JPH0873482A - 還元性を低減させた糖質とその製造方法並びに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 分子中にトレハロース構造を有する糖質及び
／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに還元
性澱粉糖を含有する低還元性糖質の還元性を更に低減せ
しめた糖質とその製造方法並びに用途を提供する。 【構成】 分子中にトレハロース構造を有する糖質及び
／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに澱粉
糖アルコールを含有してなる還元性を低減させた糖質と
該糖質の製造方法並びに該糖質を含有せしめた組成物を
主な構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、還元性を低減させた糖
質とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、分
子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハ
ロースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖アルコール
を含有してなる実質的に還元性を示さない糖質とその製
造方法並びに用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコースを構成糖とする非還元性糖質
として、古くからトレハロース（α，α−トレハロー
ス）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イ
ン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６
３年）アカデミック・プレス社（米国）及び『アプライ
ド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー
（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３２
１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載されて
いるように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広
範囲に及んでいる。トレハロースのような非還元性糖質
は、アミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミ
ノカルボニル反応を起こさず、含アミノ酸物質を損なわ
ないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加
工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が
望まれている。

【０００３】トレハロースの製造方法としては、例え
ば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微
生物菌体を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公
報で提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレ
ハロース・ホスホリラーゼとの組合せでマルトースを変
換する方法などが知られている。しかしながら、微生物
菌体を用いる方法は、該菌体を出発原料とし、これに含
まれるトレハロースの含量が、通常、固形物当り１５ｗ
／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、
ｗ／ｗ％を単に％と略称する）未満と低く、その上、こ
れを抽出、精製する工程が煩雑で、工業的製造方法とし
ては不適である。また、マルトース・ホスホリラーゼ及
びトレハロース・ホスホリラーゼを用いる方法は、いず
れもグルコース−１リン酸を経由しており、その基質濃
度を高めることが困難であり、また、両酵素の反応系が
可逆反応で目的物の生成率が低く、更には、両酵素の反
応系を安定に維持して反応をスムーズに進行させること
が困難であって、未だ、工業的製造方法として実現する
に至っていない。

【０００４】これに関係して、『月刊フードケミカ
ル』、８月号、第６７乃至７２頁（１９９２年）、「澱
粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項におい
て、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考
えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分
解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には
不可能であるといわれている。」と記載されているよう
に、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを
製造することは、従来、学術的にも不可能であると考え
られてきた。

【０００５】一方、澱粉を原料として製造される澱粉部
分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各
種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元
基を有し還元性を示すことが知られている。このような
澱粉部分分解物を、本明細書では、還元性澱粉部分分解
物と称する。一般に、還元性澱粉部分分解物は、固形物
当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレン
ト（ＤｅｘｔｒｏｓｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）と
して表している。この値の大きいものは、通常、分子が
小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、ア
ミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカル
ボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品
質を劣化し易い性質のあることが知られている。

【０００６】このような還元性澱粉部分分解物の種々の
特性は、ＤＥの大小に依存しており、還元性澱粉部分分
解物とＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界
では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられ
てきた。

【０００７】これを解決するために、本発明者等は、先
に、特願平５−３４９２１６号明細書で、グルコース重
合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉
部分分解物から分子の末端にトレハロース構造を有する
非還元性糖質を生成する新規非還元性糖質生成酵素（本
酵素を、本明細書を通じて、非還元性糖質生成酵素と称
する。）を開示し、本非還元性糖質生成酵素を利用し
て、還元性澱粉部分分解物から分子の末端にトレハロー
ス構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質
とこれを含む低還元性糖質並びにこれら糖質からのトレ
ハロースの製造方法を確立した。

【０００８】また、本発明者等は、特願平６−７９２９
１号明細書で、分子の末端にトレハロース構造を有する
グルコース重合度３以上の非還元性糖質のトレハロース
部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解
する新規トレハロース遊離酵素（本酵素を、本明細書を
通じて、トレハロース遊離酵素と称する。）を開示し、
前述の非還元性糖質生成酵素と本トレハロース遊離酵素
とを併用して還元性澱粉部分分解物から比較的高収量の
トレハロースの製造方法を確立した。しかしながら、こ
れら酵素を利用して還元性澱粉部分分解物から分子中に
トレハロース構造を有する糖質や、トレハロースなどの
非還元性糖質を製造する場合には、未反応の還元性澱粉
部分分解物の残存が避けられないばかりか、新たに、グ
ルコース、マルトースなどの還元性澱粉糖を生成するこ
とも判明した。このような非還元性糖質とともに還元性
澱粉糖を含有する低還元性糖質の還元性を更に低減する
ことが強く望まれる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、分子中にト
レハロース構造を有する糖質、すなわち、分子の末端に
トレハロース構造を有する非還元性糖質（以下、本物質
を、本明細書では、α−グリコシルトレハロースと称す
る。）、トレハロースの両グルコースに重合度１若しく
は２以上のグルコースを有している非還元性糖質（以
下、本物質を、本明細書では、α−グリコシル α−グ
リコシドと称する。）及びトレハロースなどの非還元性
糖質とともに還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質の還
元性を更に低減せしめた糖質、及び、その製造方法を確
立し、併せて、これら糖質の用途を提供するものであ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決するために、該低還元性糖質の水素添加法に着目
し、種々研究を続けてきた。その結果、分子中にトレハ
ロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからな
る非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有する低還元
性糖質を水素添加すると該非還元性糖質が悪影響を与え
ること無く、還元性澱粉糖が対応する澱粉糖アルコール
になり、原料の低還元性糖質の還元性を更に低減し、そ
の還元性を実質的に消滅させることも容易であることを
見いだし、本発明を完成した。

【００１１】また、本発明者等は、原料の製造方法につ
いても検討したところ、分子中にトレハロース構造を有
する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質
とともに還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質として
は、例えば、グルコース重合度３以上の還元性澱粉部分
分解物に非還元性糖質生成酵素又は非還元性糖質生成酵
素とともにトレハロース遊離酵素を作用させて得られる
ものが有利に利用でき、とりわけ、澱粉を液化した溶液
に、非還元性糖質生成酵素、又は、非還元性糖質生成酵
素及びトレハロース遊離酵素を作用させるに際し、澱粉
枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカ
ノトランスフェラーゼを併用して得られる低還元性糖質
が好都合であり、また、本出願人が特願平６−１４４０
９２号明細書で開示した、マルトースにマルトース・ト
レハロース変換酵素を作用させて得られる低還元性糖質
も好都合であることを見いだし、本発明を完成した。

【００１２】例えば、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶
液、望ましくは、ＤＥ１５未満の溶液に非還元性糖質生
成酵素を作用させて該低還元性糖質を製造するに際し、
澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グ
ルカノトランスフェラーゼをともに作用させて得られる
非還元性糖質を含む低還元性糖質は、非還元性糖質生成
酵素だけを作用させた場合と比較して、その還元性をほ
とんど増加させることなく、その分子量を著しく低減
し、粘度を低下し、取扱い容易で、本発明の原料糖質と
して好適であることが判明した。ちなみに、このように
して得られた低還元性糖質にグルコアミラーゼを作用さ
せたところ、その構造中に含まれるトレハロース含量が
大幅に増加していることも判明した。また、澱粉を比較
的低ＤＥに液化した溶液、望ましくはＤＥ１５未満の溶
液に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を
作用させてトレハロースを製造するに際し、澱粉枝切酵
素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトラ
ンスフェラーゼをともに作用させて得られるトレハロー
スは、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素
だけを作用させた場合と比較して、その収量が大幅に増
加し、本発明の原料として好適であることも判明した。
また、マルトース・トレハロース変換酵素の作用によ
り、マルトースから製造されるトレハロースとマルトー
スとの混合糖質も、本発明の原料糖質として好適である
ことが判明した。このようにして得られる分子中にトレ
ハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースから
なる非還元性糖質含量を高めた低還元性糖質を原料とし
て、これに水素添加することは有利に実施できる。この
ようにして得られる本発明の還元性を低減させた糖質
は、実質的に還元性を示さない糖質、望ましくはＤＥ１
未満の糖質で、安定性が高く、取扱い容易で、広範な用
途に利用でき、例えば、飲食物、化粧品、医薬品など各
種組成物に有利に利用できる。

【００１３】まず、本発明で用いる非還元性糖質生成酵
素としては、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液に含ま
れるグルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種
以上の還元性澱粉部分分解物からα−グリコシルトレハ
ロースを生成する酵素であればよく、例えば、特願平５
−３４９２１６号明細書に開示されるリゾビウム属、ア
ルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、フラボバク
テリウム属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム
属、マイコバクテリウム属及びテラバクター属などに属
する微生物由来の酵素が有利に利用できる。また、必要
ならば、耐熱性の非還元性糖質生成酵素を用いることも
随意であり、例えば、本出願人が特願平６−１６６０１
１号明細書で開示したスルフォロブス属由来の耐熱性非
還元性糖質生成酵素を用いることも有利に実施できる。
また、トレハロース遊離酵素としては、澱粉を液化した
溶液に非還元性糖質生成酵素を作用させて生成されるα
−グリコシルトレハロースを、そのトレハロース部分と
それ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する酵
素であればよく、例えば、特願平６−７９２９１号明細
書で開示したリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレ
ビバクテリウム属及びミクロコッカス属などに属する微
生物由来の酵素が有利に利用できる。また、必要なら
ば、耐熱性のトレハロース遊離酵素を用いることも随意
であり、例えば、本出願人が特願平６−１６６１２６号
明細書で開示したスルフォロブス属に属するトレハロー
ス遊離酵素を用いることも有利に実施できる。

【００１４】更に、本発明で用いるマルトース・トレハ
ロース変換酵素としては、マルトースからトレハロース
を生成する酵素であればよく、例えば、本出願人が、特
願平６−１４４０９２号明細書で開示されるピメロバク
ター属、シュードモナス属およびサーマス属などに属す
る微生物由来の酵素が有利に利用できる。微生物から、
例えば、非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース
遊離酵素を調製する方法は、更には、マルトース・トレ
ハロース変換酵素を調製する方法は、これら酵素の産生
能を有する微生物を培養して調製すればよい。

【００１５】微生物の培養に用いる培地は、微生物が生
育でき、該酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合
成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源として
は、微生物が資化しうる物であればよく、例えば、グル
コース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マン
ニトール、ソルビトール、糖蜜、還元性澱粉部分分解物
などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸又
はその塩も使用することができる。培地におけるこれら
の炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。
例えば、還元性澱粉部分分解物の場合には、通常、２０
％以下が望ましく、菌の生育及び増殖からは５％以下が
好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、
硝酸塩などの無機窒素化合物及び、例えば、尿素、コー
ン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エ
キス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。ま
た、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネ
シウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マン
ガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト
塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ
酸、ビタミンなども適宜用いられる。

【００１６】培養は、通常、温度４乃至４０℃、好まし
くは２０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは５乃
至９から選ばれる条件で好気的に行われる。また、耐熱
性酵素を産生する微生物の場合には、通常、温度４０乃
至９０℃、好ましくは５０乃至８０℃、ｐＨ２乃至１
０、好ましくはｐＨ３乃至９から選ばれる条件で行われ
る。培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間であれば
よく、好ましくは１０時間乃至１００時間である。ま
た、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常
は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通
気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加した
り、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段
が採用される。また、培養方式は、回分培養又は連続培
養のいずれでもよい。

【００１７】このようにして、微生物を培養した後、酵
素を回収する。酵素活性は、培養物の菌体及び除菌液い
ずれにも認められ、菌体及び除菌液を粗酵素液として採
取することも、また、培養物全体を粗酵素液として用い
ることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の
固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものをそ
のまま遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィル
ターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜な
どの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。
除菌液をそのまま酵素液として用いることができるが、
一般的には、濃縮して用いられる。濃縮方法としては、
例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、
平膜、中空糸膜など膜濃縮法などが採用される。

【００１８】更に、除菌液及びその濃縮物を公知の方法
により固定化することもできる。例えば、イオン交換体
への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高
分子物質を用いた包括法などが採用される。また、培養
物から分離した菌体もそのまま粗酵素として用いること
ができるが、これを固定化して用いてもよい。一例とし
て、これをアルギン酸ナトリウムと混合して、塩化カル
シウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させて固定化す
る。この粒状化物をさらにポリエチレンイミン、グルタ
ールアルデヒドで処理して固定化してもよい。菌体から
酵素を抽出して、その抽出液を粗酵素液として用いるこ
ともできる。例えば、超音波による破砕法、ガラスビー
ズ及びアルミナによる機械的破砕法、フレンチプレスに
よる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心分離又は
膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることができる。

【００１９】本酵素液はそのまま用いることができる
が、公知の方法によって更に精製して利用することもで
きる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮
した粗酵素標品を透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ
−トヨパール』などを用いた陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィー、続いて、同社製『ブチルトヨパール』な
どを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、同社製『ト
ヨパール ＨＷ−５５』などを用いたゲル濾過クロマト
グラフィーを用いて精製することにより、電気泳動的に
単一な酵素を得ることができる。

【００２０】このようにして得られる非還元性糖質生成
酵素は、一般的には、例えば、下記の理化学的性質を有
する。 （１） 作用 グルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上
の還元性澱粉部分分解物からα−グリコシルトレハロー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７６，０００乃至８
７，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．６乃
至４．６。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、３５乃至４０℃付近。 （５） 至適ｐＨ ４０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．４乃至７．２。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３５乃至４０℃付近まで
安定。 （７） ｐＨ安定性 ２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．５乃至１１．０。

【００２１】非還元性糖質生成酵素の活性測定方法は、
基質としてマルトペンタオース１．２５ｗ／ｖ％（５０
ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）４ｍｌに酵素液を１ｍ
ｌ加え４０℃で６０分間反応させた後、１００℃で１０
分間加熱して反応を停止させ、その反応液を正確に脱イ
オン水で１０倍に希釈し、その希釈液の還元力をソモギ
ー・ネルソン法にて測定する。対照として、あらかじめ
１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素
液を用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、
１分間に１μｍｏｌｅのマルトペンタオースに相当する
還元力を減少させる酵素量を１単位と定義した。

【００２２】また、前述のようにして得られるトレハロ
ース遊離酵素は、一般的には、例えば、下記の理化学的
性質を有する。 （１） 作用 α−グリコシルトレハロースのトレハロース部分とそれ
以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解
する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約５７，０００乃至６
８，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．３乃
至４．６。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応で、３５乃至４５℃付近。 （５） 至適ｐＨ ４０℃、３０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至７．５。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０乃至４５℃付近まで
安定。 （７） ｐＨ安定性 ２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．０乃至１０．０。

【００２３】トレハロース遊離酵素の活性は次のように
して測定する。基質としてマルトトリオシルトレハロー
ス（別名、α−マルトテトラオシル α−Ｄ−グルコシ
ド）１．２５ｗ／ｖ％（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
７．０）４ｍｌに酵素液を１ｍｌ加え４０℃で３０分間
反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、還
元力をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照とし
て、あらかじめ１００℃で１０分間加熱することにより
失活させた酵素液を用いて同様に測定する。上記の測定
方法を用いて、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相
当する還元力を増加させる酵素量を１単位と定義する。

【００２４】更に、前述のようにして得られるマルトー
ス・トレハロース変換酵素は、下記の理化学的性質を有
する。 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至１２
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃
至５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 起源 微生物により産生された酵素である。

【００２５】マルトース・トレハロース変換酵素の活性
は、次のようにして測定する。基質としてマルトース２
０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）１
ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃とし、６
０分間反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応
を停止させる。この反応液を正確に５０ｍＭリン酸塩緩
衝液ｐＨ７．５で１１倍に希釈し、その希釈液０．４ｍ
ｌにトレハラーゼ含有溶液（１単位／ｍｌ）を０．１ｍ
ｌ添加したものを４５℃、１２０分間インキュベートし
た後、この反応液中のグルコース量をグルコースオキシ
ダーゼ法で定量する。対照として、予め１００℃で１０
分間加熱することにより、失活させた酵素液及びトレハ
ラーゼを用いて同様に測定する。上記の測定方法を用い
て、増加するグルコース量からマルトース・トレハロー
ス変換酵素により生成するトレハロース量を求め、１分
間に１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量を１
単位と定義する。

【００２６】次に、本発明で用いる澱粉枝切酵素は、澱
粉を比較的低ＤＥに液化した溶液、望ましくは、ＤＥ１
５未満の液化溶液に作用し、澱粉の枝分かれ結合を加水
分解する酵素であって、公知のプルラナーゼ、イソアミ
ラーゼなどが有利に利用でき、また、市販の酵素剤を利
用することも有利に実施できる。また、シクロマルトデ
キストリン・グルカノトランスフェラーゼは、澱粉を比
較的低ＤＥに液化した溶液、望ましくは、ＤＥ１５未満
の液化溶液に作用し、澱粉糖を糖転移し、不均化（ｄｉ
ｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｉｏｎ）反応する酵素であ
って、公知のバチルス属、クレブシーラ属などに属する
微生物由来の酵素が有利に利用でき、また、市販の酵素
剤を利用することも有利に実施できる。

【００２７】また、前述の澱粉枝切酵素及び／又はシク
ロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼに
加えて、必要に応じて、他のアミラーゼ、望ましくは、
澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液に作用して、主とし
てグルコース重合度３以上のオリゴ糖を生成するアミラ
ーゼ、例えば、α−アミラーゼ、マルトトリオース生成
アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マル
トペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生
成アミラーゼ、マルトヘプタオース生成アミラーゼなど
を用いることも有利に実施できる。

【００２８】本発明で使用される澱粉は、とうもろこし
澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬
鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であ
ってもよい。澱粉を液化するには、通常、澱粉を水に懸
濁した澱粉乳、望ましくは濃度１０％以上、更に望まし
くは約２０乃至５０％とし、これを加熱して機械的に液
化しても、酸又は酵素で液化してもよい。液化の程度
は、比較的低いものが適しており、望ましくはＤＥ１５
未満、更に望ましくはＤＥ１０未満のものが好適であ
る。酸で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸
などで液化し、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシウ
ム、炭酸ナトリウムなどで必要ｐＨに中和して利用すれ
ばよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、と
りわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適して
いる。

【００２９】このようにして得られる澱粉を液化した溶
液に、非還元性糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又は
シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラー
ゼとともに作用させるか、又は、非還元性糖質生成酵素
及びトレハロース遊離酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシ
クロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ
とともに作用させるには、これら酵素が作用しうるｐ
Ｈ、温度で行えばよく、通常、ｐＨ４乃至１０、好まし
くは、ｐＨ５乃至８、温度約１０乃至８０℃、好ましく
は、約３０乃至７０℃で行われる。また、澱粉を液化し
た溶液にこれら酵素を加える順序は問わず、いずれかの
酵素を先に加え、他の酵素をその後に加えて作用させる
ことも、また、これら酵素を同時に加えて作用させるこ
とも随意である。

【００３０】酵素の使用量は、作用条件、反応時間によ
って適宜選べばよいが、通常、基質である澱粉を液化し
た溶液に対して、固形物グラム当たり、非還元性糖質生
成酵素及びトレハロース遊離酵素の場合、それぞれ約
０．０１乃至１００単位から選ばれ、また、澱粉枝切酵
素の場合、約１乃至１０，０００単位から選ばれ、シク
ロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの
場合、約０．０５乃至５００単位から選ばれる。このよ
うにして得られる非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を
含む低還元性糖質は、澱粉を液化した溶液に、澱粉枝切
酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノト
ランスフェラーゼが非還元性糖質生成酵素又は非還元性
糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素とともに作用す
るため、比較的低分子のα−グリコシルトレハロース及
び／又はα−グリコシル α−グリコシドを多量に含有
するか、又はトレハロースを多量に含有する特長を有し
ており、本発明の原料用低還元性糖質として好適であ
る。なお、α−グリコシル α−グリコシドは、本出願
人が特願平６−５４３７７号明細書で開示したα−Ｄ−
オリゴグリコシル α−Ｄ−オリゴグルコシドを含む呼
称である。

【００３１】反応液は、常法により、濾過、遠心分離な
どして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮し、シラップ
状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも
随意である。必要ならば、更に、精製、例えば、イオン
交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマト
グラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなど
のカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及
びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を
有する膜による分離などの方法を１種又は２種以上組み
合わせて精製することにより、非還元性糖質含量を高め
た、本発明の原料用低還元性糖質を得ることも容易であ
る。

【００３２】とりわけ、工業的大量生産方法としては、
イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であ
り、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５
８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチ
オン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより
夾雑糖類を除去し、非還元性糖質含量を高めた、原料用
低還元性糖質を有利に製造することができる。この際、
固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方
式を採用することも随意である。

【００３３】このようにして得られた分子中にトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質を含む低還元性糖質を、
必要により、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどや、又はα−グル
コシダーゼで分解し、甘味性を調整したり、粘性を低下
させたりする更なる加工処理を施して、原料用の低還元
性糖質を製造することも随意である。

【００３４】このようにして得られる還元性を低減した
糖質は、本発明の原料糖質として有利に用いられる。原
料糖質としては、分子中にトレハロース構造を有する糖
質及びトレハロースからなる非還元性糖質含量が高いも
のが望ましく、通常、２０％以上、望ましくは４０％以
上、更に望ましくは６０％以上が好適であり、また、そ
のＤＥは低いものが望ましく、通常、ＤＥ７０未満、望
ましくは５０未満のもの、更に望ましくは３０未満のも
のが好適である。本発明の原料糖質は、糖組成によって
も変動するが、一般的には、多量の非還元性糖質を含有
し、甘味を有する程の比較的低分子、低粘度であるにも
かかわらず、そのＤＥが低く、本発明の水素添加工程、
その後の精製、濃縮などの製造工程を容易にし、しか
も、水素必要量を大幅に低減させる特長を有している。

【００３５】このようにして得られる分子中にトレハロ
ース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる
非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含む低還元性糖質
を水素添加するには、該非還元性糖質を分解することな
く、これに含まれる還元性澱粉糖が澱粉糖アルコールに
還元されればよく、例えば、原料の糖質を濃度３０乃至
７０％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒として
ラネーニッケル約８乃至１０％を添加し、攪拌しながら
温度を９０乃至１５０℃に上げて水素添加を完了、望ま
しくは、ＤＥを０．５未満に低減させるまで水素添加を
行い、ラネーニッケルを除去し、次いで、常法に従っ
て、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩など
の精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。
必要ならば、更に乾燥、粉末状製品にすることも、ま
た、トレハロースなどを晶出させた結晶性粉末状製品に
することも随意である。このようにして製造される本発
明の還元性を低減させた糖質は、α−グリコシルトレハ
ロース、α−グリコシル α−グリコシドなど分子中に
トレハロース構造を有する非還元性糖質及び／又はトレ
ハロースからなる非還元性糖質に加えて、ソルビトー
ル、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトラ
イトール及びマルトペンタイトールから選ばれる１種又
は２種以上の澱粉糖アルコールを含有している。

【００３６】従って、本発明の還元性を低減させた糖質
は、還元性が極めて低く安定であり、他の素材、特にア
ミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有す
る物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発
生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少
ない。また、還元力が低いにもかかわらず低粘度であ
り、平均グルコース重合度が低いものの場合には、良質
で上品な甘味を有している。

【００３７】また、本発明の還元性を低減させた糖質に
含まれる分子中にトレハロース構造を有する糖質は、ア
ミラーゼ、例えば、すい臓由来α−アミラーゼにより分
解し、低分子非還元性オリゴ糖や低分子マルトオリゴ糖
を生成し、また、これらオリゴ糖も、α−グルコシダー
ゼや小腸酵素でも容易に分解し、グルコース及びトレハ
ロースを生成し、更に、生成したトレハロースはトレハ
ラーゼにより容易にグルコースにまで分解することか
ら、経口摂取により、消化吸収され、カロリー源として
利用される。虫歯誘発菌などによって、醗酵されにく
く、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。

【００３８】また、安定な甘味料であることにより、結
晶高含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチル
スターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用し
て錠剤の糖衣剤として利用することも有利に実施でき
る。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿
性、粘性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の
老化防止性などの性質を具備している。

【００３９】また、本発明の還元性を低減させた糖質
は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤
などとして、飲食物、飼料、餌料、化粧品、医薬品など
の各種組成物に有利に利用できる。

【００４０】本発明の還元性を低減させた糖質は、その
まま甘味付けのための調味料として使用することができ
る。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトー
ス、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマ
ルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、
ラクトスクロース、ソルビトール、マルチトール、ラク
チトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリ
コシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチ
ン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような
他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混合して使用し
てもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖
などのような増量剤と混合して使用することもできる。

【００４１】また、本発明の還元性を低減させた糖質、
とりわけ、結晶状製品は、そのままで、又は必要に応じ
て、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球
状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型し
て使用することも随意である。

【００４２】また、本発明の還元性を低減させた糖質の
甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の
呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も
大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、ま
た品質改良などに有利に利用できる。

【００４３】例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉
末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、
マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし
酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、
焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、
ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みり
ん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味
料として有利に使用できる。

【００４４】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなど
の洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、
果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペ
ースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプ
レッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロ
ップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、
べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たく
あん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソー
セージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、
かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカ
の塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの
各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造
されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻など
の惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、
畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リ
キュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、
ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼
飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席
しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、
治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各
種飲食物への甘味付けに、呈味改良に、また、品質改良
などに有利に利用できる。

【００４５】また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚な
どの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上さ
せる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練
歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トロー
チ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤な
ど各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧
品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈
味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤、安定剤
などとして有利に利用できる。

【００４６】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健
康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、イン
ターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフ
ェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツ
モア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊
走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファク
ター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン、イン
シュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエ
チン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワク
チン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワ
クチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免
疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマ
イシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ス
プレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、
チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、
カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなど
のビタミン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、
プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グル
カナーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、ス
ッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポ
リスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母な
どの生菌、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、
その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液
状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などに容易
に製造できることとなる。

【００４７】以上述べたような各種組成物に本発明の還
元性を低減させた糖質を含有せしめる方法は、その製品
が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、
混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴
霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。
その量は、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有
せしめるのが好適である。

【００４８】次に実験により本発明をさらに具体的に説
明する。

【００４９】まず、新規微生物リゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１及びアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６からの非還元性糖質生成酵素について説明し、次い
で、公知微生物からの非還元性糖質生成酵素について説
明する。

【００５０】

【実験１ リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１からの
非還元性糖質生成酵素の生産】マルトース２．０ｗ／ｖ
％、ペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ
％、リン酸二ナトリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一カリ
ウム０．１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をｐＨ７．
０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培地を
約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２
０分間滅菌し、冷却して、リゾビウム・スピーシーズ
Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を接種し、２７
℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを種培養液と
した。

【００５１】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地約２０ｌを入れて滅菌、冷却して温度
３０℃とした後、種培養液１ｗ／ｖ％を接種し、温度３
０℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、約２４時間通
気撹拌培養した。培養液の本酵素活性は約１．５単位／
ｍｌであった。培養液の一部を採り遠心分離して菌体と
培養液上清とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で元の培養液と同じ液量の懸濁液とし
た後、菌体懸濁液と培養液上清の酵素活性を測定したと
ころ、菌体懸濁液には約０．６単位／ｍｌの酵素活性
が、また、培養液上清には約０．９単位／ｍｌの酵素活
性が認められた。

【００５２】

【実験２ 酵素の精製】実験１で得られた培養液約１８
ｌを、超高圧菌体破砕装置、大日本製薬株式会社製『ミ
ニラボ』で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を
遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することに
より、約１６ｌの上清を得た。その液に飽和度０．２に
なるように硫安を溶解させ、４℃、１時間放置した後、
遠心分離して上清を回収した。

【００５３】更に、その液に飽和度０．６になるように
硫安を溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離
して硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ
緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を
除いた。その透析液（３６０ｍｌ）を２回に分けて、
『ＤＥＡＥ−トヨパール』を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。

【００５４】本酵素は『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着
し、食塩を含む同緩衝液でカラムから溶出した。得られ
る酵素活性画分を、２Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透
析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、得られ
る上清を東ソー株式会社製『ブチルトヨパール ６５
０』を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３
００ｍｌ）を行った。吸着した本酵素を硫安２Ｍから０
Ｍのリニアグラジエントによりカラムから溶出させ、酵
素活性画分を回収した。続いて、『トヨパールＨＷ−５
５』を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３０
０ｍｌ）を行い、酵素活性画分を回収した。精製の各工
程における酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。

【００５５】

【表１】

【００５６】表１の工程でゲル濾過溶出液として得られ
た精製酵素標品をポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度
７．５％）を用いる電気泳動法で純度を検定したとこ
ろ、蛋白バンドは単一であることが示され、得られた酵
素標品は電気泳動的に単一な純度の高い標品であった。

【００５７】

【実験３ 酵素の性質】実験２で得られた精製酵素標品
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）
を用いる電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マー
カー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社
製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子
量約７７，０００乃至８７，０００ダルトンであった。

【００５８】精製酵素標品を２％アンフォライン含有ポ
リアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動法に供
し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求
めたところ、等電点は約３．６乃至４．６であった。

【００５９】本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影
響は活性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の
影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で、４０℃付近、至適ｐ
Ｈは、４０℃、６０分間反応で、約７．０であった。本
酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液
を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩
衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐＨを７に調整
し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。そ
れぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定
性）に示した。本酵素の温度安定性は４０℃付近まで安
定であり、ｐＨ安定性は約６乃至９であった。

【００６０】

【実験４ 非還元性糖質の調製】基質として、グルコー
ス、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、又はマ
ルトヘプタオースの２０％水溶液を調製し、それぞれに
実験２で得られた精製酵素を基質固形物グラム当たり２
単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用
させた後、脱塩し、和光純薬工業株式会社製『ワコービ
ーズ ＷＢ−Ｔ−３３０』を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーで反応生成物を分析した。高速液体クロマトグ
ラフィーは、室温下で行い、溶離液として水を流速０．
５ｍｌ／分で流し、示差屈折計、東ソー株式会社製『Ｒ
Ｉ−８０１２』で分析した。その結果を表２に示す。

【００６１】

【表２】

【００６２】表２の結果から明らかなように、反応物中
には残存するそれぞれの基質と新たに生成したそれぞれ
の糖質ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶからな
り、それ以外の糖質はほとんど検出されない。それぞれ
の生成率はグルコース重合度３のＰＩが比較的低いもの
の、グルコース重合度４以上のＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩ
Ｖ、ＰＶは８５％以上の高い生成率であることが判明し
た。なお、グルコース、マルトースからは、新たな糖質
を生成しないことが判明した。

【００６３】それぞれの反応物から新たに生成した糖質
を精製するため、脱色、脱塩、濃縮後、ナトリウム型強
酸性カチオン交換樹脂、東京有機化学工業株式会社製
『ＸＴ−１０１６』（架橋度４％）を用いたカラム分画
を行った。樹脂を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケッ
ト付ステンレス製カラム３本に充填し、直列につなぎ、
カラム内温度を５５℃に維持しつつ、反応糖液を樹脂に
対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．
１３で流して分画し、新たに生成した糖質含量９７％以
上の高純度画分を採取した。得られた高純度画分を真空
乾燥し、それぞれ高純度糖質標品を調製した。基質原料
に対する収率は、固形物換算で、それぞれＰＩで約９
％、ＰＩＩで約６５％、ＰＩＩＩで約８２％、ＰＩＶで
約８０％、ＰＶで約７７％であった。その純度は、それ
ぞれＰＩで９７．５％、ＰＩＩで９８．６％、ＰＩＩＩ
で９９．５％、ＰＩＶで９８．４％、ＰＶで９８．４％
であった。

【００６４】またこれらの新たに生成した高純度糖質標
品の還元力をソモギー・ネルソン法で測定し、ＤＥで表
した。結果は表３にまとめた。

【００６５】

【表３】

【００６６】表３の結果から明らかなように、いずれの
標品にも僅かな還元力しか認めらなかった。その僅かな
還元力は、その標品中に微量に混入、残存している基質
由来の還元性マルトオリゴ糖に起因するものと推定さ
れ、新たに生成した糖質はいずれも実質的に非還元性で
あると判断される。

【００６７】

【実験５ メイラード反応】実験４において調製した糖
質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶの
１０％とグリシン１％と、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）とを含む溶液を１００℃で９０分間保ち、冷却
後、この溶液の４８０ｎｍ、１ｃｍセルにおける吸光度
を測定した。対照として、それぞれの原料であるマルト
トリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオース、又はマルトヘプタオースを用
いて、同様に、処理し、４８０ｎｍにおける吸光度を測
定した。それらの結果を表４に示す。

【００６８】

【表４】

【００６９】表４の結果から明らかなように、新たに生
成した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、Ｐ
ＩＶ、ＰＶのいずれもメイラード反応による着色度は極
めて低く、それぞれ原料の基質であるマルトオリゴ糖の
着色度の僅かに３乃至６％程度であり、本発明の新規酵
素によって生成する非還元性糖質はメイラード反応をほ
とんど示さない糖質であることが判明した。

【００７０】

【実験６ グルコアミラーゼによる酵素分解】実験４に
おいて調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩ
ＩＩ、ＰＩＶ又は、ＰＶのそれぞれ５０ｍｇを、５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解し、１単位の
グルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を加え、４
０℃で６時間保ち、酵素分解した後、高速液体クロマト
グラフィーで分解物を分析したところ、いずれの標品か
らも分解物としてグルコースとトレハロースのみが検出
された。検出されたグルコース含量、トレハロース含
量、その組成モル比の結果を表５に示す。

【００７１】

【表５】

【００７２】表５の結果から明らかなように、グルコア
ミラーゼにより、非還元性糖質ＰＩはグルコース１分子
とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＩ
はグルコース２分子とトレハロース１分子に分解され、
非還元性糖質ＰＩＩＩはグルコース３分子とトレハロー
ス１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＶはグルコース
４分子とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質
ＰＶはグルコース５分子とトレハロース１分子に分解さ
れることが判明した。

【００７３】また、グルコアミラーゼの反応特性を考慮
すると、これら非還元性糖質の構造はトレハロース分子
にグルコース分子がα−１，４−結合、もしくはα−
１，６−結合で結合した糖質で、それぞれ、ＰＩはトレ
ハロース１分子にグルコース１分子が結合したグルコー
ス重合度３の非還元性糖質で、ＰＩＩはトレハロース１
分子にグルコース２分子が結合したグルコース重合度４
の非還元性糖質で、ＰＩＩＩはトレハロース１分子にグ
ルコース３分子が結合したグルコース重合度５の非還元
性糖質で、ＰＩＶはトレハロース１分子にグルコース４
分子が結合したグルコース重合度６の非還元性糖質で、
ＰＶはトレハロース１分子にグルコース５分子が結合し
たグルコース重合度７の非還元性糖質であると判断され
る。なお、同様に、非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、
ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶにβ−アミラーゼを作用さ
せたところ、非還元性糖質ＰＩ、ＰＩＩは分解されず、
ＰＩＩＩはマルトースの１分子とＰＩの１分子に分解さ
れ、ＰＩＶはマルトースの１分子とＰＩＩの１分子に分
解され、ＰＶはマルトースの２分子とＰＩの１分子に分
解されることが判明した。

【００７４】以上の結果から、本発明の非還元性糖質生
成酵素による反応は、基質の低分子化及び高分子化を伴
わない、換言すれば、グルコース重合度の変化を伴わな
い、分子内変換反応と判断され、また、この非還元性糖
質生成酵素によって生成した非還元性糖質、ＰＩ、ＰＩ
Ｉ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ及びＰＶは、それぞれ、α−グル
コシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α
−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオ
シルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロ
ースで示されるα−グリコシルトレハロース（Ｇ_n−
Ｔ：但し、 Ｇはグルコース残基を意味し、ｎは１以上
の整数を意味し、Ｔはα，α−トレハロースを意味す
る。）であると判断される。

【００７５】

【実験７ 各種の酵素による分解】実験４において調製
した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩ
Ｖ、又はＰＶのそれぞれを基質として、ブタすい臓由来
α−アミラーゼ（シグマ社販売）、コメ由来α−グルコ
シダーゼ（同社販売）、又はラット小腸アセトン粉末酵
素（同社販売）のそれぞれに作用させた後、分解物の糖
組成を高速液体クロマトグラフィーで分析した。α−ア
ミラーゼの反応は、それぞれの基質１０ｍｇを、５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍｌに溶解し、これ
に、酵素活性１単位加え、３７℃で１８時間保って行っ
た。α−グルコシダーゼの反応は、５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）を用いた以外、α−アミラーゼの場合と
同様の条件で行った。ラット小腸アセトン粉末酵素の場
合も、５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い
た以外、α−アミラーゼの場合と同様の条件で行った。
α−アミラーゼによる分解物の糖組成を以下の表６に、
α−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉末酵素に
よる分解物の糖組成を以下の表７、表８に示す。

【００７６】

【表６】

【００７７】

【表７】

【００７８】

【表８】

【００７９】表６の結果から明らかなように、糖質標
品、ＰＩ及びＰＩＩは、α−アミラーゼによりほとんど
分解されないものの、糖質標品、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、及
びＰＶはα−アミラーゼにより低分子のオリゴ糖、Ｐ
Ｉ、ＰＩＩ、マルトトリオース、マルトース及びグルコ
ースにまで分解されることが判明した。

【００８０】また、表７、表８の結果から明らかなよう
に、糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶ
いずれもα−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉
末酵素により、実験６のグルコアミラーゼの場合と同様
に、グルコースとトレハロースにまで分解されることが
判明した。

【００８１】また、同様にα−グルコシダーゼ及びラッ
ト小腸アセトン粉末酵素によって分解されたそれぞれの
反応物に、更に、１単位のブタ腎臓由来トレハラーゼ
（シグマ社販売）を加え、ｐＨ５．７、３７℃で１８時
間作用させ、高速液体クロマトグラフィー法で糖組成を
分析したところ、糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、
ＰＩＶ、ＰＶいずれの場合も、α−グルコシダーゼ及び
ラット小腸アセトン粉末酵素により生成したトレハロー
スはトレハラーゼによりグルコースにまで分解すること
が判明した。

【００８２】上述のように、 （１） 非還元性糖質生成酵素は、グルコース重合度３
以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分
解物から、そのグルコース重合度を変化することなく、
α−グリコシルトレハロースを生成している。 （２） 非還元性糖質ＰＶは、α−アミラーゼにより、
主に非還元性糖質ＰＩＩとマルトトリオースを生じ、非
還元性糖質ＰＩＩは、グルコアミラーゼにより、トレハ
ロース１分子とグルコース２分子を生じている。 これらの結果から、本発明の非還元性糖質生成酵素は、
還元性澱粉部分分解物の還元性末端を非還元性のトレハ
ロース構造に分子内変換する全く新しい作用機作の酵素
であると判断される。

【００８３】

【実験８ 急性毒性】７週齢のｄｄ系マウスを使用し
て、実験４において調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、
ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶを経口投与して急
性毒性試験を行った。その結果、これら非還元性糖質は
いずれも低毒性の物質で、投与可能な最大投与量におい
ても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とは
いえないが、それらのＬＤ₅₀値は、いずれも５０ｇ／ｋ
ｇ以上であった。

【００８４】

【実験９ アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６か
らの非還元性糖質生成酵素の生産】リゾビウム・スピー
シーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）に代え
て、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３１６）を用いた以外は、実験１と同様に
ファーメンターで約７２時間培養した。培養液の非還元
性糖質生成酵素の酵素活性は、約１．２単位／ｍｌであ
った。実験１と同様にして菌体懸濁液と培養液上清の酵
素活性を測定したところ、それぞれ約０．５単位／ｍｌ
及び約０．７単位／ｍｌであった。

【００８５】

【実験１０ 酵素の精製】実験９の方法で得られた培養
液約１８ｌを用いて、実験２と同様に精製した。精製の
各工程結果は表９にまとめた。

【００８６】

【表９】

【００８７】表９の工程で、ゲル濾過溶出液として得ら
れた精製酵素標品を、実験２の場合と同様に電気泳動法
で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であること
が示され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度
の高い標品であった。

【００８８】

【実験１１ 酵素の性質】実験１０で得られた精製酵素
標品を、実験３の場合と同様に、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法で分子量を測定したところ、約７
６，０００乃至８６，０００ダルトンであった。また、
本精製酵素標品の等電点を実験３の場合と同様に等電点
電気泳動法で求めたところ、ｐＩ約３．６乃至４．６で
あった。また、本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの
影響、及び本酵素の温度安定性、ｐＨ安定性について、
実験３の場合と同様にして求めた。結果は、温度の影響
を図５に、ｐＨの影響を図６に、温度安定性を図７に、
ｐＨ安定性を図８に示した。

【００８９】図から明らかなように酵素の至適温度は４
０℃付近、至適ｐＨは約６．５乃至７．０である。温度
安定性は４０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約６．０
乃至９．５である。

【００９０】

【実験１２ 非還元性糖質の調製】実験１０で得られた
精製酵素標品を用いて、実験４及び実験６の方法に従っ
て、非還元性糖質の調製とその構造確認の実験を行った
ところ、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の場合と同様に、グルコース重合度
３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分
分解物からα−グリコシルトレハロースを生成すること
が判明した。

【００９１】

【実験１３ 公知微生物からの非還元性糖質生成酵素の
生産とその性質】公知微生物のうち、本発明の非還元性
糖質生成酵素産生能の確認された表１０に示す特定の微
生物を、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＡＴＣＣ１
９４２０の場合に３７℃で培養した以外は、実験１の場
合と同様にファーメンターで２７℃で７２時間培養し
た。それぞれの培養液約１８ｌを用いて、実験２の場合
と同様に、培養液を破砕装置にかけ、その上清を硫安塩
析、透析し、更にイオン交換カラムにかけ、部分精製酵
素標品を得、その性質を調べた。結果を表１０にまとめ
た。

【００９２】

【表１０】

【００９３】また、これら公知菌由来の部分精製酵素を
用いて、実験１２の方法に従って、非還元性糖質の調製
とその構造確認を行ったところ、いずれの酵素もリゾビ
ウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成
酵素の場合と同様に、グルコース重合度３以上から選ば
れる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物からα−
グリコシルトレハロースを生成することが判明した。

【００９４】次に、新規微生物リゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１及びアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６からのトレハロース遊離酵素について説明し、次い
で、公知微生物からのトレハロース遊離酵素について説
明する。

【００９５】

【実験１４ リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１から
のトレハロース遊離酵素の生産】澱粉部分分解物、松谷
化学工業株式会社製『パインデックス＃』４２．０ｗ／
ｖ％、ペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／
ｖ％、リン酸二ナトリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一カ
リウム０．１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をｐＨ
７．０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培
地を約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃
で２０分間滅菌し、冷却して、リゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を接種し、
２７℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを種培養
液とした。

【００９６】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地約２０ｌを入れて殺菌、冷却して温度
２７℃とした後、種培養液１ｗ／ｖを接種し、温度２７
℃、ｐＨは６．０乃至８．０に保ちつつ、約７２時間通
気撹拌培養した。

【００９７】培養液の非還元性糖質生成酵素の酵素活性
は約１．５単位／ｍｌで、本発明のトレハロース遊離酵
素の酵素活性は約２単位／ｍｌであった。培養液の一部
を採り遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更に
菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で元の培養
液と同じ液量の懸濁液とした後、菌体懸濁液と培養上清
との酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には、非還
元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．６単位／ｍｌ、ト
レハロース遊離酵素の酵素活性が約０．８単位／ｍｌ認
められ、培養上清には、非還元性糖質生成酵素の酵素活
性が約０．９単位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素
活性が約１．２単位／ｍｌ認められた。

【００９８】

【実験１５ 酵素の精製】実験１４の方法で得られた培
養液約１８ｌを超高圧菌体破砕装置『ミニラボ』で処理
し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離（１
０，０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、約１６
ｌの遠心上清液を得た。その液に飽和度０．２になるよ
うに硫安を加え溶解させ、４℃、１時間放置した後、遠
心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することによ
り上清を回収した。

【００９９】更に、その液に硫安を飽和度０．６になる
ように溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離
して硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ
緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離し、不溶物を
除いた。その透析液（３６０ｍｌ）を２回に分けて、
『ＤＥＡＥ−トヨパール』を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。

【０１００】本発明のトレハロース遊離酵素、非還元性
糖質生成酵素とも『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着し、
食塩を含む同緩衝液でカラムから異なる食塩濃度におい
てそれぞれ溶出した。『ＤＥＡＥ−トヨパール』からの
溶出パターンを図９に示す。非還元性糖質生成酵素は食
塩濃度約０．２Ｍで、トレハロース遊離酵素は食塩濃度
約０．３Ｍで溶出し、それぞれの酵素活性画分を回収
し、以下、両酵素を別々に精製した。

【０１０１】非還元性糖質生成酵素活性画分を２Ｍ硫安
を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離
し不溶物を除き、得られる上清を『ブチルトヨパール
６５０』を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル
量３００ｍｌ）を行った。吸着した本酵素を２Ｍから０
Ｍ硫安のリニアグラジエントでカラムより溶出させ、酵
素活性画分を回収した。続いて、『トヨパール ＨＷ−
５５』を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３
００ｍｌ）を行い、非還元性糖質生成酵素活性画分を回
収した。

【０１０２】トレハロース遊離酵素の精製は、『ＤＥＡ
Ｅ−トヨパール』から溶出したトレハロース遊離酵素活
性画分を用いて、上記の非還元性糖質生成酵素の精製方
法と同様に、２Ｍ硫安を含む緩衝液に対して透析し、次
いで疎水カラムクロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマト
グラフィーを行った。

【０１０３】精製の各工程における酵素活性量、比活
性、収率を、非還元性糖質生成酵素の場合は表１１に、
本発明のトレハロース遊離酵素の場合は表１２に示す。

【０１０４】

【表１１】

【０１０５】

【表１２】

【０１０６】表１１及び表１２の工程でそれぞれゲル瀘
過溶出液として得られた、精製非還元性糖質生成酵素標
品及び精製トレハロース遊離酵素標品をポリアクリルア
ミドゲル（ゲル濃度７．５％）を用いる電気泳動法で純
度を検定したところ、蛋白バンドは単一であることが示
され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度の高
い標品であった。

【０１０７】

【実験１６ トレハロース遊離酵素の性質】実験１５の
方法で得られた精製トレハロース遊離酵素標品をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）を用いる
電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日
本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較
して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約５８，
０００乃至６８，０００ダルトンであった。

【０１０８】精製酵素標品をポリアクリルアミドゲルを
用いる等電点電気泳動法に供し、泳動後、ゲルのｐＨを
測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は約
３．３乃至４．３であった。

【０１０９】本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影
響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図１０（温度
の影響）、図１１（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適
温度は、ｐＨ７．０、３０分間反応で、４５℃付近、至
適ｐＨは、４０℃、３０分間反応で、約６．０乃至７．
５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分
間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定するこ
とにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ
の５０ｍＭ緩衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐ
Ｈを７に調整し、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。それぞれの結果を図１２（温度安定性）、図
１３（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の熱安定性は約４
０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５乃至１０であっ
た。

【０１１０】

【実験１７ α−グリコシルトレハロースからのトレハ
ロースの調製】基質として用いるα−グリコシルトレハ
ロースは、実験４の方法に従って調製した。即ち、マル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースから選
ばれる還元性澱粉部分分解物の２０％水溶液に実験１５
の方法で得られた精製非還元性糖質生成酵素標品を基質
固形物グラム当りそれぞれ２単位の割合で加え、４０
℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた後、常法に従っ
て、加熱失活、瀘過、脱色、脱塩、濃縮し、ナトリウム
型強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』を用いた
イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を
内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付ステンレス製
カラム３本に充填し、直列につなぎ、カラム内温度を５
５℃に維持しつつ、反応糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％
加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画
し、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度
が３以上の非還元性糖質の高純度標品を調製した。得ら
れた高純度標品のうち、グルコシルトレハロース標品の
純度は９７．６％で、マルトシルトレハロース標品の純
度は９８．６％で、マルトトリオシルトレハロース標品
の純度は９９．６％で、マルトテトラオシルトレハロー
ス標品の純度は９８．３％で、マルトペンタオシルトレ
ハロース標品の純度は９８．１％であった。

【０１１１】上記５種の非還元性糖質（α−グリコシル
トレハロース）の２０％水溶液を調製し、それぞれに実
験１５で得られた精製トレハロース遊離酵素を基質固形
物グラム当り２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０
で４８時間作用させた後、脱塩し、『ワコービーズ Ｗ
Ｂ−Ｔ−３３０』を用いた高速液体クロマトグラフィー
で反応生成物を分析した。対照として、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオースに精製トレハロース
遊離酵素を同様に作用させ、高速液体クロマトグラフィ
ーで分析した。それらの結果を表１３に示す。

【０１１２】

【表１３】

【０１１３】表１３の結果から明らかなように、 （１） トレハロース遊離酵素は、α−グリコシルトレ
ハロースのトレハロース部分とグリコシル部分との間の
結合を特異的に加水分解し、トレハロースとグルコース
重合度が１以上の還元性糖質とを生成する。 （２） マルトオリゴ糖は、トレハロース遊離酵素によ
って全く作用を受けない。 これらの結果から、本発明のトレハロース遊離酵素は、
α−グリコシルトレハロースのトレハロース部分とその
他のグリコシル部分との間の結合を極めて特異的に加水
分解し、トレハロースを遊離する全く新しい作用機構の
酵素であると判断される。

【０１１４】次いで、それぞれの反応物からトレハロー
スを精製するため、脱色、脱塩、濃縮し、ナトリウム型
強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』を用いたカ
ラム分画を行い、トレハロース含量９７％以上の高純度
画分を採取した。得られた高純度画分を濃縮して濃度約
６５％にし、２５℃で２日間放置して含水トレハロース
結晶を晶出させ、分蜜し、真空乾燥して、トレハロース
含量９９％以上の高純度標品を調製した。原料基質に対
するそれぞれの収率は、固形物換算で、グルコシルトレ
ハロースから９．５％、マルトシルトレハロースから１
４．９％、マルトトリオシルトレハロースから１６．０
％、マルトテトラオシルトレハロースから１８．５％、
マルトペンタオシルトレハロースから１７．７％であっ
た。得られたそれぞれの高純度トレハロース標品用い
て、市販の試薬トレハロース（和光純薬工業株式会社販
売）を標準品として、融点、融解熱、比旋光度、赤外線
吸収スペクトル、粉末Ｘ線回折パターン及びブタ腎臓由
来トレハラーゼでの分解性について比較したところ、調
製したすべての高純度トレハロース標品は、融点９７．
０±０．５℃、融解熱５７．８±１．２ＫＪ／ｍｏｌ
ｅ、比旋光度＋１８２±１．１°で、試薬トレハロース
の実測値とよく一致し、また、赤外線吸収スペクトル及
び粉末Ｘ線回折パターンについても、試薬トレハロース
のスペクトル又はパターンとよく一致した。更に、ブタ
腎臓由来トレハラーゼによって、高純度トレハロース標
品は試薬トレハロースと同様にグルコースに分解され
た。以上の結果から明らかなように、α−グリコシルト
レハロースに本発明のトレハロース遊離酵素を作用させ
生成した糖質はトレハロースであると確認された。

【０１１５】

【実験１８ 還元性澱粉部分分解物からのトレハロース
の調製】５％ワキシーコーンスターチ懸濁液を加熱糊化
させた後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、これにイ
ソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉
グラム当り４，０００単位の割合になるように加え、２
０時間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２
０℃、１０分間）し、次いで６０℃に冷却し、これを東
ソー株式会社製『トヨパール ＨＷ−５０Ｓ』を用いた
ゲル瀘過クロマトグラフィー（ゲル量７５０ｍｌ）でグ
ルコース重合度３５乃至１０の還元性澱粉部分分解物を
調製した。

【０１１６】得られた還元性澱粉部分分解物、又はグル
コース重合度３のマルトトリオースを、１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で１％濃度に調整し、これに実験
１５の方法で調製した精製非還元性糖質生成酵素標品及
び精製トレハロース遊離酵素標品をそれぞれ基質固形物
当り４単位の割合で加え、４０℃で２４時間作用させた
後、一部を採り、脱塩し、高速液体クロマトグラフィー
で反応生成物を分析した。

【０１１７】残りの反応液は、更に、５０℃、ｐＨ４．
５に調整した後、グルコアミラーゼ（生化学工業株式会
社製）を基質固形物当り５０単位の割合で加え、２４時
間作用させ、同様に脱塩し、高速液体クロマトグラフィ
ーで反応生成物を分析した。それらの結果を表１４に示
す。

【０１１８】

【表１４】

【０１１９】表１４に示すように、非還元性糖質生成酵
素及びトレハロース遊離酵素を作用させた後のトレハロ
ース生成率は、グルコース重合度３のマルトトリオース
では４．２％と低い値であったが、グルコース重合度１
０乃至３４．１の澱粉部分分解物では６６．１乃至８
０．８％の高い値が得られた。また、原料の還元性澱粉
部分分解物のグルコース重合度が高い程、得られるトレ
ハロース純度が高いことも判明した。更に、該両酵素を
作用させた反応液にグルコアミラーゼを作用させ、残存
する末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度
が３以上の非還元性糖質をトレハロースとグルコースと
に分解することにより、生成するトレハロース純度がよ
り高まることも判明した。

【０１２０】

【実験１９ メイラード反応】実験１７の方法で得られ
た高純度トレハロース標品（純度９９．５％）の１０％
とグリシン１％と、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）とを含む溶液を１００℃で９０分間保ち、冷却後、
この溶液の４８０ｎｍ、１ｃｍセルにおける吸光度を測
定した。対照として、グルコース、マルトースを用い
て、同様に処理し、４８０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。結果を表１５に示す。

【０１２１】

【表１５】

【０１２２】表１５の結果から明らかなように、トレハ
ロース標品は、メイラード反応による着色度は僅かであ
り、グルコースやマルトースの着色度の僅か０．４乃至
０．６％程度であり、本発明のトレハロース標品はメイ
ラード反応をほとんど示さない糖質であることが判明し
た。従って、本糖質は、アミノ酸と混合しても、アミノ
酸を損なうことが少ない糖質である。

【０１２３】

【実験２０ 生体内での利用試験】厚治等が、『臨床栄
養』、第４１巻、第２号、第２００乃至２０８頁（１９
７２年）で報告している方法に準じて、実験１７の方法
で得られた高純度トレハロース標品（純度９９．５％）
３０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア
６名（健康な２６才、２７才、２８才、２９才、３０
才、３１才の男性）にそれぞれ経口投与し、経時的に採
血して、血糖値及びインスリン値を測定した。対照とし
ては、グルコースを用いた。その結果、トレハロース
は、グルコースの場合と同様の挙動を示し、血糖値、イ
ンスリン値ともに、投与後、約０．５乃至１時間で最大
値を示した。トレハロースは、容易に消化吸収、代謝利
用されて、エネルギー源になることが判明した。

【０１２４】

【実験２１ 急性毒性試験】マウスを使用して、実施例
Ａ−５、Ａ−７およびＡ−８の方法で得られた還元性を
低減させた糖質粉末を経口投与して急性毒性試験を行っ
た。その結果、いずれの標品も低毒性の物質で、投与可
能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。
従って、正確な値とはいえないが、それらのＬＤ５０値
は、５０ｇ／ｋｇ以上であった。

【０１２５】

【実験２２ アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６
からのトレハロース遊離酵素の生産】リゾビウム・スピ
ーシーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）に代
えて、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４３１６）を用いた以外は、実験１４と同
様に、ファーメンターで約７２時間培養した。培養液の
非還元性糖質生成酵素の酵素活性は約１．３単位／ｍｌ
で、本発明のトレハロース遊離酵素の酵素活性は約１．
８単位／ｍｌであった。実験１４と同様にして菌体懸濁
液と培養上清との酵素活性を測定したところ、菌体懸濁
液には、非還元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．５単
位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素活性が約０．５
単位／ｍｌ認められ、培養上清には、非還元性糖質生成
酵素の酵素活性が約０．８単位／ｍｌ、トレハロース遊
離酵素の酵素活性が約１．３単位／ｍｌ認められた。

【０１２６】

【実験２３ 酵素の精製】実験２２の方法で得られた培
養液約１８ｌを用いて、実験１５と同様の方法で精製し
た。精製の各工程結果は非還元性糖質生成酵素の場合は
表１６に、トレハロース遊離酵素の場合は表１７にまと
めた。

【０１２７】

【表１６】

【０１２８】

【表１７】

【０１２９】表１６及び表１７の工程で、それぞれゲル
瀘過溶出液として得られた精製非還元性糖質生成酵素及
び精製トレハロース遊離酵素を、実験１５の場合と同様
に電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単
一であることが示され、得られた両精製酵素は電気泳動
的に単一な純度の高い標品であった。

【０１３０】

【実験２４ 酵素の性質】実験２３の方法で得られた精
製トレハロース遊離酵素を、実験１６の場合と同様にＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測
定したところ、約５７，０００乃至６７，０００ダルト
ンであった。また、本酵素の等電点を実験３の場合と同
様に等電点電気泳動法で求めたところ、等電点は３．６
乃至４．６であった。また、本酵素活性に対する温度の
影響、ｐＨの影響、及び本酵素の温度安定性、ｐＨ安定
性について、実験１６の場合と同様にして求めた。結果
は、温度の影響を図１４に、ｐＨの影響を図１５に、温
度安定性を図１６に、ｐＨ安定性を図１７に示した。

【０１３１】図から明らかなように酵素の至適温度は４
５℃付近、至適ｐＨは約６．０乃至７．５である。温度
安定性は４５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．０
乃至１０．０である。

【０１３２】

【実験２５ α−グリコシルトレハロースからのトレハ
ロースの調製】実験２３の方法で得られた精製酵素を用
いて、実験１７の方法に従って、末端にトレハロース構
造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質か
らのトレハロースの調製の実験を行ったところ、リゾビ
ウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊離
酵素の場合と同様に、α−グリコシルトレハロースから
トレハロースを遊離することが判明した。

【０１３３】

【実験２６ 公知微生物からのトレハロース遊離酵素の
生産とその性質】公知微生物のうち、本発明のトレハロ
ース遊離酵素産生能の確認されたブレビバクテリウム・
ヘロボルムＡＴＣＣ１１８２２及びミクロコッカス・ロ
ゼウスＡＴＣＣ１８６を、実験１４の場合と同様にファ
ーメンターで２７℃で７２時間培養した。それぞれの培
養液約１８ｌを用いて、実験１５の場合と同様に、培養
液を破砕装置で処理し、その遠心上清を回収し、続い
て、硫安塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィーし、得られた部分精製酵素標品の性質を調べた。こ
れらの結果を、前述のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−
１１及びアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６の場
合とともに表１８にまとめた。

【０１３４】

【表１８】

【０１３５】また、これらの公知微生物由来の部分精製
酵素を用いて、実験２５の方法に従って、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元
性糖質からのトレハロースの調製の実験を行ったとこ
ろ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来のトレハロ
ース遊離酵素の場合と同様に、α−グリコシルトレハロ
ースからトレハロースを遊離することが判明した。

【０１３６】

【実験２７ トレハロース高含有糖質を製造するための
澱粉の液化程度と使用酵素の影響】澱粉からトレハロー
ス高含有糖質を製造するために、澱粉の液化程度と使用
する酵素の組合わせの影響を調べた。濃度２０％のとう
もろこし澱粉乳に炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ
６．５に調整した後、これにα−アミラーゼ、ノボ社販
売『ターマミール』を澱粉当たり０．１乃至２．０％を
加え、９５℃で１５分間反応させ、１２０℃にオートク
レーブして１０分間保って、ＤＥ２．５乃至２０．５の
液化溶液とし、これを急冷したものに実験２の方法で調
製した精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり５
単位及び実験１５の方法で調製した精製トレハロース遊
離酵素を澱粉グラム当たり１０単位加え、更に澱粉枝切
酵素イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販
売）を澱粉グラム当たり５００単位及び／又はシクロマ
ルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式
会社林原生物化学研究所販売）を澱粉グラム当たり５単
位加えてｐＨ６．０、４５℃で２４時間反応させた。本
反応液を９５℃、１０分間加熱した後、冷却し、次い
で、グルコアミラーゼを澱粉グラム当たり１０単位加え
てｐＨ５．０で１０時間反応させた。本反応液を高速液
体クロマトグラフィーで分析し、糖質中のトレハロース
含量（％）を求めた。対照として、澱粉液化溶液に非還
元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素だけを同様
に作用させ、同様に、グルコアミラーゼを作用させて、
高速液体クロマトグラフィーで分析した。結果は、表１
９に示す。

【０１３７】

【表１９】

【０１３８】表１９の結果から明らかなように、澱粉か
らトレハロース高含有糖質を製造するには、その液化の
程度は比較的低いものが適しており、望ましくは、ＤＥ
１５未満、更に望ましくはＤＥ１０未満が好適であるこ
とが判明した。また、それに使用する酵素は、非還元性
糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素だけを作用させ
るよりも、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離
酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリ
ン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させた方
が、澱粉からのトレハロース収量を約２乃至４倍にも向
上することとなり、澱粉からトレハロースを工業的に大
量生産する上で、極めて有利であることが判明した。

【０１３９】以下、本発明の還元性を低減させた糖質の
製造方法を実施例Ａで、該糖質を含有せしめた組成物を
実施例Ｂで示す。

【０１４０】

【実施例Ａ−１】馬鈴薯澱粉を濃度約２０％の澱粉乳と
し、これに蓚酸を０．３％加えてオートクレーブし、冷
却し、炭酸カルシウムでｐＨ６．５に中和して、ＤＥ約
１２の液化溶液を得た。本液化溶液に実験２の方法で得
た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり２単位
及びイソアミラーゼを澱粉グラム当たり３００単位加
え、温度４５℃で２４時間反応させた、本反応液を９５
℃に加熱して酵素を失活させた後、冷却し、濾過して得
られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及
びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃
縮して濃度約５０％のシラップを固形物当たり約９０％
の収率で得た。本品は、α−グリコシルトレハロースと
ともに還元性澱粉糖を含むＤＥ約８の低還元性糖質であ
る。本低還元性糖質シラップをオートクレーブに入れ、
ラネーニッケル１０％を添加し、攪拌しながら温度を９
０乃至１２０℃に上げ、水素圧を２０乃至１２０ｋｇ／
ｃｍ²に上げて水素添加を完了させた後、ラネーニッケ
ルを除去し、次いで、常法に従って、脱色、脱塩して精
製し、濃縮して、濃度７０％のシラップを固形物当たり
約８０％の収率で得た。本品は、分子中にトレハロース
構造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを
含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和
で上品な甘味、比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘
味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などと
して、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有
利に利用できる。

【０１４１】

【実施例Ａ−２】タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳と
し、これにα−アミラーゼ、ナガセ生化学工業株式会社
製『ネオスピターゼ』を澱粉グラム当たり０．２％加
え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２
０℃にオートクレーブし、急冷してＤＥ約４の液化溶液
を得、これに実験９の方法で得た精製非還元性糖質生成
酵素を澱粉グラム当たり５単位、プルラナーゼ（株式会
社林原生物化学研究所販売）を澱粉グラム当たり１００
単位及びマルトテトラオース生成アミーゼ（株式会社林
原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり２０単位加
え、ｐＨ６．５、温度４０℃で３６時間反応させた。本
反応液を、実施例Ａ−１と同様に、加熱して酵素を失活
させた後、精製し、濃度約６０％に濃縮した。本濃縮液
を原糖液とし、非還元性糖質の含量を高めるため、カル
シウム型強酸性カチオン交換樹脂、東京有機化学工業株
式会社製『ＸＴ−１０１６』を用いたカラムクロマトグ
ラフィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット
付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹
脂層長全長２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に維持
しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５
５℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、非還元性糖質
高含有のグルコース重合度４乃至６の画分を採取し、精
製、濃縮し、濃度約５０％のシラップを得た。本品は、
α−グリコシルトレハロースとともに還元性澱粉糖を含
むＤＥ５．４の低還元性糖質である。本低還元性シラッ
プを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製
し、濃縮して、濃度７０％のシラップを固形物当たり約
５０％の収率で得た。本品は、分子中にトレハロース構
造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含
有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で
上品な甘味、比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味
料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとし
て、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利
に利用できる。

【０１４２】

【実施例Ａ−３】とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱
粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ
６．５に調整し、α−アミラーゼ、ノボ社製『ターマミ
ール６０Ｌ』を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃
で１５分間反応させ、次いで１２０℃にオートクレイブ
し、急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実験２の
方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当た
り４単位、イソアミラーゼを澱粉グラム当たり３００単
位及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフ
ェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）を澱粉グ
ラム当たり５単位加え、ｐＨ６．３、温度４５℃で４８
時間反応させた。本反応液を９５℃で１０分間保った
後、冷却し、これにβ−アミラーゼを澱粉グラム当たり
１０単位加えてｐＨ５．５、温度５５℃で１６時間反応
させた。本反応液を、加熱して酵素を失活させた後、常
法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して濃度約５
０％のシラップを得た。本品は、末端にトレハロース構
造を有する非還元性糖質及びα−グリコシル α−グル
コシドなどの非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含む
低還元性糖質である。本低還元性シラップを、実施例Ａ
−１の方法に準じて、水素添加し、精製し濃縮して、濃
度７０％のシラップを固形物当たり約８０％の収率で得
た。本品は、分子中にトレハロース構造を有する非還元
性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低
減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、比較
的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、
品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、
化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

【０１４３】

【実施例Ａ−４】実施例Ａ−３の方法で得たシラップを
濃度約５５％にして原糖液とし、非還元性糖質の含量を
高めるため、実施例Ａ−２の方法に準じて塩型強酸性カ
チオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行
って、非還元性糖質高含有のグルコース重合度３乃至６
の画分を採取し、精製、濃縮し、濃度約５０％のシラッ
プを得た。本品は、末端にトレハロース構造を有する非
還元性糖質及びα−グリコシル α−グルコシドなどの
非還元性糖質を多量含むとともに還元性澱粉糖を含むＤ
Ｅ８の低還元性糖質である。本低還元性シラップを実施
例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮し
て濃度７０％のシラップを固形物当たり約３０％の収率
で得た。本品は、分子中にトレハロース構造を有する非
還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性
を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、
比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味料、呈味改良
剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食
物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用でき
る。

【０１４４】

【実施例Ａ−５】とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱
粉乳とし、これに実施例Ａ−３の方法に準じて、α−ア
ミラーゼを作用させてＤＥ４の液化溶液を得、次いで、
実験２の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グ
ラム当たり５単位、実験１５記載の精製トレハロース遊
離酵素を澱粉グラム当たり１０単位及びイソアミラーゼ
を澱粉グラム当たり５００単位加え、ｐＨ６．０、温度
４０℃で４８時間反応させた。本反応液には、トレハロ
ースを７６．３％含有していた。本反応液を加熱して酵
素を失活させた後、常法に従って、脱色、脱塩して精製
し、濃縮して約４５％のシラップを得た。本トレハロー
ス高含有低還元性糖質シラップを、実施例Ａ−１の方法
に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して濃度約８５％
にして助晶機にとり、撹拌しつつ徐冷して助晶し、これ
をプラスチック製バットに取り出し、室温で２日間放置
し、晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブ
ロックを切削機にて粉砕してトレハロース含水結晶とと
もに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤ
Ｅ１未満の糖質粉末を、原料澱粉に対して固形物当たり
８０％の収率で得た。本品は、取扱いが容易であり、甘
味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などと
して、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有
利に利用できる。

【０１４５】

【実施例Ａ−６】タピオカ澱粉を濃度約３０％の澱粉乳
とし、これに実施例Ａ−２の方法に準じて、α−アミラ
ーゼを作用させてＤＥ５の液化溶液を得、次いで、実験
１０の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラ
ム当たり３単位、実験２３の方法で得た精製トレハロー
ス遊離酵素を澱粉グラム当たり５単位及びプルラナーゼ
を２００単位及びシクロマルトデキストリン・グルカノ
トランスフェラーゼを澱粉グラム当たり３単位加え、ｐ
Ｈ６．０、温度４５℃で４８時間反応させた。本反応液
には、固形物当たりトレハロースを８４．７％含有して
いた。本反応液を加熱失活し、常法に従って、脱色、脱
塩して精製し、濃縮しながら連続晶析させ、得られるマ
スキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少
量の水でスプレーし洗浄してトレハロース含水結晶を固
形物当たり約５５％の収率で得た。この方法で得られた
母液には多量のトレハロース及びトレハロース構造を有
する非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有してお
り、これを濃縮して濃度５０％のシラップを得た。本低
還元性糖質シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、
水素添加し、精製し、濃縮して、濃度７０％のシラップ
を固形物当たり約３０％得た。本品は、トレハロース及
びトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに澱粉
糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満
の糖質で、温和で上品な甘味、比較的低粘度、適当な保
湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして、各種組成物に有利に利用でき
る。

【０１４６】

【実施例Ａ−７】実施例Ａ−６の方法で得た加熱失活し
た反応液に、グルコアミラーゼを基質グラム当たり１０
単位加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１０時間反応させ
た。本反応液を加熱失活し、常法に従って、脱色、脱塩
して精製し、濃縮して濃度４５％のシラップを得た。本
トレハロース高含有低還元性糖質シラップを、実施例Ａ
−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、次いで、濃
度約７０％に濃縮した後、助晶機にとり撹拌しつつ徐冷
して助晶し、晶出率約４０％のマスキットを得た。本マ
スキットを乾燥塔上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ²の
高圧にて噴霧し、同時に乾燥塔の上部より８５℃の熱風
を送風し、底部に設けた移送金網コンベア上に結晶粉末
を補集した。コンベアの下より４５℃の温風を送りつ
つ、該粉末を乾燥塔外に徐々に移動させて、取り出し
た。この結晶粉末を熟成塔に充填して温風を送りつつ１
０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース
含水結晶及びソルビトールを含有する還元性を低減させ
たＤＥ１未満の糖質粉末を、原料の澱粉に対して、固形
物当たり約７５％の収率で得た。本品は、取扱いが容易
であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦
形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種
組成物に有利に利用できる。

【０１４７】

【実施例Ａ−８】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）の変異株を実験１の方法
に準じて、ファーメンターで約７０時間培養した。培養
後、ＳＦ膜を用いて除菌瀘過し、約１００ｌの培養瀘液
を回収し、更に、その瀘液をＵＦ膜濃縮し、非還元性糖
質生成酵素（約４１０単位／ｍｌ）とトレハロース遊離
酵素（約４９０単位／ｍｌ）とを含む濃縮酵素液約５ｌ
を回収した。とうもろこし澱粉を濃度約３３％の澱粉乳
とし、これに実施例Ａ−３の方法に準じて、α−アミラ
ーゼを作用させてＤＥ約４の液化溶液を得、次いで、前
記方法で調製した非還元性糖質精製酵素とトレハロース
遊離酵素とを含む濃縮液を澱粉グラム当たり０．０２ｍ
ｌ、イソアミラーゼを澱粉グラム当たり５００単位及び
シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラー
ゼを澱粉グラム当たり５単位加え、ｐＨ６．２、温度４
０℃で４８時間反応させた。本反応液を加熱失活し、次
いで、グルコアミラーゼを基質グラム当たり１０単位加
え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１０時間反応させた。本
反応液には、固形物当たりトレハロースを８５．６％含
有していた。本反応液を加熱失活し、常法に従って、脱
色、脱塩して精製し、濃縮して濃度４５％のシラップを
得た。本トレハロース高含有低還元性糖質シラップを、
実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、次
いで、実施例Ａ−５の方法に準じて、濃縮、晶出させて
ブロックを調製し、切削機にて粉砕して、トレハロース
含水結晶とともにソルビトールを含有する還元性を低減
させたＤＥ１未満の糖質粉末を原料澱粉に対して固形物
当たり約８０％の収率で得た。本品は、取扱いが容易で
あり、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物など
に有利に利用できる。

【０１４８】

【実施例Ａ−９】グルコース２ｗ／ｖ％、ポリペプトン
０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二
カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６
ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カ
ルシウム０．５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をファ
ーメンターにとり、加熱滅菌、冷却し、これにピメロバ
クター・スピーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３
１５）を植菌し、温度２７℃で約４０時間、通気攪拌培
養した。この培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素の活性は、培養液ｍｌ当たり０．５５単位であった。
この培養液１８ｌから回収した湿重量０．１８ｋｇの菌
体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
この菌体懸濁液約１．５ｌを、超音波破砕装置で処理
し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機
にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮
し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約
１８単位有する濃縮酵素液約５００ｍｌを回収した。１
５％とうもろこし澱粉乳（ｐＨ５．５）に、α−アミラ
ーゼ、ナガセ生化学工業株式会社製『スピターゼＨＳ』
を澱粉グラム当たり２単位加えて攪拌し、加熱糊化、液
化させ、直ちにオートクレーブ（１２０℃）を２０分間
行った後、温度５５℃、ｐＨ５．０に調整した。これに
イソアミラーゼを澱粉グラム当たり３００単位及びβ−
アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラ
ム当たり２０単位の割合になるように加え、２４時間反
応させ、マルトース含量約９２％の糖液を得た。その反
応液を１００℃で２０分間加熱した後、温度２０℃、ｐ
Ｈ７．０に調整し、これに前記方法で調製したマルトー
ス・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１．５
単位の割合になるよう加え、７２時間反応させた。その
反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従
って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹
脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約５０％の
シラップを得た。

【０１４９】本品は、固形物当たり、トレハロースを約
６４％含有していて還元力がＤＥ１８．０と低い。本シ
ラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精
製し、濃縮して、濃度約７０％のシラップを固形物当た
り約８０％の収率で得た。本品は、トレハロースととも
にマルチトール及び少量のソルビトールを含有する還元
性を低減させたＤＥ１未満の糖質シラップで、温和な甘
味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、
安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬
品、など各種組成物に有利に利用できる。

【０１５０】

【実施例Ｂ−１ 甘味料】実施例Ａ−７の方法で得た還
元性を低減させた糖質粉末１重量部に、α−グリコシル
ステビオシド、東洋精糖株式会社販売『αＧスイート』
０．０１重量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル、味の素株式会社販売『アスパル
テーム』０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機に
かけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優
れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリ
ーは、蔗糖の約１／２に低下している。本甘味料は、そ
れに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優
れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制
限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲
食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味
料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グル
カンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物な
どに対する甘味付けにも好適である。

【０１５１】

【実施例Ｂ−２ ハードキャンディー】濃度５５％蔗糖
溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得た還元性を
低減させた糖質含有シラップ３０重量部を加熱混合し、
次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、こ
れにクエン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料と
を混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は、
歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出、変形も起こらない高
品質のハードキャンディーである。

【０１５２】

【実施例Ｂ−３ チョコレート】カカオペースト４０重
量部、カカオバター１０重量部、蔗糖３０重量部、実施
例Ａ−８の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末２０
重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた
後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げる。この
間に、レシチン０．５重量部を加え充分に混和分散させ
た。次いで、温度調節器で３１℃に調節し、バターの固
まる直前に型に流し込み、振動機でアワ抜きを行い、１
０℃の冷却トンネルを２０分間くぐらせて固化させた。
これを型抜きして包装し製品を得た。本品は、吸湿性が
なく、色、光沢共によく、内部組織も良好で、口中でな
めらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有する。

【０１５３】

【実施例Ｂ−４ チューインガム】ガムベース３重量部
を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部
及び実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質
粉末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混
合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、
包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも
良好なチューインガムである。

【０１５４】

【実施例Ｂ−５ 加糖練乳】原乳１００重量部に実施例
Ａ−３の方法で得た還元性を低減させた糖質含有シラッ
プ３重量部及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒータ
ーで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態
で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味も
よく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶
などの調味用に有利に利用できる。

【０１５５】

【実施例Ｂ−６ 乳酸菌飲料】脱脂粉乳１７５重量部、
実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質高含
有粉末８０重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で
開示されているラクトスクロース高含有粉末５０重量部
を水１，２００重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌
し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌の
スターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養し
て乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料で
ある。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定
に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも
有する。

【０１５６】

【実施例Ｂ−７ 粉末ジュース】噴霧乾燥により製造し
たオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−５
の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末５０重量部、
蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ
酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、ク
エン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉
末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれ
を流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これ
に、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース高含有シラ
ップをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、
計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０
％の粉末ジュースである。また、本品は異味、異臭がな
く、長期に安定であった。

【０１５７】

【実施例Ｂ−８ カスタードクリーム】コーンスターチ
１００重量部、実施例Ａ−６の方法で得た還元性を低減
させた糖質含有シラップ１００重量部、マルトース８０
重量部、蔗糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合
し、鶏卵２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した
牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に、これを火に
かけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全
体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量
のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得
た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味
である。

【０１５８】

【実施例Ｂ−９ ういろうの素】米粉９０重量部に、コ
ーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−
５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末８０重量部
及びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を
製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、
これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを
製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良
い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。

【０１５９】

【実施例Ｂ−１０ あん】原料あずき１０重量部に、常
法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし
て、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重
量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ
−９の方法で得た還元性を低減させた糖質含有シラップ
５重量部及び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量の
サラダオイルを加えてつぶあんをこわさないように練り
上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼け
もなく、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まん
じゅう、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として好
適である。

【０１６０】

【実施例Ｂ−１１ パン】小麦粉１００重量部、イース
ト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−７の方法で得た
還元性を低減させた糖質含有粉末１重量部及び無機フー
ド０．１重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２
６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上
げた。本品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、
温和な甘味を有する高品質のパンである。

【０１６１】

【実施例Ｂ−１２ ハム】豚もも肉１，０００重量部に
食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり
込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量
部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例
Ａ−８の方法で得た還元性を低減させた糖質含有粉末４
０重量部及び香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け
込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き
締め、燻煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得
た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムで
ある。

【０１６２】

【実施例Ｂ−１３ 粉末ペプチド】濃度４０％食品用大
豆ペプチド溶液、不二製油株式会社製『ハイニュート
Ｓ』１重量部に、実施例Ａ−８の方法で得た還元性を低
減させた糖質粉末２重量部を混合し、プラスチック製バ
ットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチ
ドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓な
どの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流
動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利
用できる。

【０１６３】

【実施例Ｂ−１４ 化粧用クリーム】モノステアリン酸
ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モ
ノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−５の方
法で得た還元性を低減させた糖質粉末２重量部、α−グ
リコシル ルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、
トリオクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量
を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量
部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６
６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香
料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品
は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止
め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。

【０１６４】

【実施例Ｂ−１５ 固体製剤】ヒト天然型インターフェ
ロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製）を、常
法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カ
ラムにかけ、該標品に含まれるヒト天然型インターフェ
ロン−αを吸着させ、安定剤であるウシ血清アルブミン
を素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒ
ト天然型インターフェロン−αを実施例Ａ−７の方法で
得た還元性を低減させた糖質粉末を５％含有する生理食
塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量
の株式会社林原商事販売無水結晶マルトース粉末『ファ
イントース』に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機に
て打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型イン
ターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。
本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃至１
０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、アレル
ギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療
に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急増し
ているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用でき
る。本品は、本発明の非還元性糖質と無水結晶マルトー
スが共に安定剤として作用し、室温で放置してもその活
性を長期間よく維持する。

【０１６５】

【実施例Ｂ−１６ 糖衣錠】重量１５０ｍｇの素錠を芯
剤とし、これに実施例Ａ−８の方法で得た還元性を低減
させた糖質粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０
万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸
化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が
約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じ還元性を
低減させた糖質粉末６５重量部、プルラン１重量部及び
水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更
に、ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠
を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長
期間維持する。

【０１６６】

【実施例Ｂ−１７ 練歯磨】 配合 第２リン酸カルシウム ４５．０重量部 プルラン ２．９５重量部 ラウリル硫酸ナトリウム １．５重量部 グリセリン ２０．０重量部 ポリオキシエチレンソルビタンラウレート ０．５重量部 防腐剤 ０．０５重量部 実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末 １２．０重量部 マルチトール ５．０重量部 水 １３．０重量部 上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品
は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として
好適である。

【０１６７】

【実施例Ｂ−１８ 流動食用固体製剤】実施例Ａ−７の
方法で製造した還元性を低減させた糖質粉末５００重量
部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩
化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量
部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量
部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミン
Ｅアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０
４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラ
ムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールし
て製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍ
ｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、
腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネ
ルギー補給用に有利に利用できる。

【０１６８】

【実施例Ｂ−１９ 外傷治療用膏薬】実施例Ａ−５の方
法で製造した還元性を低減させた糖質粉末２００重量部
及びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解
したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／
ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度
の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、
ヨウ素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる
細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから、
治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。

【０１６９】

【発明の効果】上記から明らかなように、本発明の分子
中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロ
ースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを
含有してなる還元性を低減させた糖質は、安定性に優
れ、良質で上品な甘味を有している。また、経口摂取に
より消化吸収され、カロリー源となる。とりわけ、これ
に含まれるトレハロースは、よく代謝利用される。従っ
て、本発明の還元性を低減させた糖質は、甘味料、呈味
改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種
飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用で
きる。また、本発明の還元性を低減させた糖質の原料用
低還元性糖質としては、澱粉を液化した溶液に、非還元
性糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルト
デキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作
用させることにより、澱粉からの分子中にトレハロース
構造を有する糖質やトレハロースなどの非還元性糖質の
収量を高め、比較的低分子、低粘度で取扱い容易な低還
元性糖質が得られ、また、マルトースにマルトース・ト
レハロース変換酵素を作用させることにより、トレハロ
ースとマルトースとの混合糖質が得られ、これらは、い
ずれも本発明の原料糖質として好適であり、本発明の工
業実施を極めて容易にする。

【０１７０】本発明の確立は、安価で無限の資源である
澱粉から、従来望むべくして容易に得られなかった非還
元性糖質、還元性を低減させた糖質を工業的に大量かつ
安価に提供できる全く新しい道を拓くこととなり、それ
が与える影響は、食品、化粧品、医薬品業界は言うに及
ばず、農水畜産業、化学工業にも及びこれら産業界に与
える工業的意義は計り知れないものがある。

【図面の簡単な説明】

【図１】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図
である。

【図２】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図
である。

【図３】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

【図４】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図５】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示
す図である。

【図６】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示
す図である。

【図７】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

【図８】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図９】ＤＥＡＥ−トヨパールからの本発明のトレハロ
ース遊離酵素と非還元性糖質生成酵素の溶出パターンを
示す図である。

【図１０】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１
１由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度
の影響を示す図である。

【図１１】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１
１由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨ
の影響を示す図である。

【図１２】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１
１由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の
影響を示す図である。

【図１３】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１
１由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの
影響を示す図である。

【図１４】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ
Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす
温度の影響を示す図である。

【図１５】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ
Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす
ｐＨの影響を示す図である。

【図１６】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ
Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温
度の影響を示す図である。

【図１７】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ
Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐ
Ｈの影響を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＤ ＡＤＳ 31/715 ＡＤＡ 47/26 Ｄ Ｂ 47/36 Ｄ Ｂ Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｇ 7433−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ 19/18 7432−4Ｂ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子中にトレハロース構造を有する糖質
   及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに
   澱粉糖アルコールを含有してなる還元性を低減させた糖
   質。
2. 【請求項２】 分子中にトレハロース構造を有する糖質
   が、分子の末端にトレハロース構造を有する非還元性糖
   質であるか、又は、分子の内部にトレハロース構造を有
   する非還元性糖質であることを特徴とする請求項１記載
   の還元性を低減させた糖質。
3. 【請求項３】 澱粉糖アルコールが、ソルビトール、マ
   ルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトー
   ル及びマルトペンタイトールから選ばれる１種又は２種
   以上の糖アルコールである請求項１又は２記載の還元性
   を低減させた糖質。
4. 【請求項４】 分子中にトレハロース構造を有する糖質
   及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに
   還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質を水素添加し、生
   成する分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又
   はトレハロースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖ア
   ルコールを含有する糖質を採取することを特徴とする還
   元性を低減させた糖質の製造方法。
5. 【請求項５】 分子中にトレハロース構造を有する糖質
   及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに
   還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質が、還元性澱粉部
   分分解物に非還元性糖質生成酵素又は非還元性糖質生成
   酵素とともにトレハロース遊離酵素を作用させて得られ
   るものであることを特徴とする請求項４記載の還元性を
   低減させた糖質の製造方法。
6. 【請求項６】 還元性澱粉糖が、グルコース、マルトー
   ス、マルトトリオース、マルトテトラオース及びマルト
   ペンタオースから選ばれる１種又は２種以上の還元性澱
   粉糖であることを特徴とする請求項４記載の還元性を低
   減させた糖質の製造方法。
7. 【請求項７】 トレハロースからなる非還元性糖質とと
   もに還元性澱粉部分分解物を含有する低還元性糖質が、
   マルトースを含有する還元性澱粉部分分解物にマルトー
   ス・トレハロース変換酵素を作用させて得られるもので
   あることを特徴とする請求項４記載の還元性を低減させ
   た糖質の製造方法。
8. 【請求項８】 澱粉を液化した溶液に、非還元性糖質生
   成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキスト
   リン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させる
   か、又は非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵
   素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン
   ・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させ、得ら
   れる分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又は
   トレハロースからなる非還元性糖質とともに還元性澱粉
   糖を含有してなる低還元性糖質を水素添加し、生成する
   分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレ
   ハロースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖アルコー
   ルを含有する糖質を採取することを特徴とする還元性を
   低減させた糖質の製造方法。
9. 【請求項９】 澱粉を液化した溶液が、濃度１０ｗ／ｗ
   ％以上の澱粉をＤＥ１５未満に液化した溶液である請求
   項８記載の還元性を低減させた糖質の製造方法。
10. 【請求項１０】 分子中にトレハロース構造を有する糖
    質が、分子の末端にトレハロース構造を有する非還元性
    糖質であるか、又は、分子の内部にトレハロース構造を
    有する非還元性糖質であることを特徴とする請求項８又
    は９記載の還元性を低減させた糖質の製造方法。
11. 【請求項１１】 分子中にトレハロース構造を有する糖
    質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質ととも
    に還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質を水素添加し、
    分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレ
    ハロースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖アルコー
    ルを含有する糖質を生成せしめることを特徴とする該低
    還元性糖質の還元性を低減させる方法。
12. 【請求項１２】 分子中にトレハロース構造を有する糖
    質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質ととも
    に澱粉糖アルコールを含有してなる還元性を低減させた
    糖質を含有せしめた組成物。
13. 【請求項１３】 還元性を低減させた糖質が、分子中に
    トレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロース
    からなる非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有する
    低還元性糖質を水素添加し、得られた糖質である請求項
    １２記載の組成物。
14. 【請求項１４】 組成物が、飲食物、化粧品又は医薬品
    である請求項１２又は１３記載の組成物。