JPH0870896A - 新規核酸断片およびこれらを用いたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｊ１株の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.
Ｊ１株の正確な検出。 【構成】 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.
Ｊ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から抽出した特異配列
をプライマーまたはプローブとして用いて検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規核酸断片およびその
用途に関する。詳しくは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｐ. Ｊ１株を検出するためのプライマーまた
はプローブとして利用可能な核酸断片、およびそれを構
成している塩基配列の部分配列、およびこれらを用いた
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検
出法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌
は、グラム陽性の桿菌で、きわめて多彩な有機化合物を
代謝する能力を持ち、特に各種芳香族化合物の分解能に
優れていることが知られている。

【０００３】近年、芳香族化合物、パラフィン、ナフテ
ンなどの脂肪族炭化水素、あるいはトリクロロエチレン
などの有機塩素系化合物などによる環境汚染が問題とな
っており、すでに汚染されてしまった環境を浄化し、も
との状態に修復していく技術の確立が強く求められてい
る。この環境修復技術としては種々の物理化学的な手法
が行われているが、コスト、操作性、投下エネルギー
量、処理範囲などに係る難点、汚染物質の単なる抽出、
回収に留まり無害な化学物に変換するものではないなど
の観点より、必ずしも実用的に満足できる技術であると
はいえない。

【０００４】そこで、上記の物理化学的手法に対して、
微生物を利用した処理が実用的な汚染環境の修復方法を
提供できるものとして期待されている。ここで、汚染物
質の多くは化学工業などで使用される合成物質であり、
自然界に生息する微生物によっては普遍的には分解され
ないためその処理が容易でないものが多い。しかし、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は先に述べたよう
にきわめて多彩な有機化合物を代謝する能力を持ってお
り、土壌汚染問題を引き起こしている芳香族炭化水素や
有機塩素系化合物などの難分解性化合物と言われるもの
でも分解することができる菌株が数多く分離されてきて
いる。とりわけトリクロロエチレン分解菌の開発は盛ん
に進められており、その分解活性を向上させたり、ある
いはトリクロロエチレン分解酵素の誘導物質を不要化し
たりした遺伝子組み換え菌の土壌への散布なども検討さ
れはじめてきている。

【０００５】ここで、発明者らはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株（寄託番号：Ｐ−１４３３
２号）がトリクロロエチレンを分解することを明らかに
しており、このようなＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属細菌を利用した環境浄化技術を普及させ、さらにこの
技術を実用的かつ社会的に有効な技術として定着させて
いくために、分解能力などにすぐれた菌の開発ととも
に、それらを導入した土壌における菌の活動、増殖、伝
搬、生残、つまりは土壌中での菌の優占度、生育状況な
どを十分に把握していくことを研究している。これらの
課題を解決していくためには、目的とする菌を選択的に
検出することができる手法の確立がまず必要不可欠であ
る。

【０００６】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の
検出方法としては種々の分離培養法が知られており、一
般的には特別な培地による選択培養を行うことが多い。
この方法は簡便であるため広く用いられるが、目的とす
る菌のみが必ずしも選択的に培養されるとは限らない。
たとえば、フェノールを分解する菌であるＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の場合には、カテ
コールのカテコール２，３オキシゲナーゼによる分解産
物である２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドの黄色
の着色を簡便な指標とすることができる。しかしなが
ら、カテコールをメタ開裂により代謝できる他の菌が存
在する可能性もあり、厳密には黄色の着色のみをその指
標とすることはできず、更に詳細な形態学的、あるいは
生化学的な性状をも検査する必要がある。

【０００７】しかしここで必要となる形態学的、あるい
は生化学的な性状から目的とする菌を検出するには数多
の熟練と経験を要し、しかもその手法は煩雑であり時間
がかかるなど、実用面では種々の問題があった。

【０００８】また、目的とする菌に特異的な抗体を用意
し放射性同位元素または蛍光色素でラベルし検出に用い
る方法も知られているが、この方法はまず抗体を得るの
に非常に手間がかかる点と、更に抗体の特異性がロット
により大きくばらつく点が大きな難点であった。

【０００９】これらの方法に代るものとして、生物種に
特異的な核酸の塩基配列に着目し、それに相補的な配列
を持つオリゴヌクレオチドプライマーあるいはプローブ
を利用することによりその生物種を検出する方法が発表
されている。特に、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は
生物において必須の細胞構成成分であり、その構造は生
物の進化の過程において比較的よく保存されている。ｒ
ＲＮＡの中でも１６ＳｒＲＮＡについては比較的よく研
究が行われており、多くの生物種についてその塩基配列
が同定されている。

【００１０】１６Ｓ ｒＲＮＡには種々の生物で共通に
保存されている領域と、生物種により配列の異なる可変
領域のあることが知られており、この可変領域に対応す
るＤＮＡプライマーあるいはプローブを利用した菌の検
出、同定法が近年開発されてきた。たとえば、ｒＲＮＡ
は細胞中に１０⁴ 個以上存在し、ハイブリダイゼーシ
ョン法のターゲットとしては感度の面からも非常に有利
に利用できるものであるが、ここでは、目的とする菌を
検出するためのプローブまたはプライマーをいかに選択
するかの点こそが最も重要かつ困難な課題となってお
り、この方法を利用するためには目的とする細菌の１６
Ｓ ｒＲＮＡ、あるいはその遺伝子の塩基配列を正しく
知る必要がある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、特定の
微生物を利用して土壌中の汚染物質の浄化処理を行う場
合、処理の条件や微生物の生育条件を最適にするために
は、まづその微生物の土壌中での優占度や生育状況を知
る必要がある。そのためには微生物を特異的に検出、計
測できる方法が必要であるが、いままでのＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の検出はフェノールを唯一の
炭素源とする選択培地による培養や、抗体法などによる
もので、その特異性、感度、簡便さ、検出に要する時間
などの点で問題が多く、土壌中での菌の挙動をリアルタ
イムでモニタリングすることは不可能であった。

【００１２】本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなさ
れたものであり、その目的は迅速、簡易かつ特異的に、
しかも感度よくＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ.Ｊ１株を検出、計数する方法を提供することにあ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、後記の配列番
号１で表されるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ. Ｊ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を提供するもの
である。本発明はまた、上記遺伝子配列で示される核
酸、ならびに、その相補的な塩基配列を有する核酸、お
よび、これらの変異配列で示される核酸から選ばれる核
酸断片に関するものである。

【００１４】本発明は、また、上記のいずれかの核酸中
の部分配列であってプライマーまたはプローブとして利
用可能な核酸からなる核酸断片に関する。具体的には、
プライマーとして利用可能な核酸が１０〜５０塩基の長
さであり、プローブとして利用可能な核酸が１０塩基か
ら上限は各核酸の全塩基数以下の長さの核酸断片であ
る。

【００１５】また、本発明は上記核酸断片を利用したプ
ライマーまたはプローブに関する。すなわち本発明によ
るプライマーまたはプローブは、上記したような核酸断
片であって、標識物または（および）固相担体と結合可
能な部位が導入されている場合もある核酸断片からなる
プライマーまたはプローブである。

【００１６】本発明は、また、上記のプライマー、ある
いはプローブを利用したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出方法に関する。すなわち、プ
ライマーを利用した本発明によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出方法は、上記したよ
うな本発明によるプライマー、好ましくは２種の組み合
わせからなるプライマーを用いて、下記（１）〜（４）
の工程を実施することを特徴とするものである。 （１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１
株の有無を検出したい試料を準備し、（２）必要に応じ
て、試料中の菌体の破砕処理を行い、（３）試料に上記
プライマーを加えプライマーの伸張反応を行い、（４）
工程（３）で得られた伸張反応物について検出操作を行
う。

【００１７】また、プローブを利用した本発明によるＣ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出
方法は、前記したようなプローブの少なくとも１種を用
いることを特徴とするものである。

【００１８】以下、本発明を詳細に説明するが、ここで
いうＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株
は、この発明の目的に適う限りにおいて遺伝子工学の常
識に従って同等の作用を奏するその突然変異株も包含す
るものである。

【００１９】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.
Ｊ１株１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング、全塩
基配列の決定 既知の種々の好気性細菌のｒＲＮＡ塩基配列を比較し、
共通配列領域の推定を行った。次に、この領域よりプラ
イマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法によりＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株ＤＮＡ中の１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子領域内の約１１００塩基の断片を増幅
し、プラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位に
クローニングした。得られた遺伝子の塩基配列を決定
し、既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列との比較により、
この断片が１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子であることを確認し
た。

【００２０】この遺伝子断片を用いて、完全長の、ＰＣ
Ｒを経由しない１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング
を行った。まず、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ.Ｊ１株ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで切断し、λファージ
ベクターＤＡＳＨＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ライ
ブラリーを調製した。これを上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝
子部分断片をプローブとしたプラークハイブリダイゼー
ション法によりスクリーニングし、完全長の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子を含むクローンを選択した。

【００２１】塩基配列の決定は欠失法と適当な制限酵素
切断部位を利用したサブクローニングにより行った。欠
失は、プラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位
に完全長の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をリクローニングの
後、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ とＭｕｎｇ Ｂｅ
ａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅにより段階的に導入した。これ
らの段階欠失クローンおよび制限酵素を利用したサブク
ローンを用いて、ダイデオキシ法により塩基配列の決定
を行った。

【００２２】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.
Ｊ１株１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特異領域の決定 上記のようにして決定した塩基配列を、既知の他種細菌
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列と比較し、特異領域を
決定した。この場合ＥＭＢＬ核酸配列データライブラリ
などを利用しパーソナル・コンピュータを利用して解析
を行った。

【００２３】決定した特異領域は、新規な塩基配列であ
り本発明の目的に利用可能性を備えているから特許請求
の範囲請求項３に列記して特許請求するものである。

【００２４】核酸断片 本発明による核酸断片は、配列番号１で示す核酸、なら
びに、その相補的な塩基配列を有する核酸、および、こ
れらの変異配列で示される核酸から選ばれる核酸断片、
また、上記のいずれかの核酸中の部分配列であってプラ
イマーまたはプローブとして利用可能な核酸からなるも
のであることは前記したとおりである。

【００２５】これらの核酸断片は、特にプローブとし
て、また、部分塩基配列はプライマーまたはプローブと
して使用することができる。プライマーまたはプローブ
として利用可能な核酸は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｐ. Ｊ１株を検出するためのプライマー、あ
るいはプローブとして機能するものであればよい。ここ
で、部分塩基配列を用いる場合には、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.Ｊ１株に特異的で、他の細菌、
たとえばＰ．ｃｅｐａｃｉａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細
菌、土壌よりよく分離される、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
属細菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｃｅａｅ属細菌などに相同性の少ない部分を選択するこ
とが好ましい。部分塩基配列は具体的には、プライマー
の場合、１０〜５０塩基の長さであり、プローブの場合
は１０塩基の長さから各核酸の全塩基数以下の長さのも
のである。

【００２６】これらの核酸断片あるいはその部分塩基配
列は、合目的的な任意の方法により調製することがで
き、たとえば後述実施例に記載の方法に従い、配列全部
または一部を化学合成してもよい。あるいは、Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の遺伝子から
制限酵素などを利用して直接切り出すことも可能であ
り、また、それらの遺伝子をＥ．ｃｏｌｉなどのプラス
ミドにクローニングし、菌の増殖の後にプラスミドを回
収し、切り出して利用することも可能である。

【００２７】本発明における上記核酸断片における変異
としては、たとえば一部の塩基もしくは塩基配列の欠
失、置換、付加などがあげられる。ここで核酸断片をプ
ライマーとして利用する場合は、プライマーの伸張反応
に大きな影響を与えると考えられる３′末端付近は変異
のないようにするか、あるいはあっても最小限にとどめ
ることが好ましく、より好適には５′末端付近で変異が
あるようにすることが本発明の目的に適う。

【００２８】ここで好適に利用できる核酸断片の塩基配
列としては、勿論前記の特異領域にそのすべてないしは
大部分が由来し僅かの隣接部分を有するもので目的遂行
に便利な程度の塩基長のものとして発明者は特許請求の
範囲の請求項６で示しているものを提出する。なお理解
の便宜の為に次にこれらの塩基配列を配列表１に示した
塩基番号を併記し再掲しておく。

【００２９】 配列番号 配列位置 塩基配列 1 1547 - 1570 : GGTAAGAATCCACAACAAGTCGTT 2 1529 - 1552 : AACGAAAGATTGACGATTGGTAAG 3 1440 - 1458 : AGGAGGACGCTTACCACGG 4 1428 - 1449 : AGTCTAACCGCAAGGAGGACGC 5 1428 - 1446 : AGTCTAACCGCAAGGAGGA 6 1428 - 1445 : AGTCTAACCGCAAGGAGG 7 1322 - 1341 : TCGGAATCGCTAGTAATCGC 8 1321 - 1341 : GTCGGAATCGCTAGTAATCGC 9 1321 - 1340 : GTCGGAATCGCTAGTAATCG 10 1320 - 1341 : AGTCGGAATCGCTAGTAATCGC 11 1320 - 1340 : AGTCGGAATCGCTAGTAATCG 12 1319 - 1341 : AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC 13 1319 - 1340 : AAGTCGGAATCGCTAGTAATCG 14 1319 - 1339 : AAGTCGGAATCGCTAGTAATC 15 1319 - 1338 : AAGTCGGAATCGCTAGTAAT 16 1319 - 1336 : AAGTCGGAATCGCTAGTA 17 1318 - 1341 : GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC 18 1318 - 1340 : GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG 19 1318 - 1339 : GAAGTCGGAATCGCTAGTAATC 20 1318 - 1337 : GAAGTCGGAATCGCTAGTAA 21 1317 - 1340 : TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG 22 1316 - 1339 : ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC 23 1316 - 1334 : ATGAAGTCGGAATCGCTAG 24 1315 - 1335 : CATGAAGTCGGAATCGCTAGT 25 1314 - 1335 : CCATGAAGTCGGAATCGCTAGT 26 1314 - 1334 : CCATGAAGTCGGAATCGCTAG 27 1314 - 1332 : CCATGAAGTCGGAATCGCT 28 1303 - 1321 : GCAACTCGACTCCATGAAG 29 1303 - 1320 : GCAACTCGACTCCATGAA 30 1302 - 1321 : TGCAACTCGACTCCATGAAG 31 1302 - 1319 : TGCAACTCGACTCCATGA 32 1301 - 1321 : CTGCAACTCGACTCCATGAAG 33 1301 - 1320 : CTGCAACTCGACTCCATGAA 34 1301 - 1319 : CTGCAACTCGACTCCATGA 35 1300 - 1321 : TCTGCAACTCGACTCCATGAAG 36 1300 - 1320 : TCTGCAACTCGACTCCATGAA 37 1300 - 1319 : TCTGCAACTCGACTCCATGA 38 1300 - 1318 : TCTGCAACTCGACTCCATG 39 1224 - 1242 : CAATGGTCGGTACAAAGGG 40 1216 - 1234 : ACGTGCTACAATGGTCGGT 41 1201 - 1219 : CGACCAGGGCTACACACGT 42 1201 - 1218 : CGACCAGGGCTACACACG 43 1200 - 1218 : ACGACCAGGGCTACACACG 44 1199 - 1219 : TACGACCAGGGCTACACACGT 45 1198 - 1219 : TTACGACCAGGGCTACACACGT 46 1198 - 1218 : TTACGACCAGGGCTACACACG 47 1198 - 1216 : TTACGACCAGGGCTACACA 48 1111 - 1128 : TTGCCAGCGGGTTAAGCC 49 1110 - 1128 : TTTGCCAGCGGGTTAAGCC 50 1110 - 1127 : TTTGCCAGCGGGTTAAGC 51 1109 - 1128 : ATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 52 1109 - 1127 : ATTTGCCAGCGGGTTAAGC 53 1109 - 1126 : ATTTGCCAGCGGGTTAAG 54 1108 - 1128 : TATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 55 1108 - 1127 : TATTTGCCAGCGGGTTAAGC 56 1108 - 1126 : TATTTGCCAGCGGGTTAAG 57 1108 - 1125 : TATTTGCCAGCGGGTTAA 58 1107 - 1128 : TTATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 59 1107 - 1127 : TTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 60 1107 - 1126 : TTATTTGCCAGCGGGTTAAG 61 1107 - 1125 : TTATTTGCCAGCGGGTTAA 62 1107 - 1124 : TTATTTGCCAGCGGGTTA 63 1106 - 1128 : CTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 64 1106 - 1127 : CTTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 65 1106 - 1126 : CTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 66 1106 - 1125 : CTTATTTGCCAGCGGGTTAA 67 1106 - 1124 : CTTATTTGCCAGCGGGTTA 68 1106 - 1123 : CTTATTTGCCAGCGGGTT 69 1105 - 1128 : CCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 70 1105 - 1127 : CCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 71 1105 - 1126 : CCTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 72 1105 - 1125 : CCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 73 1105 - 1124 : CCTTATTTGCCAGCGGGTTA 74 1105 - 1123 : CCTTATTTGCCAGCGGGTT 75 1105 - 1122 : CCTTATTTGCCAGCGGGT 76 1104 - 1127 : TCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 77 1104 - 1126 : TCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 78 1104 - 1125 : TCCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 79 1104 - 1124 : TCCTTATTTGCCAGCGGGTTA 80 1104 - 1123 : TCCTTATTTGCCAGCGGGTT 81 1104 - 1122 : TCCTTATTTGCCAGCGGGT 82 1104 - 1121 : TCCTTATTTGCCAGCGGG 83 1103 - 1126 : TTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 84 1103 - 1125 : TTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 85 1103 - 1124 : TTCCTTATTTGCCAGCGGGTTA 86 1103 - 1123 : TTCCTTATTTGCCAGCGGGTT 87 1103 - 1121 : TTCCTTATTTGCCAGCGGG 89 1102 - 1125 : TTTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 90 1010 - 1029 : GTGCCTTCGGGAACTTACAT 91 1002 - 1022 : GATGGATTGGTGCCTTCGGGA 92 1001 - 1022 : AGATGGATTGGTGCCTTCGGGA 93 1001 - 1021 : AGATGGATTGGTGCCTTCGGG 94 1000 - 1022 : GAGATGGATTGGTGCCTTCGGGA 95 1000 - 1021 : GAGATGGATTGGTGCCTTCGGG 96 1000 - 1020 : GAGATGGATTGGTGCCTTCGG 97 999 - 1022 : AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGA 98 999 - 1021 : AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGG 99 999 - 1020 : AGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 100 999 - 1019 : AGAGATGGATTGGTGCCTTCG 101 998 - 1021 : CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGG 102 998 - 1020 : CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 103 998 - 1019 : CAGAGATGGATTGGTGCCTTCG 104 998 - 1018 : CAGAGATGGATTGGTGCCTTC 105 984 - 1004 : TAGTAAGAACTTTCCAGAGAT 106 828 - 846 : CTTTGAGGCTTTAGTGGCG 107 732 - 750 : CTAATACTGACGCTGAGGT 108 732 - 749 : CTAATACTGACGCTGAGG 109 731 - 749 : CCTAATACTGACGCTGAGG 110 730 - 750 : GCCTAATACTGACGCTGAGGT 111 730 - 749 : GCCTAATACTGACGCTGAGG 112 730 - 748 : GCCTAATACTGACGCTGAG 113 729 - 750 : GGCCTAATACTGACGCTGAGGT 114 729 - 749 : GGCCTAATACTGACGCTGAGG 115 728 - 750 : TGGCCTAATACTGACGCTGAGGT 116 728 - 749 : TGGCCTAATACTGACGCTGAGG 117 728 - 748 : TGGCCTAATACTGACGCTGAG 118 728 - 746 : TGGCCTAATACTGACGCTG 119 727 - 750 : CTGGCCTAATACTGACGCTGAGGT 120 727 - 749 : CTGGCCTAATACTGACGCTGAGG 121 727 - 748 : CTGGCCTAATACTGACGCTGAG 122 726 - 749 : TCTGGCCTAATACTGACGCTGAGG 123 726 - 748 : TCTGGCCTAATACTGACGCTGAG 124 726 - 747 : TCTGGCCTAATACTGACGCTGA 125 726 - 746 : TCTGGCCTAATACTGACGCTG 126 726 - 744 : TCTGGCCTAATACTGACGC 127 725 - 748 : ATCTGGCCTAATACTGACGCTGAG 128 725 - 747 : ATCTGGCCTAATACTGACGCTGA 129 725 - 746 : ATCTGGCCTAATACTGACGCTG 130 725 - 745 : ATCTGGCCTAATACTGACGCT 131 724 - 747 : CATCTGGCCTAATACTGACGCTGA 132 724 - 746 : CATCTGGCCTAATACTGACGCTG 133 724 - 745 : CATCTGGCCTAATACTGACGCT 134 724 - 744 : CATCTGGCCTAATACTGACGC 135 705 - 723 : TACCGATGGCGAAGGCAGC 136 704 - 722 : ATACCGATGGCGAAGGCAG 137 703 - 723 : AATACCGATGGCGAAGGCAGC 138 703 - 721 : AATACCGATGGCGAAGGCA 139 702 - 723 : GAATACCGATGGCGAAGGCAGC 140 702 - 722 : GAATACCGATGGCGAAGGCAG 141 702 - 721 : GAATACCGATGGCGAAGGCA 142 702 - 720 : GAATACCGATGGCGAAGGC 143 701 - 723 : GGAATACCGATGGCGAAGGCAGC 144 701 - 722 : GGAATACCGATGGCGAAGGCAG 145 701 - 721 : GGAATACCGATGGCGAAGGCA 146 700 - 723 : AGGAATACCGATGGCGAAGGCAGC 147 700 - 722 : AGGAATACCGATGGCGAAGGCAG 148 700 - 721 : AGGAATACCGATGGCGAAGGCA 149 700 - 720 : AGGAATACCGATGGCGAAGGC 150 699 - 722 : GAGGAATACCGATGGCGAAGGCAG 151 699 - 721 : GAGGAATACCGATGGCGAAGGCA 152 699 - 720 : GAGGAATACCGATGGCGAAGGC 153 699 - 719 : GAGGAATACCGATGGCGAAGG 154 699 - 717 : GAGGAATACCGATGGCGAA 155 699 - 716 : GAGGAATACCGATGGCGA 156 698 - 721 : GGAGGAATACCGATGGCGAAGGCA 157 698 - 720 : GGAGGAATACCGATGGCGAAGGC 158 698 - 719 : GGAGGAATACCGATGGCGAAGG 159 698 - 718 : GGAGGAATACCGATGGCGAAG 160 698 - 717 : GGAGGAATACCGATGGCGAA 161 698 - 716 : GGAGGAATACCGATGGCGA 162 698 - 715 : GGAGGAATACCGATGGCG 163 697 - 720 : TGGAGGAATACCGATGGCGAAGGC 164 697 - 719 : TGGAGGAATACCGATGGCGAAGG 165 697 - 718 : TGGAGGAATACCGATGGCGAAG 166 697 - 717 : TGGAGGAATACCGATGGCGAA 167 697 - 716 : TGGAGGAATACCGATGGCGA 168 697 - 715 : TGGAGGAATACCGATGGCG 169 697 - 714 : TGGAGGAATACCGATGGC 170 696 - 719 : CTGGAGGAATACCGATGGCGAAGG 171 696 - 718 : CTGGAGGAATACCGATGGCGAAG 172 696 - 717 : CTGGAGGAATACCGATGGCGAA 173 696 - 716 : CTGGAGGAATACCGATGGCGA 174 696 - 715 : CTGGAGGAATACCGATGGCG 175 696 - 714 : CTGGAGGAATACCGATGGC 176 695 - 718 : TCTGGAGGAATACCGATGGCGAAG 177 695 - 717 : TCTGGAGGAATACCGATGGCGAA 178 695 - 716 : TCTGGAGGAATACCGATGGCGA 179 695 - 715 : TCTGGAGGAATACCGATGGCG 180 695 - 714 : TCTGGAGGAATACCGATGGC 181 695 - 713 : TCTGGAGGAATACCGATGG 182 694 - 717 : ATCTGGAGGAATACCGATGGCGAA 183 694 - 716 : ATCTGGAGGAATACCGATGGCGA 184 694 - 715 : ATCTGGAGGAATACCGATGGCG 185 694 - 714 : ATCTGGAGGAATACCGATGGC 186 694 - 713 : ATCTGGAGGAATACCGATGG 187 693 - 716 : GATCTGGAGGAATACCGATGGCGA 189 693 - 715 : GATCTGGAGGAATACCGATGGCG 190 693 - 714 : GATCTGGAGGAATACCGATGGC 191 693 - 713 : GATCTGGAGGAATACCGATGG 192 693 - 712 : GATCTGGAGGAATACCGATG 193 693 - 710 : GATCTGGAGGAATACCGA 194 675 - 696 : AGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 195 674 - 696 : TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 196 674 - 695 : TAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT 197 673 - 696 : GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 198 673 - 694 : GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA 199 672 - 695 : TGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT 200 668 - 689 : AGGTTGTAGCGGTGAAATGCGT 201 667 - 690 : CAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGTA 202 667 - 689 : CAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGT 203 667 - 688 : CAGGTTGTAGCGGTGAAATGCG 204 666 - 689 : CCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGT 205 666 - 688 : CCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCG 206 666 - 687 : CCAGGTTGTAGCGGTGAAATGC 207 665 - 688 : TCCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCG 208 644 - 662 : TATGGGAGAGGATGGTAGA 209 643 - 663 : GTATGGGAGAGGATGGTAGAA 210 643 - 662 : GTATGGGAGAGGATGGTAGA 211 643 - 661 : GTATGGGAGAGGATGGTAG 212 643 - 660 : GTATGGGAGAGGATGGTA 213 642 - 663 : AGTATGGGAGAGGATGGTAGAA 214 642 - 662 : AGTATGGGAGAGGATGGTAGA 215 642 - 661 : AGTATGGGAGAGGATGGTAG 216 642 - 660 : AGTATGGGAGAGGATGGTA 217 641 - 664 : GAGTATGGGAGAGGATGGTAGAAT 218 641 - 662 : GAGTATGGGAGAGGATGGTAGA 219 641 - 661 : GAGTATGGGAGAGGATGGTAG 220 641 - 660 : GAGTATGGGAGAGGATGGTA 221 641 - 659 : GAGTATGGGAGAGGATGGT 222 641 - 658 : GAGTATGGGAGAGGATGG 223 640 - 663 : AGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAA 224 640 - 662 : AGAGTATGGGAGAGGATGGTAGA 225 640 - 661 : AGAGTATGGGAGAGGATGGTAG 226 640 - 660 : AGAGTATGGGAGAGGATGGTA 227 640 - 659 : AGAGTATGGGAGAGGATGGT 228 640 - 658 : AGAGTATGGGAGAGGATGG 229 640 - 657 : AGAGTATGGGAGAGGATG 230 639 - 662 : TAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGA 231 639 - 661 : TAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG 232 639 - 660 : TAGAGTATGGGAGAGGATGGTA 233 639 - 659 : TAGAGTATGGGAGAGGATGGT 234 639 - 658 : TAGAGTATGGGAGAGGATGG 235 639 - 657 : TAGAGTATGGGAGAGGATG 236 638 - 661 : CTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG 237 638 - 660 : CTAGAGTATGGGAGAGGATGGTA 238 638 - 659 : CTAGAGTATGGGAGAGGATGGT 239 638 - 658 : CTAGAGTATGGGAGAGGATGG 240 638 - 657 : CTAGAGTATGGGAGAGGATG 241 638 - 656 : CTAGAGTATGGGAGAGGAT 242 638 - 655 : CTAGAGTATGGGAGAGGA 243 637 - 660 : GCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTA 244 637 - 659 : GCTAGAGTATGGGAGAGGATGGT 245 637 - 658 : GCTAGAGTATGGGAGAGGATGG 246 637 - 657 : GCTAGAGTATGGGAGAGGATG 247 637 - 655 : GCTAGAGTATGGGAGAGGA 248 636 - 659 : AGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGT 249 636 - 658 : AGCTAGAGTATGGGAGAGGATGG 250 636 - 657 : AGCTAGAGTATGGGAGAGGATG 251 636 - 656 : AGCTAGAGTATGGGAGAGGAT 252 636 - 655 : AGCTAGAGTATGGGAGAGGA 253 636 - 654 : AGCTAGAGTATGGGAGAGG 254 635 - 658 : AAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGG 255 635 - 657 : AAGCTAGAGTATGGGAGAGGATG 256 635 - 656 : AAGCTAGAGTATGGGAGAGGAT 257 635 - 655 : AAGCTAGAGTATGGGAGAGGA 258 635 - 654 : AAGCTAGAGTATGGGAGAGG 259 635 - 653 : AAGCTAGAGTATGGGAGAG 260 625 - 643 : CGATACTGGGAAGCTAGAG 261 625 - 642 : CGATACTGGGAAGCTAGA 262 624 - 642 : TCGATACTGGGAAGCTAGA 263 624 - 641 : TCGATACTGGGAAGCTAG 264 590 - 610 : TGTGAAATCCCTGAGCTTAAC 265 590 - 609 : TGTGAAATCCCTGAGCTTAA 266 590 - 608 : TGTGAAATCCCTGAGCTTA 267 589 - 610 : ATGTGAAATCCCTGAGCTTAAC 268 589 - 609 : ATGTGAAATCCCTGAGCTTAA 269 589 - 608 : ATGTGAAATCCCTGAGCTTA 270 589 - 607 : ATGTGAAATCCCTGAGCTT 271 589 - 606 : ATGTGAAATCCCTGAGCT 272 465 - 485 : GTGGACGTTACTCGCAGAATA 273 465 - 483 : GTGGACGTTACTCGCAGAA 274 465 - 482 : GTGGACGTTACTCGCAGA 275 448 - 467 : ATTAATACTCTAGGATAGTG 276 426 - 448 : AAGCGAGGAGGAGGCTACTTAGAT 277 423 - 440 : TTTAAGCGAGGAGGAGGC 278 207 - 228 : GCTAATAGATGAGCCTAAGTCA 279 194 - 213 : CTTCGGACCTTGCGCTAATA 280 193 - 212 : TCTTCGGACCTTGCGCTAAT 281 193 - 211 : TCTTCGGACCTTGCGCTAA 282 193 - 210 : TCTTCGGACCTTGCGCTA 283 192 - 212 : ATCTTCGGACCTTGCGCTAAT 284 192 - 210 : ATCTTCGGACCTTGCGCTA 285 191 - 212 : GATCTTCGGACCTTGCGCTAAT 286 190 - 213 : GGATCTTCGGACCTTGCGCTAATA 287 185 - 206 : GCAGGGGATCTTCGGACCTTGC 289 184 - 205 : AGCAGGGGATCTTCGGACCTTG 290 184 - 204 : AGCAGGGGATCTTCGGACCTT 291 184 - 202 : AGCAGGGGATCTTCGGACC 292 161 - 178 : ACCGCATACGCCCTACGG 293 160 - 178 : TACCGCATACGCCCTACGG 294 160 - 177 : TACCGCATACGCCCTACG 295 159 - 178 : ATACCGCATACGCCCTACGG 296 159 - 177 : ATACCGCATACGCCCTACG 297 159 - 176 : ATACCGCATACGCCCTAC 298 158 - 178 : AATACCGCATACGCCCTACGG 299 158 - 177 : AATACCGCATACGCCCTACG 300 158 - 176 : AATACCGCATACGCCCTAC 301 158 - 175 : AATACCGCATACGCCCTA 302 157 - 178 : TAATACCGCATACGCCCTACGG 303 157 - 177 : TAATACCGCATACGCCCTACG 304 157 - 176 : TAATACCGCATACGCCCTAC 305 157 - 175 : TAATACCGCATACGCCCTA 306 157 - 174 : TAATACCGCATACGCCCT 307 156 - 178 : CTAATACCGCATACGCCCTACGG 308 156 - 177 : CTAATACCGCATACGCCCTACG 309 156 - 176 : CTAATACCGCATACGCCCTAC 310 156 - 174 : CTAATACCGCATACGCCCT 311 156 - 173 : CTAATACCGCATACGCCC 312 155 - 178 : GCTAATACCGCATACGCCCTACGG 313 155 - 177 : GCTAATACCGCATACGCCCTACG 314 155 - 176 : GCTAATACCGCATACGCCCTAC 315 155 - 175 : GCTAATACCGCATACGCCCTA 316 155 - 174 : GCTAATACCGCATACGCCCT 317 155 - 173 : GCTAATACCGCATACGCCC 318 147 - 165 : AAAGGAATGCTAATACCGC 319 146 - 164 : GAAAGGAATGCTAATACCG 320 146 - 163 : GAAAGGAATGCTAATACC 321 145 - 165 : CGAAAGGAATGCTAATACCGC 322 144 - 165 : CCGAAAGGAATGCTAATACCGC 323 137 - 155 : CAACATTCCGAAAGGAATGC 324 124 - 144 : TATTAGTGGGGGACAACATTC 325 124 - 142 : TATTAGTGGGGGACAACAT 326 89 - 110 : GCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 327 89 - 109 : GCGGCGGACGGGTGAGTAATG 328 89 - 107 : GCGGCGGACGGGTGAGTAA 329 88 - 111 : AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCT 330 88 - 110 : AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 331 88 - 109 : AGCGGCGGACGGGTGAGTAATG 332 88 - 108 : AGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 333 88 - 106 : AGCGGCGGACGGGTGAGTA 334 87 - 110 : TAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 335 87 - 109 : TAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG 336 87 - 108 : TAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 337 87 - 107 : TAGCGGCGGACGGGTGAGTAA 338 87 - 105 : TAGCGGCGGACGGGTGAGT 339 86 - 109 : CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG 340 86 - 108 : CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 341 86 - 107 : CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA 342 86 - 106 : CTAGCGGCGGACGGGTGAGTA 343 85 - 108 : CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 344 85 - 107 : CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA 345 85 - 106 : CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTA 346 85 - 105 : CCTAGCGGCGGACGGGTGAGT 347 78 - 95 : TACATTTCCTAGCGGCGG 348 56 - 77 : CGAGCGGGGAGATGTAGCTTGC 標識物および固相担体と結合可能な部位 このような、プライマーまたはプローブとして利用可能
な核酸断片または部分塩基配列は、必要なら標識物また
は固相担体と結合可能な部位が導入されていてもよい。
ここで、プライマーを利用した検出を行う場合、標識物
または固相担体と結合可能な部位を導入してよい位置は
プライマーの伸張反応を妨げない位置ならばどこでもよ
いが、可能であれば５′末端は最も好ましい。またプロ
ーブを利用した検出を行う場合なら、標識物または固相
担体と結合可能な部位を導入してよい位置は３′末端や
５′末端の水酸基部分さらには塩基部分やりん酸ジエス
テル部分などが考えられるが、プローブの塩基配列や長
さなどを考慮し、ハイブリダイゼーションの妨げになら
ないようにすることが望ましい。

【００３０】上記核酸をプローブまたはプライマーとし
て利用する場合、標識物として、放射性物質、非放射性
物質のどちらを用いてもよい。非放射性の標識物として
は、直接標識可能なものとしてフルオレセイン誘導体、
ローダミンおよびその誘導体などの蛍光物質、化学発光
物質、遅延蛍光物質などがあげられる。

【００３１】また、標識物と特異的に結合する物質を利
用し間接的に標識物を検出することも可能である。こう
した標識物としてはビオチン、ハプテンなどがあげら
れ、ビオチンの場合アビジンあるいはストレプトアビジ
ンを、ハプテンの場合はこれに特異的に結合する抗体を
利用する。ハプテンとしては２，４−ジニトロフェニル
基を有する化合物やジゴキシゲニンなどを使うことがで
きる。これらの標識物はいずれも単独あるいは必要に応
じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマーに
導入可能である。

【００３２】サンドイッチハイブリダイゼーションなど
核酸の特定断片を固相担体に特異的に結合する必要があ
る場合は、固相担体と結合可能な部位は、該担体と選択
的に結合可能なものであれば何であってもよい。たとえ
ば、ビオチンあるいはフルオレセイン、２，４−ジニト
ロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンなどのハ
プテンがあげられ、これらはいずれも単独あるいは必要
に応じ複数種を組み合わせて、プローブまたはプライマ
ーに導入可能である。

【００３３】プローブを用いた検出法 プローブを用いた本発明によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出法は、前記核酸断片の
塩基配列を有する核酸断片であって、標識物または（お
よび）固相担体と結合可能な部位が導入されている場合
もある核酸断片よりなるプローブの少なくとも１種を用
いることを特徴とするものである。

【００３４】一般的にプローブを用いた検出法として
は、ドットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダ
イゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーショ
ンがあり、これらのいずれでも上記標識核酸断片を使用
し、常法どおりハイブリダイゼーションを行うことがで
きる。

【００３５】近年、ハイブリダイゼーションの感度をあ
げるために１細胞あたり多数のコピーが存在するｒＲＮ
Ａを検出ターゲットとする方法が開発されているが、本
発明における核酸断片は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする
領域を含む核酸断片であり、同様の手法でｒＲＮＡの検
出に供することができる。

【００３６】また、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョンにおいても、一般にｒＲＮＡを検出ターゲットとす
ることでＳ／Ｎ比のよい検出が可能であるが、上記同様
に本発明における核酸断片を検出に供することが可能で
ある。

【００３７】また、操作の簡易化のためにサンドイッチ
ハイブリダイゼーションを基本とする方法が開発されて
おり、これらの方法によっても本発明における核酸断片
を利用してＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.
Ｊ１株の検出を行うことができる。

【００３８】プライマーを用いた検出法 プライマーを用いた本発明によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｐ.Ｊ１株の検出法は、前記核酸断片の
塩基配列を有する核酸断片であって、標識物または（お
よび）固相担体と結合可能な部位が導入されている場合
もある核酸断片よりなるプライマーの少なくとも１種を
用いることを特徴とするものであり、より好ましい例と
しては、後述するような２種の異なるプライマーによる
遺伝子増幅反応により試料中の微量核酸断片を増幅する
ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ）法を用いた検出法である。

【００３９】ここで２種のプライマーの基本的な形態と
しては、たとえば、２種のプライマーともに何の修飾も
されていないもの、２種のプライマーのうち少なくとも
一方に検出可能な標識または固相担体と結合可能な部分
が導入されたもの、２種のプライマーのうち一方に標識
物が導入され、他方に固相担体と結合可能な部位が導入
されたもの、２種のプライマーともに固相担体と結合可
能な部分が導入されたもの、などがあげられる。

【００４０】本発明によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出方法は前記したような本発
明によるプライマー、好ましくは２種の組み合わせから
なるプライマーを用いて以下のように実施することがで
きる。 （１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１
株の有無を検出したい試料を準備し、（２）必要に応じ
て、試料中の菌体の破砕処理を行い、（３）試料に上記
プライマーを加えプライマーの伸張反応を行い、（４）
工程（３）で得られた伸張反応物について検出操作を行
う。

【００４１】ここで、プライマー伸張反応により増幅さ
れた核酸断片の検出は、電気泳動、あるいはハイブリダ
イゼーションなどの通常用いられる方法を利用してもよ
いし、遺伝子の増幅反応においてそれぞれのプライマー
に別々の標識を導入しておき、増幅反応後生成物を固相
担体に吸着し、生成物を選択的に検出する方法などを用
いることも可能である。

【００４２】ここで固相担体としてはポリスチレンボー
ル、アガロースビーズ、ポリアクリルビーズ、ラテック
ス、ミクロタイターウェルなどの固相材料に、プライマ
ー中に導入された結合部位を捕捉できるようなもの例え
ば、ストレプトアビジン、抗体などを導入したものがあ
げられる。たとえば、ビオチンが導入されたプライマー
からのＰＣＲ産物を捕捉するには、ストレプトアビジン
を固相に結合した担体が、フルオレセインなどが導入さ
れたプライマーからの伸張反応物を捕捉するには、それ
ぞれに対する抗体を固相に結合した担体が用いられる。

【００４３】さらに、固相担体を微粒子とすることによ
り、目的とする核酸を凝集、あるいは沈殿の有無により
簡便に判定することもできる。また、一方のプライマー
には固相担体と結合可能な部位を、他方のプライマーに
は標識物を導入したものをそれぞれ用いて、伸張反応を
行った反応物を固相担体と接触させた後に不純物を適当
な溶媒で洗浄除去する方法もあり、目的核酸は標識物を
持つ形で該固相担体に固定され特異的に検出される。

【００４４】これら標識物質の実際の検出には、使用す
る標識物質に応じて一般的な手法を用いればよい。たと
えば、標識物質がラジオアイソトープであれば、そのま
ま活性を測定すればよいし、たとえばビオチンであれば
アビジン−酵素結合体、また、ハプテンであれば抗体−
酵素結合体などを用いてＡＭＰＰＤなどの基質と反応さ
せ、光学的、蛍光的手段により検出を行えばよい。

【００４５】また、遺伝子の増幅反応に用いる酵素、反
応条件などについてはさまざまな方法が考案されている
が、本発明における核酸断片は、種々のＰＣＲ法に利用
するのに十分な長さおよび塩基配列を持ち、これを用い
ることでＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ
１株の検出を確実簡便に行うことができるものである。

【００４６】

【実施例】

［実施例１］ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ. Ｊ１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のクローニングと
塩基配列の決定 既知の好気性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏ
ｓｔｅｒｏｎｉ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌ
ｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙ
ｌｏｓｏｘｉｄａｎｓおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）からの１６Ｓ ｒＲＮＡを得て、以
下の２つの共通塩基配列を選び出した。 配列１：５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ
Ｇ３′ 配列２：５′ＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴ
Ｔ３′ 上記配列について、配列１については主鎖を、配列２に
ついてはその相補鎖を合成した。これらの合成したＤＮ
Ａをプライマーとして、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｓｐ. Ｊ１株のＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
生成した約１１００塩基対のＤＮＡ断片を、プラスミド
ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位に挿入し、大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換した。

【００４７】形質転換株を、アンピシリン、ＩＰＴＧ、
Ｘ−ｇａｌを含む寒天培地上で選択し、生じた白色コロ
ニーよりプラスミドを調製し、挿入断片の有無を調べ
た。約１１００塩基対のＤＮＡ断片が挿入されている組
み換えプラスミドを選択し、上記ＰＣＲ断片の末端の塩
基配列をダイデオキシ法により決定した。これを既知の
各種細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列と比較したとこ
ろ、非常に相同性が高く、この挿入断片はＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の１６ＳｒＲＮＡ
部分配列であると推定した。

【００４８】ＰＣＲを経由しない、完全長の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子のクローニングを以下のように行った。Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株のＤＮ
Ａを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、アガロースゲ
ル電気泳動により９〜２３キロ塩基対断片を分離、精製
し、これらのＤＮＡ断片をλＤＡＳＨＩＩ（ＳＴＲＡＴ
ＡＧＥＮＥ）のＢａｍＨＩ消化物に挿入した。Ｇｉｇａ
ｐａｃｋＩＩ Ｇｏｌｄ ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴ
ＡＧＥＮＥ）を用いて、インビトロパッケージング法に
よりファージ粒子の調製を行い、ＤＮＡライブラリーを
作製した。ここで、上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子部分断
片をプローブとして、該ＤＮＡライブラリーからプラー
クハイブリダイゼーション法により陽性ファージのスク
リーニングを行った。陽性ファージは５００個に１個程
度の割合で取得できた。常法により陽性ファージを培養
の後、塩化セシウム密度勾配法によりファージＤＮＡを
精製した。

【００４９】塩基配列の決定は段階欠失クローンと、１
６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内の制限酵素切断部位を利用して
得たサブクローンを用いて行った。欠失は、プラスミド
ｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ切断部位に完全長の１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子をリクローニングの後、Ｅｘｏｎｕｃｌ
ｅａｓｅＩＩＩ とＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａ
ｓｅにより段階的に導入した。これらの段階欠失クロー
ンおよび制限酵素を利用したサブクローンを用いて、ダ
イデオキシ法により塩基配列の決定を行った。こうして
決定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.
Ｊ１株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列は、配列番号１の塩
基配列である。

【００５０】［実施例２］ プライマーの調製 本発明において、標識物あるいは固相担体と結合可能な
部位が導入されているプライマー、あるいは導入されて
いないプライマーは、以下に示す化学合成法により調製
した。

【００５１】まず、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位がいずれも導入されていないものは、ＤＮＡ自動
合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎ
ｃ．モデル３８１Ａ）を用いて、ホスホアミダイト法に
より０．２μｍｏｌスケールで合成を行い、ＯＰＣカー
トリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎ
ｃ．）により精製した。

【００５２】また、標識物あるいは固相担体と結合可能
な部位が導入されているプライマーは、まずその５′末
端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドとして合成
し、その後に適当な試薬を用いて標識物あるいは固相担
体と結合可能な部位を導入した。以下にその例を示す。

【００５３】５′末端にアミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（５′−ＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＡ
ＡＧＴＣＡ−３′）の合成は、上述したような合成反応
により５′末端に最後の塩基（この場合はＧ）を付加し
た後、アミノリンクＩＩ^TM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）をさらに付加することにより
行い、合成終了後、ＯＰＣカートリッジにより精製し
た。

【００５４】ビオチン化は、以下のようにして行った。
１Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリゴヌクレオチド水溶液１０μ
ｌに、１ＭＮａＨＣＯ₃ 水溶液１０μｌ、水３０μ
ｌ、および２０μｇ／μｌのビオチニル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステル（ＢＲＬ）のＤＭＦ溶液を５０
μｌ加え、混和後室温で放置した。４時間後、セファデ
ックスＧ−５０を担体としたゲルろ過にかけ、５０ｍＭ
ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出し、最初のピークを集め乾固の
後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。

【００５５】５′末端にジニトロフェニル基（ＤＮＰ）
を導入したオリゴヌクレオチド（５′−ＣＴＴＡＣＣＡ
ＡＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＧＴＴ−３′）は、ビオ
チン標識のときと同様に、まずその５′末端にアミノ基
を導入したオリゴヌクレオチドとして合成および精製を
行った。このようにして得た２Ｏ．Ｄ．のアミノ化オリ
ゴヌクレオチド水溶液１８０μｌに、１ＭＮａＨＣＯ₃
水溶液２０μｌを加え、これに５％（ｖ／ｖ）ジニト
ロフルオロベンゼンのエタノール溶液１００μｌを加え
３７℃で２時間加温し、反応を行った。精製は、ビオチ
ン化オリゴヌクレオチドと同様にゲルろ過により行い、
乾固の後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。

【００５６】［実施例３］ プローブの調製 ３′末端にビオチン標識を導入したオリゴヌクレオチド
（５’−ＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＡ
ＧＡＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＡＧＧＡＴＡＧＴＧ−３′）
を調製した。あらかじめ３′末端がビオチン標識されて
いる、０．５μｍｏｌスケールの３′Ｂｉｏｔｉｎ−Ｏ
Ｎ ＣＰＧカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、ホス
ホアミダイト法によりオリゴヌクレオチドを合成し、常
法によりＯＰＣカートリッジを用いて精製、乾固の後、
ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。

【００５７】［実施例４］ プライマーの特異性の評価Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株、
Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
２３５）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＢＨ株、Ｐ．ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ（ＩＦＯ ３０８０）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓ（ＩＦＯ１４１６０）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＩＦＯ １４４７９）、Ｘａｎ
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（ＩＦＯ
１４１６１）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃ
ａｅ（ＩＦＯ １３５３５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０
９株の９種の細菌を用いて、常法により各種細菌よりＤ
ＮＡを調製したものを試料とし、ＰＣＲ法によりプライ
マーの特異性を評価した。プライマーは実施例２で調製
した２種のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＴＡ
ＡＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡ−３′、５′−
ＤＮＰ−ＣＴＴＡＣＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣ
ＧＴＴ−３′）を用いた。ＰＣＲは、以下の反応溶液組
成ならびに条件で行った。

【００５８】３０ｐｍｏｌ／μｌ濃度の上記プライマー
をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μ
ｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を５μｌ、試料ＤＮ
Ａを１０ｎｇ加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５
０μｌとした。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加え、９０
℃に加温して５分間保持した後、９０℃・６０秒、５５
℃・４５秒、７２℃・９０秒を１サイクルとした３０サ
イクルの反応を行い、反応後さらに７２℃で５分間保温
した。反応後、５０μｌより１０μｌを分取し、アガロ
ースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色を行い、
増幅核酸鎖の検出を行った。その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１株においてのみ、期待さ
れる約１４００塩基対の長さに、明瞭な一本のバンドが
確認できた。ここで、他の８種の菌株においては、いか
なる増幅核酸鎖もまったく検出することはできなかっ
た。 ［実施例５］ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．Ｊ１株のプライマーを用いた検出（１） 実施例４と同様にして、９種類の各種細菌よりＤＮＡを
調製した。これを以下の反応溶液組成、反応条件でＰＣ
Ｒに供した。

【００５９】実施例２で調製した、２０ｐｍｏｌ／μｌ
濃度のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＴＡＡＴ
ＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡ−３′、５′−ＤＮ
Ｐ−ＣＴＴＡＣＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＧＴ
Ｔ−３′）をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩
衝液を５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μ
ｌ、試料ＤＮＡをＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．Ｊ１株は１０ｐｇを、他の細菌については１０ｎｇ
を加え、さらに水を加えて反応溶液全量を５０μｌとし
た。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加え、９０℃に加温し
て５分間保持した後、９０℃・６０秒、５５℃・４５
秒、７２℃・９０秒を１サイクルとした３５サイクルの
反応を行い、最後に７２℃で５分間保温した。反応後、
プライマー除去用フィルター付遠心チューブ ＳＵＰＲ
ＥＣ−０２（宝酒造）で３回、未反応のプライマーの除
去操作を行った。

【００６０】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μｌ加えておき、これに反応後の上記混合液を１０μｌ
加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで
３回洗浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識
抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したも
のを１００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝
液５００μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの
濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０
分間放置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１に示す。

【００６１】

【表１】 ［実施例６］ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．Ｊ１株のプライマーを用いた検出（２） 実施例４と同様にして、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｓｐ．Ｊ１株よりＤＮＡを調製した。これを以下の
反応溶液組成、反応条件でＰＣＲに供した。

【００６２】実施例２で調製した、２０ｐｍｏｌ／μｌ
濃度のプライマー（５′−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＴＡＡＴ
ＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡ−３′、５′−ＤＮ
Ｐ−ＣＴＴＡＣＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＧＴ
Ｔ−３′）をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩
衝液を５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合溶液を２μ
ｌ、試料としてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．Ｊ１株より調製したＤＮＡを、１０ｐｇ、１ｐｇ、
１００ｆｇ、１０ｆｇ加え、さらに水を加えて反応溶液
全量を５０μｌとした。これに、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を１ｕｎｉｔ加
え、９０℃に加温して５分間保持した後、９０℃・６０
秒、５５℃・４５秒、７２℃・９０秒を１サイクルとし
た４０サイクルの反応を行い、最後に７２℃で５分間保
温した。反応後、実施例５と同様に未反応のプライマー
除去操作を行った。

【００６３】ストレプトアビジン固定化マイクロプレー
トに、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を１００
μｌ加えておき、これに反応後の上記混合液を１０μｌ
加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝液５００μｌで
３回洗浄した。これにアルカリ性フォスフォターゼ標識
抗ＤＮＰ抗体を上述の緩衝液で２０００倍に希釈したも
のを１００μｌ加え、室温３０分間放置の後、上記緩衝
液５００μｌで３回洗浄した。これに、４ｍｇ／ｍｌの
濃度で１Ｍジエタノールアミン緩衝液に溶解した、ｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌ加え、室温３０
分間放置の後、マイクロプレートリーダーを用いて４０
５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２に示す。

【００６４】

【表２】 ［実施例７］ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｐ．Ｊ１株のプライマーとＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０
１株のプライマーを用いた両株の同時検出 実施例４で調製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐ．Ｊ１株のＤＮＡとＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１
株などその他８種類のうちのどれか１種類のＤＮＡを混
合した試料を８種類用意しこれを試料として、ＰＣＲ法
によりこれらＪ１株とＫＫ０１株の同時検出の可能性を
評価した。

【００６５】プライマーは実施例２で調製した２種のプ
ライマー（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴ
ＧＡＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡ−３’、５’−ＤＮＰ−ＣＴ
ＴＡＣＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＧＴＴ−
３’）およびすでに出願済みの特平６−５１７３９号に
記載されたＰ．ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１株に特異的に
反応する２種のプライマー（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡ
ＡＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＣＧ−
３’、５’−ＤＮＰ−ＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＴ
ＣＡＧＣＡＧ−３’を用いた。ＰＣＲは、以下の反応溶
液組成ならびに反応条件で行った。

【００６６】１５ｐｍｏｌ／μｌ濃度の上記プライマー
をそれぞれ１μｌずつ、酵素に添付の反応緩衝液を５μ
ｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合液を５μｌ，Ｊ１株ＤＮ
Ａ５ｎｇと実施例４で実験に供したＫＫ０１株などその
他の８種類のうち１種類のＤＮＡを５ｎｇ加え、さらに
水を加えて反応溶液全体を５０μｌとした。これにＡｍ
ｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１ ｕ
ｎｉｔ加え、実施例４と同様の温度時間条件で増幅反応
を行った。反応後、実施例４と同様に電気泳動、染色を
行った。その結果、すべての試料でＪ１株においてのみ
期待される約１４００塩基対の長さに、明瞭な一本のバ
ンドが確認できた。また、ＫＫ０１株のＤＮＡを混合し
た試料のみ、ＫＫ０１株においてのみ期待される約５８
０塩基対の長さに、もう一本の明瞭なバンドが確認でき
た。ここで、他の７種の試料においては、約１４００塩
基対のバンド以外にはいかなる増幅核酸鎖も検出するこ
とはできなかった。

【００６７】［実施例８］ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１株のプローブを用いた検出（１） 実施例４と同様にして、９種類の各種細菌よりＤＮＡを
調製した。それぞれのＤＮＡをアルカリ変性の後、ドッ
トブロット装置（ＢＲＬ）を用いて１μｇずつナイロン
膜（Ｔｒｏｐｉｌｏｎ−４５、Ｔｒｏｐｉｘ社）にドッ
トした。８０℃で２時間乾燥の後、ナイロン膜をビニー
ルバッグに入れ、プレハイブリダイゼーション溶液（６
×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１０
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）を３ｍｌ加え、６０
℃でプレハイブリダイゼーションを１時間行った。これ
に、ハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼ
ーション溶液に実施例３で調製したビオチン標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（５′−ＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧ
ＡＧＧＣＴＡＣＴＴＡＧＡＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＡＧＧ
ＡＴＡＧＴＧ−Ｂｉｏｔｉｎ−３′）を熱変性の後に１
００ｎｇ加えたもの）を３ｍｌ加え、６０℃で２時間ハ
イブリダイゼーションを行った。ナイロン膜をビニール
バッグより取り出し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液
を用いて６０℃で５分間ずつ３回洗浄した。検出はサザ
ンライト（Ｔｒｏｐｉｘ社）を用いて、アルカリ性フォ
スファターゼ標識ストレプトアビジンとＡＭＰＰＤ^TMに
よる化学発光法を利用して、添付のプロトコルに従い行
った。

【００６８】その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｓｐ．Ｊ１株ＤＮＡをドットしたものについての
み、きわめて強い陽性の反応を確認できた。ここで、他
の８種の菌株においては、陽性の反応を検出することは
できなかった。

【００６９】［実施例９］ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１株のプローブを用いた検出（２） 実施例４に記載の９種類の各種細菌を常法により培養し
た。０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で
洗浄の後、前記緩衝液を用いてそれぞれの菌数が２×１
０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。このように
して調製した菌懸濁液５０μｌに６％のホルムアルデヒ
ド溶液を５０μｌ加え菌体を固定し、０．１％ゼラチ
ン、０．０１％クロムミョウバンでコートしたスライド
グラスに３０μｌを滴下し、風乾した。試料を固定した
スライドグラスを、９０％メタノール、３％ホルムアル
デヒド溶液に１０分間浸けて菌体を再固定した後、純水
で洗浄した。

【００７０】上記処理を行ったスライドグラスを、５０
ｍＭ ＮａＢＨ₄ を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）に室温で３０分間、遮光状態で浸した
後、純水で洗浄、風乾した。プローブは実施例３で調製
したビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブ（５−Ａ
ＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＡＧＡＴＴＡ
ＡＴＡＣＴＣＴＡＧＧＡＴＡＧＴＧ−Ｂｉｏｔｉｎ−
３′）に、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識されたストレプトアビジ
ンをあらかじめ結合させたものを用いた。この標識プロ
ーブを、ハイブリダイゼーション溶液（０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．７５Ｍ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％硫酸デキストラン、０．
２％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉ
ｎ）、０．０１％ポリアデニル酸）で５ｎｇ／μｌ濃度
とし、３０μｌを滴下した。スライドグラスを気密性の
容器に入れて、４５℃、１時間の反応を遮光状態で行っ
た。

【００７１】反応後、ＳＥＴ緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ
（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）でスライドグラスを洗浄し、遮光状態で風乾の
後、オリンパスの落射型蛍光顕微鏡で検鏡を行い蛍光の
有無を調べた。励起光源は水銀ランプを使用し、Ｂ励起
により観察を行った。検鏡の結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１株については菌体に蛍光が認
められたが、他の８種類の菌株においては、蛍光を観察
することはできなかった。

【００７２】

【発明の効果】本発明の核酸断片は、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコ
ードする遺伝子であり、これらの構成塩基またはその一
部分の塩基配列をプライマーまたはプローブとして利用
すれば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１
株の検出を特異的に行うことができる。

【００７３】また、本発明によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｊ１株の検出方法は、上記の核酸断
片あるいはこれらの一部をプライマーまたはプローブと
して用いるものであり、感度、特異性、簡便さ、迅速性
の点で優れたものであり、環境浄化などの分野で多大な
貢献をなすものである。

【００７４】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１５６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｒＲＮＡ遺伝子ＤＮＡ 起源 生物名： Corynebacterium sp. 株名 ： J1 配列 1 : AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATG 51 : CAAGTCGAGCGGGGAGATGTAGCTTGCTACATTTCCTAGCGGCGGACGGG 101 : TGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAG 151 : GAATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGGA 201 : CCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAA 251 : AGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCAC 301 : ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA 351 : TATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGA 401 : AGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTAGATT 451 : AATACTCTAGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTC 501 : TGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTA 551 : CTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCCC 601 : TGAGCTTAACTTAGGAATTGCATTCGATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGA 651 : GAGGATGGTAGAATTCCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGA 701 : GGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGT 751 : ACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCG 801 : TAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCACT 851 : AACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCA 901 : AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG 951 : ATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAG 1001 : AGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTC 1051 : GTCAGCTGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC 1101 : TTTTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTTTAAGGATACTGCCA 1151 : GTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA 1201 : CGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACC 1251 : TAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGT 1301 : CTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAA 1351 : TGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA 1401 : TGGGAATTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGCT 1451 : TACCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA 1501 : GGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTAACGAAAGATTGACGATTGGTA 1551 : AGAATCCACAACAAGT

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/06 ＺＡＢ 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の塩基配列で示されるＣｏｒ
   ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の１６Ｓ
   ｒＲＮＡ遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１の配列で示される核酸、ならび
   に、その相補的な塩基配列を有する核酸、および、これ
   らの変異配列で示される核酸から選ばれる新規な核酸断
   片。
3. 【請求項３】 次に列記する特異配列番号１から８まで
   のいずれかの配列またはそれら配列のいずれかを一部と
   して含むことを特徴とする請求項２に記載の新規な核酸
   断片。 特異配列1（配列番号1における塩基番号56から塩基番号226までの174塩基） CGAGCGGGGAGATGTAGCTTGCTACATTTCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTT AGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATAC GCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGT CAG 特異配列2（配列番号1における塩基番号419から塩基番号490までの72塩基） GCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTAGATTAATACTCTAGGATAGTGGACGTTAC TCGCAGAATAAGCAC 特異配列3（配列番号1における塩基番号565から塩基番号751までの187塩基） TGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCCCTGAGCTTAACTTAGGAATTGC ATTCGATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTTGTAGCG GTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAA TACTGACGCTGAGGTA 特異配列4（配列番号1における塩基番号810から塩基番号865までの56塩基） TCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCACTAACGCGATAAGTAGA 特異配列5（配列番号1における塩基番号973から塩基番号1031までの56塩基） TGGTCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACA TA 特異配列6（配列番号1における塩基番号1101から塩基番号1140までの40塩基） TTTTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTTTAAG 特異配列7（配列番号1における塩基番号1186から塩基番号1355までの170塩基） TCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGG TTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAG TCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCG 特異配列8（配列番号1における塩基番号1408から塩基番号1461までの54塩基） TTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGCTTACCACGGTGT
4. 【請求項４】 請求項３に記載のいずれかの核酸中の部
   分配列であってプライマー、またはプローブとして利用
   可能な核酸よりなる新規な核酸断片。
5. 【請求項５】 プライマーとして利用可能な核酸が１０
   〜５０塩基の長さであり、プローブとして利用可能な核
   酸が１０塩基から請求項２に記載の核酸の全塩基数以下
   の長さである請求項４に記載の新規な核酸断片。
6. 【請求項６】 部分配列が次に配列する部分配列番号１
   から３４８までのいずれかである請求項４に記載の新規
   な核酸断片。 配列番号 塩基配列 1 GGTAAGAATCCACAACAAGTCGTT 2 AACGAAAGATTGACGATTGGTAAG 3 AGGAGGACGCTTACCACGG 4 AGTCTAACCGCAAGGAGGACGC 5 AGTCTAACCGCAAGGAGGA 6 AGTCTAACCGCAAGGAGG 7 TCGGAATCGCTAGTAATCGC 8 GTCGGAATCGCTAGTAATCGC 9 GTCGGAATCGCTAGTAATCG 10 AGTCGGAATCGCTAGTAATCGC 11 AGTCGGAATCGCTAGTAATCG 12 AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC 13 AAGTCGGAATCGCTAGTAATCG 14 AAGTCGGAATCGCTAGTAATC 15 AAGTCGGAATCGCTAGTAAT 16 AAGTCGGAATCGCTAGTA 17 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC 18 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG 19 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATC 20 GAAGTCGGAATCGCTAGTAA 21 TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG 22 ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC 23 ATGAAGTCGGAATCGCTAG 24 CATGAAGTCGGAATCGCTAGT 25 CCATGAAGTCGGAATCGCTAGT 26 CCATGAAGTCGGAATCGCTAG 27 CCATGAAGTCGGAATCGCT 28 GCAACTCGACTCCATGAAG 29 GCAACTCGACTCCATGAA 30 TGCAACTCGACTCCATGAAG 31 TGCAACTCGACTCCATGA 32 CTGCAACTCGACTCCATGAAG 33 CTGCAACTCGACTCCATGAA 34 CTGCAACTCGACTCCATGA 35 TCTGCAACTCGACTCCATGAAG 36 TCTGCAACTCGACTCCATGAA 37 TCTGCAACTCGACTCCATGA 38 TCTGCAACTCGACTCCATG 39 CAATGGTCGGTACAAAGGG 40 ACGTGCTACAATGGTCGGT 41 CGACCAGGGCTACACACGT 42 CGACCAGGGCTACACACG 43 ACGACCAGGGCTACACACG 44 TACGACCAGGGCTACACACGT 45 TTACGACCAGGGCTACACACGT 46 TTACGACCAGGGCTACACACG 47 TTACGACCAGGGCTACACA 48 TTGCCAGCGGGTTAAGCC 49 TTTGCCAGCGGGTTAAGCC 50 TTTGCCAGCGGGTTAAGC 51 ATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 52 ATTTGCCAGCGGGTTAAGC 53 ATTTGCCAGCGGGTTAAG 54 TATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 55 TATTTGCCAGCGGGTTAAGC 56 TATTTGCCAGCGGGTTAAG 57 TATTTGCCAGCGGGTTAA 58 TTATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 59 TTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 60 TTATTTGCCAGCGGGTTAAG 61 TTATTTGCCAGCGGGTTAA 62 TTATTTGCCAGCGGGTTA 63 CTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 64 CTTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 65 CTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 66 CTTATTTGCCAGCGGGTTAA 67 CTTATTTGCCAGCGGGTTA 68 CTTATTTGCCAGCGGGTT 69 CCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCC 70 CCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 71 CCTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 72 CCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 73 CCTTATTTGCCAGCGGGTTA 74 CCTTATTTGCCAGCGGGTT 75 CCTTATTTGCCAGCGGGT 76 TCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGC 77 TCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 78 TCCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 79 TCCTTATTTGCCAGCGGGTTA 80 TCCTTATTTGCCAGCGGGTT 81 TCCTTATTTGCCAGCGGGT 82 TCCTTATTTGCCAGCGGG 83 TTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAG 84 TTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 85 TTCCTTATTTGCCAGCGGGTTA 86 TTCCTTATTTGCCAGCGGGTT 87 TTCCTTATTTGCCAGCGGG 89 TTTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAA 90 GTGCCTTCGGGAACTTACAT 91 GATGGATTGGTGCCTTCGGGA 92 AGATGGATTGGTGCCTTCGGGA 93 AGATGGATTGGTGCCTTCGGG 94 GAGATGGATTGGTGCCTTCGGGA 95 GAGATGGATTGGTGCCTTCGGG 96 GAGATGGATTGGTGCCTTCGG 97 AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGA 98 AGAGATGGATTGGTGCCTTCGGG 99 AGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 100 AGAGATGGATTGGTGCCTTCG 101 CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGG 102 CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 103 CAGAGATGGATTGGTGCCTTCG 104 CAGAGATGGATTGGTGCCTTC 105 TAGTAAGAACTTTCCAGAGAT 106 CTTTGAGGCTTTAGTGGCG 107 CTAATACTGACGCTGAGGT 108 CTAATACTGACGCTGAGG 109 CCTAATACTGACGCTGAGG 110 GCCTAATACTGACGCTGAGGT 111 GCCTAATACTGACGCTGAGG 112 GCCTAATACTGACGCTGAG 113 GGCCTAATACTGACGCTGAGGT 114 GGCCTAATACTGACGCTGAGG 115 TGGCCTAATACTGACGCTGAGGT 116 TGGCCTAATACTGACGCTGAGG 117 TGGCCTAATACTGACGCTGAG 118 TGGCCTAATACTGACGCTG 119 CTGGCCTAATACTGACGCTGAGGT 120 CTGGCCTAATACTGACGCTGAGG 121 CTGGCCTAATACTGACGCTGAG 122 TCTGGCCTAATACTGACGCTGAGG 123 TCTGGCCTAATACTGACGCTGAG 124 TCTGGCCTAATACTGACGCTGA 125 TCTGGCCTAATACTGACGCTG 126 TCTGGCCTAATACTGACGC 127 ATCTGGCCTAATACTGACGCTGAG 128 ATCTGGCCTAATACTGACGCTGA 129 ATCTGGCCTAATACTGACGCTG 130 ATCTGGCCTAATACTGACGCT 131 CATCTGGCCTAATACTGACGCTGA 132 CATCTGGCCTAATACTGACGCTG 133 CATCTGGCCTAATACTGACGCT 134 CATCTGGCCTAATACTGACGC 135 TACCGATGGCGAAGGCAGC 136 ATACCGATGGCGAAGGCAG 137 AATACCGATGGCGAAGGCAGC 138 AATACCGATGGCGAAGGCA 139 GAATACCGATGGCGAAGGCAGC 140 GAATACCGATGGCGAAGGCAG 141 GAATACCGATGGCGAAGGCA 142 GAATACCGATGGCGAAGGC 143 GGAATACCGATGGCGAAGGCAGC 144 GGAATACCGATGGCGAAGGCAG 145 GGAATACCGATGGCGAAGGCA 146 AGGAATACCGATGGCGAAGGCAGC 147 AGGAATACCGATGGCGAAGGCAG 148 AGGAATACCGATGGCGAAGGCA 149 AGGAATACCGATGGCGAAGGC 150 GAGGAATACCGATGGCGAAGGCAG 151 GAGGAATACCGATGGCGAAGGCA 152 GAGGAATACCGATGGCGAAGGC 153 GAGGAATACCGATGGCGAAGG 154 GAGGAATACCGATGGCGAA 155 GAGGAATACCGATGGCGA 156 GGAGGAATACCGATGGCGAAGGCA 157 GGAGGAATACCGATGGCGAAGGC 158 GGAGGAATACCGATGGCGAAGG 159 GGAGGAATACCGATGGCGAAG 160 GGAGGAATACCGATGGCGAA 161 GGAGGAATACCGATGGCGA 162 GGAGGAATACCGATGGCG 163 TGGAGGAATACCGATGGCGAAGGC 164 TGGAGGAATACCGATGGCGAAGG 165 TGGAGGAATACCGATGGCGAAG 166 TGGAGGAATACCGATGGCGAA 167 TGGAGGAATACCGATGGCGA 168 TGGAGGAATACCGATGGCG 169 TGGAGGAATACCGATGGC 170 CTGGAGGAATACCGATGGCGAAGG 171 CTGGAGGAATACCGATGGCGAAG 172 CTGGAGGAATACCGATGGCGAA 173 CTGGAGGAATACCGATGGCGA 174 CTGGAGGAATACCGATGGCG 175 CTGGAGGAATACCGATGGC 176 TCTGGAGGAATACCGATGGCGAAG 177 TCTGGAGGAATACCGATGGCGAA 178 TCTGGAGGAATACCGATGGCGA 179 TCTGGAGGAATACCGATGGCG 180 TCTGGAGGAATACCGATGGC 181 TCTGGAGGAATACCGATGG 182 ATCTGGAGGAATACCGATGGCGAA 183 ATCTGGAGGAATACCGATGGCGA 184 ATCTGGAGGAATACCGATGGCG 185 ATCTGGAGGAATACCGATGGC 186 ATCTGGAGGAATACCGATGG 187 GATCTGGAGGAATACCGATGGCGA 189 GATCTGGAGGAATACCGATGGCG 190 GATCTGGAGGAATACCGATGGC 191 GATCTGGAGGAATACCGATGG 192 GATCTGGAGGAATACCGATG 193 GATCTGGAGGAATACCGA 194 AGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 195 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 196 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT 197 GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 198 GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA 199 TGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT 200 AGGTTGTAGCGGTGAAATGCGT 201 CAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGTA 202 CAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGT 203 CAGGTTGTAGCGGTGAAATGCG 204 CCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCGT 205 CCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCG 206 CCAGGTTGTAGCGGTGAAATGC 207 TCCAGGTTGTAGCGGTGAAATGCG 208 TATGGGAGAGGATGGTAGA 209 GTATGGGAGAGGATGGTAGAA 210 GTATGGGAGAGGATGGTAGA 211 GTATGGGAGAGGATGGTAG 212 GTATGGGAGAGGATGGTA 213 AGTATGGGAGAGGATGGTAGAA 214 AGTATGGGAGAGGATGGTAGA 215 AGTATGGGAGAGGATGGTAG 216 AGTATGGGAGAGGATGGTA 217 GAGTATGGGAGAGGATGGTAGAAT 218 GAGTATGGGAGAGGATGGTAGA 219 GAGTATGGGAGAGGATGGTAG 220 GAGTATGGGAGAGGATGGTA 221 GAGTATGGGAGAGGATGGT 222 GAGTATGGGAGAGGATGG 223 AGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAA 224 AGAGTATGGGAGAGGATGGTAGA 225 AGAGTATGGGAGAGGATGGTAG 226 AGAGTATGGGAGAGGATGGTA 227 AGAGTATGGGAGAGGATGGT 228 AGAGTATGGGAGAGGATGG 229 AGAGTATGGGAGAGGATG 230 TAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGA 231 TAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG 232 TAGAGTATGGGAGAGGATGGTA 233 TAGAGTATGGGAGAGGATGGT 234 TAGAGTATGGGAGAGGATGG 235 TAGAGTATGGGAGAGGATG 236 CTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAG 237 CTAGAGTATGGGAGAGGATGGTA 238 CTAGAGTATGGGAGAGGATGGT 239 CTAGAGTATGGGAGAGGATGG 240 CTAGAGTATGGGAGAGGATG 241 CTAGAGTATGGGAGAGGAT 242 CTAGAGTATGGGAGAGGA 243 GCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTA 244 GCTAGAGTATGGGAGAGGATGGT 245 GCTAGAGTATGGGAGAGGATGG 246 GCTAGAGTATGGGAGAGGATG 247 GCTAGAGTATGGGAGAGGA 248 AGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGT 249 AGCTAGAGTATGGGAGAGGATGG 250 AGCTAGAGTATGGGAGAGGATG 251 AGCTAGAGTATGGGAGAGGAT 252 AGCTAGAGTATGGGAGAGGA 253 AGCTAGAGTATGGGAGAGG 254 AAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGG 255 AAGCTAGAGTATGGGAGAGGATG 256 AAGCTAGAGTATGGGAGAGGAT 257 AAGCTAGAGTATGGGAGAGGA 258 AAGCTAGAGTATGGGAGAGG 259 AAGCTAGAGTATGGGAGAG 260 CGATACTGGGAAGCTAGAG 261 CGATACTGGGAAGCTAGA 262 TCGATACTGGGAAGCTAGA 263 TCGATACTGGGAAGCTAG 264 TGTGAAATCCCTGAGCTTAAC 265 TGTGAAATCCCTGAGCTTAA 266 TGTGAAATCCCTGAGCTTA 267 ATGTGAAATCCCTGAGCTTAAC 268 ATGTGAAATCCCTGAGCTTAA 269 ATGTGAAATCCCTGAGCTTA 270 ATGTGAAATCCCTGAGCTT 271 ATGTGAAATCCCTGAGCT 272 GTGGACGTTACTCGCAGAATA 273 GTGGACGTTACTCGCAGAA 274 GTGGACGTTACTCGCAGA 275 ATTAATACTCTAGGATAGTG 276 AAGCGAGGAGGAGGCTACTTAGAT 277 TTTAAGCGAGGAGGAGGC 278 GCTAATAGATGAGCCTAAGTCA 279 CTTCGGACCTTGCGCTAATA 280 TCTTCGGACCTTGCGCTAAT 281 TCTTCGGACCTTGCGCTAA 282 TCTTCGGACCTTGCGCTA 283 ATCTTCGGACCTTGCGCTAAT 284 ATCTTCGGACCTTGCGCTA 285 GATCTTCGGACCTTGCGCTAAT 286 GGATCTTCGGACCTTGCGCTAATA 287 GCAGGGGATCTTCGGACCTTGC 289 AGCAGGGGATCTTCGGACCTTG 290 AGCAGGGGATCTTCGGACCTT 291 AGCAGGGGATCTTCGGACC 292 ACCGCATACGCCCTACGG 293 TACCGCATACGCCCTACGG 294 TACCGCATACGCCCTACG 295 ATACCGCATACGCCCTACGG 296 ATACCGCATACGCCCTACG 297 ATACCGCATACGCCCTAC 298 AATACCGCATACGCCCTACGG 299 AATACCGCATACGCCCTACG 300 AATACCGCATACGCCCTAC 301 AATACCGCATACGCCCTA 302 TAATACCGCATACGCCCTACGG 303 TAATACCGCATACGCCCTACG 304 TAATACCGCATACGCCCTAC 305 TAATACCGCATACGCCCTA 306 TAATACCGCATACGCCCT 307 CTAATACCGCATACGCCCTACGG 308 CTAATACCGCATACGCCCTACG 309 CTAATACCGCATACGCCCTAC 310 CTAATACCGCATACGCCCT 311 CTAATACCGCATACGCCC 312 GCTAATACCGCATACGCCCTACGG 313 GCTAATACCGCATACGCCCTACG 314 GCTAATACCGCATACGCCCTAC 315 GCTAATACCGCATACGCCCTA 316 GCTAATACCGCATACGCCCT 317 GCTAATACCGCATACGCCC 318 AAAGGAATGCTAATACCGC 319 GAAAGGAATGCTAATACCG 320 GAAAGGAATGCTAATACC 321 CGAAAGGAATGCTAATACCGC 322 CCGAAAGGAATGCTAATACCGC 323 CAACATTCCGAAAGGAATGC 324 TATTAGTGGGGGACAACATTC 325 TATTAGTGGGGGACAACAT 326 GCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 327 GCGGCGGACGGGTGAGTAATG 328 GCGGCGGACGGGTGAGTAA 329 AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCT 330 AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 331 AGCGGCGGACGGGTGAGTAATG 332 AGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 333 AGCGGCGGACGGGTGAGTA 334 TAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC 335 TAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG 336 TAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 337 TAGCGGCGGACGGGTGAGTAA 338 TAGCGGCGGACGGGTGAGT 339 CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG 340 CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 341 CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA 342 CTAGCGGCGGACGGGTGAGTA 343 CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 344 CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA 345 CCTAGCGGCGGACGGGTGAGTA 346 CCTAGCGGCGGACGGGTGAGT 347 TACATTTCCTAGCGGCGG 348 CGAGCGGGGAGATGTAGCTTGC
7. 【請求項７】 変異配列が、核酸の塩基配列の一部を欠
   失するか、または他の塩基もしくは塩基配列で置換もし
   くは付加されたものである請求項２〜６のいずれか１項
   に記載の新規な核酸断片。
8. 【請求項８】 請求項２〜７のいずれか１項に記載の核
   酸断片であって、標識物または（および）固相担体と結
   合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片より
   なるプライマー。
9. 【請求項９】 請求項２〜７のいずれか１項に記載の核
   酸断片であって、標識物または（および）固相担体と結
   合可能な部位が導入されている場合もある核酸断片より
   なるプローブ。
10. 【請求項１０】 ２種の核酸断片の組み合わせからなる
    プライマーであって、少なくとも一方の核酸断片が請求
    項８に記載の核酸断片より選ばれたものであり、それぞ
    れの核酸断片に標識物または（および）固相担体と結合
    可能な部位が導入されている場合もあるプライマー。
11. 【請求項１１】 変異配列が核酸断片の塩基配列の一部
    を欠失するか、または他の塩基もしくは塩基配列で置換
    もしくは付加されたものである請求項８および１０のい
    ずれか１項に記載のプライマー。
12. 【請求項１２】 標識物または固相担体と結合可能な部
    位が、核酸断片の５′末端側に導入されている請求項８
    〜１１のいずれか１項に記載のプライマーまたはプロー
    ブ。
13. 【請求項１３】 標識物または固相担体と結合可能な部
    位が、ビオチン残基、２，４−ジニトロフェニル基、ジ
    ゴキシゲニン残基のいずれかである請求項８〜１２のい
    ずれか１項に記載のプライマーまたはプローブ。
14. 【請求項１４】 請求項２〜７，９，１２または１３の
    いずれかに記載の核酸の塩基配列を有する核酸断片の少
    なくとも１種をプローブとして用いることを特徴とする
    Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検
    出方法。
15. 【請求項１５】 請求項２〜８，１０〜１３のいずれか
    に記載の核酸の塩基配列を有する核酸断片の少なくとも
    １種をプライマーとして用いることを特徴とするＣｏｒ
    ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出方
    法。
16. 【請求項１６】 請求項８，１０〜１３または１５のい
    ずれかに記載のプライマーを用い、下記（１）〜（４）
    の工程を実施することを特徴とするＣｏｒｙｎｅｂａｃ
    ｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検出方法。 （１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１
    株の有無を検出したい試料を準備し、（２）必要に応じ
    て、試料中の菌体の破砕処理を行い、（３）試料に上記
    プライマーを加えプライマーの伸張反応を行い、（４）
    工程（３）で得られた伸張反応物について検出操作を行
    う。
17. 【請求項１７】 請求項１０に記載のプライマーを用い
    る請求項１６記載のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
    ｓｐ. Ｊ１株の検出方法。
18. 【請求項１８】 該プライマーの伸張反応がＰＣＲ（Ｐ
    ｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で
    ある請求項１６、あるいは１７のいずれか１項に記載の
    Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. Ｊ１株の検
    出方法。