたはプローブを含む。したが
って、本発明は、別の側面において、ＬＳＭ５、ＬＳＭ
６、ＬＳＭ７、ＬＳＭ８、ＬＳＭ９、ＬＳＭ１０、ＬＳ
Ｍ１１、ＬＳＭ１２、ＬＳＭ１３、ＬＳＭ１４、ＬＳＭ
１５（Ｓ）、ＬＳＭ１６（Ｓ）、ＬＳＭ１７およびＬＳ
Ｍ１８から選んだオリゴニュクレオチドプライマーまた
はプローブを提供する。選んだオリゴニュクレオチドプ
ライマーまたはプローブは、それぞれ表IIIに示すニュ
クレオチド配列を有する。
【００２５】さらに、Ｒｘ１株からのある種のＰｓｐＡ
フラグメントは肺炎球菌の各種株による攻撃誘発に対し
て干渉効果を有することが明らかとなった。これらのフ
ラグメントは、アミノ酸１９２〜５８８、２９３〜８８
８および１９２〜２９９を含む。したがって、本発明
は、別の側面において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅの多くの株に対して干渉効果を有す
る免疫原性組成物を提供し、その組成物は （Ｉ）（ａ）Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株の
アミノ酸残基１９２〜５８８、また必要ならばさらにＮ
Ｈ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基のＰ
ｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなるフラグメント、
または当該タンパクフラグメントと効果的に相同なフラ
グメント、（ｂ）Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
株のアミノ酸残基２９３〜５８８、また必要ならばさら
にＮＨ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基
のＰｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなるフラグメン
ト、または当該タンパクフラグメントと効果的に相同な
フラグメント、または（ｃ）遺伝子組換えで製造され、
Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のＰｓｐＡタン
パクのアミノ酸残基１９２〜２９９、また必要ならばさ
らにＮＨ2−および／またはＣＯＯＨ−末端方向に向か
ってさらに４０アミノ酸残基からなるフラグメント、ま
たは当該タンパクフラグメントと効果的に相同なフラグ
メントから選ばれた単離タンパクフラグメントと、 （ＩＩ）生理学的に許容される担体とからなる。
フラグメントは肺炎球菌の各種株による攻撃誘発に対し
て干渉効果を有することが明らかとなった。これらのフ
ラグメントは、アミノ酸１９２〜５８８、２９３〜８８
８および１９２〜２９９を含む。したがって、本発明
は、別の側面において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅの多くの株に対して干渉効果を有す
る免疫原性組成物を提供し、その組成物は （Ｉ）（ａ）Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株の
アミノ酸残基１９２〜５８８、また必要ならばさらにＮ
Ｈ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基のＰ
ｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなるフラグメント、
または当該タンパクフラグメントと効果的に相同なフラ
グメント、（ｂ）Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
株のアミノ酸残基２９３〜５８８、また必要ならばさら
にＮＨ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基
のＰｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなるフラグメン
ト、または当該タンパクフラグメントと効果的に相同な
フラグメント、または（ｃ）遺伝子組換えで製造され、
Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のＰｓｐＡタン
パクのアミノ酸残基１９２〜２９９、また必要ならばさ
らにＮＨ2−および／またはＣＯＯＨ−末端方向に向か
ってさらに４０アミノ酸残基からなるフラグメント、ま
たは当該タンパクフラグメントと効果的に相同なフラグ
メントから選ばれた単離タンパクフラグメントと、 （ＩＩ）生理学的に許容される担体とからなる。
【００２６】さらに、単離、精製した完全長ＰｓｐＡ
は、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株に対して干渉
効果を誘発することが明らかとなった。したがって、本
発明は別の側面において、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ株に対して干渉効果を有する免疫原性組成物を提
供するものであり、その組成物は単離、精製された完全
長ＰｓｐＡと生理学的に許容される担体とからなる。当
該単離、精製された完全長ＰｓｐＡは、天然物から単離
してもよいし、遺伝子組換えにより製造してもよい。
は、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株に対して干渉
効果を誘発することが明らかとなった。したがって、本
発明は別の側面において、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ株に対して干渉効果を有する免疫原性組成物を提
供するものであり、その組成物は単離、精製された完全
長ＰｓｐＡと生理学的に許容される担体とからなる。当
該単離、精製された完全長ＰｓｐＡは、天然物から単離
してもよいし、遺伝子組換えにより製造してもよい。
【００２７】前記のように、米国特許出願シリーズ番号
08/048,896では、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
株からの１９２〜２６０の６８アミノ酸領域を有し、防
御作用誘導エピトープを含み、その他のＳ． ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ株からの別のＰｓｐＡと十分な交差反応を
示すため、遺伝子組換えＰｓｐＡワクチンに組み込むの
に好適なＰｓｐＡ領域であるＰｓｐＡの同定が開示され
ている。
08/048,896では、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
株からの１９２〜２６０の６８アミノ酸領域を有し、防
御作用誘導エピトープを含み、その他のＳ． ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ株からの別のＰｓｐＡと十分な交差反応を
示すため、遺伝子組換えＰｓｐＡワクチンに組み込むの
に好適なＰｓｐＡ領域であるＰｓｐＡの同定が開示され
ている。
【００２８】さらに、我々はＰｓｐＡのＣ−末端領域を
含むＰｓｐＡフラグメントが防御作用誘導エピトープも
含んでいることを発見した。したがって、本発明は別の
側面において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のアミノ酸残基２９３〜５８８
のＰｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなり、少なくと
も１個の防御作用誘導エピトープを含み、必要に応じて
ＮＨ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基を
有する単離された肺炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）
フラグメント、または当該タンパクフラグメントと効果
的に相同なフラグメントを提供する。
含むＰｓｐＡフラグメントが防御作用誘導エピトープも
含んでいることを発見した。したがって、本発明は別の
側面において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のアミノ酸残基２９３〜５８８
のＰｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなり、少なくと
も１個の防御作用誘導エピトープを含み、必要に応じて
ＮＨ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基を
有する単離された肺炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）
フラグメント、または当該タンパクフラグメントと効果
的に相同なフラグメントを提供する。
【００２９】さらに、本発明は別の側面において、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ
１株のアミノ酸残基２９３〜５８８の肺炎球菌表面タン
パク（ＰｓｐＡ）のＣ−末端部分に含まれるエピトープ
に相当する少なくとも１個の防御作用誘導エピトープの
アミノ酸配列またはそれと効果的に相同なアミノ酸配列
からなり、必要に応じてＮＨ2−末端方向に向かってさ
らに２５アミノ酸残基を有する単離された肺炎球菌表面
タンパクＡ（ＰｓｐＡ）フラグメントを提供する。ここ
で使用する「効果的に相同」という言葉は、規定した配
列と効果的に相同なアミノ酸配列に関して、前記のアミ
ノ酸配列は前記の規定した配列とは同一ではなく、前記
のアミノ酸配列における抗原性エピトープが前記の規定
した配列の相当するエピトープと限りなく同じである場
合、少なくとも約７０％、望ましくは約８０％、さらに
望ましくは約９０％が同一であることを意味する。
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ
１株のアミノ酸残基２９３〜５８８の肺炎球菌表面タン
パク（ＰｓｐＡ）のＣ−末端部分に含まれるエピトープ
に相当する少なくとも１個の防御作用誘導エピトープの
アミノ酸配列またはそれと効果的に相同なアミノ酸配列
からなり、必要に応じてＮＨ2−末端方向に向かってさ
らに２５アミノ酸残基を有する単離された肺炎球菌表面
タンパクＡ（ＰｓｐＡ）フラグメントを提供する。ここ
で使用する「効果的に相同」という言葉は、規定した配
列と効果的に相同なアミノ酸配列に関して、前記のアミ
ノ酸配列は前記の規定した配列とは同一ではなく、前記
のアミノ酸配列における抗原性エピトープが前記の規定
した配列の相当するエピトープと限りなく同じである場
合、少なくとも約７０％、望ましくは約８０％、さらに
望ましくは約９０％が同一であることを意味する。
【００３０】
【発明の一般的説明】上記引用の米国特許出願（および
対応するWO 92/1448）およびYotherら(I)および(II)に
記載されているように、６５ｋＤａ分子をコード化した
Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子は５８８アミノ酸からなって
いる。ｐｓｐＡ遺伝子のニュクレオチド配列（配列番号
１）および得られたアミノ酸配列（配列番号２）は、図
１〜３に示す。ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、長さが
２０８６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメン
トに含まれている。ｐｓｐＡ遺伝子自体は１９８５塩基
対のフラグメントであり、翻訳がＡＴＧ／ｍｅｔ（ニュ
クレオチド位置１２７）で始まる転写および翻訳シグナ
ルを含む領域から始まり、ＡＴＧ／ｍｅｔからＧＣＡ／
ａｌａ（ニュクレオチド位置２１７）にまで延びるリー
ダー配列に続いている。成熟ＰｓｐＡはニュクレオチド
位置２２０のｇｌｕアミノ酸から始まり、ニュクレオチ
ド位置１９５４の翻訳ストップＴＡＡ／ＯＣＨで終わ
る。この翻訳ストップコドンの後に転写終了シグナルが
続いている。
対応するWO 92/1448）およびYotherら(I)および(II)に
記載されているように、６５ｋＤａ分子をコード化した
Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子は５８８アミノ酸からなって
いる。ｐｓｐＡ遺伝子のニュクレオチド配列（配列番号
１）および得られたアミノ酸配列（配列番号２）は、図
１〜３に示す。ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、長さが
２０８６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメン
トに含まれている。ｐｓｐＡ遺伝子自体は１９８５塩基
対のフラグメントであり、翻訳がＡＴＧ／ｍｅｔ（ニュ
クレオチド位置１２７）で始まる転写および翻訳シグナ
ルを含む領域から始まり、ＡＴＧ／ｍｅｔからＧＣＡ／
ａｌａ（ニュクレオチド位置２１７）にまで延びるリー
ダー配列に続いている。成熟ＰｓｐＡはニュクレオチド
位置２２０のｇｌｕアミノ酸から始まり、ニュクレオチ
ド位置１９５４の翻訳ストップＴＡＡ／ＯＣＨで終わ
る。この翻訳ストップコドンの後に転写終了シグナルが
続いている。
【００３１】分子のＮ−末端半分は高度に荷電し、図４
に示すようにこの領域（２８８アミノ酸）はα−螺旋状
のコイル状タンパク構造を有していると予想される。Ｐ
ｓｐＡのＣ−末端半分は、α−螺旋構造ではなく、プロ
リンリッチの領域（８３アミノ酸）と高度に保護された
２０アミノ酸反復を含む反復領域、ならびにＣ−末端に
おける１７アミノ酸のやや疎水性の配列を含んでいる。
ＰｓｐＡはそのＣ−末端半分によってＳ． ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅに係留されていることが知られ、プロリンリ
ッチ領域は細胞膜に分子を絡ませていると思われる。さ
らに、高度に荷電したα−螺旋状領域は細胞膜から始ま
り、莢膜中または莢膜を通して延びていると予想され
る。このようなモデルは、α−螺旋ドメインが肺炎球菌
表面上のＰｓｐＡと反応するモノクロナール抗体（MAb
s）によって識別される表面露出エピトープの全てを含
んでいるこという知見によって裏づけられる。
に示すようにこの領域（２８８アミノ酸）はα−螺旋状
のコイル状タンパク構造を有していると予想される。Ｐ
ｓｐＡのＣ−末端半分は、α−螺旋構造ではなく、プロ
リンリッチの領域（８３アミノ酸）と高度に保護された
２０アミノ酸反復を含む反復領域、ならびにＣ−末端に
おける１７アミノ酸のやや疎水性の配列を含んでいる。
ＰｓｐＡはそのＣ−末端半分によってＳ． ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅに係留されていることが知られ、プロリンリ
ッチ領域は細胞膜に分子を絡ませていると思われる。さ
らに、高度に荷電したα−螺旋状領域は細胞膜から始ま
り、莢膜中または莢膜を通して延びていると予想され
る。このようなモデルは、α−螺旋ドメインが肺炎球菌
表面上のＰｓｐＡと反応するモノクロナール抗体（MAb
s）によって識別される表面露出エピトープの全てを含
んでいるこという知見によって裏づけられる。
【００３２】防御作用誘導エピトープの位置を知るた
め、上記の米国特許出願シリーズ番号08/048,896の記載
にしたがってＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株の
ＰｓｐＡタンパクのマッピングを行った。このマッピン
グはＰｓｐＡタンパクおよびＰｓｐＡの遺伝子組換えフ
ラグメントに対する抗体を用いて行った。このマッピン
グ法によって、含まれている防御作用誘導エピトープと
してＰｓｐＡのα−螺旋状領域の１／３Ｃ−末端に相当
するアミノ酸配列、特にＲｘ１ ＰｓｐＡタンパクのア
ミノ酸残基１９２〜２６０を同定した。残基１９２〜２
６０のアミノ酸配列は、α−螺旋状配列の１／３Ｃ−末
端であり、細胞膜表面の近くにあると期待される。
め、上記の米国特許出願シリーズ番号08/048,896の記載
にしたがってＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株の
ＰｓｐＡタンパクのマッピングを行った。このマッピン
グはＰｓｐＡタンパクおよびＰｓｐＡの遺伝子組換えフ
ラグメントに対する抗体を用いて行った。このマッピン
グ法によって、含まれている防御作用誘導エピトープと
してＰｓｐＡのα−螺旋状領域の１／３Ｃ−末端に相当
するアミノ酸配列、特にＲｘ１ ＰｓｐＡタンパクのア
ミノ酸残基１９２〜２６０を同定した。残基１９２〜２
６０のアミノ酸配列は、α−螺旋状配列の１／３Ｃ−末
端であり、細胞膜表面の近くにあると期待される。
【００３３】今回、我々はアミノ酸１９２〜２９９から
なるＲｘ１からの遺伝子組換えＰｓｐＡフラグメント
（ｐＢＡＲ４１６から製造）が多くのＳ． ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ野生型株による攻撃誘発に対して干渉効果を
誘導することを明らかにした。また、我々はオリゴニュ
クレオチドプライマー対ＬＳＭ４およびＬＳＭ６を用い
て１６種類の肺炎球菌株の全てからＤＮＡを増幅させ、
これら多くの増幅ＤＮＡをクローン化した。
なるＲｘ１からの遺伝子組換えＰｓｐＡフラグメント
（ｐＢＡＲ４１６から製造）が多くのＳ． ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ野生型株による攻撃誘発に対して干渉効果を
誘導することを明らかにした。また、我々はオリゴニュ
クレオチドプライマー対ＬＳＭ４およびＬＳＭ６を用い
て１６種類の肺炎球菌株の全てからＤＮＡを増幅させ、
これら多くの増幅ＤＮＡをクローン化した。
【００３４】さらに、ｐＢＣ１００によってＥ．ｃｏｌ
ｉから表現させ、アミノ酸１９２〜５８８からなる、す
なわちＣ−末端アンカー領域を含むＲｘ１の遺伝子組換
えＰｓｐＡフラグメントも、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ野生型株による攻撃誘発に対して干渉効果を誘
導したことから、防御作用誘導エピトープを有している
と考えられる。さらに、ｐＢＡＲ５０１によってＥ．ｃ
ｏｌｉから表現させ、アミノ酸２９３〜５８８からな
る、すなわちＰｓｐＡのプロリン部分および反復領域の
みからなるＲｘ１の遺伝子組換えＰｓｐＡフラグメント
も、多くのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ野生型株による攻
撃誘発に対して干渉効果を誘導したので、このフラグメ
ントに防御作用誘導エピトープが存在していると考えら
れる。
ｉから表現させ、アミノ酸１９２〜５８８からなる、す
なわちＣ−末端アンカー領域を含むＲｘ１の遺伝子組換
えＰｓｐＡフラグメントも、多くのＳ． ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ野生型株による攻撃誘発に対して干渉効果を誘
導したことから、防御作用誘導エピトープを有している
と考えられる。さらに、ｐＢＡＲ５０１によってＥ．ｃ
ｏｌｉから表現させ、アミノ酸２９３〜５８８からな
る、すなわちＰｓｐＡのプロリン部分および反復領域の
みからなるＲｘ１の遺伝子組換えＰｓｐＡフラグメント
も、多くのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ野生型株による攻
撃誘発に対して干渉効果を誘導したので、このフラグメ
ントに防御作用誘導エピトープが存在していると考えら
れる。
【００３５】アミノ酸残基１９２〜２６０の配列部分は
６８アミノ酸を含んでいるに過ぎないので、この大きさ
の各ＰｓｐＡタンパクフラグメントは高い抗原性を有さ
ないと考えられる。この問題は、米国特許出願シリーズ
番号08/048,896に記載されているように、いくつかのｐ
ｓｐＡ遺伝子の適当な部分の遺伝子融合によって表現さ
せた各種ＰｓｐＡのタンデムフラグメントを含む遺伝子
組換えタンパクを製造することによって克服することが
できる。
６８アミノ酸を含んでいるに過ぎないので、この大きさ
の各ＰｓｐＡタンパクフラグメントは高い抗原性を有さ
ないと考えられる。この問題は、米国特許出願シリーズ
番号08/048,896に記載されているように、いくつかのｐ
ｓｐＡ遺伝子の適当な部分の遺伝子融合によって表現さ
せた各種ＰｓｐＡのタンデムフラグメントを含む遺伝子
組換えタンパクを製造することによって克服することが
できる。
【００３６】当該タンデム分子は接合部位に適切なコイ
ル状構造を保持し、免疫原性を有するほどの大きさをも
ち、広スペクトルのＰｓｐＡと交差反応を有する防御作
用誘導エピトープのアレーを表現させるように遺伝子工
学的に合成することができる。さもなくば、遺伝子工学
的に合成した各ペプチドを化学的手段により結合させ、
分子複合体を形成させてもよい。
ル状構造を保持し、免疫原性を有するほどの大きさをも
ち、広スペクトルのＰｓｐＡと交差反応を有する防御作
用誘導エピトープのアレーを表現させるように遺伝子工
学的に合成することができる。さもなくば、遺伝子工学
的に合成した各ペプチドを化学的手段により結合させ、
分子複合体を形成させてもよい。
【００３７】さらに、別の方法として、遺伝子組換え融
合物または共有結合またはイオン結合等の化学的結合に
よって、ＰｓｐＡフラグメントを大きな担体タンパクま
たは細菌の細胞に結合させてもよい。
合物または共有結合またはイオン結合等の化学的結合に
よって、ＰｓｐＡフラグメントを大きな担体タンパクま
たは細菌の細胞に結合させてもよい。
【００３８】ここに提供するタンパクフラグメントなら
びにそのペプチド類縁体は、肺炎球菌によって引き起こ
させる疾患に対するワクチンの成分として有用である。
したがって、本発明は別の側面において、ここで規定し
たようにその免疫学的に活性な成分として少なくとも１
種類のＰｓｐＡタンパクフラグメントからなる免疫原性
組成物を提供するものである。
びにそのペプチド類縁体は、肺炎球菌によって引き起こ
させる疾患に対するワクチンの成分として有用である。
したがって、本発明は別の側面において、ここで規定し
たようにその免疫学的に活性な成分として少なくとも１
種類のＰｓｐＡタンパクフラグメントからなる免疫原性
組成物を提供するものである。
【００３９】我々は、ＰｓｐＡには血清学的に変動があ
るが、各ＰｓｐＡに由来する抗血清は十分な交差反応性
を有し、血清学的に識別できるＰｓｐＡを表現するＳ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対してしばしば防御作用を示
すことをすでに明らかにしている。今回、我々は自然界
または遺伝子工学的に得た各種肺炎球菌の完全長Ｐｓｐ
Ａが、肺炎球菌の各種単離株による攻撃誘発から動物モ
デルを防御することを見いだした。これらの結果は、血
清学的ＰｓｐＡ型のうち限られたものが広スペクトルの
肺炎球菌に対して防御作用を誘導することを示してい
る。
るが、各ＰｓｐＡに由来する抗血清は十分な交差反応性
を有し、血清学的に識別できるＰｓｐＡを表現するＳ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対してしばしば防御作用を示
すことをすでに明らかにしている。今回、我々は自然界
または遺伝子工学的に得た各種肺炎球菌の完全長Ｐｓｐ
Ａが、肺炎球菌の各種単離株による攻撃誘発から動物モ
デルを防御することを見いだした。これらの結果は、血
清学的ＰｓｐＡ型のうち限られたものが広スペクトルの
肺炎球菌に対して防御作用を誘導することを示してい
る。
【００４０】ここに提供するワクチンを含む免疫原性組
成物は、完全長ＰｓｐＡまたはここに記載した各種Ｐｓ
ｐＡフラグメントからなり、それを投与したホストによ
る抗体の生産を含む免疫反応を誘導する。
成物は、完全長ＰｓｐＡまたはここに記載した各種Ｐｓ
ｐＡフラグメントからなり、それを投与したホストによ
る抗体の生産を含む免疫反応を誘導する。
【００４１】当該免疫原性組成物は、注射剤として、溶
液または乳液として調製することができる。完全長Ｐｓ
ｐＡまたはその免疫原性フラグメントは、ＰｓｐＡと相
容性のある生理学的に許容される担体と混合してもよ
い。これらの担体には、水、生理食塩水、デキストロー
ス、グリセロール、メタノールおよびこれらの混合物が
含まれる。さらに、ワクチンは、ワクチンの効果をさら
に増強するための、湿展剤または乳化剤、pH緩衝剤、ま
たはアジュバント等の補助剤を含んでもよい。ワクチン
は、皮下注射または筋肉内注射によって、投与すること
ができる。
液または乳液として調製することができる。完全長Ｐｓ
ｐＡまたはその免疫原性フラグメントは、ＰｓｐＡと相
容性のある生理学的に許容される担体と混合してもよ
い。これらの担体には、水、生理食塩水、デキストロー
ス、グリセロール、メタノールおよびこれらの混合物が
含まれる。さらに、ワクチンは、ワクチンの効果をさら
に増強するための、湿展剤または乳化剤、pH緩衝剤、ま
たはアジュバント等の補助剤を含んでもよい。ワクチン
は、皮下注射または筋肉内注射によって、投与すること
ができる。
【００４２】別の方法として、本発明にしたがって調製
した完全長ＰｓｐＡまたはその免疫原性フラグメントを
含む免疫原性組成物は、粘膜表面に免疫反応を起こさせ
るような方法で投与してもよい。したがって、免疫原性
組成物は、例えば吸入または経口（胃内）によって粘膜
表面に投与してもよい。別の方法として、坐薬等の投与
方法も望ましい。坐薬としては、バインダーおよび担
体、例えばポリアルキレングリコールおよびトリグリセ
リドを含んでいてもよい。経口製剤は、通常医薬品級の
サッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウム等の甘
味料を含んでいてもよい。
した完全長ＰｓｐＡまたはその免疫原性フラグメントを
含む免疫原性組成物は、粘膜表面に免疫反応を起こさせ
るような方法で投与してもよい。したがって、免疫原性
組成物は、例えば吸入または経口（胃内）によって粘膜
表面に投与してもよい。別の方法として、坐薬等の投与
方法も望ましい。坐薬としては、バインダーおよび担
体、例えばポリアルキレングリコールおよびトリグリセ
リドを含んでいてもよい。経口製剤は、通常医薬品級の
サッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウム等の甘
味料を含んでいてもよい。
【００４３】これらの免疫原性組成物は、本発明の微粒
子を１〜９５％含む溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセ
ル、徐放性製剤または粉末の形態としてもよい。
子を１〜９５％含む溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセ
ル、徐放性製剤または粉末の形態としてもよい。
【００４４】免疫原性組成物は、投与製剤に矛盾しない
方法で、かつ治療効果、予防効果または免疫原性のある
用量で投与する。投与量は、例えば合成抗体に対する被
処置者の免疫系の適応性等被処置者によって異なり、必
要であれば、細胞において免疫反応を起こさせる量とす
る。完全長ＰｓｐＡおよび／またはそのフラグメントの
正確な投与量は、医師の判断による。しかし、適当な用
量範囲は当該分野の専門家であれば容易に決定すること
ができ、μｇ〜ｍｇの範囲にある。適当な初回投与量お
よび追加免疫投与量にも幅があるが、初回投与後に追加
投与を行ってもよい。ワクチンの投与量も投与経路によ
って異なり、ホストの体重によっても異なる。
方法で、かつ治療効果、予防効果または免疫原性のある
用量で投与する。投与量は、例えば合成抗体に対する被
処置者の免疫系の適応性等被処置者によって異なり、必
要であれば、細胞において免疫反応を起こさせる量とす
る。完全長ＰｓｐＡおよび／またはそのフラグメントの
正確な投与量は、医師の判断による。しかし、適当な用
量範囲は当該分野の専門家であれば容易に決定すること
ができ、μｇ〜ｍｇの範囲にある。適当な初回投与量お
よび追加免疫投与量にも幅があるが、初回投与後に追加
投与を行ってもよい。ワクチンの投与量も投与経路によ
って異なり、ホストの体重によっても異なる。
【００４５】本発明によるタンパクフラグメントは、あ
らゆる望ましい方法で調製することができる。特に、望
ましいフラグメントをコード化したゲノムＤＮＡを増幅
させるためのＰＣＲ反応に使用するため、独特なＤＮＡ
プローブを公知の方法で仕立て、増幅ＤＮＡを適当なプ
ラスミッドベクターに挿入し、ベクターを用い、以下の
実施例２および３の方法に準じた公知の方法でＥ． ｃ
ｏｌｉ等の適当なホストにタンパクを表現させる。
らゆる望ましい方法で調製することができる。特に、望
ましいフラグメントをコード化したゲノムＤＮＡを増幅
させるためのＰＣＲ反応に使用するため、独特なＤＮＡ
プローブを公知の方法で仕立て、増幅ＤＮＡを適当なプ
ラスミッドベクターに挿入し、ベクターを用い、以下の
実施例２および３の方法に準じた公知の方法でＥ． ｃ
ｏｌｉ等の適当なホストにタンパクを表現させる。
【００４６】適当なＰｓｐＡフラグメントをクローン化
し、表現させて、適当なプロモータ、例えばＥ．ｃｏｌ
ｉ ｏｍｐＡを表現するＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモー
タおよびリーダー配列を含むベクターのコントロール下
でそれらのトランケート産物を表現させて、ｏｍｐ
ａ：：ｐｓｐＡ融合プラスミッドを作る。必要であれ
ば、ＰｓｐＡフラグメントをコード化した配列と人間に
注射するために適当な別のタンパクをコード化した配列
を結合させてもよい。このようなタンパクはワクチンと
してすでに使用されているタンパクである。これらのタ
ンパクは、防御免疫反応を誘導するか、または強い免疫
性担体として機能することが知られている。これらのタ
ンパクは、破傷風毒素等の毒素、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）２型Ｂの外膜タンパ
ク等の外膜タンパクの部分的または完全なアミノ酸配列
を含む。
し、表現させて、適当なプロモータ、例えばＥ．ｃｏｌ
ｉ ｏｍｐＡを表現するＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモー
タおよびリーダー配列を含むベクターのコントロール下
でそれらのトランケート産物を表現させて、ｏｍｐ
ａ：：ｐｓｐＡ融合プラスミッドを作る。必要であれ
ば、ＰｓｐＡフラグメントをコード化した配列と人間に
注射するために適当な別のタンパクをコード化した配列
を結合させてもよい。このようなタンパクはワクチンと
してすでに使用されているタンパクである。これらのタ
ンパクは、防御免疫反応を誘導するか、または強い免疫
性担体として機能することが知られている。これらのタ
ンパクは、破傷風毒素等の毒素、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）２型Ｂの外膜タンパ
ク等の外膜タンパクの部分的または完全なアミノ酸配列
を含む。
【００４７】また、前記のように、各種のＰｓｐＡ分子
の交差反応性防御誘導領域を有する癒合タンパクを製造
することもできる。当該融合タンパクは、高い免疫原性
を有するようにできるだけ大きく（分子量４０，０００
以上）、かつ単一タンパクでできるだけ多くの肺炎球菌
に干渉効果を有するようにすることもできる。高度の免
疫原性を付与するためには、５〜６ＰｓｐＡの干渉効果
性アミノ酸領域７０を組み合わせると十分である。肺炎
球菌のＰｓｐＡは血清学的に異なることが知られている
ので、１種類以上のＰｓｐＡからのエピトープ表現構築
物が特に好ましい。現在までの知見から、広い防御作用
を有するワクチンは、1種類以上の肺炎球菌からの交差
反応性防御誘導エピトープを含む必要がある。
の交差反応性防御誘導領域を有する癒合タンパクを製造
することもできる。当該融合タンパクは、高い免疫原性
を有するようにできるだけ大きく（分子量４０，０００
以上）、かつ単一タンパクでできるだけ多くの肺炎球菌
に干渉効果を有するようにすることもできる。高度の免
疫原性を付与するためには、５〜６ＰｓｐＡの干渉効果
性アミノ酸領域７０を組み合わせると十分である。肺炎
球菌のＰｓｐＡは血清学的に異なることが知られている
ので、１種類以上のＰｓｐＡからのエピトープ表現構築
物が特に好ましい。現在までの知見から、広い防御作用
を有するワクチンは、1種類以上の肺炎球菌からの交差
反応性防御誘導エピトープを含む必要がある。
【００４８】このような融合タンパクは、ＰｓｐＡのコ
リン結合領域を含めることにより融合タンパクの単離を
助けるようなドメイン、またはＥ．ｃｏｌｉのマルトー
ス結合タンパク（ｍａｌＥによりコード化）等のタンパ
クのリガンド結合ドメインを有していてもよい。前者の
場合、融合タンパクは、コリン セファロースカラムに
吸着させ、２％塩化コリンを用いて溶出させることによ
って単離することができる。後者の場合、マンノース−
セファデックスカラムに吸着させ、マンノースを含む溶
液で溶出する。
リン結合領域を含めることにより融合タンパクの単離を
助けるようなドメイン、またはＥ．ｃｏｌｉのマルトー
ス結合タンパク（ｍａｌＥによりコード化）等のタンパ
クのリガンド結合ドメインを有していてもよい。前者の
場合、融合タンパクは、コリン セファロースカラムに
吸着させ、２％塩化コリンを用いて溶出させることによ
って単離することができる。後者の場合、マンノース−
セファデックスカラムに吸着させ、マンノースを含む溶
液で溶出する。
【００４９】タンデム交差反応性のコイル状ＰｓｐＡ領
域含むこのような融合タンパクの構築において、各下流
遺伝子フラグメントの適当なオープンリーディングフレ
ームが結紮遺伝子フラグメントの接合部に保存されてい
ることのみならず、コイル状アミノ酸配列の七価元素モ
チーフが壊されていないことが大切である。後者を達成
するための一つの方法としては、ＰｓｐＡのα−螺旋状
ドメインに認められる天然非コイル状領域内にあるよう
に遺伝子融合物を構築する。Yotherら(I)は、非コイル
状断片がアミノ酸部分１６９〜１７６、１９９、２２
５、２７４および２８９にあることを明らかにした。一
方の端がアミノ酸部分１７０または１９９またはその近
くにあり、他端がアミノ酸残基２７４または２８９また
はその近くにある２種類またはそれ以上の干渉効果領域
（残基１９２〜２６０）の融合は、通常コイル状領域内
にエピトープを表現すると期待される。
域含むこのような融合タンパクの構築において、各下流
遺伝子フラグメントの適当なオープンリーディングフレ
ームが結紮遺伝子フラグメントの接合部に保存されてい
ることのみならず、コイル状アミノ酸配列の七価元素モ
チーフが壊されていないことが大切である。後者を達成
するための一つの方法としては、ＰｓｐＡのα−螺旋状
ドメインに認められる天然非コイル状領域内にあるよう
に遺伝子融合物を構築する。Yotherら(I)は、非コイル
状断片がアミノ酸部分１６９〜１７６、１９９、２２
５、２７４および２８９にあることを明らかにした。一
方の端がアミノ酸部分１７０または１９９またはその近
くにあり、他端がアミノ酸残基２７４または２８９また
はその近くにある２種類またはそれ以上の干渉効果領域
（残基１９２〜２６０）の融合は、通常コイル状領域内
にエピトープを表現すると期待される。
【００５０】いずれの場合にも、当該構築物を調製する
上での最も簡単な方法は、遺伝子融合物を構築するため
に使用するＤＮＡのＰＣＲ増幅である。この場合、適当
な制限部位を用いて対応する配列を調製することができ
る。各ｐｓｐａフラグメントの調製に使用する遺伝子融
合物およびＰＣＲプライマーの設計は、適当なリーディ
ングフレームがニュクレオチドレベルの各融合遺伝子フ
レームに保存されるように行う。
上での最も簡単な方法は、遺伝子融合物を構築するため
に使用するＤＮＡのＰＣＲ増幅である。この場合、適当
な制限部位を用いて対応する配列を調製することができ
る。各ｐｓｐａフラグメントの調製に使用する遺伝子融
合物およびＰＣＲプライマーの設計は、適当なリーディ
ングフレームがニュクレオチドレベルの各融合遺伝子フ
レームに保存されるように行う。
【００５１】本発明によれば、従来のペプチド合成法に
よっても、適当なアミノ酸配列を有するペプチドを合成
することができる。
よっても、適当なアミノ酸配列を有するペプチドを合成
することができる。
【００５２】生物材料 実施例ならびに添付図面に、全体またはトランケートｐ
ｓｐＡ遺伝子配列を含むいくつかのプラスミッドを引用
した。これらの材料を下表に示す。
ｓｐＡ遺伝子配列を含むいくつかのプラスミッドを引用
した。これらの材料を下表に示す。
【００５３】
【表２】 さらに、以下の実施例ではいくつかのＰＣＲオリゴニュ
クレオチドプライマー配列を引用した。さらに、本発明
は、肺炎球菌ＤＮＡの特定の部分を増幅させるために組
み合わせて使用できるいくつかのオリゴニュクレオチド
プライマーまたはプローブを提供するものである。プラ
イマーの同定、その記述プライマーまたはプローブの
５’〜３’配列およびＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ
ｘ１株のＤＮＡにおけるプライマー配列のニュクレオチ
ド位置を表IIIに示す。また、Ｒｘ１株の成熟ＰｓｐＡ
タンパクのドメインに対するプライマーＬＳＭ１〜ＬＳ
Ｍ１４の相対的位置を図５に示す。
クレオチドプライマー配列を引用した。さらに、本発明
は、肺炎球菌ＤＮＡの特定の部分を増幅させるために組
み合わせて使用できるいくつかのオリゴニュクレオチド
プライマーまたはプローブを提供するものである。プラ
イマーの同定、その記述プライマーまたはプローブの
５’〜３’配列およびＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ
ｘ１株のＤＮＡにおけるプライマー配列のニュクレオチ
ド位置を表IIIに示す。また、Ｒｘ１株の成熟ＰｓｐＡ
タンパクのドメインに対するプライマーＬＳＭ１〜ＬＳ
Ｍ１４の相対的位置を図５に示す。
【００５４】
【実施例】以下の実施例には、前記の米国特許出願シリ
ーズ番号08/048,896に記載したいくつかの材料を含め
た。 実施例１：本実施例では、ここで使用した細菌株、プラ
スミッドおよびモノクロナール抗体ならびに当該モノク
ロナール抗体を用いたマウスの免疫投与の手順を記載す
る。
ーズ番号08/048,896に記載したいくつかの材料を含め
た。 実施例１：本実施例では、ここで使用した細菌株、プラ
スミッドおよびモノクロナール抗体ならびに当該モノク
ロナール抗体を用いたマウスの免疫投与の手順を記載す
る。
【００５５】０．５％のイースト抽出物を含むTodd Hew
ittブロスまたは３％のヒツジ血液を含む血液寒天プレ
ートを用い、表IIIに示したＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
株をキャンドルジャー中で３７℃で培養した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ１株（Hanahan, J.Mol. Biol. 166, 557）
は、ＬＢ培地または最小栄養Ｅ培地で培養した。プラス
ミッドとして、ｐＵＣ１８（遺伝子３３：１０３）、ｐ
ＪＹ４１６３（Yotherら(II)）およびｐＩＮ−ＩＩＩ−
ｏｍｐＡ（EMBO J. 3:2437）を用いた。
ittブロスまたは３％のヒツジ血液を含む血液寒天プレ
ートを用い、表IIIに示したＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
株をキャンドルジャー中で３７℃で培養した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ１株（Hanahan, J.Mol. Biol. 166, 557）
は、ＬＢ培地または最小栄養Ｅ培地で培養した。プラス
ミッドとして、ｐＵＣ１８（遺伝子３３：１０３）、ｐ
ＪＹ４１６３（Yotherら(II)）およびｐＩＮ−ＩＩＩ−
ｏｍｐＡ（EMBO J. 3:2437）を用いた。
【００５６】抗体分泌雑種細胞培養株は、非抗体分泌骨
髄腫細胞培養株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３（J. I
mmunol. 123:1548）を用いた融合により得た。用いた特
異性抗体は、表IVに示す。抗ＰｓｐＡ雑種細胞培養株Ｘ
ｉ６４、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８は、McDanielら
(I)およびCrainら（前出）によってすでに記載されてい
る。その他の細胞株は、McDanielら(I)によって記載さ
れている手順にしたがって、λｇｔＩＩに表現させた遺
伝子組換えＤ３９ ＰｓｐＡをＣＢＡ／Ｎ系マウスに免
疫投与して調製した。ＰｓｐＡに対する抗体を生産する
細胞株は、ＰｓｐＡ上の表面暴露エピトープと反応する
ＭＡｂに選択的な熱殺菌（６０℃、３０分間）Ｓ． ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ３６ＡまたはＲｘ１株をコーテ
ィングしたミクロタイトーレションプレートを用い、Ｅ
ＬＩＳＡ法で同定した。ＭＡｂのＨ−鎖アイソタイプ
は、マウスのＩｇＭおよびＩｇＧ免疫グロブリンのμお
よびγＨ−鎖に特異的なアフィニティー精製ヤギ抗体で
ＥＬＩＳＡを現像して測定した。ＰｓｐＡに対するＭＡ
ｂの特異性は、免疫ブロット法で確認した。
髄腫細胞培養株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３（J. I
mmunol. 123:1548）を用いた融合により得た。用いた特
異性抗体は、表IVに示す。抗ＰｓｐＡ雑種細胞培養株Ｘ
ｉ６４、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８は、McDanielら
(I)およびCrainら（前出）によってすでに記載されてい
る。その他の細胞株は、McDanielら(I)によって記載さ
れている手順にしたがって、λｇｔＩＩに表現させた遺
伝子組換えＤ３９ ＰｓｐＡをＣＢＡ／Ｎ系マウスに免
疫投与して調製した。ＰｓｐＡに対する抗体を生産する
細胞株は、ＰｓｐＡ上の表面暴露エピトープと反応する
ＭＡｂに選択的な熱殺菌（６０℃、３０分間）Ｓ． ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ３６ＡまたはＲｘ１株をコーテ
ィングしたミクロタイトーレションプレートを用い、Ｅ
ＬＩＳＡ法で同定した。ＭＡｂのＨ−鎖アイソタイプ
は、マウスのＩｇＭおよびＩｇＧ免疫グロブリンのμお
よびγＨ−鎖に特異的なアフィニティー精製ヤギ抗体で
ＥＬＩＳＡを現像して測定した。ＰｓｐＡに対するＭＡ
ｂの特異性は、免疫ブロット法で確認した。
【００５７】新たに生産させた６種類のＭＡｂ（表IVに
示したＸｉＲ１５２６、ＸｉＲ３５、ＸｉＲ１２２４、
ＸｉＲ１６、ＸｉＲ１３２５およびＸｉＲ１３２３）
は、いずれもＲｘ１およびＤ３９株の免疫ブロットで期
待した大きさ（みかけ分子量８４ｋＤａ）のタンパクを
検出することができた。Ｒｘ１株のＰｓｐＡ-変異株（M
cDanielら(III)およびYotherら(II)を参照）であるＷＧ
４４．１株の免疫ブロットでは、いずれのＭＡｂにも反
応性が認められなかった。
示したＸｉＲ１５２６、ＸｉＲ３５、ＸｉＲ１２２４、
ＸｉＲ１６、ＸｉＲ１３２５およびＸｉＲ１３２３）
は、いずれもＲｘ１およびＤ３９株の免疫ブロットで期
待した大きさ（みかけ分子量８４ｋＤａ）のタンパクを
検出することができた。Ｒｘ１株のＰｓｐＡ-変異株（M
cDanielら(III)およびYotherら(II)を参照）であるＷＧ
４４．１株の免疫ブロットでは、いずれのＭＡｂにも反
応性が認められなかった。
【００５８】下記の実施例５に記載するように、先に記
載した抗体Ｘｉ６、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８とと
もに、これら６種類の抗体を用いて、ＰｓｐＡ上のエピ
トープをマップするために使用したパネル１マウス抗体
を調製した。ＭＡｂの防御作用は、肺炎球菌ＷＵ２また
はＤ３９を１０3ＣＦＵ（ＬＤ５０の１０倍以上）で静
注する１時間前に各ＭＡｂの１／１０倍希釈液（約５〜
３０μｇ）０．１ｍｌをＣＢＡ／Ｎ系マウスに注射して
検定した。群内の全動物の死亡が防止できたとき、防御
効果があると判断した。非防御動物は、攻撃誘発後４８
時間以内に肺炎球菌感染によって全て死亡した。 実施例２：本実施例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）による肺炎球菌Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子の条件お
よびマウスに対するＰｓｐＡフラグメントの免疫投与の
手順を記載する。
載した抗体Ｘｉ６、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８とと
もに、これら６種類の抗体を用いて、ＰｓｐＡ上のエピ
トープをマップするために使用したパネル１マウス抗体
を調製した。ＭＡｂの防御作用は、肺炎球菌ＷＵ２また
はＤ３９を１０3ＣＦＵ（ＬＤ５０の１０倍以上）で静
注する１時間前に各ＭＡｂの１／１０倍希釈液（約５〜
３０μｇ）０．１ｍｌをＣＢＡ／Ｎ系マウスに注射して
検定した。群内の全動物の死亡が防止できたとき、防御
効果があると判断した。非防御動物は、攻撃誘発後４８
時間以内に肺炎球菌感染によって全て死亡した。 実施例２：本実施例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）による肺炎球菌Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子の条件お
よびマウスに対するＰｓｐＡフラグメントの免疫投与の
手順を記載する。
【００５９】ＰＣＲプライマーは、肺炎球菌Ｒｘ１株の
ｐｓｐＡ遺伝子の配列（図１〜３参照）に基づいて設計
した。５’プライマーは、ＬＳＭ３、ＬＳＭ４およびＬ
ＳＭ７であった。ＬＳＭ３は塩基５７６から始まる２８
塩基の長さを有し、ＬＳＭ４は塩基７９２から始まる３
１塩基、ＬＳＭ７は塩基１０９３から始まる３１塩基の
長さを有する。これら３種類のプライマーは、いずれも
さらにＢａｍＨＩ部位を含んでいる。３’ｐｓｐＡプラ
イマーは、長さが３３塩基で、塩基１９９０から始まる
ＬＳＭ２、および長さが３１塩基で、塩基１１１７から
始まるＬＳＭ６であった。さらにプライマーＬＳＭ２お
よびＬＳＭ６は、いずれもＳａｌＩ部位を含んでいる。
プライマーのニュクレオチド配列は、表IIIに示す。
ｐｓｐＡ遺伝子の配列（図１〜３参照）に基づいて設計
した。５’プライマーは、ＬＳＭ３、ＬＳＭ４およびＬ
ＳＭ７であった。ＬＳＭ３は塩基５７６から始まる２８
塩基の長さを有し、ＬＳＭ４は塩基７９２から始まる３
１塩基、ＬＳＭ７は塩基１０９３から始まる３１塩基の
長さを有する。これら３種類のプライマーは、いずれも
さらにＢａｍＨＩ部位を含んでいる。３’ｐｓｐＡプラ
イマーは、長さが３３塩基で、塩基１９９０から始まる
ＬＳＭ２、および長さが３１塩基で、塩基１１１７から
始まるＬＳＭ６であった。さらにプライマーＬＳＭ２お
よびＬＳＭ６は、いずれもＳａｌＩ部位を含んでいる。
プライマーのニュクレオチド配列は、表IIIに示す。
【００６０】以下に述べる一般的な手順により、ｐＢＣ
２０７はプライマー対ＬＳＭ３−ＬＳＭ２を用い、ｐＢ
Ｃ１００はプライマー対ＬＳＭ４−ＬＳＭ２を、ｐＢＡ
Ｒ５０１はプライマー対ＬＳＭ７−ＬＳＭ２を、ｐＢＡ
Ｒ４１６はプライマー対ＬＳＭ４−ＬＳＭ６を用いてそ
れぞれ調製した。
２０７はプライマー対ＬＳＭ３−ＬＳＭ２を用い、ｐＢ
Ｃ１００はプライマー対ＬＳＭ４−ＬＳＭ２を、ｐＢＡ
Ｒ５０１はプライマー対ＬＳＭ７−ＬＳＭ２を、ｐＢＡ
Ｒ４１６はプライマー対ＬＳＭ４−ＬＳＭ６を用いてそ
れぞれ調製した。
【００６１】５’および３’プライマー対を用い、ゲノ
ム性Ｒｘ１肺炎球菌ＤＮＡ約１０ｎｇを増幅させた。試
料の総容量を５０μｌとし、最終濃度としてＫＣｌ ５
０ｍＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ ８．３）１０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2 １．５ｍＭ、ゼラチン ０．００１％、各プラ
イマー０．５ｍＭ、デオキシニュクレオシド 三リン酸
および２．５ＵのＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼそれぞれ
２００ｍＭとした。試料に鉱物油５０μｌを重ね、９４
℃で２分間変性させ、９４℃で１分間、５０℃で２分
間、７２℃で３分間処理を１サイクルとして１０サイク
ルの処理を行った後、さらに９４℃で１分間、６０℃で
２分間、７２℃で３分間の処理を１サイクルとして２０
サイクルの処理を行った。３０サイクルの処理を行った
後、試料をさらに７２℃に５分間保ち、４℃に冷却し
た。
ム性Ｒｘ１肺炎球菌ＤＮＡ約１０ｎｇを増幅させた。試
料の総容量を５０μｌとし、最終濃度としてＫＣｌ ５
０ｍＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ ８．３）１０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2 １．５ｍＭ、ゼラチン ０．００１％、各プラ
イマー０．５ｍＭ、デオキシニュクレオシド 三リン酸
および２．５ＵのＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼそれぞれ
２００ｍＭとした。試料に鉱物油５０μｌを重ね、９４
℃で２分間変性させ、９４℃で１分間、５０℃で２分
間、７２℃で３分間処理を１サイクルとして１０サイク
ルの処理を行った後、さらに９４℃で１分間、６０℃で
２分間、７２℃で３分間の処理を１サイクルとして２０
サイクルの処理を行った。３０サイクルの処理を行った
後、試料をさらに７２℃に５分間保ち、４℃に冷却し
た。
【００６２】上記の手順についで、プライマーＬＳＭ４
およびＬＳＭ６を用い、１６種類のＳ． ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ株全て、すなわちＤ３９、ＷＵ２、ＢＧ９７３
９、Ｌ８１９０５、ＤＢＬ６Ａ、ＤＢＬ５、ＢＧ９１６
３、Ａ６６、ＥＦ６７９６、ＢＧ７３２２、ＥＦ５６６
８、ＢＧ７３７６、ＬＭ１００、ＢＧ６７９６、ＢＧ５
−８ＡおよびＲ３６Ａの相当する領域を増幅させること
ができた。さらに、これらの株のいくつか、すなわちＤ
３９、ＷＵ２、ＢＧ９７３９、ＤＢＬ６Ａ、ＤＢＬ５、
Ａ６６、ＥＦ５６６８、ＬＭ１００およびＲ３６Ａにつ
いては、増幅させたフラグメントをクローン化した。 実施例３：本実施例では、トランケートＰｓｐＡ分子の
表現を記載する。前記の米国特許出願シリーズ番号07/8
35,698および07/656,773（また、Yotherら(II)前出も参
照）に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＮ
−末端フラグメントを表現し、肺炎球菌からのフラグメ
ントと同じフラグメントを分泌する３’欠失ｐｓｐＡ遺
伝子を構築した。
およびＬＳＭ６を用い、１６種類のＳ． ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ株全て、すなわちＤ３９、ＷＵ２、ＢＧ９７３
９、Ｌ８１９０５、ＤＢＬ６Ａ、ＤＢＬ５、ＢＧ９１６
３、Ａ６６、ＥＦ６７９６、ＢＧ７３２２、ＥＦ５６６
８、ＢＧ７３７６、ＬＭ１００、ＢＧ６７９６、ＢＧ５
−８ＡおよびＲ３６Ａの相当する領域を増幅させること
ができた。さらに、これらの株のいくつか、すなわちＤ
３９、ＷＵ２、ＢＧ９７３９、ＤＢＬ６Ａ、ＤＢＬ５、
Ａ６６、ＥＦ５６６８、ＬＭ１００およびＲ３６Ａにつ
いては、増幅させたフラグメントをクローン化した。 実施例３：本実施例では、トランケートＰｓｐＡ分子の
表現を記載する。前記の米国特許出願シリーズ番号07/8
35,698および07/656,773（また、Yotherら(II)前出も参
照）に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＮ
−末端フラグメントを表現し、肺炎球菌からのフラグメ
ントと同じフラグメントを分泌する３’欠失ｐｓｐＡ遺
伝子を構築した。
【００６３】内部フラグメント（ＢＡＲ４１６）および
５’欠失ｐｓｐＡ構築物を表現させるためには、分泌ベ
クターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡを用いた。増幅ｐｓｐ
ＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、
適当なＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍ
ｐＡベクター中に結紮し、ｌａｃプロモータのコントロ
ール下でフレーム中のｏｍｐＡリーダーに融合した挿入
フラグメントを提供した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換株
は、カザミノ酸（０．１％）、グルコース（０．２
％）、チアミン（０．０５ｍＭ）および５０μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを添加した最小栄養培地Ｅ上で選抜し
た。
５’欠失ｐｓｐＡ構築物を表現させるためには、分泌ベ
クターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡを用いた。増幅ｐｓｐ
ＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、
適当なＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍ
ｐＡベクター中に結紮し、ｌａｃプロモータのコントロ
ール下でフレーム中のｏｍｐＡリーダーに融合した挿入
フラグメントを提供した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換株
は、カザミノ酸（０．１％）、グルコース（０．２
％）、チアミン（０．０５ｍＭ）および５０μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを添加した最小栄養培地Ｅ上で選抜し
た。
【００６４】ｌａｃ表現を誘導するために、６６０ｎｍ
における吸光度密度が約０．６となるまで細菌を３７℃
の最小栄養培地Ｅ中で培養した後、最終濃度２ｍＭのＩ
ＰＴＧを添加した。３７℃でさらに２時間培養した後、
細胞を収穫し、浸透圧衝撃によって周縁細胞質を遊離さ
せた。
における吸光度密度が約０．６となるまで細菌を３７℃
の最小栄養培地Ｅ中で培養した後、最終濃度２ｍＭのＩ
ＰＴＧを添加した。３７℃でさらに２時間培養した後、
細胞を収穫し、浸透圧衝撃によって周縁細胞質を遊離さ
せた。
【００６５】これらの手順によって、３’欠失ｐｓｐＡ
についてはプラスミッドｐＪＹ４２８４、ｐＪＹ４２８
５、ｐＪＹ４３１０およびｐＪＹ４３０６、内部フラグ
メントｐＢＡＲ４１６を、５’欠失ｐｓｐＡについては
プラスミッドｐＢＣ２０７、ｐＢＣ１００およびｐＢＡ
Ｒ５０１を得た。プラスミッドｐＪＹ４２８４およびｐ
ＪＹ４２８５は、挿入された５６４塩基対（ニュクレオ
チド１〜５６４）を含み、アミノ酸１〜１１５に相当す
る推定１８ｋＤａのＰｓｐＡ Ｃ−末端欠失産物をコー
ド化している。プラスミッドＪＹ４３１０は、挿入され
た７９５塩基対（ニュクレオチド１〜７９５）を含み、
アミノ酸１〜１９２に相当する推定２１ｋＤａのＰｓｐ
Ａ Ｃ−末端欠失産物をコード化している。プラスミッ
ドＪＹ４３０６は、挿入された９９９塩基対（ニュクレ
オチド１〜９９９）を含み、アミノ酸１〜２６０に相当
する推定２９ｋＤａのＰｓｐＡ Ｃ−末端欠失産物をコ
ード化している。プラスミッドｐＢＣ１００は、挿入さ
れた１１９９塩基対（ニュクレオチド７９２〜１９９
０）を含み、アミノ酸１９２〜５８８に相当する推定４
８ｋＤａのＰｓｐＡ Ｎ−末端欠失産物をコード化して
いる。ｐＢＣ２０７は、挿入された１４１５塩基対（ニ
ュクレオチド５７６〜１９９０）を含み、アミノ酸１１
９〜５８８に相当する推定５１ｋＤａのＰｓｐＡ Ｎ−
末端欠失産物をコード化している。ｐＢＡＲ５０１は、
挿入された９０３塩基対（ニュクレオチド１０９３〜１
９９０）を含み、アミノ酸２９３〜５８８に相当する推
定３２ｋＤａのＰｓｐＡ Ｎ−末端欠失産物をコード化
している。プラスミッドｐＢＡＲ４１６は、挿入された
３２６塩基対（ニュクレオチド７９２〜１１１７）を含
み、アミノ酸１９２〜２９９に相当する推定１２ｋＤａ
のＰｓｐＡ内部分子をコード化している。
についてはプラスミッドｐＪＹ４２８４、ｐＪＹ４２８
５、ｐＪＹ４３１０およびｐＪＹ４３０６、内部フラグ
メントｐＢＡＲ４１６を、５’欠失ｐｓｐＡについては
プラスミッドｐＢＣ２０７、ｐＢＣ１００およびｐＢＡ
Ｒ５０１を得た。プラスミッドｐＪＹ４２８４およびｐ
ＪＹ４２８５は、挿入された５６４塩基対（ニュクレオ
チド１〜５６４）を含み、アミノ酸１〜１１５に相当す
る推定１８ｋＤａのＰｓｐＡ Ｃ−末端欠失産物をコー
ド化している。プラスミッドＪＹ４３１０は、挿入され
た７９５塩基対（ニュクレオチド１〜７９５）を含み、
アミノ酸１〜１９２に相当する推定２１ｋＤａのＰｓｐ
Ａ Ｃ−末端欠失産物をコード化している。プラスミッ
ドＪＹ４３０６は、挿入された９９９塩基対（ニュクレ
オチド１〜９９９）を含み、アミノ酸１〜２６０に相当
する推定２９ｋＤａのＰｓｐＡ Ｃ−末端欠失産物をコ
ード化している。プラスミッドｐＢＣ１００は、挿入さ
れた１１９９塩基対（ニュクレオチド７９２〜１９９
０）を含み、アミノ酸１９２〜５８８に相当する推定４
８ｋＤａのＰｓｐＡ Ｎ−末端欠失産物をコード化して
いる。ｐＢＣ２０７は、挿入された１４１５塩基対（ニ
ュクレオチド５７６〜１９９０）を含み、アミノ酸１１
９〜５８８に相当する推定５１ｋＤａのＰｓｐＡ Ｎ−
末端欠失産物をコード化している。ｐＢＡＲ５０１は、
挿入された９０３塩基対（ニュクレオチド１０９３〜１
９９０）を含み、アミノ酸２９３〜５８８に相当する推
定３２ｋＤａのＰｓｐＡ Ｎ−末端欠失産物をコード化
している。プラスミッドｐＢＡＲ４１６は、挿入された
３２６塩基対（ニュクレオチド７９２〜１１１７）を含
み、アミノ酸１９２〜２９９に相当する推定１２ｋＤａ
のＰｓｐＡ内部分子をコード化している。
【００６６】これらのプラスミッドに含まれるｐｓｐＡ
遺伝子配列は、図４に示すようにＰｓｐＡのフラグメン
トに対応するアミノ酸配列をコード化し、表現する。
遺伝子配列は、図４に示すようにＰｓｐＡのフラグメン
トに対応するアミノ酸配列をコード化し、表現する。
【００６７】本実施例に記載したプラスミッドから製造
したＰｓｐＡフラグメントは、フロイントの完全アジュ
バント（ＣＦＡ）に１：１で乳化させて浸透圧調製物と
し、ＣＢＡ／Ｎ系マウスの鼠径部に皮下注射して免疫投
与した。１４日後に、ＣＦＡを含まない乳酸リンゲル液
で１：１に希釈した抗原をマウスの腹腔内に注射した。
７日後に、ＬＤ５０の少なくとも１００倍の肺炎球菌Ｄ
３９またはＷＵ２株を静脈内に攻撃投与した。１０日間
にわたって、マウスの生存率を調査した。 実施例４：本実施例では、免疫検定の手順を記載する。
免疫ブロット分析は、McDanielら(IV)の方法にしたがっ
て行った。実施例３に記載したように調製したトランケ
ートＰｓｐＡ分子またはＰｓｐＡを濃縮したモノクロナ
ール調製物（McDanielら(II)参照）を１０％ナトリウム
ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ニトロセルロース上に電気ブ
ロットした。ブロットは、実施例１に記載したように調
製した各ＭＡｂでプローブした。
したＰｓｐＡフラグメントは、フロイントの完全アジュ
バント（ＣＦＡ）に１：１で乳化させて浸透圧調製物と
し、ＣＢＡ／Ｎ系マウスの鼠径部に皮下注射して免疫投
与した。１４日後に、ＣＦＡを含まない乳酸リンゲル液
で１：１に希釈した抗原をマウスの腹腔内に注射した。
７日後に、ＬＤ５０の少なくとも１００倍の肺炎球菌Ｄ
３９またはＷＵ２株を静脈内に攻撃投与した。１０日間
にわたって、マウスの生存率を調査した。 実施例４：本実施例では、免疫検定の手順を記載する。
免疫ブロット分析は、McDanielら(IV)の方法にしたがっ
て行った。実施例３に記載したように調製したトランケ
ートＰｓｐＡ分子またはＰｓｐＡを濃縮したモノクロナ
ール調製物（McDanielら(II)参照）を１０％ナトリウム
ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ニトロセルロース上に電気ブ
ロットした。ブロットは、実施例１に記載したように調
製した各ＭＡｂでプローブした。
【００６８】免疫ブロット法で認められた反応性を確認
するために、直接結合ＥＬＩＳＡ法で定量した。この手
順で、浸透圧衝撃調製物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で希釈して、総タンパク濃度を３μｇ／ｍｌとし、
１００μｌを採って、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ミクロタイト
レーションプレートのウエルに添加した。ＰＢＳで１％
液とした仔牛血清アルブミンでブロックした後、各ＭＡ
ｂの未分画組織培養液上清を３倍に連続希釈し（７ウエ
ル）、２反復で滴定し、ヤギ抗マウス免疫グロブリン
アルカリ リン酸共役二次抗体およびアルカリ リン酸
基質を用い、McDanielら(IV)の方法で発色させた。DYNA
TECH（商標）プレートリーダーを用い、４０５ｎｍでプ
レートを読み取り、各調製物および各抗体について、３
０％終点を算出した。 実施例５：本実施例では、各種の病原性肺炎球菌株の攻
撃誘発に対する遺伝子組換えＰｓｐＡフラグメントの動
物モデルにおける緩衝効果を示す。ｐＢＣ２０７によっ
てＥ．ｃｏｌｉ中に生産されたＰｓｐＡフラグメント
（実施例３と同様に生産）の精製フラグメントを５匹の
マウスに免疫投与し、別の５匹にはｐＢＣ１００によっ
てＥ．ｃｏｌｉに生産されたＰｓｐＡ（実施例３）の精
製フラグメントを免疫投与した。いずれの場合にも、フ
ラグメントはフロイントの完全アジュバントとともに注
射し、２週間後に生理食塩水中のフラグメントを追加免
疫投与し、その７日後に攻撃誘発を行った。各フラグメ
ントを免疫投与したマウスは、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ ＷＵ２莢膜型３をＬＤ５０の１００倍量で攻撃誘
発後も全て生存した。
するために、直接結合ＥＬＩＳＡ法で定量した。この手
順で、浸透圧衝撃調製物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で希釈して、総タンパク濃度を３μｇ／ｍｌとし、
１００μｌを採って、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ミクロタイト
レーションプレートのウエルに添加した。ＰＢＳで１％
液とした仔牛血清アルブミンでブロックした後、各ＭＡ
ｂの未分画組織培養液上清を３倍に連続希釈し（７ウエ
ル）、２反復で滴定し、ヤギ抗マウス免疫グロブリン
アルカリ リン酸共役二次抗体およびアルカリ リン酸
基質を用い、McDanielら(IV)の方法で発色させた。DYNA
TECH（商標）プレートリーダーを用い、４０５ｎｍでプ
レートを読み取り、各調製物および各抗体について、３
０％終点を算出した。 実施例５：本実施例では、各種の病原性肺炎球菌株の攻
撃誘発に対する遺伝子組換えＰｓｐＡフラグメントの動
物モデルにおける緩衝効果を示す。ｐＢＣ２０７によっ
てＥ．ｃｏｌｉ中に生産されたＰｓｐＡフラグメント
（実施例３と同様に生産）の精製フラグメントを５匹の
マウスに免疫投与し、別の５匹にはｐＢＣ１００によっ
てＥ．ｃｏｌｉに生産されたＰｓｐＡ（実施例３）の精
製フラグメントを免疫投与した。いずれの場合にも、フ
ラグメントはフロイントの完全アジュバントとともに注
射し、２週間後に生理食塩水中のフラグメントを追加免
疫投与し、その７日後に攻撃誘発を行った。各フラグメ
ントを免疫投与したマウスは、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ ＷＵ２莢膜型３をＬＤ５０の１００倍量で攻撃誘
発後も全て生存した。
【００６９】対照群のマウス５匹には、非ＰｓｐＡ生産
性Ｅ．ｃｏｌｉからの同様な調製物（ＫＳＤ１５００−
ＤＨ１を含むプラスミッドベクター、ただし無挿入）を
アジュバントとともに注射した。同じ用量のＷＵ２株で
攻撃誘発すると、全てのマウスが死亡した。フラグメン
トは１９２〜２６０領域を含んでいるので、これらの結
果はマッピングデータと一致する。
性Ｅ．ｃｏｌｉからの同様な調製物（ＫＳＤ１５００−
ＤＨ１を含むプラスミッドベクター、ただし無挿入）を
アジュバントとともに注射した。同じ用量のＷＵ２株で
攻撃誘発すると、全てのマウスが死亡した。フラグメン
トは１９２〜２６０領域を含んでいるので、これらの結
果はマッピングデータと一致する。
【００７０】さらに、別のマウスには、Ｅ．ｃｏｌｉに
よって生産され、アミノ酸１９２〜２９９に相当するｐ
ＢＣ１００由来ＰｓｐＡの精製フラグメント（ｐＢＡＲ
４１６）を上記と同様に免疫投与し、各種Ｓ． ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ株で攻撃誘発した。ＰｓｐＡフラグメン
トを免疫投与したマウスは、ＥＬＩＳＡで１／７５０の
抗ＰｓｐＡ力価を示した。ＫＳＤ１５００の浸透圧衝撃
調製物を免疫投与した対照群のマウスは、１／１０以下
の抗ＰｓｐＡ力価を示した。得られた結果を、表Vに示
す。
よって生産され、アミノ酸１９２〜２９９に相当するｐ
ＢＣ１００由来ＰｓｐＡの精製フラグメント（ｐＢＡＲ
４１６）を上記と同様に免疫投与し、各種Ｓ． ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ株で攻撃誘発した。ＰｓｐＡフラグメン
トを免疫投与したマウスは、ＥＬＩＳＡで１／７５０の
抗ＰｓｐＡ力価を示した。ＫＳＤ１５００の浸透圧衝撃
調製物を免疫投与した対照群のマウスは、１／１０以下
の抗ＰｓｐＡ力価を示した。得られた結果を、表Vに示
す。
【００７１】表Vから明らかなように、多くの場合攻撃
誘発に対する防御効果が認められ、そうでない場合でも
延命効果が認められた。
誘発に対する防御効果が認められ、そうでない場合でも
延命効果が認められた。
【００７２】さらに、上記と同様にｐＢＣ１００により
Ｅ．ｃｏｌｉ中に生産させたＰｓｐＡの精製フラグメン
トを別のマウスに免疫投与した。各種の病原性株で攻撃
誘発したところ、ｐＢＣ１００フラグメントは１４株の
病原性株のうち７株の攻撃誘発に対して防御効果があ
り、その他の７株に対しても延命効果が認められた。Ｗ
Ｕ２の攻撃誘発による結果を含め、得られた結果を表VI
に示す。
Ｅ．ｃｏｌｉ中に生産させたＰｓｐＡの精製フラグメン
トを別のマウスに免疫投与した。各種の病原性株で攻撃
誘発したところ、ｐＢＣ１００フラグメントは１４株の
病原性株のうち７株の攻撃誘発に対して防御効果があ
り、その他の７株に対しても延命効果が認められた。Ｗ
Ｕ２の攻撃誘発による結果を含め、得られた結果を表VI
に示す。
【００７３】本実施例に示した結果から、それぞれアミ
ノ酸１１９および１９２のＣ−末端エピトープは防御免
疫を誘導することができると考えられる。この結果は、
米国特許出願シリーズ番号08/048,896に示したアミノ酸
１９２〜２６０のＰｓｐＡ領域が少なくとも１つの防御
作用誘導エピトープを含むというエピトープマッピング
の知見と一致する。 実施例６：本実施例は、ただ１つのプロリンおよび反復
領域を含むＰｓｐＡのＣ−末端フラグメントによる動物
モデルにおける攻撃誘発に対する緩衝効果を示す。実施
例５と同様に、ｐＢＡＲ５０１（実施例３と同様に調
製）によりＥ．ｃｏｌｉ中に生産させたＰｓｐＡの精製
フラグメントをマウスに免疫投与した。対照群のマウス
にはＰｓｐＡを含まない同様な調製物を免疫投与した。
両群の動物に、各種Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株をＬ
Ｄ５０の約１００倍で攻撃誘発した。得られた結果を表
VIIに示す。
ノ酸１１９および１９２のＣ−末端エピトープは防御免
疫を誘導することができると考えられる。この結果は、
米国特許出願シリーズ番号08/048,896に示したアミノ酸
１９２〜２６０のＰｓｐＡ領域が少なくとも１つの防御
作用誘導エピトープを含むというエピトープマッピング
の知見と一致する。 実施例６：本実施例は、ただ１つのプロリンおよび反復
領域を含むＰｓｐＡのＣ−末端フラグメントによる動物
モデルにおける攻撃誘発に対する緩衝効果を示す。実施
例５と同様に、ｐＢＡＲ５０１（実施例３と同様に調
製）によりＥ．ｃｏｌｉ中に生産させたＰｓｐＡの精製
フラグメントをマウスに免疫投与した。対照群のマウス
にはＰｓｐＡを含まない同様な調製物を免疫投与した。
両群の動物に、各種Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株をＬ
Ｄ５０の約１００倍で攻撃誘発した。得られた結果を表
VIIに示す。
【００７４】表VIIに示すデータから、ｐＢＡＲ５０１
によって生産されたＣ−末端ＰｓｐＡフラグメントは、
各種病原性肺炎球菌株に対して干渉効果を有すると考え
られる。 実施例７：本実施例は、動物モデルにおける各種肺炎球
菌株の攻撃誘発に対する完全長遺伝子組換えＰｓｐＡの
干渉効果を示す。
によって生産されたＣ−末端ＰｓｐＡフラグメントは、
各種病原性肺炎球菌株に対して干渉効果を有すると考え
られる。 実施例７：本実施例は、動物モデルにおける各種肺炎球
菌株の攻撃誘発に対する完全長遺伝子組換えＰｓｐＡの
干渉効果を示す。
【００７５】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１およびＥＦ５６６８株からＥ．ｃｏ
ｌｉに表現させ、精製した完全長遺伝子組換えＰｓｐＡ
を５匹のマウスに免疫投与した。ＰｓｐＡはフロイント
の完全アジュバントとともに皮下注射し、２週間後に完
全長ＰｓｐＡをフロイントの不完全アジュバントととも
に追加免疫投与し、その７日後に病原性株をＬＤ５０の
１００倍で攻撃誘発した。得られた結果を表VIIIおよび
IXに示す。
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１およびＥＦ５６６８株からＥ．ｃｏ
ｌｉに表現させ、精製した完全長遺伝子組換えＰｓｐＡ
を５匹のマウスに免疫投与した。ＰｓｐＡはフロイント
の完全アジュバントとともに皮下注射し、２週間後に完
全長ＰｓｐＡをフロイントの不完全アジュバントととも
に追加免疫投与し、その７日後に病原性株をＬＤ５０の
１００倍で攻撃誘発した。得られた結果を表VIIIおよび
IXに示す。
【００７６】表VIIIおよびIXから明らかなように、Ｒｘ
１からのＰｓｐＡは広いスペクトルのＳ． ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ株に対して防御作用を示し、一方ＥＦ５６６
８からのＰｓｐＡは多くの株に対して干渉効果を示し
た。これらの結果から、ＰｓｐＡの限られた血清型のも
のが広いスペクトルの肺炎球菌に対して防御作用を誘導
するものと考えられる。また、このデータから、Ｐｓｐ
Ａはタンパクを基材とした肺炎球菌ワクチンの重要な成
分として利用できるものと思われる。
１からのＰｓｐＡは広いスペクトルのＳ． ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ株に対して防御作用を示し、一方ＥＦ５６６
８からのＰｓｐＡは多くの株に対して干渉効果を示し
た。これらの結果から、ＰｓｐＡの限られた血清型のも
のが広いスペクトルの肺炎球菌に対して防御作用を誘導
するものと考えられる。また、このデータから、Ｐｓｐ
Ａはタンパクを基材とした肺炎球菌ワクチンの重要な成
分として利用できるものと思われる。
【００７７】
【表３】
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
【表６】
【００８１】
【表７】
【００８２】
【表８】
【００８３】
【表９】
【００８４】
【表１０】
【００８５】
（１）配列番号第１番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０８５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：二重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子のタイプ：タンパク （ｉｉｉ）仮説：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖｉ）発生源： （Ａ）生物体：Streptococcus pneumoniae （Ｂ）株：Rx1 （ｖｉｉ）直接源： （Ｂ）クローン：ＪＹ４３１３ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：イントロン （Ｂ）場所：１．．２０８５ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）場所：ジョイン（１２７．．１９８４） （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１番：
【００８６】
【表１１】
【００８７】
【表１２】
【００８８】
【表１３】
【００８９】
【表１４】
【００９０】（２）配列番号第２番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６１９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子のタイプ：タンパク （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第２番：
【００９１】
【表１５】
【００９２】
【表１６】
【００９３】
【表１７】
【００９４】（３）配列番号第３番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第３番： ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧ ＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ ＡＡＡＡＡＣ
【００９５】（４）配列番号第４番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第４番： ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣ ＧＧＣＴＴＡＡＡＣＣ ＣＡＴＴＣＡＣＣＡＴ ＴＧＧ
【００９６】（５）配列番号第５番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第５番： ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧ ＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡ ＧＴＴＧＧＣＴＧ
【００９７】（６）配列番号第６番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第６番： ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣ ＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴ ＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴ Ｇ
【００９８】（７）配列番号第７番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第７番： ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧ ＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＴＣＴＡＡＡＧＣＴ Ｇ
【００９９】（８）配列番号第８番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第８番： ＣＴＧＡＧＴＣＧＡＣ ＴＧＧＡＧＴＴＴＣＴ ＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ Ｃ
【０１００】（９）配列番号第９番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第９番： ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣ ＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡ Ｇ
【０１０１】（１０）配列番号第１０番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１０番： ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴ ＧＡＣＣＡＡＴＡＴＴ ＴＡＣＧＧＡＧＧＡＧ ＧＣ
【０１０２】（１１）配列番号第１１番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１１番： ＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧ ＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧ
【０１０３】（１２）配列番号第１２番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１２番： ＧＣＴＡＴＧＧＣＴＡ ＣＡＧＧＴＴＧ
【０１０４】（１３）配列番号第１３番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１３番： ＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧ ＣＣＡＴＡＧＣ
【０１０５】（１４）配列番号第１４番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１４番： ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧ ＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣ ＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧ ＧＴＴ
【０１０６】（１５）配列番号第１５番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１５番： ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴ ＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡ ＴＴＴＧＴＡＡＣ
【０１０７】（１６）配列番号第１６番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１６番： ＧＣＧＣＧＴＣＴＣＴ ＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴ ＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴ
【０１０８】（１７）配列番号第１７番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１７番： ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴ ＣＡＧＡＧＣＴＣＴＴ ＧＴＴＣＴＡＧ
【０１０９】（１８）配列番号第１８番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１８番： ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡ ＣＴＧＣＴＴＴ
【０１１０】（１９）配列番号第１９番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第１９番： ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧ ＴＡＧＣＣＡＧＴＣＡ ＧＴＣＴＡＡＡＧＣＴ Ｇ
【０１１１】（２０）配列番号第２０番の一般情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド化：一重 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ） 配列の番号：配列番号第２０番： ＴＡＴＴＴＣＡＧＴＴ ＡＣＧＧＴＴＡＣＣＡ ＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡ ＡＧＧ ＣＧ
【図１】図１は、図２と図３に連結してＳ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）およびＰｓｐＡタンパクの推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）およびＰｓｐＡタンパクの推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
【図２】図２は、図１と図３に連結してＳ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）およびＰｓｐＡタンパクの推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）およびＰｓｐＡタンパクの推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、図１と図２に連結してＳ．Ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）およびＰｓｐＡタンパクの推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
ｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）およびＰｓｐＡタンパクの推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
【図４】図４は、成熟ＰｓｐＡタンパクのドメインの模
式図ならびに完全長タンパク（ｐＫＳＤ１０１４）、タ
ンパクのＮ−末端部分（ｐＪＹ４２８４、ｐＪＹ４２８
５、ｐＪＹ４３１０、またはｐＪＹ４３０６）の特定セ
グメント、タンパクのＣ−末端領域（ｐＢＣ２０７、ｐ
ＢＣ１００、ｐＢＡＲ５０１、ｐＢＡＲ７１４）の特異
的配列、およびタンパクの特定中間領域（ｐＢＡＲ４１
６、ｐＢＡＲ６３５）のいくつかのプラスミッドの同定
を示す。
式図ならびに完全長タンパク（ｐＫＳＤ１０１４）、タ
ンパクのＮ−末端部分（ｐＪＹ４２８４、ｐＪＹ４２８
５、ｐＪＹ４３１０、またはｐＪＹ４３０６）の特定セ
グメント、タンパクのＣ−末端領域（ｐＢＣ２０７、ｐ
ＢＣ１００、ｐＢＡＲ５０１、ｐＢＡＲ７１４）の特異
的配列、およびタンパクの特定中間領域（ｐＢＡＲ４１
６、ｐＢＡＲ６３５）のいくつかのプラスミッドの同定
を示す。
【図５】図５は、成熟タンパクＰｓｐＡのドメインの模
式図とここで同定したＰＣＲプライマー配列の位置の同
定を示す。
式図とここで同定したＰＣＲプライマー配列の位置の同
定を示す。
【図６】図６は、成熟ＰｓｐＡタンパクのドメインの模
式図とある種のモノクロナール抗体により識別されるエ
ピトープの一般的位置を示す。
式図とある種のモノクロナール抗体により識別されるエ
ピトープの一般的位置を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/09 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ジャネット エル． ヨーザー アメリカ合衆国 35242 アラバマ州 バ ーミンガム ヒーザーブルック ロード 2208 (72)発明者 ラリー エス． マクダニエル アメリカ合衆国 35210 アラバマ州 バ ーミンガム コーネル ドライヴ 5354
Claims (13)
- 【請求項１】 肺炎球菌ＤＮＡの製造または試料中の肺
炎球菌ＤＮＡの検出に使用する肺炎球菌ＤＮＡのポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅用の１対のオリゴニュクレオチドプ
ライマーマタハプローブであって、（ａ）ＬＳＭ１、Ｌ
ＳＭ３、ＬＳＭ４、ＬＳＭ７、ＬＳＭ８、ＬＳＭ１０、
ＬＳＭ１２およびＬＳＭ１３から選んだＮ−末端プライ
マーまたはプローブと、（ｂ）ＬＳＭ２、ＬＳＭ６、Ｌ
ＳＭ９、ＬＳＭ１１およびＬＳＭ１４から選んだＣ−末
端プライマーまたはプローブであって、かつ表IIIに示
すニュクレオチド配列を有するＣ−末端プライマーまた
はプローブとからなる。ただし、ＬＳＭ１とＬＳＭ２、
ＬＳＭ３とＬＳＭ２、およびＬＳＭ４とＬＳＭ２の組み
合わせを除く。 - 【請求項２】 （ａ）ＬＳＭ７とＬＳＭ２、（ｂ）ＬＳ
Ｍ４とＬＳＭ６、（ｃ）ＬＳＭ３とＬＳＭ１４、（ｄ）
ＬＳＭ３とＬＳＭ６、および（ｅ）ＬＳＭ８とＬＳＭ２
のいずれかの対である請求項１に記載の１対のオリゴニ
ュクレオチドプライマーまたはプローブ - 【請求項３】 請求項１または２に記載の１対のプライ
マーによって増幅される肺炎球菌ＤＮＡ - 【請求項４】 請求項３に記載の増幅肺炎球菌ＤＮＡに
よってコード化された肺炎球菌表面タンパクＡ - 【請求項５】 それぞれ表IIIに示したニュクレオチド
配列を有するオリゴニュクレオチドプライマーＬＳＭ４
およびＬＳＭ６によるポリメラーゼ連鎖反応によって増
幅された肺炎球菌ＤＮＡでコード化されたアミノ酸配列
を有する単離された肺炎球菌表面タンパクＡ（Ｐｓｐ
Ａ）フラグメント - 【請求項６】 ｐＢＡＲ４１６またはｐＢＡＲ５０１の
いずれかである遺伝子組換えプラスミッド - 【請求項７】 請求項６に記載のプラスミッドの表現産
物である肺炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）フラグメ
ント - 【請求項８】 ＬＳＭ５、ＬＳＭ６、ＬＳＭ７、ＬＳＭ
８、ＬＳＭ９、ＬＳＭ１０、ＬＳＭ１１、ＬＳＭ１２、
ＬＳＭ１３、ＬＳＭ１４、ＬＳＭ１５（Ｓ）、ＬＳＭ１
６（Ｓ）、ＬＳＭ１７、またはＬＳＭ１８のいずれかで
あるオリゴニュクレオチドプライマーまたはプローブで
あって、前記のオリゴニュクレオチドプライマーまたは
プローブはそれぞれ表IIIに示すニュクレオチド配列を
有する。 - 【請求項９】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅの多くの株に対して干渉効果を有する免疫
原性組成物であって、 （Ｉ）（ａ）Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株の
アミノ酸残基１９２〜５８８、また必要ならばさらにＮ
Ｈ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基のＰ
ｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなるフラグメント、
または当該タンパクフラグメントと効果的に相同なフラ
グメントと、（ｂ）Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ
１株のアミノ酸残基２９３〜５８８、また必要ならばさ
らにＮＨ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残
基のＰｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなるフラグメ
ント、または当該タンパクフラグメントと効果的に相同
なフラグメント、または（ｃ）遺伝子組換えで製造さ
れ、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のＰｓｐＡ
タンパクのアミノ酸残基１９２〜２９９、また必要なら
ばさらにＮＨ2−および／またはＣＯＯＨ−末端方向に
向かってさらに４０アミノ酸残基からなるフラグメン
ト、または当該タンパクフラグメントと効果的に相同な
フラグメントから選ばれた単離タンパクフラグメント
と、 （ＩＩ）生理学的に許容される担体とからなる。 - 【請求項１０】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅの多くの株に対して干渉効果を有する免
疫原性組成物であって、単離され、精製された完全長肺
炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）と、生理学的に許容
される担体とからなる。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の免疫原性組成物で
あって、前記の完全長ＰｓｐＡは遺伝子組換えによって
製造する。 - 【請求項１２】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のアミノ酸残基２９３〜５８
８のＰｓｐＡタンパクのＣ−末端部分からなり、少なく
とも１個の防御作用誘導エピトープを含み、必要に応じ
てＮＨ2−末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基
を有する単離された肺炎球菌表面タンパクＡ（Ｐｓｐ
Ａ）フラグメント、または当該タンパクフラグメントと
効果的に相同なフラグメント - 【請求項１３】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株のアミノ酸残基２９３〜５８
８の肺炎球菌表面タンパク（ＰｓｐＡ）のＣ−末端部分
に含まれるエピトープに相当する少なくとも１個の防御
作用誘導エピトープのアミノ酸配列またはそれと効果的
に相同なアミノ酸配列からなり、必要に応じてＮＨ2−
末端方向に向かってさらに２５アミノ酸残基を有する単
離された肺炎球菌表面タンパクＡ（ＰｓｐＡ）フラグメ
ント
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US246636 | 1994-05-20 | ||
| US08/246,636 US5965141A (en) | 1991-02-15 | 1994-05-20 | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a |
| US08/319,795 US5980909A (en) | 1991-02-15 | 1994-10-07 | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A |
| US319795 | 1994-10-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0866198A true JPH0866198A (ja) | 1996-03-12 |
Family
ID=26938118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7122872A Withdrawn JPH0866198A (ja) | 1994-05-20 | 1995-05-22 | 肺炎球菌の表面タンパクａのエピトープ領域 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5980909A (ja) |
| EP (1) | EP0695803A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0866198A (ja) |
| AU (1) | AU693175B2 (ja) |
| CA (1) | CA2149345A1 (ja) |
| FI (1) | FI952444A7 (ja) |
| IL (1) | IL113775A0 (ja) |
| NO (1) | NO951981L (ja) |
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| JP2004508416A (ja) * | 2000-09-15 | 2004-03-18 | グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | ワクチン |
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| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
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