JPH0870815A

JPH0870815A - 調味料の製造法

Info

Publication number: JPH0870815A
Application number: JP6238567A
Authority: JP
Inventors: Katsuya Seguro; 勝也脊黒; Masao Motoki; 正雄本木; Koji Ikura; 宏司伊倉; Ryuzo Sasaki; 隆造佐々木
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-09-05
Filing date: 1994-09-05
Publication date: 1996-03-19
Anticipated expiration: 2018-04-14
Also published as: JP3395397B2

Abstract

(57)【要約】【目的】グルタミン酸等の呈味成分を高濃度に含有す
る調味料を得る。【構成】蛋白質原料に、架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼ活性物質を作用せしめた後、蛋白質加水分解酵素活
性物質を作用せしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、調味料の製造法に関す
るものであり、さらに詳細には、調味料の好ましい呈味
性を決定するグルタミン酸を蛋白質原料より効果的かつ
高濃度に分離し、グルタミン酸含量の高い調味料または
調味料原料を製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質原料またはペプチドを含有する蛋
白質原料に、蛋白質加水分解酵素を含有する酵素活性物
質を作用せしめ、醤油または醤油様調味料あるいはそれ
らの調味料の原料を製造する方法に関しては、既に多数
の報告がなされている（例えば特公昭５７−１８８５９
号、特公昭６３−９４９７４号各公報参照）。

【０００３】また、蛋白質原料に蛋白質加水分解酵素を
作用せしめた際には、その構成部分としてグルタミン酸
を有するにも関わらず、呈味性に寄与しない遊離形のグ
ルタミンが相当高濃度に生成するため、この遊離形グル
タミンにグルタミナ−ゼ等を作用せしめて、加水分解物
中のグルタミン酸の濃度を向上せしめる試みがあり、そ
れらの方法の一部は既に実用化されている（例えば、特
公昭４７−１７８２８号、特公昭４９−１５７８９号各
公報参照）。

【０００４】さらに、遊離形グルタミンは、加水分解物
中で不安定であり、容易に環化（ピロ化）し、グルタミ
ナ−ゼ等が作用し難いピログルタミン酸に変化してしま
うため、加水分解物中のグルタミン酸の濃度を向上させ
る際の障害となっている。

【０００５】以上、要するに、蛋白質原料に蛋白質加水
分解酵素を作用せしめ、単純に加水分解反応を行う従来
の方法は、蛋白質原料に存在する結合形のグルタミン酸
を効果的に遊離せしめる方法としては限界のある方法と
云わざるを得ない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明にあっては、蛋
白質原料中に存在する結合形グルタミン酸を蛋白質加水
分解酵素の作用により、遊離形のグルタミン酸として加
水分解物中に効果的に遊離せしめ、且つ、遊離したグル
タミン酸を変化せしめることなく安定に保全し、グルタ
ミン酸を高濃度に含有する調味料または調味料原料を取
得することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の課
題及び目的を解決すべく、従来の関連する技術を詳細に
亙って再検討し、更に新たな見地から種々の検討を行っ
た結果、蛋白質原料に蛋白質加水分解酵素を作用せしめ
るに先だって、従来より知られているトランスグルタミ
ナ−ゼに比較して架橋反応よりも脱アミド化反応を優先
的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性
物質を前記蛋白質原料に作用せしめ、その後、蛋白質加
水分解酵素活性物質を作用せしめる場合には、極めて効
果的に遊離形のグルタミン酸を加水分解物中に遊離また
は放出させることができ、且つ遊離したグルタミン酸は
変化することなく、加水分解物中に安定に保全出来るこ
とから、グルタミン酸を高濃度に含有する調味料または
調味料原料を製造し得るという知見を得た。

【０００８】本発明者等は、この知見に基づき本発明を
完成した。すなわち、本発明は、蛋白質原料に、架橋反
応よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有す
るトランスグルタミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後、
蛋白質加水分解酵素活性物質を作用せしめることを特徴
とする調味料の製造法である。

【０００９】

【作用】本発明における蛋白質原料には、各種の植物性
蛋白質原料、動物性蛋白質原料または微生物性蛋白質原
料、それらの部分加水分解物、それらの各種蛋白質原料
に由来するペプチドならびにそれらの混合物原料が使用
される。

【００１０】植物性蛋白質原料としては、丸大豆、大豆
ミ−ル、大豆フレ−ク、大豆搾油ケ−ク、分離大豆蛋
白、小麦粉、分離小麦グルテン、コ−ン・グルテンが例
示される。

【００１１】動物性蛋白質原料としては、鳥獣類肉、魚
介類肉、それらの加工品、フィシュ・ミ−ル、フィシュ
・ソルブル、カゼイン、分離乳精蛋白、コテ−ジ・チ−
ズ、絹糸部分加水分解物が例示される。

【００１２】微生物性蛋白質原料としては、酵母菌体、
酵母エキス、アミノ酸発酵菌体、同抽出物が例示され
る。

【００１３】架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性を有
するトランスグルタミナ−ゼ活性物質としては、架橋反
応よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有す
るモルモット肝トランスグルタミナ−ゼ標品、架橋反応
よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有する
微生物トランスグルタミナ−ゼ標品、架橋反応よりも脱
アミド化反応を優先的に触媒する能力を有する魚トラン
スグルタミナ−ゼ標品、これらの酵素の生成能を大腸菌
等の微生物菌体内で発現するプラスミドを導入して改質
した改質菌の培養物、同改質菌培養物の処理物などが挙
げられる。

【００１４】この架橋反応よりも脱アミド化反応を優先
的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼは、
従来より知られているトランスグルタミナ−ゼに対して
改変蛋白（ミュテイン、Mutein) の関係にある蛋白構
造、アミノ酸配列を有する。

【００１５】従って、この架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼは、生物化学的あるいは遺伝子工学的な公知の改変
蛋白の調製法に準ずる方法によっても調製することが出
来る。

【００１６】但し、本発明の方法において使用されるト
ランスグルタミナ−ゼ、即ち、架橋反応よりも脱アミド
化反応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタ
ミナ−ゼは、前述のようなトランスグルタミナ−ゼの改
変蛋白に限定されるものではなく、このような能力を有
するトランスグルタミナ−ゼであれば、何れの調製法に
より調製されたトランスグルタミナ−ゼであっても使用
可能である。

【００１７】トランスグルタミナ−ゼ活性物質を作用せ
しめた後の蛋白質原料に作用せしめる蛋白質分解酵素活
性物質は、各種のプロテイナ−ゼ標品、プロテア−ゼ標
品、ペプチダ−ゼ標品、およびこれらの蛋白質分解酵素
を含有する混合物であって、その起源、原料には特に限
定されない。また、エンド型蛋白質分解酵素、エクソ型
蛋白質分解酵素、あるいはそれらの混合物であっても良
い。さらに蛋白質分解酵素活性物質は、精製された標品
である必要はなく、例えば米麹、麦麹、麹菌液体培地培
養物であっても良い。

【００１８】架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性物質
を蛋白質原料に作用せしめるには、水性媒体中で、蛋白
質原料とこのトランスグルタミナ−ゼ活性物質を接触せ
しめる方法が採用される。

【００１９】この酵素の活性範囲は、５〜５５℃、ｐＨ
４〜１０であるので、接触せしめる条件もこの範囲から
選択される。また、接触せしめる時間は０．１〜２４時
間が適当である。蛋白質分解酵素の共存によって、この
酵素の活性は損われることが多いので、蛋白質加水分解
酵素活性物質を作用せしめる次工程を同時に実施するこ
とは得策ではない。

【００２０】架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性物質
を作用せしめた後の蛋白質原料に、蛋白質加水分解酵素
活性物質を作用せしめるには、水性媒体中で、同トラン
スグルタミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後の蛋白質原
料と蛋白質加水分解酵素活性物質を接触せしめる方法が
採用される。

【００２１】この場合の接触の条件は、選択した蛋白質
加水分解酵素の活性範囲から選択される。また、接触せ
しめる時間は０．５〜１２時間が適当である。尚、この
工程では、トランスグルタミナ−ゼ活性物質が共存して
いても、蛋白質加水分解酵素の活性には影響が生じない
ので、格別な中間処理を行うことなく、前工程より本工
程に移行することが出来る。

【００２２】蛋白質加水分解酵素活性物質を作用せしめ
た後の蛋白質加水分解液は、そのまま、あるいは必要に
より固液分離、濃縮、乾燥などの処理工程を経た後、調
味料またはその原料として利用される。

【００２３】本発明で使用するトランスグルタミナ−
ゼ、即ち、架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に触
媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼは、本発明
者等が新たに発見した酵素であって、その調製法および
特異活性については、後述の参考例１及び２にそれらの
具体的事項を述べる。尚、このトランスグルタミナ−ゼ
の調製法および特異活性については、各参考例の末尾に
記載したように既に公表されている事柄である。

【００２４】以下、実施例により本発明の内容を具体的
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

【００２５】

【実施例】

（実施例１）架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼとして本
実施例で使用したトランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、Ｔ
ＧＭ２またはＴＧＭ３は、後述の参考例１の方法により
調製され、その特異活性は参考例２に記載した通りであ
る。

【００２６】トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ
２又はＴＧＭ３の標品、各０．１ｇを、脱脂大豆粉また
は小麦粉よりアルカリ抽出等電点沈殿法によって各々新
たに分離した大豆蛋白粉末または小麦蛋白粉末の各５ｇ
とｐＨ７の燐酸塩緩衝液１Ｌ中にて弱撹拌下、３７℃で
２．０時間に亘り接触せしめた。次いで、各々ｐＨを７
に再調整した後、エクソ型ペプチダ−ゼ標品「プロテア
−ゼＭ」（商品名：天野製薬（株）製品）各０．１ｇを
添加し、弱撹拌下にて３７℃で２．０時間に亘り更に接
触を続けた。この場合、何れの加水分解試料中にも固体
物は存在せず、蛋白粉末は完全に溶解したことが認めら
れた。

【００２７】他方で、上記のトランスグルタミナ−ゼを
添加せずに、Ｎ塩酸０．１ｍＬを添加した試料（対照
１）と、上記のトランスグルタミナ−ゼを添加しない試
料（対照２）と、モルモット肝トランスグルタミナ−ゼ
発現用プラスミドｐＫＴＧ１を導入した大腸菌の培養物
より調製したトランスグルタミナ−ゼＴＧ標品の０．１
ｇを添加した試料（対照３）とについても、同様に処理
した。尚、対照３で使用したトランスグルタミナ−ゼＴ
Ｇ標品は、架橋反応を優先的に触媒する通常のトランス
グルタミナ−ゼ活性を有する。

【００２８】以上の合計１２種類の加水分解試料につい
て、イオン交換カラムを使用する通常のアミノ酸分析
（液体クロマトグラフ法）により検出される総グルタミ
ン酸量（ＧＨ）の定量およびミクロケ−ルダ−ル法によ
る総窒素量（ＴＮ）の定量により、総窒素量に対するグ
ルタミン酸量の比（ＧＨ／ＴＮ）を算出した。それらの
結果をまとめて表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】改変型トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、
ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を使用した試料は、蛋白質原料が
大豆蛋白または小麦蛋白の場合とも、対照１、対照２及
び対照３の試料に比較して、総窒素量に対するグルタミ
ン酸量の比（ＧＨ／ＴＮ）は同等または高い数値が認め
られた。

【００３１】この事実は、架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３との接触により、
蛋白質原料からグルタミン酸が効果的に遊離し、加水分
解液中に保全されていることを示す。

【００３２】尚、ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を作
用せしめた試料では、対照１の試料のように酸処理は行
っていないので、人体に悪影響を与えるとされるモノク
ロロプロパノ−ル、ジクロロプロパノ−ルなどの有機塩
素化合物は全く副生しないと云う利点がある。

【００３３】参考例１：＝改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又は
ＴＧＭ３の調製例＝モルモット肝トランスグルタミナ−ゼの大腸菌発現用プ
ラスミドｐＫＴＧ１を鋳型とし、ポリメラ−ゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を使用する部位特異的変異法（特定部位を変
異させたプライマ−を使用したＤＮＡ鎖の特定部位のみ
を迅速且つ容易に増幅する反応；小野寺一清監修「組換
えＤＮＡ実験ノ−ト」１１２−１１５頁；現代工学社
刊）により、３種類の改変トランスグルタミナ−ゼＴＧ
Ｍ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を発現するプラスミドｐＫ
ＴＧＭ１、ｐＫＴＧＭ２又はｐＫＴＧＭ３を構築した。
これらのプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入して取得し
た改質菌を培養し、培養菌体よりＴＧＭ１、ＴＧＭ２又
はＴＧＭ３を調製した。又、それらはｐＫＴＧ１を導入
した大腸菌の場合と同程度のレベルで発現した。

【００３４】改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１を発
現するプラスミドｐＫＴＧＭ１により形質転換された大
腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)ＡＪ１３
０３７は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭＰ−１
４５１３である。

【００３５】また、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
２を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ２により形質転換さ
れた大腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)Ａ
Ｊ１３０３８は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４５１４である。

【００３６】更に、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
３を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ３により形質転換さ
れた大腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)Ａ
Ｊ１３０３９は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４５１５である。

【００３７】加えて、モルモット肝トランスグルタミナ
−ゼ発現用プラスミドｐＫＴＧ１で形質転換された大腸
菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)ＡＪ１２３
７０は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭＰ−１０
００８である。

【００３８】また、（１）モルモット肝トランスグルタ
ミナ−ゼの大腸菌発現用プラスミドｐＫＴＧ１を有する
大腸菌を培養して取得した生産物と、（２）その改変ト
ランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２及びＴＧＭ３
を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ１、ｐＫＴＧＭ２及び
ｐＫＴＧＭ３をそれぞれ有する大腸菌を培養して取得し
た生産物と、（３）対照としてモルモット肝トランスグ
ルタミナ−ゼを発現する遺伝子を担持していないプラス
ミド・ベクタ−ｐＫＫ２３３−２を有する大腸菌の培養
物の抽出物および（４）モルモット肝から抽出したトラ
ンスグルタミナ−ゼＧ．Ｐ．Ｌ．について、ＳＤＳポリ
アクリルアミド・ゲル上で電気泳動を行ったところ、
（３）を例外として他の試料では略全て殆ど同一の分子
量を有していることが判明した。（３）では該電気泳動
条件下でモルモット肝トランスグルタミナ−ゼ蛋白に対
応する蛋白の存在を認め得なかった。図１は、それらの
ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上での電気泳動の結果
を示す模式図である。

【００３９】尚、未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧに
対するＴＧＭ１、ＴＧＭ２またはＴＧＭ３の改変部位は
次の通りである。ＴＧＭ１：中央部負電荷領域、２３１および２３２残基
目のアスパラギン酸残基２個をアスパラギン残基に変
換。ＴＧＭ２：Ｃ−末端側負電荷領域、４４５、４４８、４
４９、４５０および４５２残基目にあるグルタミン酸残
基５個をグルタミン残基に変換。ＴＧＭ３：ＴＧＭ１およびＴＧＭ２の改変部位を併有。
尚、未改変モルモット肝トランスグルタミナ−ゼのＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列については特開平１−３００
８８９号公報等に記載されている。

【００４０】参考例２＝改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又は
ＴＧＭ３の特異活性の確認＝（１）架橋反応の抑制：改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴ
ＧＭ３は、アセチル化α_s1- カゼインへの蛍光性一級ア
ミンであるモノダンシルカダベリンに代表される架橋反
応において、この蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋ
ｍは未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧと変わりなく同
一である一方、最大反応速度Ｖｍａｘは２．５倍以上低
下していることから、架橋反応の抑制が発生しているこ
とを認めた。

【００４１】尚、蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋ
ｍ及び最大反応速度Ｖｍａｘは次式により定義される。Ｋｍ＝（Ｖｍａｘ／ｖ−１）［Ｓ］Ｖｍａｘ＝（Ｋｍ＋［Ｓ］）ｖ／［Ｓ］但し、ｖは生成物の生成速度、［Ｓ］は基質濃度であ
る。

【００４２】蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋｍ及
び最大反応速度Ｖｍａｘに関する測定値を表２に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】また、反応開始後、３０分単位で測定した
反応系に存在するα_s1- カゼイン単量体の存在比は、未
改変トランスグルタミナ−ゼＴＧの反応系では、時間の
経過と共に急速に低下したのに対し、改変トランスグル
タミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の反応系で
は殆ど変化がなく、当初の９０〜９５％に維持、抑制さ
れていることを認めた（図２参照）。

【００４５】（２）脱アミド化反応の無変化：改変トラ
ンスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の
脱アミド化反応は、未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧ
のそれと比較して殆ど同一のレベルにあり、両者の間に
実質的な差異は認められなかった（図３参照）。

【００４６】（３）改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の酵素学的挙動：上記のよう
に、ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３は、未改変トラン
スグルタミナ−ゼＴＧに比較して、架橋反応の抑制が発
生している一方で脱アミド化反応には変化がないので、
ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を作用せしめた蛋白基
質に蛋白加水分解酵素を作用せしめた場合、蛋白基質を
構成している結合グルタミン酸は、容易に且つ変化を蒙
ることなく、換言すれば効果的に、遊離のグルタミン酸
に変化して加水分解物中に放出される。

【００４７】尚、参考例１及び参考例２に記載の事項
は、次の通り既に公表されている。『伊倉宏司ほか「ト
ランスグルタミナ−ゼ分子に保存された負電荷領域の部
位特異的変異」日本生化学会第６６回大会発表：内容要
旨、同大会要旨７３３頁、要旨発行日、平成５年８月２
５日、口頭発表、平成５年１０月２日』

【００４８】

【発明の効果】本発明は、以上に説明した通り、蛋白質
原料中に存在する結合形グルタミン酸を、遊離形のグル
タミン酸として加水分解物中に効果的に遊離せしめ、且
つ遊離したグルタミン酸は変化することなく安定に保全
し得るので、グルタミン酸を高濃度に含有する調味料ま
たは調味料原料を製造出来るという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】モルモット肝トランスグルタミナ−ゼの大腸菌
発現用プラスミドｐＫＴＧ１を有する大腸菌を培養して
取得した生産物と、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
１，ＴＧＭ２及びＴＧＭ３を発現するプラスミドｐＫＴ
ＧＭ１，ｐＫＴＧＭ２及びｐＫＴＧＭ３をそれぞれ有す
る大腸菌を培養して取得した各生産物、並びに対照とし
てモルモット肝トランスグルタミナ−ゼの遺伝子を担持
していないプラスミドｐＫＫ２３３−２を有する大腸菌
の培養物の抽出物、およびモルモット肝から抽出したト
ランスグルタミナ−ゼＧ．Ｐ．Ｌ．について、ＳＤＳポ
リアクリルアミド・ゲル上における電気泳動の結果を示
す模式図である。図において縦軸は分子量（ＫＤａ）
を、横軸には上記の生産物またはＧ．Ｐ．Ｌ．を示す。

【図２】モルモット肝トランスグルタミナ−ゼＴＧと、
その改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２、
ＴＧＭ３との架橋化反応活性を示す線図である。図２に
おいて縦軸は架橋化反応後のα_s1- カゼイン単量体存在
比（％）を、横軸は反応時間（分）を示す。また、黒丸
はＴＧを、白三角はＴＧＭ１を、白丸はＴＧＭ２を、黒
三角はＴＧＭ３をそれぞれ示す。

【図３】モルモット肝トランスグルタミナ−ゼＴＧと、
その改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２、
ＴＧＭ３との脱アミド化反応活性を示す線図である。図
３において縦軸は脱アミド化反応で生成するアンモニア
量（ｍＭ) を、横軸は反応時間（分）を示す。また、黒
丸はＴＧを、白三角はＴＧＭ１を、白丸はＴＧＭ２を、
黒三角はＴＧＭ３をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛋白質原料に、架橋反応よりも脱アミド
化反応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタ
ミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後、蛋白質加水分解酵
素活性物質を作用せしめることを特徴とする調味料の製
造法。