JPH0866199A - 試料反応混合物中で複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法および反応混合物中で複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで評価する自動装置 - Google Patents
試料反応混合物中で複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法および反応混合物中で複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで評価する自動装置Info
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- JPH0866199A JPH0866199A JP7140865A JP14086595A JPH0866199A JP H0866199 A JPH0866199 A JP H0866199A JP 7140865 A JP7140865 A JP 7140865A JP 14086595 A JP14086595 A JP 14086595A JP H0866199 A JPH0866199 A JP H0866199A
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Classifications
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＰＣＲプロセスにおいてＤＮＡ増幅の特異性
を確認するより簡単で自動的に実施可能な方法および装
置 【構成】 記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度
対サイクル数の測定曲線を作成し、次の関係式： 【数１】 による既知の成長曲線に対して測定曲線が最良に適合す
るｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定
するために逐次近似法を用い、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定して、出発濃度Ｃoを調
節することにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を計
算することにより反応混合物中でＰＣＲの開始時にター
ゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法お
よび装置。
を確認するより簡単で自動的に実施可能な方法および装
置 【構成】 記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度
対サイクル数の測定曲線を作成し、次の関係式： 【数１】 による既知の成長曲線に対して測定曲線が最良に適合す
るｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定
するために逐次近似法を用い、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定して、出発濃度Ｃoを調
節することにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を計
算することにより反応混合物中でＰＣＲの開始時にター
ゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法お
よび装置。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般に生化学的分析お
よびさらに特に複製連鎖反応（ＰＣＲ）においてＤＮＡ
のような核酸試料の定量分析に関する。
よびさらに特に複製連鎖反応（ＰＣＲ）においてＤＮＡ
のような核酸試料の定量分析に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲプロセスの間のＤＮＡ増幅のリア
ルタイムモニタリングは、Higuchi etal, Bio/Technolo
gy Vol.11, pp. 1026-1030に記載されている。この文献
において、Higuchi et alは、増幅可能なＤＮＡターゲ
ット配列についての定量アッセイを記載しており、これ
は、ＰＣＲプロセスの開始時に存在するターゲットＤＮ
Ａの総量に対するターゲット配列の特定の濃度に達する
のに必要な温度サイクルの数に関連づけられる。
ルタイムモニタリングは、Higuchi etal, Bio/Technolo
gy Vol.11, pp. 1026-1030に記載されている。この文献
において、Higuchi et alは、増幅可能なＤＮＡターゲ
ット配列についての定量アッセイを記載しており、これ
は、ＰＣＲプロセスの開始時に存在するターゲットＤＮ
Ａの総量に対するターゲット配列の特定の濃度に達する
のに必要な温度サイクルの数に関連づけられる。
【０００３】ＰＣＲのそれぞれのサイクルの間の試料の
蛍光の測定により、蛍光レベルを達成するために必要な
サイクル数はＰＣＲプロセスの開始時に増幅可能なター
ゲットの濃度と共に直接変化することが見出された。こ
のアッセイでは６００ｎｍの通過フィルターを有するＣ
ＣＤカメラが、反応混合物を含有するそれぞれのくぼみ
のアレーに向けられる。この反応混合物は臭化エチジウ
ムを含有し、これは２本鎖ＤＮＡ中へインタカーレーシ
ョン（挿入）される場合には約６００ｎｍの波長で著し
い蛍光を示すが、遊離溶液中では著しく弱い蛍光を示す
にすぎない染料である。この混合物のアレーは、臭化エ
チジウムを励起させる約３０２ｎｍのＵＶ線が照射され
る。試料のアレーは、交互に変性温度およびアニーリン
グ／延長温度にさらされる、つまりターゲットの実質的
な増幅を達成するために充分なサイクル数の熱的サイク
ルにかけられる。この蛍光強度は、それぞれのサイクル
のアニール／延長期間の間にＣＣＤにより検出され、カ
メラ出力は記憶およびデータ処理のためにパーソナルコ
ンピューターに送られる。このカメラ出力は、実際に、
それぞれのサイクルのそれぞれのアニーリング／延長期
の間の同じ時間に撮られたビデオイメージである。
蛍光の測定により、蛍光レベルを達成するために必要な
サイクル数はＰＣＲプロセスの開始時に増幅可能なター
ゲットの濃度と共に直接変化することが見出された。こ
のアッセイでは６００ｎｍの通過フィルターを有するＣ
ＣＤカメラが、反応混合物を含有するそれぞれのくぼみ
のアレーに向けられる。この反応混合物は臭化エチジウ
ムを含有し、これは２本鎖ＤＮＡ中へインタカーレーシ
ョン（挿入）される場合には約６００ｎｍの波長で著し
い蛍光を示すが、遊離溶液中では著しく弱い蛍光を示す
にすぎない染料である。この混合物のアレーは、臭化エ
チジウムを励起させる約３０２ｎｍのＵＶ線が照射され
る。試料のアレーは、交互に変性温度およびアニーリン
グ／延長温度にさらされる、つまりターゲットの実質的
な増幅を達成するために充分なサイクル数の熱的サイク
ルにかけられる。この蛍光強度は、それぞれのサイクル
のアニール／延長期間の間にＣＣＤにより検出され、カ
メラ出力は記憶およびデータ処理のためにパーソナルコ
ンピューターに送られる。このカメラ出力は、実際に、
それぞれのサイクルのそれぞれのアニーリング／延長期
の間の同じ時間に撮られたビデオイメージである。
【０００４】このデータは、次に、それぞれのくぼみに
対して生じる強度の値の標準化および処理のためにコン
ピューター中の通常のスプレッドシートプログラムに送
られる。それぞれのくぼみはターゲット核酸分子の異な
る初期濃度を含有する。さらに特に、この増幅は、１本
鎖ＨＩＶ鋳型ＤＮＡの一連の希釈で開始される。１０8
の鋳型で開始し、１０倍の希釈で１０2の鋳型に低下さ
せた。ＨＩＶ特異的プライマーは１４２ｂｐＰＣＲ生成
物の製造のために使用される。ゲノムＤＮＡの明らかに
固定された量は、さらに典型的な天然の試料をシュミレ
ートするためにそれぞれの反応混合物に添加される。
対して生じる強度の値の標準化および処理のためにコン
ピューター中の通常のスプレッドシートプログラムに送
られる。それぞれのくぼみはターゲット核酸分子の異な
る初期濃度を含有する。さらに特に、この増幅は、１本
鎖ＨＩＶ鋳型ＤＮＡの一連の希釈で開始される。１０8
の鋳型で開始し、１０倍の希釈で１０2の鋳型に低下さ
せた。ＨＩＶ特異的プライマーは１４２ｂｐＰＣＲ生成
物の製造のために使用される。ゲノムＤＮＡの明らかに
固定された量は、さらに典型的な天然の試料をシュミレ
ートするためにそれぞれの反応混合物に添加される。
【０００５】増幅が完了した後、一定の蛍光強度を達成
するために必要なサイクルの数と、出発核酸ターゲット
の濃度の対数との間の直接的な相関関係があることが見
出された。初期鋳型の濃度の対数をサイクル数に対して
プロットする場合、１９０の蛍光レベルに達し、この結
果は直線であった。線状の回帰適合を用いて１０8〜１
０3の出発コピーの間の一致は．９９より良かった（ｒ2
＞．９９）。しかし、１０3の出発コピーより下では、
この一致は非特異的生成物の増幅のために明らかに逸脱
する。
するために必要なサイクルの数と、出発核酸ターゲット
の濃度の対数との間の直接的な相関関係があることが見
出された。初期鋳型の濃度の対数をサイクル数に対して
プロットする場合、１９０の蛍光レベルに達し、この結
果は直線であった。線状の回帰適合を用いて１０8〜１
０3の出発コピーの間の一致は．９９より良かった（ｒ2
＞．９９）。しかし、１０3の出発コピーより下では、
この一致は非特異的生成物の増幅のために明らかに逸脱
する。
【０００６】ＤＮＡの出発コピーを決定するためのHigu
chi et alにより用いられたこの方法は、最大蛍光レベ
ルを決定し、そのレベルでサイクルまたはそのフラクシ
ョンを測定し、標準の成長曲線と既知の出発コピーとを
比較するための多様なＲＣＲについて記録された成長曲
線を観察する際に、人間の判定の適用に依存する。１９
０のレベルは、指数的成長の上昇曲線から極限または漸
近線に向かった下降曲線への移行において、全ての成長
曲線が比較的直線的である範囲の中央にあるため選択さ
れる。選択された蛍光レベルの付近のそれぞれの成長曲
線におけるいくつかのデータの点だけが、初期コピー数
の決定のために寄与する。若干の個々の測定におけるノ
イズは、未知の出発コピーの最終的な決定において、多
数の成長曲線上の著しく多数の測定が決定において含ま
れる場合に、つまりこれらの誤差の平均化およびこの結
果の精度の改善が行われるよりも大きな誤差の原因とな
ることがある。
chi et alにより用いられたこの方法は、最大蛍光レベ
ルを決定し、そのレベルでサイクルまたはそのフラクシ
ョンを測定し、標準の成長曲線と既知の出発コピーとを
比較するための多様なＲＣＲについて記録された成長曲
線を観察する際に、人間の判定の適用に依存する。１９
０のレベルは、指数的成長の上昇曲線から極限または漸
近線に向かった下降曲線への移行において、全ての成長
曲線が比較的直線的である範囲の中央にあるため選択さ
れる。選択された蛍光レベルの付近のそれぞれの成長曲
線におけるいくつかのデータの点だけが、初期コピー数
の決定のために寄与する。若干の個々の測定におけるノ
イズは、未知の出発コピーの最終的な決定において、多
数の成長曲線上の著しく多数の測定が決定において含ま
れる場合に、つまりこれらの誤差の平均化およびこの結
果の精度の改善が行われるよりも大きな誤差の原因とな
ることがある。
【０００７】さらに、Higuchi et alにより用いられた
方法は、実際に存在するかどうかを測定しない標準の成
長曲線と同じものを保持するために、それぞれの成長曲
線の形状を信頼しており、その際、結果として主要な誤
差の機会を残している。反対に、本発明の方法および装
置は、データの処理における人間の介在または判定の必
要がなく、成長曲線状のほとんど全てのデータ点を使用
することができ、つまりその誤差の平均化およびその結
果の精度の改良を行うことができ、それぞれの曲線の形
状パラメータを決定することによりそのＰＣＲが所望の
ものであるかどうかを決定することができ、および反応
条件の時間またはサイクルによる変化、たとえば酵素の
熱的分解が判明した場合には、成長曲線形状パラメータ
に関するこの作用により検出し、この成長曲線の変化し
た形状にもかかわらず正確な結果が得ることができる。
方法は、実際に存在するかどうかを測定しない標準の成
長曲線と同じものを保持するために、それぞれの成長曲
線の形状を信頼しており、その際、結果として主要な誤
差の機会を残している。反対に、本発明の方法および装
置は、データの処理における人間の介在または判定の必
要がなく、成長曲線状のほとんど全てのデータ点を使用
することができ、つまりその誤差の平均化およびその結
果の精度の改良を行うことができ、それぞれの曲線の形
状パラメータを決定することによりそのＰＣＲが所望の
ものであるかどうかを決定することができ、および反応
条件の時間またはサイクルによる変化、たとえば酵素の
熱的分解が判明した場合には、成長曲線形状パラメータ
に関するこの作用により検出し、この成長曲線の変化し
た形状にもかかわらず正確な結果が得ることができる。
【０００８】ＰＣＲの結果に関する現行の品質制御チェ
ックは、典型的に、増幅プロダクトが実際に所望の核酸
配列であるかを確かめるためにＰＣＲプロダクトのゲル
電気泳動分析操作を必要とするか、またはＰＣＲプロダ
クトと、所望のプロダクト鎖の１つに対して相補的な配
列を有する標識されたＤＮＡ試料とのハイブリッド化を
必要とする。このような方法どちらもが比較的時間のか
かる手順である。従って、増幅の特異性を確認するより
簡単な方法についての必要性が生じ、さらに付加的に、
ＰＣＲプロセスの間の品質チェックを自動的に実施する
装置が必要となる。
ックは、典型的に、増幅プロダクトが実際に所望の核酸
配列であるかを確かめるためにＰＣＲプロダクトのゲル
電気泳動分析操作を必要とするか、またはＰＣＲプロダ
クトと、所望のプロダクト鎖の１つに対して相補的な配
列を有する標識されたＤＮＡ試料とのハイブリッド化を
必要とする。このような方法どちらもが比較的時間のか
かる手順である。従って、増幅の特異性を確認するより
簡単な方法についての必要性が生じ、さらに付加的に、
ＰＣＲプロセスの間の品質チェックを自動的に実施する
装置が必要となる。
【０００９】
【発明の構成】本明細書において、次の用語の定義が用
いられる。
いられる。
【００１０】ＰＣＲという用語は、当初 Cetus Corpora
tionのDr. Kary Mullisにより開発された公知の複製連
鎖反応プロセスを意味し、特に、Dr. Mullis他により米
国特許第４６８３２０２号、同第４６８３１９５号およ
び同第４９６５１８８号明細書に記載されており、これ
らはここではそのまま参照される。
tionのDr. Kary Mullisにより開発された公知の複製連
鎖反応プロセスを意味し、特に、Dr. Mullis他により米
国特許第４６８３２０２号、同第４６８３１９５号およ
び同第４９６５１８８号明細書に記載されており、これ
らはここではそのまま参照される。
【００１１】「成長曲線」という用語は、特別な反応混
合物から製造される複製連鎖反応（ＰＣＲ）中でのそれ
ぞれの熱的サイクルの延長期の終わりまたはその付近に
存在し、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルの間にと
られるモル濃度に変換されたプロダクトＤＮＡ（ｄｓＤ
ＮＡ）の一連の量である。
合物から製造される複製連鎖反応（ＰＣＲ）中でのそれ
ぞれの熱的サイクルの延長期の終わりまたはその付近に
存在し、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルの間にと
られるモル濃度に変換されたプロダクトＤＮＡ（ｄｓＤ
ＮＡ）の一連の量である。
【００１２】「プライマー制限ＰＣＲ（primer limited
PCR）」とは、ＰＣＲプロセスであり、そのプロセスに
おいて、この成長曲線の形状はＰＣＲの熱的サイクルの
延長期の間に形成される全ての感作１本鎖のｄｓＤＮＡ
プロダクト合成を完了するために充分なポリメラーゼ酵
素活性が常にあることと一致し、著しいプロダクト濃度
での新たに合成されたＤＮＡの成長曲線における安定期
は、感作鎖（primed strand）を形成する確率を減少さ
せるプライマーと相補的１本鎖との間の競合により、お
よび最終的にプライマーの消耗により引き起こされる安
定期と一致するプライマーの初期濃度に対して漸近であ
る。
PCR）」とは、ＰＣＲプロセスであり、そのプロセスに
おいて、この成長曲線の形状はＰＣＲの熱的サイクルの
延長期の間に形成される全ての感作１本鎖のｄｓＤＮＡ
プロダクト合成を完了するために充分なポリメラーゼ酵
素活性が常にあることと一致し、著しいプロダクト濃度
での新たに合成されたＤＮＡの成長曲線における安定期
は、感作鎖（primed strand）を形成する確率を減少さ
せるプライマーと相補的１本鎖との間の競合により、お
よび最終的にプライマーの消耗により引き起こされる安
定期と一致するプライマーの初期濃度に対して漸近であ
る。
【００１３】「酵素性制限ＰＣＲ（enzyme limited PC
R）」とは、それぞれのサイクルの延長期中の全ての感
作鎖の合成を完了するために不十分なポリメラーゼ酵素
活性があるものであり、その結果、高いプロダクト濃度
で、ＰＣＲ鋳型モル濃度は、サイクルの延長期の間に重
合させることができる塩基の数により制限された速度で
それぞれのサイクルを増大させる。この場合のサイクル
あたりの鋳型のモル濃度増大は、塩基中の鋳型の長さに
依存する。
R）」とは、それぞれのサイクルの延長期中の全ての感
作鎖の合成を完了するために不十分なポリメラーゼ酵素
活性があるものであり、その結果、高いプロダクト濃度
で、ＰＣＲ鋳型モル濃度は、サイクルの延長期の間に重
合させることができる塩基の数により制限された速度で
それぞれのサイクルを増大させる。この場合のサイクル
あたりの鋳型のモル濃度増大は、塩基中の鋳型の長さに
依存する。
【００１４】本発明の対象は、特別なＰＣＲの唯一のセ
ットの特徴を決定し、ＰＣＲ中のターゲット核酸分子の
出発濃度を正確に決定する方法を提供することである。
ットの特徴を決定し、ＰＣＲ中のターゲット核酸分子の
出発濃度を正確に決定する方法を提供することである。
【００１５】本発明のもう一つの対象は、ＰＣＲプロセ
スのそれぞれのサイクルの間の蛍光の観察に基づくター
ゲット核酸分子の出発濃度を正確に測定する方法を提供
することである。
スのそれぞれのサイクルの間の蛍光の観察に基づくター
ゲット核酸分子の出発濃度を正確に測定する方法を提供
することである。
【００１６】本発明のもう一つの対象は、特別な核酸タ
ーゲットのための唯一のセットのＰＣＲ特徴パラメータ
を自動的に測定するための装置を提供することである。
ーゲットのための唯一のセットのＰＣＲ特徴パラメータ
を自動的に測定するための装置を提供することである。
【００１７】本発明のもう一つの対象は、外標準を必要
としない一定のＰＣＲの特異性を自動的に検証するため
の装置を提供することである。
としない一定のＰＣＲの特異性を自動的に検証するため
の装置を提供することである。
【００１８】前記のまたはその他の対象を達成するため
に、本発明は、その１実施態様において、適当な緩衝
液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファー
ト、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度の
ターゲット核酸分子を含有する試料反応混合物中で、複
製連鎖反応の開始時に、ターゲット核酸分子の未知の出
発モル濃度を決定するための新規の改良された方法を提
供する。２種類のプライマーは既知の濃度（Ｃpo）で提
供される。この方法は、ＰＣＲにレポーター分子を添加
する工程を含んでおり、この分子は反応に重大に干渉し
ないが、反応により製造されたＤＮＡを少なくとも１回
のそれぞれのサイクルで検出可能および測定可能にす
る。典型的なレポーター分子は臭化エチジウムであり、
これは紫外線または青緑光で励起された場合、２本鎖Ｄ
ＮＡ中へインターカレーションする際に著しく強い蛍光
を示すが、試薬系中で溶解して遊離している場合には著
しく弱い蛍光を示す。他の蛍光インターカレーション染
料もこの方法で使用される。たとえばＴＯＰＲＯ染料で
ある。実際に、干渉を引き起こさずに反応混合物中に残
ることができ、この反応により製造されたＤＮＡを破壊
せずに測定することができる全てのＤＮＡ検出分子系も
使用することができる。本発明の１実施態様において、
蛍光インターカレーション染料は、前記の複製連鎖反応
により製造された延長プロダクト中へ組み込まれた場
合、適当に励起される際に検出可能な信号を発し、核酸
分子の最終的な所望の濃度を確定するのに充分な、それ
ぞれ少なくとも変性および延長期間を有するサイクル数
についての前記反応混合物を熱的にサイクル処理し、お
よびそれぞれのサイクルの少なくとも延長期の間に前記
の反応混合物を励起させることができる。さらにこの方
法は、サイクルのそれぞれの少なくとも延長期の間の信
号の強度（Ｉ）を検出および測定する工程、この強度を
ｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、それぞれのサイクル
の延長期のそれぞれのモル濃度値を記憶する工程；およ
び前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対
サイクル数の測定された曲線を作成する工程を有する。
信号強度の測定値のモル濃度への変換は、ＰＣＲ試料
を、ブランクからＰＣＲにより製造されるような濃度範
囲にわたるｄｓＤＮＡの多様な既知のモル濃度を除いて
同量の全ての同じ材料を含有する標準のＤＮＡ溶液と置
き換える通常の方法を用いることにより行うことができ
る。ブランクの信号を既知の測光標準に関して測定され
た信号から引き算し、その際、ブランクバックグランド
について補正した測定シグナルを鋳型ｄｓＤＮＡのモル
濃度と関連させて検量線を作成する。この検量線を準備
するためにＰＣＲを実施する必要はない。ＤＮＡの既知
のモル濃度を有する測光標準溶液が必要とされることの
全てである。
に、本発明は、その１実施態様において、適当な緩衝
液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファー
ト、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度の
ターゲット核酸分子を含有する試料反応混合物中で、複
製連鎖反応の開始時に、ターゲット核酸分子の未知の出
発モル濃度を決定するための新規の改良された方法を提
供する。２種類のプライマーは既知の濃度（Ｃpo）で提
供される。この方法は、ＰＣＲにレポーター分子を添加
する工程を含んでおり、この分子は反応に重大に干渉し
ないが、反応により製造されたＤＮＡを少なくとも１回
のそれぞれのサイクルで検出可能および測定可能にす
る。典型的なレポーター分子は臭化エチジウムであり、
これは紫外線または青緑光で励起された場合、２本鎖Ｄ
ＮＡ中へインターカレーションする際に著しく強い蛍光
を示すが、試薬系中で溶解して遊離している場合には著
しく弱い蛍光を示す。他の蛍光インターカレーション染
料もこの方法で使用される。たとえばＴＯＰＲＯ染料で
ある。実際に、干渉を引き起こさずに反応混合物中に残
ることができ、この反応により製造されたＤＮＡを破壊
せずに測定することができる全てのＤＮＡ検出分子系も
使用することができる。本発明の１実施態様において、
蛍光インターカレーション染料は、前記の複製連鎖反応
により製造された延長プロダクト中へ組み込まれた場
合、適当に励起される際に検出可能な信号を発し、核酸
分子の最終的な所望の濃度を確定するのに充分な、それ
ぞれ少なくとも変性および延長期間を有するサイクル数
についての前記反応混合物を熱的にサイクル処理し、お
よびそれぞれのサイクルの少なくとも延長期の間に前記
の反応混合物を励起させることができる。さらにこの方
法は、サイクルのそれぞれの少なくとも延長期の間の信
号の強度（Ｉ）を検出および測定する工程、この強度を
ｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、それぞれのサイクル
の延長期のそれぞれのモル濃度値を記憶する工程；およ
び前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対
サイクル数の測定された曲線を作成する工程を有する。
信号強度の測定値のモル濃度への変換は、ＰＣＲ試料
を、ブランクからＰＣＲにより製造されるような濃度範
囲にわたるｄｓＤＮＡの多様な既知のモル濃度を除いて
同量の全ての同じ材料を含有する標準のＤＮＡ溶液と置
き換える通常の方法を用いることにより行うことができ
る。ブランクの信号を既知の測光標準に関して測定され
た信号から引き算し、その際、ブランクバックグランド
について補正した測定シグナルを鋳型ｄｓＤＮＡのモル
濃度と関連させて検量線を作成する。この検量線を準備
するためにＰＣＲを実施する必要はない。ＤＮＡの既知
のモル濃度を有する測光標準溶液が必要とされることの
全てである。
【００１９】次に、使用すべきＰＣＲについての成長曲
線パラメータｅsｅv、およびａが、鋳型ＤＮＡの既知の
初期濃度を有する１つ以上の標準試料に関するＰＣＲを
実施する際およびこれらのＰＣＲ成長曲線の記録の際に
既にわかっていない場合に、これらのパラメータは測定
される。既知の初期プライマー濃度Ｃpoおよび既知の出
発鋳型濃度Ｃoを用い、３変数逐次近似法を用いて、測
定された成長曲線と、次の関係式に従って計算された成
長曲線との間で最良に適合する変数ｅs、ｅvおよびａを
測定する：
線パラメータｅsｅv、およびａが、鋳型ＤＮＡの既知の
初期濃度を有する１つ以上の標準試料に関するＰＣＲを
実施する際およびこれらのＰＣＲ成長曲線の記録の際に
既にわかっていない場合に、これらのパラメータは測定
される。既知の初期プライマー濃度Ｃpoおよび既知の出
発鋳型濃度Ｃoを用い、３変数逐次近似法を用いて、測
定された成長曲線と、次の関係式に従って計算された成
長曲線との間で最良に適合する変数ｅs、ｅvおよびａを
測定する：
【００２０】
【数１０】
【００２１】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度
であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳
型の確率であり；ｅsは、理論上、完全に合成される鋳
型の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモ
ル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある。］ 最終的に、未知の試料中のＤＮＡ鋳型の出発モル濃度
は、既知の標準に関するＰＣＲについてと同様の条件下
で同様のＰＣＲを実施し、成長曲線を記録することによ
り行われる。前記の同じ関係式を用いて、既知の標準試
料に関して測定したｅv、ｅsおよびａに付いての値を、
既知の初期プライマー濃度Ｃpoと一緒に前記の同じ関係
式に代入し、未知の初期プライマー濃度Ｃoを変化さ
せ、その際、計算された理論的に生成された成長曲線と
それぞれ測定された成長曲線との間で最良の適合を得る
ために１変数逐次近似が実施される。最良の適合を提供
するこの変数Ｃoが結果として得られる。
回のサイクルの延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度
であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳
型の確率であり；ｅsは、理論上、完全に合成される鋳
型の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモ
ル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある。］ 最終的に、未知の試料中のＤＮＡ鋳型の出発モル濃度
は、既知の標準に関するＰＣＲについてと同様の条件下
で同様のＰＣＲを実施し、成長曲線を記録することによ
り行われる。前記の同じ関係式を用いて、既知の標準試
料に関して測定したｅv、ｅsおよびａに付いての値を、
既知の初期プライマー濃度Ｃpoと一緒に前記の同じ関係
式に代入し、未知の初期プライマー濃度Ｃoを変化さ
せ、その際、計算された理論的に生成された成長曲線と
それぞれ測定された成長曲線との間で最良の適合を得る
ために１変数逐次近似が実施される。最良の適合を提供
するこの変数Ｃoが結果として得られる。
【００２２】計算された成長曲線と測定された成長曲線
との間の最良の適合を決定する方法は、測定されたそれ
ぞれのサイクルでの測定されたモル濃度と計算されたモ
ル濃度との間の差、この差の２乗およびこの差の２乗の
和を得ることができる。次にこの２乗の和を最小にする
ためにパラメータを変える。等しい結果を得る全ての方
法が行われる。
との間の最良の適合を決定する方法は、測定されたそれ
ぞれのサイクルでの測定されたモル濃度と計算されたモ
ル濃度との間の差、この差の２乗およびこの差の２乗の
和を得ることができる。次にこの２乗の和を最小にする
ためにパラメータを変える。等しい結果を得る全ての方
法が行われる。
【００２３】測定成長曲線と計算成長曲線との間の適合
の質は、この差の２乗の平均をどのようにして小さくす
ることができるかにより測定される。有効な尺度は適合
の平均２乗誤差平方根またはＲＭＳ誤差である。これは
差の２乗の和を、適合に含まれるサイクル数により割り
算し、この結果の平方根がとられることにより決定され
る。
の質は、この差の２乗の平均をどのようにして小さくす
ることができるかにより測定される。有効な尺度は適合
の平均２乗誤差平方根またはＲＭＳ誤差である。これは
差の２乗の和を、適合に含まれるサイクル数により割り
算し、この結果の平方根がとられることにより決定され
る。
【００２４】こうして決定されたＲＭＳ誤差が使用した
測定方法のノイズに等しい濃度にほぼ等しい適合が、作
成することができる最良の質の適合である。この精度は
主に測定ノイズにより決定され、このアルゴリズムの理
論的精度により決定されるものではない。
測定方法のノイズに等しい濃度にほぼ等しい適合が、作
成することができる最良の質の適合である。この精度は
主に測定ノイズにより決定され、このアルゴリズムの理
論的精度により決定されるものではない。
【００２５】実際のこの方法において運転すべきサイク
ル数は、関心物質の最小の出発濃度を有する試料につい
てそれぞれのサイクルの終わりで鋳型濃度を測定するた
めにどのような方法が用いられても、鋳型分子のモル濃
度を前記の検出可能な限界の値にまで上昇させるために
少なくとも十分であるべきである。これよりも多いサイ
クル数はより良い結果をもたらすが、いったん鋳型ＤＮ
Ａのモル濃度がそれぞれのサイクルにおいて明らかに増
加しなくなればサイクルの増加の恩恵は減少する。
ル数は、関心物質の最小の出発濃度を有する試料につい
てそれぞれのサイクルの終わりで鋳型濃度を測定するた
めにどのような方法が用いられても、鋳型分子のモル濃
度を前記の検出可能な限界の値にまで上昇させるために
少なくとも十分であるべきである。これよりも多いサイ
クル数はより良い結果をもたらすが、いったん鋳型ＤＮ
Ａのモル濃度がそれぞれのサイクルにおいて明らかに増
加しなくなればサイクルの増加の恩恵は減少する。
【００２６】この発明のもう一つの実施態様において、
適当な緩衝剤、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチド
プライマー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホス
ファート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル
濃度のターゲット核酸分子を含有する反応混合物中での
複製連鎖反応の期待された妥当性をリアルタイムで評価
するための新規の改良された自動化された装置が提供さ
れる。この２種類のプライマーは既知のモル濃度
（Ｃpo）で提供され、レポーター分子の少なくとも１つ
の適当な濃度は、複製連鎖反応により製造される延長プ
ロダクト中へインターカレーションする場合に適当に励
起される際に検出可能な信号を放射することができる。
この装置は、それぞれ少なくとも変性およびアニーリン
グ／延長期間を有し、核酸の所望の最終濃度を確定する
のに十分であるサイクル数で、反応混合物を熱的にサイ
クル処理するための熱的サイクル装置を有している。検
出システムは、少なくともそれぞれのサイクルの延長期
の間に反応混合物を励起させるための手段と、少なくと
も前記サイクルのそれぞれの延長期の間に信号の強度
（Ｉ）を検出および測定する手段とを有している。マイ
クロコンピューターは、そこからの信号を受信し、およ
び混合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、前記サ
イクルのそれぞれの延長期のそれぞれのモル濃度値を記
憶するために検出システムと接続される。ユーザーイン
ターフェースは、ユーザーの指示を入力しおよび結果の
情報を表示するためにコンピューターおよび熱的サイク
ル装置と接続される。このコンピューターは、前記の記
憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数
の測定された曲線を作成する手段と、次の関係式により
理論的モデル曲線に対する測定された曲線の最良の適合
を提供する特性パラメータ変数のｅv、ｅsおよびａを決
定するための逐次近似法を用いるための手段とを有して
いる：
適当な緩衝剤、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチド
プライマー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホス
ファート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル
濃度のターゲット核酸分子を含有する反応混合物中での
複製連鎖反応の期待された妥当性をリアルタイムで評価
するための新規の改良された自動化された装置が提供さ
れる。この２種類のプライマーは既知のモル濃度
（Ｃpo）で提供され、レポーター分子の少なくとも１つ
の適当な濃度は、複製連鎖反応により製造される延長プ
ロダクト中へインターカレーションする場合に適当に励
起される際に検出可能な信号を放射することができる。
この装置は、それぞれ少なくとも変性およびアニーリン
グ／延長期間を有し、核酸の所望の最終濃度を確定する
のに十分であるサイクル数で、反応混合物を熱的にサイ
クル処理するための熱的サイクル装置を有している。検
出システムは、少なくともそれぞれのサイクルの延長期
の間に反応混合物を励起させるための手段と、少なくと
も前記サイクルのそれぞれの延長期の間に信号の強度
（Ｉ）を検出および測定する手段とを有している。マイ
クロコンピューターは、そこからの信号を受信し、およ
び混合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、前記サ
イクルのそれぞれの延長期のそれぞれのモル濃度値を記
憶するために検出システムと接続される。ユーザーイン
ターフェースは、ユーザーの指示を入力しおよび結果の
情報を表示するためにコンピューターおよび熱的サイク
ル装置と接続される。このコンピューターは、前記の記
憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数
の測定された曲線を作成する手段と、次の関係式により
理論的モデル曲線に対する測定された曲線の最良の適合
を提供する特性パラメータ変数のｅv、ｅsおよびａを決
定するための逐次近似法を用いるための手段とを有して
いる：
【００２７】
【数１１】
【００２８】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期の間に測定されたＤＮＡターゲッ
トモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで
残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、合
成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出発ターゲ
ット核酸分子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマ
ーモル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相補的
鎖の競合係数である。］ 本発明の実施態様により、検出システムはサイクルのそ
れぞれのアニール／延長期の期間の間に反応混合物から
蛍光を測定するためのフルオリメーター（fluorimete
r）を備えている。
回のサイクルの延長期の間に測定されたＤＮＡターゲッ
トモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで
残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、合
成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出発ターゲ
ット核酸分子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマ
ーモル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相補的
鎖の競合係数である。］ 本発明の実施態様により、検出システムはサイクルのそ
れぞれのアニール／延長期の期間の間に反応混合物から
蛍光を測定するためのフルオリメーター（fluorimete
r）を備えている。
【００２９】本発明のもう一つの実施態様により、この
装置はさらに、反応管中の反応混合物とフルオリメータ
ーとの間に光ファイバ結合接続装置を備えている。
装置はさらに、反応管中の反応混合物とフルオリメータ
ーとの間に光ファイバ結合接続装置を備えている。
【００３０】複製連鎖反応の間の２本鎖ＤＮＡプロダク
ト（ｄｓＤＮＡ）の成長曲線を独自に記載する式または
等式は、いったんｄｓＤＮＡの実際の成長曲線と適合す
るが、未知の期間においてｄｓＤＮＡ濃度を測定するた
めの曲線のその未知の期間に対して外挿するために使用
することができる。この反応の特異性は検証することも
でき、ターゲットＤＮＡの出発濃度を確かめることもで
き、著しい数のＰＣＲを以上の反応条件のためにスクリ
ーニングすることもでき、全ては熱的サイクル装置中の
特別なＤＮＡターゲットについての成長曲線を予想する
ために、ＰＣＲの間のｄｓＤＮＡの実際の成長速度を比
較することにより可能である。
ト（ｄｓＤＮＡ）の成長曲線を独自に記載する式または
等式は、いったんｄｓＤＮＡの実際の成長曲線と適合す
るが、未知の期間においてｄｓＤＮＡ濃度を測定するた
めの曲線のその未知の期間に対して外挿するために使用
することができる。この反応の特異性は検証することも
でき、ターゲットＤＮＡの出発濃度を確かめることもで
き、著しい数のＰＣＲを以上の反応条件のためにスクリ
ーニングすることもでき、全ては熱的サイクル装置中の
特別なＤＮＡターゲットについての成長曲線を予想する
ために、ＰＣＲの間のｄｓＤＮＡの実際の成長速度を比
較することにより可能である。
【００３１】本発明の実施態様において、適当な緩衝
液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファー
ト、ＤＮＡポリメラーゼおよび前記の未知の出発モル濃
度のターゲット核酸分子を含有し、２種類のプライマー
は既知の濃度（Ｃpo）で準備される試料反応混合物中の
複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の未知の出
発モル濃度を決定するための方法が提供され、その際、
前記の方法は、反応に重大に干渉せず、かつ２本鎖ＤＮ
Ａの不在では著しい信号を発しないが、反応により製造
されたｄｓＤＮＡを少なくとも１回のそれぞれのサイク
ルで検出および測定可能にするリポーター分子を添加す
る工程と、およびターゲット核酸分子の既知の出発モル
濃度で１種以上の成長曲線を得るための既知の出発モル
濃度のターゲット核酸分子を有することを除いて実際に
あらゆる点において同じである１つ以上の標準反応混合
物を熱的サイクル処理する工程とを包含する。この方法
は、さらに、少なくともそれぞれのサイクルの延長期の
間に反応混合物を励起させる工程、少なくともサイクル
のそれぞれの延長期の間に信号の強度を検出および測定
する工程、この強度をｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し
かつサイクルの延長期のそれぞれのモル濃度値を記憶す
る工程、および記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル
濃度対サイクル数の測定された曲線を作成する工程を包
含する。次の工程は、次の関係式：
液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファー
ト、ＤＮＡポリメラーゼおよび前記の未知の出発モル濃
度のターゲット核酸分子を含有し、２種類のプライマー
は既知の濃度（Ｃpo）で準備される試料反応混合物中の
複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の未知の出
発モル濃度を決定するための方法が提供され、その際、
前記の方法は、反応に重大に干渉せず、かつ２本鎖ＤＮ
Ａの不在では著しい信号を発しないが、反応により製造
されたｄｓＤＮＡを少なくとも１回のそれぞれのサイク
ルで検出および測定可能にするリポーター分子を添加す
る工程と、およびターゲット核酸分子の既知の出発モル
濃度で１種以上の成長曲線を得るための既知の出発モル
濃度のターゲット核酸分子を有することを除いて実際に
あらゆる点において同じである１つ以上の標準反応混合
物を熱的サイクル処理する工程とを包含する。この方法
は、さらに、少なくともそれぞれのサイクルの延長期の
間に反応混合物を励起させる工程、少なくともサイクル
のそれぞれの延長期の間に信号の強度を検出および測定
する工程、この強度をｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し
かつサイクルの延長期のそれぞれのモル濃度値を記憶す
る工程、および記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル
濃度対サイクル数の測定された曲線を作成する工程を包
含する。次の工程は、次の関係式：
【００３２】
【数１２】
【００３３】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡ鋳型モ
ル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存
する鋳型の確率であり；ｅsは、理論上、合成される鋳
型の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモ
ル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある］により測定された曲線と前記の１つ以上の公知の
成長曲線との最良の適合を提供する変数ｅv、ｅsおよび
ａを測定しながら逐次近似法を用いて、次にそれぞれ未
知の試料の測定された成長曲線に対する最良の適合を得
るために、ｅv、ｅsおよびａを固定し、出発濃度Ｃoを
調節することにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を
計算する工程である。
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡ鋳型モ
ル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存
する鋳型の確率であり；ｅsは、理論上、合成される鋳
型の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモ
ル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある］により測定された曲線と前記の１つ以上の公知の
成長曲線との最良の適合を提供する変数ｅv、ｅsおよび
ａを測定しながら逐次近似法を用いて、次にそれぞれ未
知の試料の測定された成長曲線に対する最良の適合を得
るために、ｅv、ｅsおよびａを固定し、出発濃度Ｃoを
調節することにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を
計算する工程である。
【００３４】本発明のもう一つの実施態様において、適
当な緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプ
ライマーモル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファ
ート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度
のターゲット核酸分子からなり、その際、２種類のプラ
イマーは既知の濃度（Ｃpo）で準備される試料反応混合
物中で、複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の
未知の出発モル濃度を測定するための方法が提供され、
その際、前記の方法は、反応に重大に干渉せずかつ２本
鎖ＤＮＡの不在で著しい信号を発しないが、反応により
製造されたｄｓＤＮＡを少なくとも１回のそれぞれのサ
イクルで検出可能および測定可能にするリポーター分子
を添加する工程、核酸分子の所望な最終濃度を確定する
ために十分な少なくとも変性および延長期をそれぞれ含
んでいるサイクルの数に対して反応混合物を熱的サイク
ル処理する工程、および少なくともそれぞれのサイクル
の延長期の間反応混合物を励起させる工程を包含する。
次の工程は、少なくともそれぞれのサイクルの延長期の
間に信号の強度の検出および測定、この信号のｄｓＤＮ
Ａのモル濃度値への変換およびそれぞれのサイクルのそ
れぞれの延長期についてのモル濃度値の記憶、および記
憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数
の測定された曲線の作成を包含する。次に、逐次近似法
を用いて、次の関係式：
当な緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプ
ライマーモル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファ
ート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度
のターゲット核酸分子からなり、その際、２種類のプラ
イマーは既知の濃度（Ｃpo）で準備される試料反応混合
物中で、複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の
未知の出発モル濃度を測定するための方法が提供され、
その際、前記の方法は、反応に重大に干渉せずかつ２本
鎖ＤＮＡの不在で著しい信号を発しないが、反応により
製造されたｄｓＤＮＡを少なくとも１回のそれぞれのサ
イクルで検出可能および測定可能にするリポーター分子
を添加する工程、核酸分子の所望な最終濃度を確定する
ために十分な少なくとも変性および延長期をそれぞれ含
んでいるサイクルの数に対して反応混合物を熱的サイク
ル処理する工程、および少なくともそれぞれのサイクル
の延長期の間反応混合物を励起させる工程を包含する。
次の工程は、少なくともそれぞれのサイクルの延長期の
間に信号の強度の検出および測定、この信号のｄｓＤＮ
Ａのモル濃度値への変換およびそれぞれのサイクルのそ
れぞれの延長期についてのモル濃度値の記憶、および記
憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数
の測定された曲線の作成を包含する。次に、逐次近似法
を用いて、次の関係式：
【００３５】
【数１３】
【００３６】［式中Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回
のサイクルの延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型
の確率であり；ｅsは、理論上、完全に合成される鋳型
の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル
濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；
ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数であ
り；Ｃzは、ポリメラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａ
zは、ポリメラーゼ酵素の比活性であり；Ｔxは、秒で示
した延長時間であり；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さ
であり；Ｌpは、塩基で示したプライマーの長さであ
る］により測定曲線対理論曲線の最良の適合を提供する
ｅv、ｅs、ａ、ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定
し、次いで、ｎ＝０のサイクルでｅv、ｅs、ａ、ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を変化させることにより未
知の試料の測定された成長曲線と同等の曲線の最良の適
合を得るために出発核酸のモル濃度を計算する。
のサイクルの延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型
の確率であり；ｅsは、理論上、完全に合成される鋳型
の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル
濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；
ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数であ
り；Ｃzは、ポリメラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａ
zは、ポリメラーゼ酵素の比活性であり；Ｔxは、秒で示
した延長時間であり；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さ
であり；Ｌpは、塩基で示したプライマーの長さであ
る］により測定曲線対理論曲線の最良の適合を提供する
ｅv、ｅs、ａ、ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定
し、次いで、ｎ＝０のサイクルでｅv、ｅs、ａ、ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を変化させることにより未
知の試料の測定された成長曲線と同等の曲線の最良の適
合を得るために出発核酸のモル濃度を計算する。
【００３７】他の実施態様において、本発明は、適当な
緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライ
マー、モル過剰量の４種類のヌクレオシドトリホスファ
ート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度
のターゲット核酸分子を含有し、その際、２種類のプラ
イマーは既知の濃度（Ｃpo）で準備される試料反応混合
物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲット核酸分子
の未知の出発モル濃度の測定のための方法において、こ
の方法は、反応に重大に干渉せずかつ２本鎖ＤＮＡの不
在では著しい信号を発しないが、この反応により製造さ
れたｄｓＤＮＡを少なくとも１回のそれぞれのサイクル
で検出可能および測定可能にするレポーター分子を添加
する工程と、実際に、ターゲット核酸分子の既知の出発
モル濃度での１種以上の成長曲線を得るための既知の出
発モル濃度のターゲット核酸分子を有することを除いて
全ての点で同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的
にサイクル処理する工程と、および少なくともそれぞれ
のサイクルの延長期の間で反応混合物を励起させる工程
とからなる方法を提供する。次の工程は、少なくともサ
イクルのそれぞれの延長期の間に信号の強度の検出およ
び測定、この強度のｄｓＤＮＡのモル濃度値への変換お
よびそれぞれのサイクルのそれぞれの延長期についての
モル濃度値の記憶、および記憶された濃度値からｄｓＤ
ＮＡモル濃度対サイクルの測定された曲線の作成を包含
する。次に、逐次近似法を用いて、次の関係式：
緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライ
マー、モル過剰量の４種類のヌクレオシドトリホスファ
ート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度
のターゲット核酸分子を含有し、その際、２種類のプラ
イマーは既知の濃度（Ｃpo）で準備される試料反応混合
物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲット核酸分子
の未知の出発モル濃度の測定のための方法において、こ
の方法は、反応に重大に干渉せずかつ２本鎖ＤＮＡの不
在では著しい信号を発しないが、この反応により製造さ
れたｄｓＤＮＡを少なくとも１回のそれぞれのサイクル
で検出可能および測定可能にするレポーター分子を添加
する工程と、実際に、ターゲット核酸分子の既知の出発
モル濃度での１種以上の成長曲線を得るための既知の出
発モル濃度のターゲット核酸分子を有することを除いて
全ての点で同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的
にサイクル処理する工程と、および少なくともそれぞれ
のサイクルの延長期の間で反応混合物を励起させる工程
とからなる方法を提供する。次の工程は、少なくともサ
イクルのそれぞれの延長期の間に信号の強度の検出およ
び測定、この強度のｄｓＤＮＡのモル濃度値への変換お
よびそれぞれのサイクルのそれぞれの延長期についての
モル濃度値の記憶、および記憶された濃度値からｄｓＤ
ＮＡモル濃度対サイクルの測定された曲線の作成を包含
する。次に、逐次近似法を用いて、次の関係式：
【００３８】
【数１４】
【００３９】［式中Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回
のサイクルの延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型
の確率であり；ｅsは、理論上、完全に合成される鋳型
の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル
濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；
ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数であ
り；Ｃzは、ポリメラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａ
zは、ポリメラーゼ酵素の比活性であり；ｔzは、秒で示
した延長時間であり；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さ
であり；Ｌpは、塩基で示したプライマーの長さであ
る］により１つ以上の公知の成長曲線に対して測定され
た曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、ａ、ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定し、その後、それぞ
れの未知の試料の測定された成長曲線に対する最良の適
合を得るために、ｅv、ｅs、ａ、ｃz（ｎ）およびＡ
z（ｎ）を固定しおよび出発濃度Ｃoを調節することによ
り未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算する。
のサイクルの延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型
の確率であり；ｅsは、理論上、完全に合成される鋳型
の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル
濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；
ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数であ
り；Ｃzは、ポリメラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａ
zは、ポリメラーゼ酵素の比活性であり；ｔzは、秒で示
した延長時間であり；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さ
であり；Ｌpは、塩基で示したプライマーの長さであ
る］により１つ以上の公知の成長曲線に対して測定され
た曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、ａ、ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定し、その後、それぞ
れの未知の試料の測定された成長曲線に対する最良の適
合を得るために、ｅv、ｅs、ａ、ｃz（ｎ）およびＡ
z（ｎ）を固定しおよび出発濃度Ｃoを調節することによ
り未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算する。
【００４０】さらに、本発明の１実施態様により、適当
な緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプラ
イマー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファ
ート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度
のターゲット核酸分子を有し、その際、２種類のプライ
マーは既知のモル濃度（Ｃpo）で提供され、２種類のプ
ライマーまたは４種類のヌクレオシドトリホスファート
の少なくとも１つが、２本鎖ＤＮＡの不在では著しい信
号を発しないが、反応により製造されたｄｓＤＮＡを少
なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能および測定
可能にするレポーター分子で標識されている反応混合物
中の複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムに
評価するための自動装置において、前記の装置は、実際
に、ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を用いて
１つ以上の成長曲線を得るためのターゲット核酸分子の
既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点で同
じである１種以上の標準反応混合物を熱的にサイクル処
理するための熱的サイクル装置と、少なくともそれぞれ
のサイクルの延長期の間に反応混合物を励起させる手段
および少なくとも前記のそれぞれのサイクルの延長期の
間に信号の強度を検出および測定するための手段を包含
する検出システムと、それから信号を受信するため、混
合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換するため、およ
びそれぞれのサイクルのそれぞれの延長期のモル濃度を
記憶するために検出システムと接続されたマイクロコン
ピューターと、ユーザーの指示を入力しかつ得られた結
果を表示するためにコンピューターおよび熱的サイクル
装置に接続されたユーザーインターフェースとを包含す
る装置が提供される。本発明により、このコンピュータ
ーは、記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対サ
イクル数の測定曲線を作成するための手段と、次の関係
式：
な緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプラ
イマー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファ
ート、ＤＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度
のターゲット核酸分子を有し、その際、２種類のプライ
マーは既知のモル濃度（Ｃpo）で提供され、２種類のプ
ライマーまたは４種類のヌクレオシドトリホスファート
の少なくとも１つが、２本鎖ＤＮＡの不在では著しい信
号を発しないが、反応により製造されたｄｓＤＮＡを少
なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能および測定
可能にするレポーター分子で標識されている反応混合物
中の複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムに
評価するための自動装置において、前記の装置は、実際
に、ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を用いて
１つ以上の成長曲線を得るためのターゲット核酸分子の
既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点で同
じである１種以上の標準反応混合物を熱的にサイクル処
理するための熱的サイクル装置と、少なくともそれぞれ
のサイクルの延長期の間に反応混合物を励起させる手段
および少なくとも前記のそれぞれのサイクルの延長期の
間に信号の強度を検出および測定するための手段を包含
する検出システムと、それから信号を受信するため、混
合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換するため、およ
びそれぞれのサイクルのそれぞれの延長期のモル濃度を
記憶するために検出システムと接続されたマイクロコン
ピューターと、ユーザーの指示を入力しかつ得られた結
果を表示するためにコンピューターおよび熱的サイクル
装置に接続されたユーザーインターフェースとを包含す
る装置が提供される。本発明により、このコンピュータ
ーは、記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度対サ
イクル数の測定曲線を作成するための手段と、次の関係
式：
【００４１】
【数１５】
【００４２】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
完全に合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出
発ターゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発
プライマーモル濃度であり；ａは、理論上、プライマー
／相補的鎖の競合係数である］による１つ以上の成長曲
線に対する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅsお
よびａの特性パラメーター値を決定するための逐次近似
法を用いるための手段と、およびそれぞれの未知の試料
の測定された成長曲線に対する最良の適合を得るため
に、ｅv、ｅsおよびａを固定し、出発濃度Ｃoを調節す
ることにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算す
るために提供される手段を包含する。
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
完全に合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出
発ターゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発
プライマーモル濃度であり；ａは、理論上、プライマー
／相補的鎖の競合係数である］による１つ以上の成長曲
線に対する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅsお
よびａの特性パラメーター値を決定するための逐次近似
法を用いるための手段と、およびそれぞれの未知の試料
の測定された成長曲線に対する最良の適合を得るため
に、ｅv、ｅsおよびａを固定し、出発濃度Ｃoを調節す
ることにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算す
るために提供される手段を包含する。
【００４３】本発明は、他の実施態様において、適当な
緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライ
マー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファー
ト、ＤＮＡポリメラーゼおよび未知の出発モル濃度のタ
ーゲット核酸分子を含有し、その際、２種のプライマー
は既知のモル濃度（Ｃpo）で準備され、２種のプライマ
ーまたは４種のヌクレオシドトリホスファートの少なく
とも１種は、２本鎖ＤＮＡの不在では著しい信号を発し
ないがこの反応により製造されたｄｓＤＮＡを少なくと
も１回それぞれのサイクルで検出可能および測定可能に
するレポーター分子により標識されている反応混合物中
の複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで評
価するための自動装置において、前記の装置は、プライ
マーが消耗される核酸分子の所望の最終濃度を確定する
ために十分な、少なくとも変性およびアニーリング／延
長期をそれぞれ有するサイクル数の予備決定のためにこ
の反応混合物を熱的サイクル処理するための熱的サイク
ル装置と、少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間
にこの反応混合物を励起させる手段および少なくともそ
れぞれのサイクルの延長期の間に信号の強度を検出およ
び測定するための手段を包含する検出システムとを包含
する自動装置に向けられる。さらに、この装置は、それ
から信号を受信し、その強度を混合物中のｄｓＤＮＡの
モル濃度値に変換し、それぞれのサイクルのそれぞれの
延長期についてのモル濃度値を記憶するための検出シス
テムに接続されたマイクロコンピューターと、ユーザー
の指示を入力し、その結果の情報を表示するためのコン
ピューターおよび熱的サイクル装置に接続されたユーザ
ーインターフェースとを包含する。このコンピューター
は、前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度
対サイクル数の測定曲線を作成するための手段と、次の
関係式：
緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライ
マー、モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファー
ト、ＤＮＡポリメラーゼおよび未知の出発モル濃度のタ
ーゲット核酸分子を含有し、その際、２種のプライマー
は既知のモル濃度（Ｃpo）で準備され、２種のプライマ
ーまたは４種のヌクレオシドトリホスファートの少なく
とも１種は、２本鎖ＤＮＡの不在では著しい信号を発し
ないがこの反応により製造されたｄｓＤＮＡを少なくと
も１回それぞれのサイクルで検出可能および測定可能に
するレポーター分子により標識されている反応混合物中
の複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで評
価するための自動装置において、前記の装置は、プライ
マーが消耗される核酸分子の所望の最終濃度を確定する
ために十分な、少なくとも変性およびアニーリング／延
長期をそれぞれ有するサイクル数の予備決定のためにこ
の反応混合物を熱的サイクル処理するための熱的サイク
ル装置と、少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間
にこの反応混合物を励起させる手段および少なくともそ
れぞれのサイクルの延長期の間に信号の強度を検出およ
び測定するための手段を包含する検出システムとを包含
する自動装置に向けられる。さらに、この装置は、それ
から信号を受信し、その強度を混合物中のｄｓＤＮＡの
モル濃度値に変換し、それぞれのサイクルのそれぞれの
延長期についてのモル濃度値を記憶するための検出シス
テムに接続されたマイクロコンピューターと、ユーザー
の指示を入力し、その結果の情報を表示するためのコン
ピューターおよび熱的サイクル装置に接続されたユーザ
ーインターフェースとを包含する。このコンピューター
は、前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃度
対サイクル数の測定曲線を作成するための手段と、次の
関係式：
【００４４】
【数１６】
【００４５】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出発ター
ゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃzは、ポリメラー
ゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ酵素の
比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であり；Ｌt
は、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で示
したプライマーの長さであり；Ｃpoは、出発プライマー
モル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖
の競合係数である］による理論モデル曲線に対する測定
曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）
およびＡz（ｎ）の特性パラメーター値を決定するため
に逐次近似法を用いるための手段と、さらに、未知の試
料の測定された成長曲線と同等の曲線の最良の適合を得
るためにｎ＝０のサイクルでｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）
およびＡz（ｎ）およびＣoの値を変化させることにより
出発核酸のモル濃度を計算するために提供される手段と
を包含する。
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出発ター
ゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃzは、ポリメラー
ゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ酵素の
比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であり；Ｌt
は、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で示
したプライマーの長さであり；Ｃpoは、出発プライマー
モル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖
の競合係数である］による理論モデル曲線に対する測定
曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）
およびＡz（ｎ）の特性パラメーター値を決定するため
に逐次近似法を用いるための手段と、さらに、未知の試
料の測定された成長曲線と同等の曲線の最良の適合を得
るためにｎ＝０のサイクルでｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）
およびＡz（ｎ）およびＣoの値を変化させることにより
出発核酸のモル濃度を計算するために提供される手段と
を包含する。
【００４６】他の実施態様として、本発明は、適当な緩
衝液、２種対の相補的オリゴヌクレオチドプライマー、
モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファート、Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよび未知の出発モル濃度のターゲッ
ト核酸分子を含有し、その際、２種類のプライマーは既
知のモル濃度（Ｃpo）で準備され、２種類のプライマー
または４種対のヌクレオシドトリホスファートの少なく
とも１種類は、２本鎖ＤＮＡの不在で著しい信号を発さ
ないが、この反応により製造されたｄｓＤＮＡを少なく
とも１回のそれぞれのサイクルで検出可能および測定可
能にするレポーター分子により標識されている反応混合
物中の複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイム
で評価するための自動装置において、前記の装置は、タ
ーゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を用いて１つ以
上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分子の既知
の出発モル濃度を有することを除いて全ての点で実際に
同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的にサイクル
処理するための熱的サイクル装置と、少なくともそれぞ
れのサイクルの延長期の間に反応混合物を励起させるた
めの手段および少なくともそれぞれのサイクルの延長期
の間にその信号の強度を検出および測定するための手段
を包含する検出システムとを包含する自動装置に向けら
れる。さらに、この装置は、この信号をこの混合物中の
ｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、かつそれぞれのサイ
クルのそれぞれの延長期についてのモル濃度値を記憶す
るための前記検出システムに接続されたマイクロコンピ
ューターと、ユーザーの指示を入力しかつ結果の情報を
表示するためのコンピューターおよび熱的サイクル装置
に接続されたユーザーインターフェースとを包含する。
前記のコンピューターは、前記の記憶された濃度値から
ｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数の測定曲線を作成す
るための手段と、次の関係式：
衝液、２種対の相補的オリゴヌクレオチドプライマー、
モル過剰量の４種のヌクレオシドトリホスファート、Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよび未知の出発モル濃度のターゲッ
ト核酸分子を含有し、その際、２種類のプライマーは既
知のモル濃度（Ｃpo）で準備され、２種類のプライマー
または４種対のヌクレオシドトリホスファートの少なく
とも１種類は、２本鎖ＤＮＡの不在で著しい信号を発さ
ないが、この反応により製造されたｄｓＤＮＡを少なく
とも１回のそれぞれのサイクルで検出可能および測定可
能にするレポーター分子により標識されている反応混合
物中の複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイム
で評価するための自動装置において、前記の装置は、タ
ーゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を用いて１つ以
上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分子の既知
の出発モル濃度を有することを除いて全ての点で実際に
同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的にサイクル
処理するための熱的サイクル装置と、少なくともそれぞ
れのサイクルの延長期の間に反応混合物を励起させるた
めの手段および少なくともそれぞれのサイクルの延長期
の間にその信号の強度を検出および測定するための手段
を包含する検出システムとを包含する自動装置に向けら
れる。さらに、この装置は、この信号をこの混合物中の
ｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、かつそれぞれのサイ
クルのそれぞれの延長期についてのモル濃度値を記憶す
るための前記検出システムに接続されたマイクロコンピ
ューターと、ユーザーの指示を入力しかつ結果の情報を
表示するためのコンピューターおよび熱的サイクル装置
に接続されたユーザーインターフェースとを包含する。
前記のコンピューターは、前記の記憶された濃度値から
ｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数の測定曲線を作成す
るための手段と、次の関係式：
【００４７】
【数１７】
【００４８】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出発ター
ゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃzは、ポリメラー
ゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ酵素の
比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であり；Ｌt
は、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で示
したプライマーの長さであり；Ｃpoは、出発プライマー
モル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖
の競合係数である］による前記の１つ以上の既知の成長
曲線に対する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、
ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の特性パラメータ
ー値を決定するために逐次近似法を用いるための手段
と、さらに、それぞれの未知の試料の測定された成長曲
線に対する最良の適合を得るために、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定し、出発濃度Ｃoを調節
することにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算
するために提供される手段とを包含する。
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出発ター
ゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃzは、ポリメラー
ゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ酵素の
比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であり；Ｌt
は、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で示
したプライマーの長さであり；Ｃpoは、出発プライマー
モル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖
の競合係数である］による前記の１つ以上の既知の成長
曲線に対する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、
ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の特性パラメータ
ー値を決定するために逐次近似法を用いるための手段
と、さらに、それぞれの未知の試料の測定された成長曲
線に対する最良の適合を得るために、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定し、出発濃度Ｃoを調節
することにより未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算
するために提供される手段とを包含する。
【００４９】本発明の特徴とされるおよび有利な多様な
対象は、特許請求の範囲および添付の図面と関連させる
場合、次の詳細な記載の参照からより明らかになる。
対象は、特許請求の範囲および添付の図面と関連させる
場合、次の詳細な記載の参照からより明らかになる。
【００５０】図面の記載 図１は、Higuchi et alの文献からとられたデータにつ
いての蛍光対サイクル数のグラフを表す。
いての蛍光対サイクル数のグラフを表す。
【００５１】図２は、出発コピー１００μｌあたり１０
8個のＨＩＶｓｓＤＮＡが存在する図１で示された曲線
の一つについての濃度対サイクル数のグラフを表す。
8個のＨＩＶｓｓＤＮＡが存在する図１で示された曲線
の一つについての濃度対サイクル数のグラフを表す。
【００５２】図３は、本発明の方法により計算された、
Higuchi et alのデータについての計算された出発コピ
ー対実際の出発コピーのグラフを表す。
Higuchi et alのデータについての計算された出発コピ
ー対実際の出発コピーのグラフを表す。
【００５３】図４は、本発明による装置の略図を表す。
【００５４】本発明の有利な実施態様の記載 本発明の有利な実施態様により、適当な緩衝液、２つの
相補的種類のオリゴヌクレオチドプライマー、モル過剰
量の４種のヌクレオシドトリホスファート、ＤＮＡポリ
メラーゼ、および未知の出発モル濃度のターゲット核酸
分子を含有する試料反応混合物中の複製連鎖反応の開始
時に、ターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定
するための自動化された方法が提供される。この方法
は、既知の濃度のいかなる標準の使用も必要としない。
この方法は、有利に、蛍光検出部材と接続され、かつ通
常マイクロソフト（登録商標）エクセルのようなスプレ
ッドシートプログラムを用いてプログラムされたマイク
ロプロセッサーを備えた自動化された熱的サイクル装置
により自動的に実施される。この反応混合物は既知の容
量の緩衝液および実際にモル過剰量のｄＮＴＰｓを含有
する。反応混合物中のこの２種類のプライマーは、特
に、ＰＣＲプロトコルの最終サイクルの間に消費される
ようにあらかじめ決定された既知のモル濃度（Ｃpo）で
準備される。この方法は、次の工程からなる： ａ） ２種類のプライマーまたは４種類のヌクレオシド
トリホスファートの少なくとも１種を、前記の複製連鎖
反応により製造された延長プロダクトに組み込まれる場
合には適当に励起される際に検出可能な信号を発するこ
とができるレポーター分子で標識する、つまり、反応に
重大に干渉せず、かつ２本鎖ＤＮＡの不在で著しい信号
を発しないが、この反応により製造されたｄｓＤＮＡを
少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能および測
定可能にするレポーター分子を添加する工程； ｂ） あらかじめ決定されたサイクル数についてこの反
応混合物を熱的にサイクル処理し、その際それぞれのサ
イクルは核酸分子の所望の最終濃度を確定するのに十分
な少なくとも変性および延長期を有する工程； ｃ） それぞれのサイクルの延長期の少なくとも一部の
間にこの反応混合物を励起させ、その結果、延長プロダ
クトに結合したそれぞれのリポーター分子により信号は
発せられる工程； ｄ） 前記のそれぞれのサイクルの延長期の少なくとも
前記の一部の間にこの信号の強度を検出および測定する
工程； ｅ） マイクロプロセッサーにおいてこの強度信号をｄ
ｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、メモリー中に、それぞ
れの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期について
モル濃度値を記憶させる工程； ｆ） 前記のメモリー中に記憶された前記の濃度値か
ら、前記のマイクロプロセッサー中でｄｓＤＮＡのモル
濃度対サイクル数の測定曲線を作成する； ｇ） 前記のマイクロプロセッサーにおいてスプレッド
シートプログラムで逐次近似法を用いることで、次の関
係式：
相補的種類のオリゴヌクレオチドプライマー、モル過剰
量の４種のヌクレオシドトリホスファート、ＤＮＡポリ
メラーゼ、および未知の出発モル濃度のターゲット核酸
分子を含有する試料反応混合物中の複製連鎖反応の開始
時に、ターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定
するための自動化された方法が提供される。この方法
は、既知の濃度のいかなる標準の使用も必要としない。
この方法は、有利に、蛍光検出部材と接続され、かつ通
常マイクロソフト（登録商標）エクセルのようなスプレ
ッドシートプログラムを用いてプログラムされたマイク
ロプロセッサーを備えた自動化された熱的サイクル装置
により自動的に実施される。この反応混合物は既知の容
量の緩衝液および実際にモル過剰量のｄＮＴＰｓを含有
する。反応混合物中のこの２種類のプライマーは、特
に、ＰＣＲプロトコルの最終サイクルの間に消費される
ようにあらかじめ決定された既知のモル濃度（Ｃpo）で
準備される。この方法は、次の工程からなる： ａ） ２種類のプライマーまたは４種類のヌクレオシド
トリホスファートの少なくとも１種を、前記の複製連鎖
反応により製造された延長プロダクトに組み込まれる場
合には適当に励起される際に検出可能な信号を発するこ
とができるレポーター分子で標識する、つまり、反応に
重大に干渉せず、かつ２本鎖ＤＮＡの不在で著しい信号
を発しないが、この反応により製造されたｄｓＤＮＡを
少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能および測
定可能にするレポーター分子を添加する工程； ｂ） あらかじめ決定されたサイクル数についてこの反
応混合物を熱的にサイクル処理し、その際それぞれのサ
イクルは核酸分子の所望の最終濃度を確定するのに十分
な少なくとも変性および延長期を有する工程； ｃ） それぞれのサイクルの延長期の少なくとも一部の
間にこの反応混合物を励起させ、その結果、延長プロダ
クトに結合したそれぞれのリポーター分子により信号は
発せられる工程； ｄ） 前記のそれぞれのサイクルの延長期の少なくとも
前記の一部の間にこの信号の強度を検出および測定する
工程； ｅ） マイクロプロセッサーにおいてこの強度信号をｄ
ｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、メモリー中に、それぞ
れの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期について
モル濃度値を記憶させる工程； ｆ） 前記のメモリー中に記憶された前記の濃度値か
ら、前記のマイクロプロセッサー中でｄｓＤＮＡのモル
濃度対サイクル数の測定曲線を作成する； ｇ） 前記のマイクロプロセッサーにおいてスプレッド
シートプログラムで逐次近似法を用いることで、次の関
係式：
【００５５】
【数１８】
【００５６】［式中、ｎはＰＣＲにおけるｎ回のサイク
ル数を表し、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイ
クルの延長期間の間に測定されたＤＮＡ鋳型モル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型
の確率であり；ｅsは、理論上、合成される鋳型の確率
であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル濃度で
あり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；ａは、
理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数である］に対
しする測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、Ｃo
およびａの値を決定する工程； ｈ） ｎ＝０（Ｃo）のサイクルで出発核酸分子のモル
濃度を表示する工程；からなる。
ル数を表し、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイ
クルの延長期間の間に測定されたＤＮＡ鋳型モル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型
の確率であり；ｅsは、理論上、合成される鋳型の確率
であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル濃度で
あり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；ａは、
理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数である］に対
しする測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、Ｃo
およびａの値を決定する工程； ｈ） ｎ＝０（Ｃo）のサイクルで出発核酸分子のモル
濃度を表示する工程；からなる。
【００５７】本発明による装置は、図４に略図として示
されている。この装置１０は、ＰＣＲ反応混合物を有す
る複数の管１６を保持するための複数のくぼみ１４を有
するコンピューター制御された熱的サイクル装置１２、
マイクロコンピューター１８、熱的サイクル装置１２中
のくぼみ１４およびマイクロコンピューター１８と接続
された検出システム２０、および熱的サイクル装置１
２、検出システム２０、およびマイクロコンピューター
との間のユーザーインターフェース２２からなる。
されている。この装置１０は、ＰＣＲ反応混合物を有す
る複数の管１６を保持するための複数のくぼみ１４を有
するコンピューター制御された熱的サイクル装置１２、
マイクロコンピューター１８、熱的サイクル装置１２中
のくぼみ１４およびマイクロコンピューター１８と接続
された検出システム２０、および熱的サイクル装置１
２、検出システム２０、およびマイクロコンピューター
との間のユーザーインターフェース２２からなる。
【００５８】熱的サイクル装置１２は、Perkin-Elmer社
のシステム９６００（Ｓｙｓｔｅｍ ９６００）のよう
な通常の設計の装置であることができ、これは、この熱
的サイクルブロックのくぼみ１４中の試料管中に９６個
までの反応混合物試料を収容することができる。この管
１６は、一般に、透明なキャップを備えたポリプロピレ
ン管である。この管の上の熱的サイクル装置の蓋は、特
に、検出システムの入力装置を収容および保持するよう
になっている。
のシステム９６００（Ｓｙｓｔｅｍ ９６００）のよう
な通常の設計の装置であることができ、これは、この熱
的サイクルブロックのくぼみ１４中の試料管中に９６個
までの反応混合物試料を収容することができる。この管
１６は、一般に、透明なキャップを備えたポリプロピレ
ン管である。この管の上の熱的サイクル装置の蓋は、特
に、検出システムの入力装置を収容および保持するよう
になっている。
【００５９】検出システム２０は、蛍光標識を意図する
場合、有利に光源、光ファイバーコネクターおよびくぼ
みの先端部とＣＣＤアレーとの間を接続する光チュー
ブ、および適当な信号の増幅装置および光信号のコンピ
ューターへ入力されるデジタルへの変換回路からなり、
これはＨｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌの文献中に使用およ
び記載されたようなデジタルカメラシステムであっても
よい。この検出システムの出力は、データの記憶および
操作のためにコンピューター１８に送られる。
場合、有利に光源、光ファイバーコネクターおよびくぼ
みの先端部とＣＣＤアレーとの間を接続する光チュー
ブ、および適当な信号の増幅装置および光信号のコンピ
ューターへ入力されるデジタルへの変換回路からなり、
これはＨｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌの文献中に使用およ
び記載されたようなデジタルカメラシステムであっても
よい。この検出システムの出力は、データの記憶および
操作のためにコンピューター１８に送られる。
【００６０】検出システムは、有利に、多重フルオリメ
ーター（multiplexed fluorimeter）であり、このフル
オリメーターは、可視光レーザーまたは紫外線ランプで
あっても良い励起光源、光ファイバーチューブおよびコ
ネクターを通して励起光線をここの反応管１６へ分配す
るためまたは反応管１６からの蛍光光線を受信するため
の多重装置、その波長により励起光からの蛍光光線を分
離するフィルター手段、および蛍光光線の強度を測定す
るための検出手段を備えている。この蛍光は、２本鎖Ｄ
ＮＺの存在で著しく蛍光する臭化エチジウムのようなイ
ンターカレーション染料から生じる。それぞれのＰＣＲ
からの蛍光は、それぞれの熱的サイクルのそれぞれの延
長期の終了時に測定される。この信号は、それぞれの試
料管１６中に存在するｄｓＤＮＡのモル濃度の測定のた
めにコンピューター１８中で処理される。それぞれのＰ
ＣＲサイクルのそれぞれの延長期の間にそれぞれの反応
管について測定された一連のＤＮＡ濃度は、コンピュー
ター１８中に記憶される。この測定値対サイクル数は、
それぞれの試料管１６中のＰＣＲについての成長曲線を
構成する。
ーター（multiplexed fluorimeter）であり、このフル
オリメーターは、可視光レーザーまたは紫外線ランプで
あっても良い励起光源、光ファイバーチューブおよびコ
ネクターを通して励起光線をここの反応管１６へ分配す
るためまたは反応管１６からの蛍光光線を受信するため
の多重装置、その波長により励起光からの蛍光光線を分
離するフィルター手段、および蛍光光線の強度を測定す
るための検出手段を備えている。この蛍光は、２本鎖Ｄ
ＮＺの存在で著しく蛍光する臭化エチジウムのようなイ
ンターカレーション染料から生じる。それぞれのＰＣＲ
からの蛍光は、それぞれの熱的サイクルのそれぞれの延
長期の終了時に測定される。この信号は、それぞれの試
料管１６中に存在するｄｓＤＮＡのモル濃度の測定のた
めにコンピューター１８中で処理される。それぞれのＰ
ＣＲサイクルのそれぞれの延長期の間にそれぞれの反応
管について測定された一連のＤＮＡ濃度は、コンピュー
ター１８中に記憶される。この測定値対サイクル数は、
それぞれの試料管１６中のＰＣＲについての成長曲線を
構成する。
【００６１】コンピューター１８およびユーザーインタ
ーフェース２２は、単一の専用装置であるかまたはキー
ボードおよびビデオモニターを備えた通常市販されてい
るパーソナルコンピューター（ＰＣ）システムであって
も良い。このコンピューター１８およびユーザーインタ
ーフェースは、成長曲線データの表示、コンピューター
中のスプレッドシートプログラムへの命令の入力、成長
曲線データの操作、およびＰＣＲ結果の表示ならびに必
要な熱的サイクル制御の提供のために使用される。この
コンピューター１８は、それぞれのＰＣＲに付いてのモ
デル等式に対する最良の適合を提供する特性パラメータ
を決定するために、多変数最小２乗曲線適合プロセス
（multi-variable least squares curve fitting proce
ss）を実施する。
ーフェース２２は、単一の専用装置であるかまたはキー
ボードおよびビデオモニターを備えた通常市販されてい
るパーソナルコンピューター（ＰＣ）システムであって
も良い。このコンピューター１８およびユーザーインタ
ーフェースは、成長曲線データの表示、コンピューター
中のスプレッドシートプログラムへの命令の入力、成長
曲線データの操作、およびＰＣＲ結果の表示ならびに必
要な熱的サイクル制御の提供のために使用される。この
コンピューター１８は、それぞれのＰＣＲに付いてのモ
デル等式に対する最良の適合を提供する特性パラメータ
を決定するために、多変数最小２乗曲線適合プロセス
（multi-variable least squares curve fitting proce
ss）を実施する。
【００６２】このように、本発明により熱的サイクル処
理の間にＤＮＡのリアルタイムモニタリングは、プライ
マー濃度が消耗してしまうかまたは指数的増幅プロセス
が完成まで続けられないにもかかわらず、ターゲットま
たは鋳型ＤＮＡの出発コピーのモル濃度を予想すること
ができるようにすることが評価される。ＰＣＲプロセス
の間にｄｓＤＮＡプロダクトの成長曲線の形状が、次の
モデルの等式により唯一に決定されることが見出され
た：
理の間にＤＮＡのリアルタイムモニタリングは、プライ
マー濃度が消耗してしまうかまたは指数的増幅プロセス
が完成まで続けられないにもかかわらず、ターゲットま
たは鋳型ＤＮＡの出発コピーのモル濃度を予想すること
ができるようにすることが評価される。ＰＣＲプロセス
の間にｄｓＤＮＡプロダクトの成長曲線の形状が、次の
モデルの等式により唯一に決定されることが見出され
た：
【００６３】
【数１９】
【００６４】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡ鋳型モ
ル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存
する鋳型の確率であり；ｅsは、理論上、合成される鋳
型の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモ
ル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある。］ この等式に従った濃度対サイクル数の成長曲線は独特の
曲線である。特別なＰＣＲのための実際の成長曲線の測
定された値に対して前記の等式を適合させる特性パラメ
ータのｅs、ｅv、ａおよびＣoの唯一の組合せがある。
回のサイクルの延長期間の間に測定されたＤＮＡ鋳型モ
ル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存
する鋳型の確率であり；ｅsは、理論上、合成される鋳
型の確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモ
ル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある。］ この等式に従った濃度対サイクル数の成長曲線は独特の
曲線である。特別なＰＣＲのための実際の成長曲線の測
定された値に対して前記の等式を適合させる特性パラメ
ータのｅs、ｅv、ａおよびＣoの唯一の組合せがある。
【００６５】パラメータｅsは、テンプレートｓｓＤＮ
ＡをｄｓＤＮＡにする合成の有効性の尺度として表すこ
とができる。パラメータｅvは、サイクルから次のサイ
クルまで残存するテンプレートｓｓＤＮＡの有効性の尺
度として表すことができる。この２つのパラメーター
は、主に、（図２において示された成長曲線の直線部分
として表れる）成長曲線の延長期の形状または傾斜を表
す。
ＡをｄｓＤＮＡにする合成の有効性の尺度として表すこ
とができる。パラメータｅvは、サイクルから次のサイ
クルまで残存するテンプレートｓｓＤＮＡの有効性の尺
度として表すことができる。この２つのパラメーター
は、主に、（図２において示された成長曲線の直線部分
として表れる）成長曲線の延長期の形状または傾斜を表
す。
【００６６】この成長曲線の上昇曲線の部分は、ターゲ
ットＤＮＡ断片を得るためにアニーリングするためのプ
ライマーと相補的鎖との間の競合の尺度を意味する期間
により表される。この上昇部分の形状または曲率は、実
際にプライマーおよび酵素が両方とも過剰量である場
合、著しく漸近的曲線である。しかし、プライマー制限
ＰＣＲにおけるように、プライマー濃度が消耗されるこ
とになるように制限されている場合、この曲線部分は同
じ形状を有するが、最終生成物の濃度およびプライマー
の消耗を示すその水平の漸近線に達する。
ットＤＮＡ断片を得るためにアニーリングするためのプ
ライマーと相補的鎖との間の競合の尺度を意味する期間
により表される。この上昇部分の形状または曲率は、実
際にプライマーおよび酵素が両方とも過剰量である場
合、著しく漸近的曲線である。しかし、プライマー制限
ＰＣＲにおけるように、プライマー濃度が消耗されるこ
とになるように制限されている場合、この曲線部分は同
じ形状を有するが、最終生成物の濃度およびプライマー
の消耗を示すその水平の漸近線に達する。
【００６７】本発明を適用することができる通常の適用
の数がある。たとえば、測定されたＰＣＲについて完了
まで、たとえば混合物中の少なくとも１つの反応体の消
耗まで実施する必要はない。これは実施するためにかな
りの数のサイクルが必要なだけであり、その結果、非特
異的な信号のバックグランドのレベルより高い増幅が達
成され、特性パラメーターの値が決定することができ
る。
の数がある。たとえば、測定されたＰＣＲについて完了
まで、たとえば混合物中の少なくとも１つの反応体の消
耗まで実施する必要はない。これは実施するためにかな
りの数のサイクルが必要なだけであり、その結果、非特
異的な信号のバックグランドのレベルより高い増幅が達
成され、特性パラメーターの値が決定することができ
る。
【００６８】通常のスプレッドシートプログラム、たと
えばマイクロソフトエクセルにおけるソルバー「solve
r」の式により用いられる逐次近似法はとくに適してお
り、特性パラメータの唯一のセットについて等式を解く
際に用いられる。アニール／延長期間の間に形成される
全ての感作された１本鎖の合成を完了するために不十分
な酵素活性がある場合、成長曲線は酵素制限されること
になる。
えばマイクロソフトエクセルにおけるソルバー「solve
r」の式により用いられる逐次近似法はとくに適してお
り、特性パラメータの唯一のセットについて等式を解く
際に用いられる。アニール／延長期間の間に形成される
全ての感作された１本鎖の合成を完了するために不十分
な酵素活性がある場合、成長曲線は酵素制限されること
になる。
【００６９】前記したプライマー制限活性は、成長曲線
に関する酵素の制限の効果を含むために延長することが
できる。
に関する酵素の制限の効果を含むために延長することが
できる。
【００７０】これは、このサイクルで存在する酵素活性
により重合されえる塩基の最大数を捜すために並行して
計算されるそれぞれのサイクルの実行により行われる。
により重合されえる塩基の最大数を捜すために並行して
計算されるそれぞれのサイクルの実行により行われる。
【００７１】「単位」で示される既知の初期酵素活性か
ら、初期モル濃度のＣzoが計算される。Ｔａｑポリメラ
ーゼＣzo＝３．５５×１０-10（モル／リットル）／
（単位／１００μＬ）。Ｃzはサイクルの増大とともに
減退する。
ら、初期モル濃度のＣzoが計算される。Ｔａｑポリメラ
ーゼＣzo＝３．５５×１０-10（モル／リットル）／
（単位／１００μＬ）。Ｃzはサイクルの増大とともに
減退する。
【００７２】酵素１モルあたりの１秒あたりの合成され
た塩基のモルで示されるポリメラーゼの特異的活性、Ａ
zは、温度、Ｍｇ2+、および反応プロダクトのピロリン
酸Ｐ2Ｏ7 4-と共に変化する。
た塩基のモルで示されるポリメラーゼの特異的活性、Ａ
zは、温度、Ｍｇ2+、および反応プロダクトのピロリン
酸Ｐ2Ｏ7 4-と共に変化する。
【００７３】この場合、酵素の重量モル濃度Ｃzは明ら
かに変化しないが、特異的活性はピロリン酸の増強によ
り指数的に阻害されると仮定される。このように、
かに変化しないが、特異的活性はピロリン酸の増強によ
り指数的に阻害されると仮定される。このように、
【００７４】
【数２０】
【００７５】［式中、Ａmaxは、阻害されていない特異
的活性を表し、ｋiは、Ａmaxｅ-1での活性をカットする
［Ｐ2Ｏ7］の濃度を表す。
的活性を表し、ｋiは、Ａmaxｅ-1での活性をカットする
［Ｐ2Ｏ7］の濃度を表す。
【００７６】これは重合されたそれぞれの塩基につい
て、ならびに２本鎖の重量モル濃度Ｃnについての１個
のピロリン酸が結果として生じる： ［Ｐ2Ｏ7］＝２（Ｃn−Ｃo）（Ｌt−Ｌp） Ａz（ｎ）がｎと共にどのように変化するかという前期
の仮定を用いてｎ倍のサイクルでの鋳型重量モル濃度の
可能な最大成長は、次の式である：
て、ならびに２本鎖の重量モル濃度Ｃnについての１個
のピロリン酸が結果として生じる： ［Ｐ2Ｏ7］＝２（Ｃn−Ｃo）（Ｌt−Ｌp） Ａz（ｎ）がｎと共にどのように変化するかという前期
の仮定を用いてｎ倍のサイクルでの鋳型重量モル濃度の
可能な最大成長は、次の式である：
【００７７】
【数２１】
【００７８】［式中、ｔxは秒で示した延長時間を表
し、Ｌtは塩基で示した鋳型の長さを表し、Ｌpは塩基で
示したプライマーの長さを表す］ 酵素制限を、前記したプライマー制限ＰＣＲに加える目
的で、増加するそれぞれのサイクルはプライマーまたは
酵素の制限の小さい方である。Ｃn+1の計算は次のよう
に変化する：
し、Ｌtは塩基で示した鋳型の長さを表し、Ｌpは塩基で
示したプライマーの長さを表す］ 酵素制限を、前記したプライマー制限ＰＣＲに加える目
的で、増加するそれぞれのサイクルはプライマーまたは
酵素の制限の小さい方である。Ｃn+1の計算は次のよう
に変化する：
【００７９】
【数２２】
【００８０】次の実施例は、ＰＣＲ法についての本発明
の適用を示す。
の適用を示す。
【００８１】
【実施例】１００μＬあたりＨＩＶｓｓＤＮＡの１０8
個の出発コピーについてのHiguchiet alの文献からの粗
いデータを、リットルあたりのモルに変換し、サイクル
数に対してプロットした。この結果は、図２において示
される実線により図示した。このデータは、コンピュー
ターにも入力され、エクセルスプレッドシートを用い
て、Ｃoを１００μＬの反応容量で１０8個のコピーに相
当する既知のモル濃度に確定した場合に、ｅs、ｅvおよ
びａの最良の適合の値が設定される理論的な等式と比較
した。この結果の曲線を図２の点線として示した。
個の出発コピーについてのHiguchiet alの文献からの粗
いデータを、リットルあたりのモルに変換し、サイクル
数に対してプロットした。この結果は、図２において示
される実線により図示した。このデータは、コンピュー
ターにも入力され、エクセルスプレッドシートを用い
て、Ｃoを１００μＬの反応容量で１０8個のコピーに相
当する既知のモル濃度に確定した場合に、ｅs、ｅvおよ
びａの最良の適合の値が設定される理論的な等式と比較
した。この結果の曲線を図２の点線として示した。
【００８２】図３は計算された初期コピー対未知の初期
コピーのグラフである。これは、標準だけとしての１０
8個の出発コピーについてのHiguchi et alのデータに対
する前記の等式のセットの最良の適合により決定された
唯一のセットのｅs、ｅvおよびａの値を基にしている。
これらの特性パラメータｅs、ｅvおよびａは、この等式
中で固定される。次に、この等式は、エクセルスプレッ
ドシート中で、Higuchi et alの成長データの５つの他
のセットのそれぞれに対する最良の適合を得るためにだ
けＣoを変化させることにより計算された初期コピーを
決定するために用られた。図３は、１０2の初期コピー
での計算された低いコピー数を除いて、この等式に従っ
て、実際の既知の初期コピーと計算された初期コピーの
値との間で、実際に１対１の、著しく接近した一致があ
ることを示している。これは、おそらくは、特異的反応
単独が製造するよりも多くのＤＮＡを製造する重大な付
加的な非特異的反応があることに原因がある。
コピーのグラフである。これは、標準だけとしての１０
8個の出発コピーについてのHiguchi et alのデータに対
する前記の等式のセットの最良の適合により決定された
唯一のセットのｅs、ｅvおよびａの値を基にしている。
これらの特性パラメータｅs、ｅvおよびａは、この等式
中で固定される。次に、この等式は、エクセルスプレッ
ドシート中で、Higuchi et alの成長データの５つの他
のセットのそれぞれに対する最良の適合を得るためにだ
けＣoを変化させることにより計算された初期コピーを
決定するために用られた。図３は、１０2の初期コピー
での計算された低いコピー数を除いて、この等式に従っ
て、実際の既知の初期コピーと計算された初期コピーの
値との間で、実際に１対１の、著しく接近した一致があ
ることを示している。これは、おそらくは、特異的反応
単独が製造するよりも多くのＤＮＡを製造する重大な付
加的な非特異的反応があることに原因がある。
【００８３】ＰＣＲプロダクトの重量モル濃度が、この
モデル関係について保持することを確認できなければな
らないことに注意しなければならない。このように、測
定された蛍光は反応混合物のリットルあたりのモルに変
換できなければならない。プロダクトの濃度の検出およ
び測定のために蛍光を使用する必要はない。蛍光は単に
ここで適用された技術にすぎない。全ての観察可能な技
術および非破壊的に測定可能な現象を使用することもで
きる。
モデル関係について保持することを確認できなければな
らないことに注意しなければならない。このように、測
定された蛍光は反応混合物のリットルあたりのモルに変
換できなければならない。プロダクトの濃度の検出およ
び測定のために蛍光を使用する必要はない。蛍光は単に
ここで適用された技術にすぎない。全ての観察可能な技
術および非破壊的に測定可能な現象を使用することもで
きる。
【００８４】成長曲線形状パラメーターは多様な方法で
適用することができる。既知の濃度の標準を使用して出
発コピー数の正確な定量は前記したように可能である。
既知の濃度を有するターゲットＤＮＡ鋳型のサンプルが
利用できる場合には、１つ以上の成長曲線を得るために
プライマー制限ＰＣＲ中で使用することができる。最初
に、１つ以上のモデル成長曲線を得るために既知の出発
鋳型およびプライマーの濃度を用いてＰＣＲを実施す
る。次に、プライマー制限モデル曲線のデータと成長曲
線のための等式に適合させ、その際、既知の出発鋳型お
よびプライマーの濃度が使用され、３つの特性パラメー
タｅs、ｅvおよびａについての最良に適合する値が決定
される。ついて、鋳型の未知の出発濃度の試料を用いて
同様の条件下でＰＣＲを行い、成長曲線データを記録し
た。この方法を用いて、出発濃度は、Higuchi et alの
方法と比較してより正確に決定することができる。これ
は、成長曲線に沿って１個または数個の点が利用される
のではなく、全ての成長曲線データが利用されるためで
ある。
適用することができる。既知の濃度の標準を使用して出
発コピー数の正確な定量は前記したように可能である。
既知の濃度を有するターゲットＤＮＡ鋳型のサンプルが
利用できる場合には、１つ以上の成長曲線を得るために
プライマー制限ＰＣＲ中で使用することができる。最初
に、１つ以上のモデル成長曲線を得るために既知の出発
鋳型およびプライマーの濃度を用いてＰＣＲを実施す
る。次に、プライマー制限モデル曲線のデータと成長曲
線のための等式に適合させ、その際、既知の出発鋳型お
よびプライマーの濃度が使用され、３つの特性パラメー
タｅs、ｅvおよびａについての最良に適合する値が決定
される。ついて、鋳型の未知の出発濃度の試料を用いて
同様の条件下でＰＣＲを行い、成長曲線データを記録し
た。この方法を用いて、出発濃度は、Higuchi et alの
方法と比較してより正確に決定することができる。これ
は、成長曲線に沿って１個または数個の点が利用される
のではなく、全ての成長曲線データが利用されるためで
ある。
【００８５】既知の濃度の全ての標準の他に鋳型の出発
濃度の評価も可能である。既知の鋳型濃度の標準が利用
できない場合には、最初に、未知のものを有するプライ
マー制限ＰＣＲを実施し、この成長曲線を記録する。次
いで、既知の出発プライマー濃度を固定して、成長曲線
形状パラメーター（特徴パラメータｅs、ｅvおよびａ）
を、測定された成長曲線データに４つのパラメーターの
最良の適合を得るために、出発鋳型濃度Ｃoと一緒に変
化させる。最良の適用において、適合は出発鋳型濃度に
ついての有用な正確な値ならびに他の特性パラメーター
についての値を与えることで得ることができる。
濃度の評価も可能である。既知の鋳型濃度の標準が利用
できない場合には、最初に、未知のものを有するプライ
マー制限ＰＣＲを実施し、この成長曲線を記録する。次
いで、既知の出発プライマー濃度を固定して、成長曲線
形状パラメーター（特徴パラメータｅs、ｅvおよびａ）
を、測定された成長曲線データに４つのパラメーターの
最良の適合を得るために、出発鋳型濃度Ｃoと一緒に変
化させる。最良の適用において、適合は出発鋳型濃度に
ついての有用な正確な値ならびに他の特性パラメーター
についての値を与えることで得ることができる。
【００８６】これを操作することは意想外である。しか
し、これを最良の適用のために操作するという理由は、
通常のプライマー制限ＰＣＲにおいて、この成長曲線の
形状が、適用プロセスによって、測定された曲線に対す
る妥当な適合を与える出発鋳型濃度の広くない範囲が存
在する程度で強制されることである。
し、これを最良の適用のために操作するという理由は、
通常のプライマー制限ＰＣＲにおいて、この成長曲線の
形状が、適用プロセスによって、測定された曲線に対す
る妥当な適合を与える出発鋳型濃度の広くない範囲が存
在する程度で強制されることである。
【００８７】異常な反応条件についての多数のＰＣＲの
スクリーニングも可能である。一般に、リアルタイムの
検出装置およびモニタリング装置と組み合わせた熱的サ
イクル装置は、９６ＰＣＲ程度同時に実施することがで
きる。これらのＰＣＲは、全て、同一のＰＣＲシステム
であり、それぞれの反応において未知の変数である出発
鋳型濃度だけを有する同一の条件下で実施される。さら
に、これらの試料のいくつかは、既知の濃度の対照標準
であることができる。
スクリーニングも可能である。一般に、リアルタイムの
検出装置およびモニタリング装置と組み合わせた熱的サ
イクル装置は、９６ＰＣＲ程度同時に実施することがで
きる。これらのＰＣＲは、全て、同一のＰＣＲシステム
であり、それぞれの反応において未知の変数である出発
鋳型濃度だけを有する同一の条件下で実施される。さら
に、これらの試料のいくつかは、既知の濃度の対照標準
であることができる。
【００８８】この同時に実施されるＰＣＲの全ては、実
際に同じ形状の成長曲線を有するべきである。換言する
と、このデータが等式に最良に適合する場合、決定され
た特性パラメーターｅs、ｅvおよびａの値はだいたい同
じである。しかし、これらの中で、非特異的反応が開始
されたか、または阻害的汚染物質が持ち込まれたか、ま
たは反応条件が基準から明らかに外れたようなものであ
る場合、これらは、最良の適用において、ターゲットの
出発濃度に関係なく、明らかに異なる形状の成長曲線お
よび異なる特性パラメータが測定される。
際に同じ形状の成長曲線を有するべきである。換言する
と、このデータが等式に最良に適合する場合、決定され
た特性パラメーターｅs、ｅvおよびａの値はだいたい同
じである。しかし、これらの中で、非特異的反応が開始
されたか、または阻害的汚染物質が持ち込まれたか、ま
たは反応条件が基準から明らかに外れたようなものであ
る場合、これらは、最良の適用において、ターゲットの
出発濃度に関係なく、明らかに異なる形状の成長曲線お
よび異なる特性パラメータが測定される。
【００８９】これは、それぞれのＰＣＲ試料についての
成長曲線を測定および記録するためおよびその特性パラ
メータを決定するためのリアルタイム検出能力を有する
コンピューターで制御された熱的サイクル処理装置を備
えた機構のための測定されたデータに関するコンピュー
ター操作方法である。全てのサンプルにおいて、このパ
ラメータのいずれかがＰＣＲにとっての既知の基準から
明らかに外れた場合、またはこのパラメータの全てのセ
ットと良好な質の適合を得ることができない場合には、
試料の測定が使用できないことの警告である。良好な質
の適合は、適合の平均２乗誤差平方根が測定の既知のノ
イズと比較可能であるものである。
成長曲線を測定および記録するためおよびその特性パラ
メータを決定するためのリアルタイム検出能力を有する
コンピューターで制御された熱的サイクル処理装置を備
えた機構のための測定されたデータに関するコンピュー
ター操作方法である。全てのサンプルにおいて、このパ
ラメータのいずれかがＰＣＲにとっての既知の基準から
明らかに外れた場合、またはこのパラメータの全てのセ
ットと良好な質の適合を得ることができない場合には、
試料の測定が使用できないことの警告である。良好な質
の適合は、適合の平均２乗誤差平方根が測定の既知のノ
イズと比較可能であるものである。
【００９０】たとえば、ｅsについての値は約１．０で
あるべきである。１．０よりも明らかに大きいｅsの値
は、同時に非特異的増幅反応が進行していることを示
す。この異常な値は誤ったサイクル温度または反応体濃
度を示す。１．０よりも著しく低いｅvの値は、阻害物
質の存在を示している。さらに、最良の適合のＲＭＳ誤
差が、５倍の既知の測定ノイズである場合、おそらくＰ
ＣＲまたは測定値のなにかの誤りがある。
あるべきである。１．０よりも明らかに大きいｅsの値
は、同時に非特異的増幅反応が進行していることを示
す。この異常な値は誤ったサイクル温度または反応体濃
度を示す。１．０よりも著しく低いｅvの値は、阻害物
質の存在を示している。さらに、最良の適合のＲＭＳ誤
差が、５倍の既知の測定ノイズである場合、おそらくＰ
ＣＲまたは測定値のなにかの誤りがある。
【００９１】通常、測定された成長曲線についてこの等
式の適合の質が良好である場合、この平均２乗誤差平方
根は検出システムの測定の既知の誤差よりも大きくな
く、および特性パラメーターはその予想される基準の付
近にあり、これはそれぞれのＰＣＲの測定値が信頼でき
およびほぼ特異的であることの著しい証拠である。
式の適合の質が良好である場合、この平均２乗誤差平方
根は検出システムの測定の既知の誤差よりも大きくな
く、および特性パラメーターはその予想される基準の付
近にあり、これはそれぞれのＰＣＲの測定値が信頼でき
およびほぼ特異的であることの著しい証拠である。
【００９２】本発明の有利な実施態様において、適当な
緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライ
マー、モル過剰量のヌクレオシドトリホスファート、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度のターゲ
ット核酸分子を含有し、その際、前記の２種類のプライ
マーは既知のモル濃度（Ｃpo）で準備され、かつ前記の
２種類のプライマーまたは４種類のヌクレオシドトリホ
スファートの少なくとも１種が、２本鎖ＤＮＡの不在で
著しい信号を発しないが、製造されたｄｓＤＮＡを少な
くとも１回のそれぞれのサイクルで検出可能および測定
可能にするレポーター分子で標識されている反応混合物
中で複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで
評価するための自動装置において、前記装置は： ａ） ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を有す
る１つ以上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分
子の既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点
で実際に同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的サ
イクル処理するための熱的サイクル装置； ｂ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させるための手段および少なくと
もそれぞれの前記のサイクルの延長期の間に前記の信号
の強度を検出および測定する手段を包含する検出システ
ム； ｃ） それから信号を受信し、前記の強度を前記の混合
物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、およびそれぞ
れの前記サイクルのそれぞれの前記の延長期で前記のモ
ル濃度値を記憶するための前記の検出システムと接続さ
れたマイクロコンピューター； ｄ） ユーザーの指示を前記のコンピューターに入力し
およびその結果の情報を表示するための前記のコンピュ
ーターおよび前記の熱的サイクル装置に接続されたユー
ザーインターフェース；からなり、その際、前記のコン
ピューターは： ｉ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成するための手段、 ｉｉ） 次の関係式：
緩衝液、２つの相補的種類のオリゴヌクレオチドプライ
マー、モル過剰量のヌクレオシドトリホスファート、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、および未知の出発モル濃度のターゲ
ット核酸分子を含有し、その際、前記の２種類のプライ
マーは既知のモル濃度（Ｃpo）で準備され、かつ前記の
２種類のプライマーまたは４種類のヌクレオシドトリホ
スファートの少なくとも１種が、２本鎖ＤＮＡの不在で
著しい信号を発しないが、製造されたｄｓＤＮＡを少な
くとも１回のそれぞれのサイクルで検出可能および測定
可能にするレポーター分子で標識されている反応混合物
中で複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで
評価するための自動装置において、前記装置は： ａ） ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を有す
る１つ以上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分
子の既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点
で実際に同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的サ
イクル処理するための熱的サイクル装置； ｂ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させるための手段および少なくと
もそれぞれの前記のサイクルの延長期の間に前記の信号
の強度を検出および測定する手段を包含する検出システ
ム； ｃ） それから信号を受信し、前記の強度を前記の混合
物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、およびそれぞ
れの前記サイクルのそれぞれの前記の延長期で前記のモ
ル濃度値を記憶するための前記の検出システムと接続さ
れたマイクロコンピューター； ｄ） ユーザーの指示を前記のコンピューターに入力し
およびその結果の情報を表示するための前記のコンピュ
ーターおよび前記の熱的サイクル装置に接続されたユー
ザーインターフェース；からなり、その際、前記のコン
ピューターは： ｉ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成するための手段、 ｉｉ） 次の関係式：
【００９３】
【数２３】
【００９４】［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１
回のサイクルの延長期間の間で測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
完全に合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出
発ターゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃzは、ポリ
メラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ
酵素の比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であ
り；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩
基で示したプライマーの長さであり；Ｃpoは、出発プラ
イマーモル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相
補的鎖の競合係数である］による前記の１つ以上の成長
曲線と測定された曲線との最良の適合を提供するｅv、
ｅsおよびａの特性パラメーター値を決定するために逐
次近似法を用いるための手段、 ｉｉｉ） それぞれの未知の試料の測定された成長曲線
に対する最良の適合を与えるために、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定し、出発濃度Ｃoを調節
することにより、未知の試料の出発核酸のモル濃度を計
算するための手段；を包含する自動装置が提供される。
回のサイクルの延長期間の間で測定されたＤＮＡターゲ
ットモル濃度であり；ｅvは、理論上、次のサイクルま
で残存するターゲットの確率であり；ｅsは、理論上、
完全に合成されるターゲットの確率であり；Ｃoは、出
発ターゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃzは、ポリ
メラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ
酵素の比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であ
り；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩
基で示したプライマーの長さであり；Ｃpoは、出発プラ
イマーモル濃度であり；ａは、理論上、プライマー／相
補的鎖の競合係数である］による前記の１つ以上の成長
曲線と測定された曲線との最良の適合を提供するｅv、
ｅsおよびａの特性パラメーター値を決定するために逐
次近似法を用いるための手段、 ｉｉｉ） それぞれの未知の試料の測定された成長曲線
に対する最良の適合を与えるために、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定し、出発濃度Ｃoを調節
することにより、未知の試料の出発核酸のモル濃度を計
算するための手段；を包含する自動装置が提供される。
【００９５】従って、本発明は、実際に、複製連鎖反応
（ＰＣＲ）プロセスにおいてＤＮＡのような核酸試料の
定量的分析のための新規の改良された方法および装置を
提供する。
（ＰＣＲ）プロセスにおいてＤＮＡのような核酸試料の
定量的分析のための新規の改良された方法および装置を
提供する。
【００９６】本発明の一定の有利な実施態様がここでは
説明の目的で開示されているが、この他の実施態様が、
この明細書の研究の後に、本発明に関連する当業者には
明らかである。従って、本発明の範囲の決定は請求項を
参照すべきである。
説明の目的で開示されているが、この他の実施態様が、
この明細書の研究の後に、本発明に関連する当業者には
明らかである。従って、本発明の範囲の決定は請求項を
参照すべきである。
【図１】Higuchi et alの文献から得られたデータにつ
いての蛍光対サイクル数のグラフ。
いての蛍光対サイクル数のグラフ。
【図２】出発コピー１００μｌあたり１０8個のＨＩＶ
ｓｓＤＮＡが存在する図１で示された曲線の一つについ
ての濃度対サイクル数のグラフ。
ｓｓＤＮＡが存在する図１で示された曲線の一つについ
ての濃度対サイクル数のグラフ。
【図３】本発明の方法により計算された、Higuchi et a
lのデータについての計算された出発コピー対実際の出
発コピーのグラフ。
lのデータについての計算された出発コピー対実際の出
発コピーのグラフ。
【図４】本発明による装置の略図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 試料反応混合物中で複製連鎖反応の開始時にターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定す る方法および反応混合物中で複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタイムで評価する自動装 置
Claims (11)
- 【請求項１】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、およ
び未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する
試料反応混合物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲ
ット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法にお
いて、前記の２種類のプライマーは既知の濃度（Ｃpo）
で準備され、前記の方法が次の工程： ａ） 反応に重大に干渉せず、２本鎖ＤＮＡの不在では
著しい信号を発しないが、この反応により製造されたｄ
ｓＤＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可
能および測定可能にするレポーター分子を添加する工
程； ｂ） それぞれ少なくとも変性および延長期を有し、核
酸分子の所望の最終濃度を確定するために十分なあらか
じめ決定されたサイクル数について前記の反応混合物を
熱的サイクル処理する工程； ｃ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる工程； ｄ） 少なくともそれぞれの前記のサイクルの延長期の
間に前記の信号の強度を検出および測定する工程； ｅ） 前記の強度をｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、
前記のそれぞれのサイクルの前記のそれぞれの延長期に
ついて前記のモル濃度値を記憶する工程； ｆ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する工程； ｇ） 逐次近似法を使用し、その際、次の関係式： 【数１】 ［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクル
の延長期の間に測定されたＤＮＡ鋳型モル濃度であり；
ｅvは、次のサイクルまで残存する鋳型の確率であり；
ｅsは、合成される鋳型の確率であり；Ｃoは、出発ター
ゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発プライ
マーモル濃度であり；ａは、プライマー／相補的鎖の競
合係数である］による理論曲線に対する測定曲線の最良
の適合を提供するｅv、ｅsおよびａの値を決定する工
程；および ｈ） 未知の試料の測定された成長曲線に対して、工程
ｇの曲線等式の最良の適合を得るために、サイクルｎ＝
０でｅv、ｅs、ａおよびＣoの値を変化させることによ
り出発核酸のモル濃度を計算する工程；からなることを
特徴とする、試料反応混合物中で複製連鎖反応の開始時
にターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する
方法。 - 【請求項２】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、およ
び未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する
試料反応混合物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲ
ット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法にお
いて、前記の２種類のプライマーは既知のモル濃度（Ｃ
po）で準備され、前記の方法は次の工程： ａ） 反応に重大に干渉せず、２本鎖ＤＮＡの不在では
著しい信号を発しないが、この反応により製造されたｄ
ｓＤＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可
能および測定可能にするレポーター分子を添加する工
程； ｂ） それぞれ少なくとも変性および延長期を有し、前
記のプライマーが消耗される核酸分子の所望の最終濃度
を確定するのに十分なあらかじめ決定されたサイクル数
について前記の反応混合物を熱的サイクル処理する工
程； ｃ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる工程； ｄ） 少なくともそれぞれの前記のサイクルの延長期の
間に前記の信号の強度を検出および測定する工程； ｅ） 前記の強度を前記の混合物中のｄｓＤＮＡのモル
濃度値に変換し、前記のそれぞれのサイクルの前記のそ
れぞれの延長期についての前記のモル濃度を記憶する工
程； ｆ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する工程； ｇ） 逐次近似法を用いて、その際、次の関係式： 【数２】 ［式中、Ｃn+1およびＣnはｎ回およびｎ＋１回のサイク
ルの延長期の間に測定されたＤＮＡターゲットモル濃度
であり；ｅvは、次のサイクルまで残存するターゲット
の確率であり；ｅsは、合成されるターゲットの確率で
あり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル濃度であ
り；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；ａは、プ
ライマー／相補的鎖の競合係数である］による理論曲線
に対する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅsおよ
びａの値を決定する工程；および ｈ） 未知の試料の測定された成長曲線に対して工程ｇ
の曲線等式の最良の適合を得るために、サイクルｎ＝０
でｅv、ｅs、ａおよびＣoの値を変化させることにより
出発核酸のモル濃度を計算する工程からなることを特徴
とする、試料反応混合物中で複製連鎖反応の開始時にタ
ーゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方
法。 - 【請求項３】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、およ
び未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する
反応混合物中で、複製連鎖反応の予想される妥当性をリ
アルタイムで評価するための自動装置において、前記の
２種類のプライマーは既知のモル濃度（Ｃpo）で準備さ
れかつ前記の２種類のプライマーまたは４種類のヌクレ
オシドトリホスファートの少なくとも１種は、レポータ
ー分子により標識されており、このレポーター分子は２
本鎖ＤＮＡの不在では著しい信号を発しないが、この反
応により製造された小さなｄｓＤＮＡを少なくとも１回
それぞれのサイクルで検出可能および測定可能にし、前
記の装置は、次のもの： ａ） それぞれ少なくとも変性およびアニーリング／延
長期を有し、前記のプライマーが消耗される核酸分子の
所望の最終濃度を確定するために十分なあらかじめ決定
されたサイクル数について前記の反応混合物を熱的サイ
クル処理するための熱的サイクル装置； ｂ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる手段および少なくとも前記
のサイクルのそれぞれの延長期の間で前記の信号の強度
を検出および測定する手段を包含する検出システム； ｃ） 前記検出システムから信号を受信し、前記の強度
を前記の混合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度に変換し、そ
れぞれの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期につ
いて前記のモル濃度値を記憶するための、前記検出シス
テムに接続されたマイクロコンピューター； ｄ） ユーザーの指示を入力し、結果の情報を表示する
ための、前記のコンピューターおよび前記の熱的サイク
ル装置に接続されたユーザーインターフェース；からな
り、その際、前記のコンピューターは次の手段： ｉ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する手段； ｉｉ） 逐次近似法を用いて、次の関係式： 【数３】 ［式中、Ｃn+1およびＣnはｎ回およびｎ＋１回のサイク
ルの延長期の間に測定されたＤＮＡターゲットモル濃度
であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存するタ
ーゲットの確率であり；ｅsは、理論上、合成されるタ
ーゲットの確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分
子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度
であり；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係
数である］による理論的モデル曲線に対する測定曲線の
最適な適合を提供するｅv、ｅsおよびａの特性パラメー
ター値を決定する手段、 ｉｉｉ） 未知の試料の測定された成長曲線に対する工
程ｇの曲線等式の最良の適合を得るために、ｎ＝０のサ
イクルでｅv、ｅs、ａおよびＣoの値を変化させること
により出発核酸のモル濃度を計算する手段を包含するこ
とを特徴とする、反応混合物中で複製連鎖反応の予想さ
れる妥当性をリアルタイムで評価するための自動装置。 - 【請求項４】 前記の検出システムが、前記のサイクル
のそれぞれの前記のアニール／延長期の一部の間に、前
記の反応混合物から蛍光を検出するためのフルオリメー
ターが備えられている請求項３記載の装置。 - 【請求項５】 前記の反応管中の反応混合物と前記のフ
ルオリメーターとの間に光ファイバ結合接続装置がさら
に備えられている請求項４記載の装置。 - 【請求項６】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼおよび
未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する試
料反応混合物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲッ
ト核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法におい
て、前記の２種類のプライマーは既知の濃度（Ｃpo）で
準備され、前記の方法は、次の工程： ａ） この反応に重大に干渉せず、２本鎖ＤＮＡの不在
で著しい信号を発しないが、反応により製造されたｄｓ
ＤＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能
および測定可能にするレポーター分子を添加する工程； ｂ） ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を有す
る１つ以上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分
子の既知の出発モル濃度を有することを除いて、実際に
全ての点で同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的
サイクル処理する工程； ｃ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる工程； ｄ） 少なくともそれぞれの前記のサイクルの延長期の
間に前記の信号の強度を検出および測定する工程； ｅ） 前記の強度をｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、
前記のサイクルの前記の延長期について、前記のモル濃
度値を記憶させる工程； ｆ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する工程； ｇ） 逐次近似法を用いて、次の関係式： 【数４】 ［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクル
の延長期の間に測定されたＤＮＡ鋳型モル濃度であり；
ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型の確率
であり；ｅsは、理論上、に合成される鋳型の確率であ
り；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル濃度であ
り；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；ａは、理
論上、プライマー／相補的鎖の競合係数である］による
前記の１つ以上の既知の成長曲線に対する測定曲線の最
良の適合を提供するｅv、ｅsおよびａの値を決定する工
程； ｈ） それぞれ未知の試料の測定された成長曲線に対す
る最良の適合を得るために、ｅv、ｅsおよびａを固定
し、出発濃度Ｃoを調節することにより、未知の試料の
出発核酸モル濃度を計算する工程を包含することを特徴
とする、試料反応混合物中で、複製連鎖反応の開始時
に、ターゲット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定す
る方法。 - 【請求項７】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、およ
び未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する
試料反応混合物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲ
ット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法にお
いて、前記の２種類のプライマーは既知の濃度（Ｃpo）
で準備され、前記の方法は、次の工程： ａ） この反応に重大に干渉せず、２本鎖ＤＮＡの不在
で著しい信号を発しないが、この反応により製造された
ｄｓＤＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出
可能および測定可能にするレポーター分子を添加する工
程； ｂ） 少なくともそれぞれ変性および延長期間を有し、
核酸分子の所望の最終濃度を確定するために十分である
サイクル数について前記の反応混合物を熱的サイクル処
理する工程； ｃ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記反応混合物を励起させる工程； ｄ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の信号の強度を検出および測定する工程； ｅ） 前記の強度をｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、
それぞれの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期に
ついて前記のモル濃度値を記憶する工程； ｆ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する工程； ｇ） 逐次近似法を用いて、次の関係式： 【数５】 ［式中Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクルの
延長期間の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度であり；ｅv
は、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型の確率であ
り；ｅsは、理論上、合成される鋳型の確率であり；Ｃo
は、出発ターゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃ
poは、出発プライマーモル濃度であり；ａは、理論上、
プライマー／相補的鎖の競合係数であり；Ｃzは、ポリ
メラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ
酵素の比活性であり；Ｔxは、秒で示した延長時間であ
り；Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩
基で示したプライマーの長さである］による理論曲線に
対する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、ａ、
Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決定する工程； ｈ） 未知の試料の測定された成長曲線に対する工程ｇ
の曲線等式の最良の適合を得るために、ｎ＝０のサイク
ルで、ｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）および
Ｃoの値を変化させることにより、出発核酸のモル濃度
を計算する工程からなることを特徴とする、試料反応混
合物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲット核酸分
子の未知の出発モル濃度を決定する方法。 - 【請求項８】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、およ
び未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する
試料反応混合物中で、複製連鎖反応の開始時に、ターゲ
ット核酸分子の未知の出発モル濃度を決定する方法にお
いて、前記の２種類のプライマーは既知の濃度（Ｃpo）
で準備され、前記の方法は次の工程： ａ） 反応に重大に干渉せず、２本鎖ＤＮＡの不在で著
しい信号を発しないが、この反応により製造されたｄｓ
ＤＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能
および測定可能にするレポーター分子を添加する工程； ｂ） ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を有す
る１つ以上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分
子の既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点
で実際に同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的サ
イクル処理する工程； ｃ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる工程； ｄ） 少なくともそれぞれの前記のサイクルの延長期の
間に前記の信号の強度を検出および測定する工程； ｅ） 前記の強度をｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、
それぞれの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期に
てついて前記のモル濃度値を記憶する工程； ｆ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する工程； ｇ） 逐次近似法を用いて、次の関係式： 【数６】 ［式中Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクルの
延長期の終わりでのＤＮＡ鋳型モル濃度であり；ｅ
vは、理論上、次のサイクルまで残存する鋳型の確率で
あり；ｅsは、理論上、合成される鋳型の確率であり；
Ｃoは、出発ターゲット核酸分子のモル濃度であり；Ｃ
poは、出発プライマーモル濃度であり；ａは、理論上、
プライマー／相補的鎖の競合係数であり；Ｃzは、ポリ
メラーゼ酵素のモル濃度であり；Ａzは、ポリメラーゼ
の比活性であり；ｔxは、秒で示した延長時間であり；
Ｌtは、塩基で示した鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で
示したプライマーの長さである］による前記の１つ以上
の既知の成長曲線に対する測定曲線の最良の適合を提供
するｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）の値を決
定する工程； ｈ） 未知の試料の測定された成長曲線に対して最良の
適合を得るために、ｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz
（ｎ）を固定し、出発濃度Ｃoの値を調節することによ
り、未知の試料の出発核酸のモル濃度を計算する工程か
らなることを特徴とする、試料反応混合物中で、複製連
鎖反応の開始時に、ターゲット核酸分子の未知の出発モ
ル濃度を決定する方法。 - 【請求項９】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌク
レオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、およ
び未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有する
反応混合物中で、複製連鎖反応の予想される妥当性をリ
アルタイムで評価するための自動装置において、前記の
２種類のプライマーは既知のモル濃度（Ｃpo）で準備さ
れ、前記の２種類のプライマーまたは４種類のヌクレオ
シドトリホスファートの少なくとも１種類はリポーター
分子により標識されており、このリポーター分子は２本
鎖ＤＮＡの不在では著しい信号を発しないが、この反応
により製造されたｄｓＤＮＡを少なくとも１回それぞれ
のサイクルで検出可能および測定可能にし、前記の装置
は次のもの： ａ） ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を有す
る１つ以上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分
子の既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点
で実際に同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的サ
イクル処理するための熱的サイクル装置； ｂ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起する手段および少なくともそれぞ
れの前記のサイクルの延長期の間に前記の信号の強度を
検出および測定するための手段を包含する検出システ
ム； ｃ） 前記検出システムから信号を受信し、前記の強度
を前記の混合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、
それぞれの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期に
ついて前記のモル濃度値を記憶するための、前記の検出
システムと接続されたマイクロコンピューター； ｄ） 前記のコンピューターにユーザーの指示を入力
し、結果の情報を表示するための、前記のコンピュータ
ーおよび前記の熱的サイクル装置と接続されたユーザー
インターフェース；からなり、その際、前記のコンピュ
ーターは次の手段： ｉ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成する手段； ｉｉ） 次の関係式： 【数７】 ［式中、Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクル
の延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲットモル濃度
であり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存するタ
ーゲットの確率であり；ｅsは、理論上、合成されるタ
ーゲットの確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分
子のモル濃度であり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度
であり；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係
数である］による前記の１つ以上の既知の成長曲線に対
する測定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅsおよびａ
の特性パラメータ値を決定するために、逐次近似法を用
いるための手段； ｉｉｉ） それぞれ未知の試料の測定された成長曲線に
対する最良の適合を得るために、ｅv、ｅsおよびａを固
定し、出発濃度Ｃoを調節することにより、未知の試料
の出発核酸のモル濃度を計算するための手段を包含する
ことを特徴とする、反応混合物中で、複製連鎖反応の予
想される妥当性をリアルタイムで評価する自動装置。 - 【請求項１０】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオ
リゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌ
クレオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、お
よび未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有す
る混合物中で、複製連鎖反応の予想される妥当性をリア
ルタイムで評価する自動装置において、前記の２種類の
プライマーは既知の濃度（Ｃpo）で準備され、前記の２
種類のプライマーまたは４種類のヌクレオシドトリホス
ファートの少なくとも１種類はリポーター分子で標識さ
れ、このリポーター分子は２本鎖ＤＮＡの不在では著し
い信号を発しないが、この方法により製造されたｄｓＤ
ＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能お
よび測定可能にし、前記の装置は次のもの： ａ） それぞれ少なくとも変性およびアニーリング／延
長期間を有し、前記のプライマーを消費する核酸分子の
所望の最終濃度を確定するのに十分なあらかじめ決定さ
れたサイクル数について前記の反応混合物を熱的サイク
ル処理するための熱的サイクル装置； ｂ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる手段および少なくともそれ
ぞれ前記のサイクルの延長期の間に前記の信号の強度を
検出および測定する手段を備えている検出システム； ｃ） 前記検出システムから信号を受信し、前記の強度
を前記の混合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換し、
それぞれの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長期に
ついて前記のモル濃度を記憶させるための、前記の検出
システムと接続されたマイクロコンピューター； ｄ） ユーザーの指示を前記のコンピューターに入力
し、結果の情報を表示するための、前記のコンピュータ
ーおよび前記の熱的サイクル装置に接続されたユーザー
インターフェース；からなり、その際、前記のコンピュ
ーターは次の手段： ｉ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成するための手段； ｉｉ） 次の反応式： 【数８】 ［式中Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクルの
延長期間の間に測定されたＤＮＡターゲットモル濃度で
あり；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存するター
ゲットの確率であり；ｅsは、理論上、合成されるター
ゲットの確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子
のモル濃度であり；Ｃzは、ポリメラーゼ酵素のモル濃
度であり；Ａzは、ポリメラーゼ酵素の比活性であり；
ｔxは、秒で示した延長時間であり；Ｌtは、塩基で示し
た鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で示したプライマー
の長さであり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であ
り；ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数で
ある］による理論的モデル曲線に対する測定曲線の最良
の適合を提供するｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡ
z（ｎ）の特性パラメーター値を決定するために逐次近
似法を使用するための手段；および ｉｉｉ） 未知の試料の測定された成長曲線に対する曲
線等式の最良の適合を得るために、ｎ＝０のサイクル
で、ｅv、ｅs、ａ、Ｃz（ｎ）およびＡz（ｎ）およびＣ
oの値を変化させることにより出発核酸のモル濃度を計
算するための手段を包含することを特徴とする、反応混
合物中で、複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタ
イムで評価する自動装置。 - 【請求項１１】 適当な緩衝液、２つの相補的種類のオ
リゴヌクレオチドプライマー、モル過剰量の４種類のヌ
クレオシドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、お
よび未知の出発モル濃度のターゲット核酸分子を含有す
る混合物中で、複製連鎖反応の予想される妥当性をリア
ルタイムで評価する自動装置において、前記の２種類の
プライマーは既知の濃度（Ｃpo）で準備され、前記の２
種類のプライマーまたは４種類のヌクレオシドトリホス
ファートの少なくとも１種類はリポーター分子で標識さ
れ、このリポーター分子は２本鎖ＤＮＡの不在では著し
い信号を発しないが、この方法により製造されたｄｓＤ
ＮＡを少なくとも１回それぞれのサイクルで検出可能お
よび測定可能にし、前記の装置は次のもの： ａ） ターゲット核酸分子の既知の出発モル濃度を有す
る１つ以上の成長曲線を得るために、ターゲット核酸分
子の既知の出発モル濃度を有することを除いて全ての点
で実際に同じである１つ以上の標準反応混合物を熱的サ
イクル処理するための熱的サイクル装置； ｂ） 少なくともそれぞれのサイクルの延長期の間に前
記の反応混合物を励起させる手段および少なくともそれ
ぞれ前記のサイクルの延長期の間に前記の信号の強度を
検出および測定する手段を備えている検出システム； ｃ） 前記の検出システムから信号を受信し、前記の強
度を前記の混合物中のｄｓＤＮＡのモル濃度値に変換
し、それぞれの前記のサイクルのそれぞれの前記の延長
期について前記のモル濃度値を記憶させるための、前記
の検出システムと接続されたマイクロコンピューター； ｄ） ユーザーの指示を前記のコンピューターに入力
し、結果の情報を表示するための、前記のコンピュータ
ーおよび前記の熱的サイクル装置に接続されたユーザー
インターフェース；からなり、その際、前記のコンピュ
ーターは次の手段： ｉ） 前記の記憶された濃度値からｄｓＤＮＡのモル濃
度対サイクル数の測定曲線を作成するための手段； ｉｉ） 次の反応式： 【数９】 ［式中Ｃn+1およびＣnはｎおよびｎ＋１回のサイクルの
延長期の間に測定されたＤＮＡターゲットモル濃度であ
り；ｅvは、理論上、次のサイクルまで残存するターゲ
ットの確率であり；ｅsは、理論上、合成されるターゲ
ットの確率であり；Ｃoは、出発ターゲット核酸分子の
モル濃度であり；Ｃzは、ポリメラーゼ酵素のモル濃度
であり；Ａzは、ポリメラーゼ酵素の比活性であり；ｔx
は、秒で示した延長時間であり；Ｌtは、塩基で示した
鋳型の長さであり；Ｌpは、塩基で示したプライマーの
長さであり；Ｃpoは、出発プライマーモル濃度であり；
ａは、理論上、プライマー／相補的鎖の競合係数であ
る］による前記の１つ以上の既知の成長曲線に対する測
定曲線の最良の適合を提供するｅv、ｅs、ａの特性パラ
メーター値を決定するために逐次近似法を使用するため
の手段；および ｉｉｉ） それぞれ未知の試料の測定された成長曲線に
対する最良の適合を得るために、ｅv、ｅs、ａ、Ｃ
z（ｎ）およびＡz（ｎ）を固定し、出発濃度Ｃoを調節
することにより、未知の試料の出発核酸のモル濃度を計
算するための手段を包含することを特徴とする、反応混
合物中で、複製連鎖反応の予想される妥当性をリアルタ
イムで評価する自動装置。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP (1) | JPH0866199A (ja) |
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