JPH0870847A - 細胞浮遊培養用容器 - Google Patents
細胞浮遊培養用容器Info
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 一つの容器内を仕切り板２，８によって、細
胞または細胞塊を培養するための培養部３と培養液を交
換するための培養液交換部４とに分け、その境界の少な
くとも一部に、細胞は透過せず培養液は透過し得る網目
状構造物５，７を設けた。 【効果】 培養液交換時における細胞や細胞塊の損傷や
逸失がなくなるので、細胞機能の維持に有効な細胞塊
（スフェロイド）培養が容易になり、また長期に安定な
培養系を提供できるので、培養系を用いた実験系、毒物
の毒性試験のための試験系、有用物質の生産等に適用す
ることが出来る。
胞または細胞塊を培養するための培養部３と培養液を交
換するための培養液交換部４とに分け、その境界の少な
くとも一部に、細胞は透過せず培養液は透過し得る網目
状構造物５，７を設けた。 【効果】 培養液交換時における細胞や細胞塊の損傷や
逸失がなくなるので、細胞機能の維持に有効な細胞塊
（スフェロイド）培養が容易になり、また長期に安定な
培養系を提供できるので、培養系を用いた実験系、毒物
の毒性試験のための試験系、有用物質の生産等に適用す
ることが出来る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞または細胞塊（ス
フェロイドとも言う）の浮遊培養に関するものであり、
培養液交換時の細胞または細胞塊の吸引による細胞数減
少を防ぐことが可能な培養容器に関するものである。
フェロイドとも言う）の浮遊培養に関するものであり、
培養液交換時の細胞または細胞塊の吸引による細胞数減
少を防ぐことが可能な培養容器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細胞を浮遊させて培養する技術は、血液
系の細胞（マクロファージや血小板は除く）の培養や、
近年盛んになった肝臓の細胞の凝集塊を培養するスフェ
ロイド培養法において重要な技術であり、このような細
胞を用いた生体由来の有用物質の産成や生体機能の解明
が盛んに行なわれている。
系の細胞（マクロファージや血小板は除く）の培養や、
近年盛んになった肝臓の細胞の凝集塊を培養するスフェ
ロイド培養法において重要な技術であり、このような細
胞を用いた生体由来の有用物質の産成や生体機能の解明
が盛んに行なわれている。
【０００３】従来、基材に接着せず培養液中に浮遊した
状態で細胞または細胞塊を培養するためには、培養容器
の表面にポリ・ヒドロキシエチルメタアクリレート等の
親水性の物質プロテオグリカンをコートし、細胞の基材
への接着を阻害する方法（Ｃell Ｓtruct Ｆunct, １
３，１７９（１９８８））や、冷却することにより培養
液に溶解する合成高分子化合物を培養容器の表面に塗布
し、細胞を接着させた後培養容器を冷却して合成高分子
化合物を溶解し、細胞のシートを作る方法（Ｂio／Ｔec
hnology,８，８５４（１９９０））、培養容器中に細胞
を入れた後、培養容器を振盪することにより細胞凝集塊
を作り、その凝集塊を培養する方法等がある。
状態で細胞または細胞塊を培養するためには、培養容器
の表面にポリ・ヒドロキシエチルメタアクリレート等の
親水性の物質プロテオグリカンをコートし、細胞の基材
への接着を阻害する方法（Ｃell Ｓtruct Ｆunct, １
３，１７９（１９８８））や、冷却することにより培養
液に溶解する合成高分子化合物を培養容器の表面に塗布
し、細胞を接着させた後培養容器を冷却して合成高分子
化合物を溶解し、細胞のシートを作る方法（Ｂio／Ｔec
hnology,８，８５４（１９９０））、培養容器中に細胞
を入れた後、培養容器を振盪することにより細胞凝集塊
を作り、その凝集塊を培養する方法等がある。
【０００４】しかしこういった培養容器は、細胞を接着
させて培養する一般的な培養容器の表面を改質して利用
する方法であり、細胞または細胞塊の浮遊培養用ではな
いため、細胞や細胞塊が培養液中に浮遊した状態で培養
液の交換をする場合、細胞や細胞塊が失われない様に細
心の注意と技術が必要となる。
させて培養する一般的な培養容器の表面を改質して利用
する方法であり、細胞または細胞塊の浮遊培養用ではな
いため、細胞や細胞塊が培養液中に浮遊した状態で培養
液の交換をする場合、細胞や細胞塊が失われない様に細
心の注意と技術が必要となる。
【０００５】こういった培養液交換時の細胞の損失を防
ぐためには、一旦培養容器に遠心操作を施し、細胞又は
細胞塊を培養容器表面に強制的に付着させた後、培養液
を交換する方法や、細胞ごと培養液を遠沈管に移し、遠
心操作で細胞を落とした後上清の培養液を交換する方法
等がある。
ぐためには、一旦培養容器に遠心操作を施し、細胞又は
細胞塊を培養容器表面に強制的に付着させた後、培養液
を交換する方法や、細胞ごと培養液を遠沈管に移し、遠
心操作で細胞を落とした後上清の培養液を交換する方法
等がある。
【０００６】このように、細胞を浮遊させた状態で培養
し遠心操作等を行なった場合、無理な機械的衝撃により
細胞に障害を与え、細胞の生存や機能に重大な欠陥を及
ぼすこととなる。また前述の操作を行なわず、接着して
いる細胞と同様の方法で培養液の交換を行なうと、浮遊
している細胞や細胞塊を吸引操作により失うこととな
る。
し遠心操作等を行なった場合、無理な機械的衝撃により
細胞に障害を与え、細胞の生存や機能に重大な欠陥を及
ぼすこととなる。また前述の操作を行なわず、接着して
いる細胞と同様の方法で培養液の交換を行なうと、浮遊
している細胞や細胞塊を吸引操作により失うこととな
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、上記のよ
うな培養過程の機械的操作による細胞の損失や障害の問
題を解決するため種々の検討を加えた結果、細胞または
細胞塊にダメージを与えることなく、かつ培養液の交換
による細胞または細胞塊の損失を防ぎうる細胞浮遊培養
用容器を完成するに至ったものである。
うな培養過程の機械的操作による細胞の損失や障害の問
題を解決するため種々の検討を加えた結果、細胞または
細胞塊にダメージを与えることなく、かつ培養液の交換
による細胞または細胞塊の損失を防ぎうる細胞浮遊培養
用容器を完成するに至ったものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、培養容
器を、細胞または細胞塊を浮遊状態で培養する領域と、
培養液を交換するための領域の２つの領域に分け、培養
室と培養液交換室の間を細胞または細胞塊が透過でき
ず、かつ培養液は自由に透過できる網目構造の材質で仕
切ることを特徴とする培養容器により、前記の問題を解
決しようとするものである。
器を、細胞または細胞塊を浮遊状態で培養する領域と、
培養液を交換するための領域の２つの領域に分け、培養
室と培養液交換室の間を細胞または細胞塊が透過でき
ず、かつ培養液は自由に透過できる網目構造の材質で仕
切ることを特徴とする培養容器により、前記の問題を解
決しようとするものである。
【０００９】以下、図面を参照して本発明を詳細に説明
する。図１は本発明の一実施例となる細胞浮遊培養用容
器を示す図である。
する。図１は本発明の一実施例となる細胞浮遊培養用容
器を示す図である。
【００１０】培養容器の形状や種類は特に限定されるも
のではなく、シャーレ、フラスコ、培養びん、タンク等
のいずれでもよく、その内部に仕切りを設けて、細胞ま
たは細胞塊を浮遊培養するための培養部（３）と、培養
液の交換を行なうための培養液交換部（４）とに分けれ
ば良い。
のではなく、シャーレ、フラスコ、培養びん、タンク等
のいずれでもよく、その内部に仕切りを設けて、細胞ま
たは細胞塊を浮遊培養するための培養部（３）と、培養
液の交換を行なうための培養液交換部（４）とに分けれ
ば良い。
【００１１】具体的な仕切り方は特に限定しないが、例
えば、図１（ａ）に示すように、シャーレ（１）内にリ
ング状の仕切り板（２）を設けて、シャーレ（１）内を
培養部（３）と培養液交換部（４）とに分ける。そし
て、仕切り板（２）の一部に切欠きを設けて、そこに網
目状構造物（５）を取り付ける。網目状構造物（５）を
設けるのは、１ケ所でも良く、複数の部位に分けて設け
ても何ら差しつかえはない。また、図１（ｂ）に示すよ
うに、フラスコ（６）内の開口部近くに、フラスコの高
さの半分の高さの仕切り板（８）を取付け、その仕切り
板（８）の一部に網目状構造物（７）を設けても良い。
えば、図１（ａ）に示すように、シャーレ（１）内にリ
ング状の仕切り板（２）を設けて、シャーレ（１）内を
培養部（３）と培養液交換部（４）とに分ける。そし
て、仕切り板（２）の一部に切欠きを設けて、そこに網
目状構造物（５）を取り付ける。網目状構造物（５）を
設けるのは、１ケ所でも良く、複数の部位に分けて設け
ても何ら差しつかえはない。また、図１（ｂ）に示すよ
うに、フラスコ（６）内の開口部近くに、フラスコの高
さの半分の高さの仕切り板（８）を取付け、その仕切り
板（８）の一部に網目状構造物（７）を設けても良い。
【００１２】本発明において用いる網目状構造物（５，
７）は、細胞は透過させず培養液だけを透過し得るもの
であればよく、そのようなものとしてはナイロンメッシ
ュ、テフロンメッシュ、金属メッシュ等が使用出来る
が、加工性やコストの点からナイロンメッシュが使い易
い。目の大きさとしては、培養の対象となる細胞の大き
さに応じて選択すれば良いが、本発明の対象となる分野
では、５〜１００μｍ、好ましくは５０〜８０μｍ程度
の範囲のメッシュを用いるのが適切である。
７）は、細胞は透過させず培養液だけを透過し得るもの
であればよく、そのようなものとしてはナイロンメッシ
ュ、テフロンメッシュ、金属メッシュ等が使用出来る
が、加工性やコストの点からナイロンメッシュが使い易
い。目の大きさとしては、培養の対象となる細胞の大き
さに応じて選択すれば良いが、本発明の対象となる分野
では、５〜１００μｍ、好ましくは５０〜８０μｍ程度
の範囲のメッシュを用いるのが適切である。
【００１３】本発明によれば、上記のように一般の細胞
培養容器に若干の改良を加えることにより、安価に細胞
または細胞塊の浮遊培養用の容器を得ることができる。
そして、培養部（３）と培養液交換部（４）とは、網目
状構造物（５，７）を介して相互に連通しているので、
培養液を交換する際は、容器を傾けて培養液交換部
（４）内に移行した古い培養液を排出した後、新しい培
養液を注入すれば良く、この時、細胞や細胞塊が損傷さ
れたり、古い培養液と一緒に排出されることはない。
尚、本容器には、少なくとも培養部（３）の内面に、細
胞の接着を防ぐため親水化処理を施しておくのが望まし
い。
培養容器に若干の改良を加えることにより、安価に細胞
または細胞塊の浮遊培養用の容器を得ることができる。
そして、培養部（３）と培養液交換部（４）とは、網目
状構造物（５，７）を介して相互に連通しているので、
培養液を交換する際は、容器を傾けて培養液交換部
（４）内に移行した古い培養液を排出した後、新しい培
養液を注入すれば良く、この時、細胞や細胞塊が損傷さ
れたり、古い培養液と一緒に排出されることはない。
尚、本容器には、少なくとも培養部（３）の内面に、細
胞の接着を防ぐため親水化処理を施しておくのが望まし
い。
【００１４】
【実施例】本発明の有効性を調べるため、ラットの初代
肝細胞の細胞塊（スフェロイド）培養を行なった。麻酔
をかけたウィスター系ラットの門脈より、コラゲナーゼ
０．０５％を含むハンクス緩衝液を還流し、肝臓内にコ
ラゲナーゼが十分に行き渡り酵素が効いていることを確
認した後、肝臓を取り出し細胞濾過器で単細胞に分散し
た細胞を回収し、さらに低速遠心分離を繰り返すことに
より肝細胞のみに精製した。
肝細胞の細胞塊（スフェロイド）培養を行なった。麻酔
をかけたウィスター系ラットの門脈より、コラゲナーゼ
０．０５％を含むハンクス緩衝液を還流し、肝臓内にコ
ラゲナーゼが十分に行き渡り酵素が効いていることを確
認した後、肝臓を取り出し細胞濾過器で単細胞に分散し
た細胞を回収し、さらに低速遠心分離を繰り返すことに
より肝細胞のみに精製した。
【００１５】得られたラット初代肝細胞を、２．５×１
０5細胞／ｍｌの濃度で、本発明による培養容器及び従
来の培養容器に播種し、培養液はライホビッツＬ−１５
を基本培養液とし、添加物として１０％子牛血清、イン
シュリン１×１０-7Ｍ、デキサメサゾン１×１０-7Ｍ、
Ｌ−ブロリン３０μｇ／ｍｌ、上皮細胞増殖因子１０ｎ
ｇ／ｍｌ、及びジメチルスルホキシド２％を加えたもの
を使用し、５％炭酸ガス、９５％空気の炭酸ガス培養装
置で培養した。
０5細胞／ｍｌの濃度で、本発明による培養容器及び従
来の培養容器に播種し、培養液はライホビッツＬ−１５
を基本培養液とし、添加物として１０％子牛血清、イン
シュリン１×１０-7Ｍ、デキサメサゾン１×１０-7Ｍ、
Ｌ−ブロリン３０μｇ／ｍｌ、上皮細胞増殖因子１０ｎ
ｇ／ｍｌ、及びジメチルスルホキシド２％を加えたもの
を使用し、５％炭酸ガス、９５％空気の炭酸ガス培養装
置で培養した。
【００１６】培養液は定期的に交換し、１，７，２８日
目の培養細胞数を求め、さらに培養液中に肝細胞が分泌
するアルブミン量を抗アルブミン抗体を用いたＥＬＩＳ
Ａ法により求めた。その結果は図２に示した通りであっ
た。
目の培養細胞数を求め、さらに培養液中に肝細胞が分泌
するアルブミン量を抗アルブミン抗体を用いたＥＬＩＳ
Ａ法により求めた。その結果は図２に示した通りであっ
た。
【００１７】最初のラット初代肝細胞の播種数は本発明
品も従来品も同じであり、培養１日目の播種細胞数に対
する比に差は見られなかったが、７日後では本発明品で
は播種数比９２％であるのに対して、従来品では５６％
まで減少し、さらに２８日後では本発明品８５％に対
し、従来品では４２％と半分以下にまで減少した。ま
た、アルブミンの分泌量は、１日目の分泌量を１００％
とした場合、７日目で本発明品が８９％であるのに対し
て従来品は５２％に減少し、２８日目には本発明品が８
０％であるのに対して従来品は３５％にまで減少してい
る。光学顕微鏡により観察した結果では、上記のような
本発明品と従来品との差は、培養液交換時の細胞の吸い
込みによる減少、及び遠心操作による細胞の死滅、又は
機能低下によるものと推測される。
品も従来品も同じであり、培養１日目の播種細胞数に対
する比に差は見られなかったが、７日後では本発明品で
は播種数比９２％であるのに対して、従来品では５６％
まで減少し、さらに２８日後では本発明品８５％に対
し、従来品では４２％と半分以下にまで減少した。ま
た、アルブミンの分泌量は、１日目の分泌量を１００％
とした場合、７日目で本発明品が８９％であるのに対し
て従来品は５２％に減少し、２８日目には本発明品が８
０％であるのに対して従来品は３５％にまで減少してい
る。光学顕微鏡により観察した結果では、上記のような
本発明品と従来品との差は、培養液交換時の細胞の吸い
込みによる減少、及び遠心操作による細胞の死滅、又は
機能低下によるものと推測される。
【００１８】
【発明の効果】本発明の浮遊培養用容器を用いることに
より、培養液交換時における細胞や細胞塊の損傷や逸失
がなくなるので、血液系の細胞や初代細胞の培養におい
て、細胞機能の維持に有効な細胞塊（スフェロイド）培
養が容易となり、また長期に安定な培養系を提供するこ
とができるので、血液細胞、抗体産成のための雑種細
胞、及びスフェロイド状の接着性の細胞の培養に有用
で、さらに細胞培養を用いた毒物の毒性試験に有効な試
験系を提供でき、バイオテクノロジー産業及び基礎医
学、臨床検査学、人工臓器学等の医学研究に有効な細胞
培養法を提供するものである。
より、培養液交換時における細胞や細胞塊の損傷や逸失
がなくなるので、血液系の細胞や初代細胞の培養におい
て、細胞機能の維持に有効な細胞塊（スフェロイド）培
養が容易となり、また長期に安定な培養系を提供するこ
とができるので、血液細胞、抗体産成のための雑種細
胞、及びスフェロイド状の接着性の細胞の培養に有用
で、さらに細胞培養を用いた毒物の毒性試験に有効な試
験系を提供でき、バイオテクノロジー産業及び基礎医
学、臨床検査学、人工臓器学等の医学研究に有効な細胞
培養法を提供するものである。
【図１】本発明の一実施例となる細胞浮遊培養用容器の
構造を示す図である。
構造を示す図である。
【図２】実施例における試験結果を示す図で、（ａ）は
ラット初代肝細胞培養における培養１，７，２８日の目
細胞数の最初の播種細胞数に対する比、（ｂ）は同じく
培養液中のアルブミン量の変化を示した図である。
ラット初代肝細胞培養における培養１，７，２８日の目
細胞数の最初の播種細胞数に対する比、（ｂ）は同じく
培養液中のアルブミン量の変化を示した図である。
１ シャーレ ２，８ 仕切り板 ３ 培養部 ４ 培養液交換部 ５，７ 網目状構造物
Claims (3)
- 【請求項１】 一つの容器内に、細胞または細胞塊を培
養するための領域（培養部）と、培養液を交換するため
の領域（培養液交換部）とを設けたことを特徴とする細
胞浮遊培養用容器。 - 【請求項２】 培養部と培養液交換部との境界の少なく
とも一部に、細胞は透過せず培養液は透過しうる網目状
の構造物を設けたことを特徴とする、請求項（１）記載
の細胞浮遊培養用容器。 - 【請求項３】 培養部が親水化処理されていることを特
徴とする、請求項（１）もしくは請求項（２）記載の細
胞浮遊培養用容器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20982294A JPH0870847A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 細胞浮遊培養用容器 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20982294A JPH0870847A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 細胞浮遊培養用容器 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870847A true JPH0870847A (ja) | 1996-03-19 |
Family
ID=16579194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20982294A Pending JPH0870847A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 細胞浮遊培養用容器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0870847A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1128082A (ja) * | 1997-07-11 | 1999-02-02 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 培養容器 |
| US6210959B1 (en) | 1998-09-25 | 2001-04-03 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Apparatus for the cultivation and concentration of non-adherent cells as well as for co-cultivation of two different cell species |
| JP2004129558A (ja) * | 2002-10-10 | 2004-04-30 | Inst Of Physical & Chemical Res | 細胞培養用容器、スクレーパーおよび細胞培養方法 |
| JP2005514042A (ja) * | 2002-01-14 | 2005-05-19 | ユニヴァーシティ オブ ザ ウエスト オブ イングランド ブリストル | 毒性試験 |
| US7052720B1 (en) | 1999-06-17 | 2006-05-30 | University Of Wales College Of Medicine | Spheroid preparation |
| JP2009273399A (ja) * | 2008-05-14 | 2009-11-26 | Asahikawa Poultry Kk | 培養装置および培養方法 |
| JP2011019413A (ja) * | 2009-07-14 | 2011-02-03 | Scivax Kk | 細胞剥離抑制器具及びこれを用いた培養容器、細胞剥離抑制方法 |
| JP2015142525A (ja) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 大日本印刷株式会社 | 細胞積層体を製造するための細胞培養容器 |
| WO2016185221A1 (en) * | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Christopher Mason | Cell culture device, system and methods of use thereof |
| JP2019520065A (ja) * | 2016-06-03 | 2019-07-18 | ロンザ リミテッドＬｏｎｚａ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 使い捨てバイオリアクター |
-
1994
- 1994-09-02 JP JP20982294A patent/JPH0870847A/ja active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1128082A (ja) * | 1997-07-11 | 1999-02-02 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 培養容器 |
| US6210959B1 (en) | 1998-09-25 | 2001-04-03 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Apparatus for the cultivation and concentration of non-adherent cells as well as for co-cultivation of two different cell species |
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| WO2016185221A1 (en) * | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Christopher Mason | Cell culture device, system and methods of use thereof |
| JP2018515144A (ja) * | 2015-05-21 | 2018-06-14 | オリビオテック リミティド | 細胞培養装置、システム及びその使用方法 |
| JP2021106591A (ja) * | 2015-05-21 | 2021-07-29 | オリビオテック リミティド | 細胞培養装置、システム及びその使用方法 |
| US11884911B2 (en) | 2015-05-21 | 2024-01-30 | Oribiotech Ltd. | Cell culture device, system and methods of use thereof |
| US12344832B2 (en) | 2015-05-21 | 2025-07-01 | Oribiotech Ltd. | Cell culture device, system and methods of use thereof |
| JP2019520065A (ja) * | 2016-06-03 | 2019-07-18 | ロンザ リミテッドＬｏｎｚａ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 使い捨てバイオリアクター |
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