JPH088855B2

JPH088855B2 - 電気的細胞操作方法及びそのためのフロ−チヤンバ−

Info

Publication number: JPH088855B2
Application number: JP61297925A
Authority: JP
Inventors: 忠明日比; 巳代治杉浦; 広美狩野; 茂行木村; 武風見
Original assignee: 農業生物資源研究所長; 日本分光工業株式会社
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1986-12-15
Publication date: 1996-01-31
Anticipated expiration: 2011-01-31
Also published as: JPS63152971A

Description

【発明の詳細な説明】発明の目的産業上の利用分野本発明は、電気的方法による細胞融合と核酸導入を効
果的に行うための電気的細胞操作方法及び装置に関する
ものである。

従来技術細胞融合法としては主にポリエチレングリコール（PE
G）を用いる化学的融合法が用いられているが、この方
法では（ｉ）PEGは細胞に対して強い毒性を持ってい
る、（ii）融合するにあたり最適な諸条件を見出すのに
手間がかかる、（iii）融合に際して高度な技術が要求
され、特定の技術に習熟した人にしか使えない、（iv）
融合効率が低い等の欠点を有している。

これに対して、電気的細胞融合法は、高度な技術が不
要で、簡単に効率よく融合させることができ、細胞に与
える毒性がなく、高活性をもったままの状態で細胞を融
合させることができるという利点がある。

電気的細胞融合法は、1981年西ドイツのZimmermannが
確立したものであり、その原理は次の通りである。すな
わち、平行電極間に交流電圧をかけそこで細胞を導入す
ると、細胞は電気密度の高い方へ引き寄せられ数珠状に
ならぶ。この状態で数μsec〜数十μsec単位の直流パル
ス電流を電極間にかけることにより、細胞膜の電気伝導
度が瞬間的に低下し膜を構成する脂質二重層の可逆的乱
れとその再構成がおこなわれ、その結果細胞融合が起こ
るものである。

従来、この電気的融合法には、（ａ）微小電極法、
（ｂ）平行電極法、（ｃ）上記Zimmermann等の方法等が
知られているが、（ａ）は融合効率が低く、手間がかか
るという欠点があり、（ｂ）は融合率が低い（１〜３
％）が、一度に大量の融合細胞（プロトプラスト）を扱
え、融合細胞が電極に付着しないなどの利点がある。ま
た、（ｃ）は、（ａ），（ｂ）に比べ融合率が高いた
め、最も実用的な方法として利用されているが、融合細
胞が電極表面に付着するため、融合細胞を傷つけること
なく回収するための電極材料を如何に開発するか及び融
合細胞をいかに大量にしかも迅速に作成するかが重要な
課題とされていた。

一方、電気的核酸導入法は、1982年Neumann等により
開発された方法で細胞と核酸とを混合して電極に懸濁し
た後、これに数μsec〜数十μsecの直流パルス電位を印
加することによって核酸を細胞内に導入する方法である
が、この場合にも、導入効率を高めることが重要な課題
であった。

発明が解決しようとする問題点本発明者等は、細胞融合と核酸導入ができる電気的細
胞操作装置の従来の平行電極及操作チャンバーの諸欠
点、すなわち、ｉ）融合率や導入率が低いii）融合細胞
を傷つけるiii）細胞が電極に付着する。iv）融合細胞
を大量、迅速に作成できない等の問題点を一挙に解決す
るための新規な装置を先に提案した。

しかし、この提案装置で使われるチャンバーは１回の
融合または核酸導入毎にチャンバーを構成するスペーサ
や平行電極を分解、組みたてしなければならず、多数回
の操作を迅速に行なうには不便であった。従って本発明
は、上記の提案を改良し、大量の細胞の迅速な操作を可
能とするフロー方式及びチャンバーを提供することを目
的とするものである。

発明の構成問題点を解決するための手段すなわち、本発明は電気的細胞融合又は核酸導入に用
いるチャンバーの二つの電極に、電圧と周期を制御可能
な発振器からの交流電位とパルス電圧とパルス巾とパル
ス数を制御可能なパルス発振器からの直流パルス電位を
それぞれ印加して細胞融合又は核酸導入を行なう方法に
おいて、細胞融合時に於いては、チャンバー内に細胞を
導入し、流れを止めて電気的融合を行ったのち、融合細
胞を排出すると同時に新規の細胞を導入。核酸導入時に
於いては、細胞と核酸との懸濁液を連続的にチャンバー
内に導入排出させながら、電気的処理を同時に行い、連
続的に核酸導入を大量に行うことを特徴とするものであ
る。

複数個のフローチャンバーを使用して、更に大量の細
胞融合又は核酸導入を可能にする構成を取ることも可能
である。複数個のチャンバーを試料の流れに対し直列又
は並列に連結し、各対電極に対して電気的処理を行なっ
て大量の処理細胞を得ることが可能である。

又複数個のフローチャンバーを同時にフローさせて使
用する代りに、各チャンバー毎に細胞をフローさせ、そ
の後フローを停止した状態で細胞融合を行うための電気
的処理を行ない、その後フローさせて処理した細胞を流
すと共に新しい細胞をフローチャンバーに導入する一連
の動作を順次行なわせることも出来る構成となってい
る。

本発明は電気的細胞融合又は核酸導入に用いるチャン
バーの二つの電極に、電圧と周期を制御可能な発振器か
らの交流電位とパルス電圧とパルス巾とパルス数を制御
可能なパルス発振器からの直流パルス電位をそれぞれ印
加して細胞融合又は核酸導入を行なう電気的細胞操作装
置において、細胞融合又は核酸導入に用いるスペースに
該当する部分を切り取った平板スペーサーと、該平板ス
ペーサーを挟み、鏡面研磨された二枚の平板電極を、組
立て分解が容易に出来るように圧着手段で圧着すると共
に、平板スペーサーのスペースへ細胞を導く導入手段
と、スペース内の細胞を排出する導出手段とを備えた構
成となっている。大きさ，厚さ，切り取ったスペースが
異なった複数の平板スペーサーと、大きさの異なった複
数の平板電極を用意し、該平板スペーサーを挟む二枚の
該平板電極を組みたて、各スペースへ細胞を導く導入手
段と、各スペース内の細胞を排出する導出手段とを設け
ることにより、電極間の距離及びチャンバー容量を可変
に出来るものである。

実施例まず、電気的細胞操作装置全体の構成を第１図に概略
的に示す。本発明で用いるフローチャンバーは、従来我
々が提案しているものと同じく基本的に平板スペーサー
３と、それを挟む電極1,2から構成されている。電極1,2
に交流発振器４及びパルス発振器５がつながれており、
交流の周期，電圧及びパルス電圧、パルス巾はオシロス
コープ６でモニターする。この装置を使用した伝奇的細
胞融合の過程を第２図を用いて説明する。

第２図中上欄には、電極に印加するシグナルシーケン
スを、下欄には、それに対応する細胞融合の過程を模式
的に示す。

過程（１）では電極に電圧が印加されていない。この
状態で細胞を第１図の平板電極1,2に挟まれたスペーサ
ー３のチャンバースペース内に導入する。

過程（２）では発振器４（第１図）からの交流成分の
電位の印加により、細胞が数珠状に配列する。

過程（３）では直流パルスにより細胞接触面で細胞膜
の一時崩壊が起きる。

過程（４）では細胞膜の再構成にともなって細胞融合
が起こる。

次にフローチャンバーについて説明するが、電気分解
を起こしにくい物質の表面を鏡面状にした平行平板電極
を用い、電場そのものが均質になるとともに細胞が電極
表面に付着せず電場に均一にさらされた細胞が高い融合
率を示すように構成される点は、前出の本出願人による
先の提案と同様である。

第3,4図はフローチャンバーの各実施例を示し、それ
ぞれ（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は組たて後の使用状態
の斜視図である。これらの実施例においては、例えばガ
ラス基板に金蒸着した二枚の電極11,12;21,22でスペー
サー13,23をサンドイッチし、クリップ14,24で圧着して
いる。二枚の電極には電極線15,25をつけ電位が印加さ
れる。さらにスペーサーは、厚さ200μｍで、中央部分
を切り取ってあるポリビニルクロライド板を用い、切り
取ってある部分と両電極にはさまれた部分が細胞操作の
ためのスペース16,26になる。

第３図のフローチャンバーは全体が細長い矩形状で、
これに応じチャンバースペース16も細長く例えば容量50
μで、電極11,12には電極線15を取付け易くするため
の張出し部17がそれぞれ反対方向に突き出ている。更
に、スペース16内へ細胞を導きまたそこから細胞を排出
するための導入・出手段が設けられており、これら導入
・出手段はスペーサ13と同様両電極間に挟持される接続
導管18,18′、及び両電極の内面にその端面から始って
スペース16との連通を可能とする地点で終端する傾斜溝
19a,19b;19a′,19b′（図に表われてない）でそれぞれ
構成されている。尚、20,20′は接続導管18,18′を受け
入れるため、スペーサ13の両端に各々形成された切り取
り部である。このように構成された各構成部品を第３
（ｂ）図に示したように組みたて、接続導管18,18′を
それぞれ不図示のポンプ、細胞リザーバ、細胞採取管等
に接続すれば、細胞融合の場合には、フローチャンバー
内に細胞が導入され、一旦停止後電気処理が行われ、し
かる後排出されると同時に新たな細胞が導入されます。
また核酸導入に際しては、細胞融合のような手続きが不
要で、フローチャンバー内を連続的に細胞と核酸の混合
溶液を流しながら、連続的に電気的処理を行って核酸導
入細胞を採取できます。

一方第４図のフローチャンバーは全体がほぼ正方向
で、それに応じ長円形のチャンバースペース26の容量が
大きい。細胞の導入・出手段は電極21,22の上面と下面
にそれぞれ固設された導入管27,導出管28で構成され、
導入出管27,28の内端はスペース26の両端に各々開口し
ている。従って、このような各構成部品を第４（ｂ）図
に示したように組みたて、導入出管27,28をそれぞれ不
図示のポンプ、細胞リザーバ、細胞採取管等に接続すれ
ば、前記したと同じく細胞融合及び核酸導入ができる第３図のフローチャンバーは容量が比較的小さいた
め、低い電源パワーで操作を実現できるが、電源パワー
アップが可能ならば容量の大きい第４図のフローチャン
バーの方が簡単で取扱いも容易であり、１回の操作量も
高められる。

電極間隔及びチャンバースペースの容量は、スペーサ
ーの厚みを変えることにより調整可能であり、又電極の
サイズも自由に大きく出来る。さらに、１つのチャンバ
ーに設けるスペースの数は１つに限られず、スペースの
大きさ、厚さが異なった複数の平板スペーサーとそれに
対応した複数の平板電極を用意し、これらの平板スペー
サを挟む形で二枚の平板電極を組みたて、各スペース毎
に独立の細胞導入出手段を設け、１つのチャンバー内に
複数のスペースのある構成とすることもできる。

第５図は、対電極を多数ある間隔に配置したチャンバ
ーを示す。

Ａは、電極54A非電極54B等巾縞状チャンバーを示す。
二枚の電極非電極等巾の縞模様の板51A,52Aで、長方形
に内部が切りぬかれたスペイサー53をはさみ、二枚の電
極板を外部の線と結ぶ部分に相当する量をずらしてチャ
ンバーを構成してある。

このようなチャンバーに試料を導入して、交流電位を
全電極に印加し、直流パルスを印加して電気的処理後、
電極の巾分だけ試料を移動させ、再度電気的処理を対電
極に対して行ない、電気的処理後チャンバー内の試料を
新しい試料に入れかえることにより細胞操作を行なう。

Ｂは、非電極狭巾電極縞状チャンバーを示す。電極巾
54Bに比較して、非電極巾55Bを狭くして多数の電極を配
列した二枚の電極板で電極巾以下の試料を入れる部分57
−１〜57−５を複数個直列に配置し、各試料スペースを
通りぬける流路分58を配置し、二枚の電極板を外部の線
と結ぶ部分に相当する分をずらしてスペーサーをはさん
でチャンバーを構成している。

第６図は、試料の流れに対して、複数のチャンバーを
並列に配置した例を示す。第７図は、試料の流れに対し
て、複数のチャンバーを直列に配置した例を示す。図
中、同一番号は同じものを示す。62は交流発振器を63は
パルス発振器を示す。64〜68はチャンバーで、撹拌器60
の持つ試料リザーバ61に試料が入れられる。80はポン
プ、81は操作細胞ハーベスタで82は、定温装置を示す。
62の交流発振器からの出力をチャンバー64〜68に印加
し、パルス発振器63からの出力は、順次切換えながら各
チャンバーの電極に印加して電気的処理を行なう。第６
図、第７図のポンプ80は吸引型を示してあるが、ポンプ
をチャンバーの試料入口側に配置し、試料を送液するこ
とも出来る。

また、同時に各チャンバーに試料を導入する代りに、
１個のチャンバー内に細胞をフローして導入し、その後
フローを停止した状態で細胞融合を行うための電気的処
理を行ない、その後フローさせて処理した細胞を流すと
共に新しい細胞をフローチャンバーに導入する動作を各
チャンバー毎に順次切換えながら行なうことによっても
大量の操作細胞を得ることが出来る。これを行うために
は、試料リザーバー61の出力管に切換弁を設置し、この
切換弁を切換えて行なうことが出来る。

これまでは種として各フローチャンバーについて、細
胞融合を行う場合の流路や電場印加法等を示しました
が、流れを停止させて細胞融合を行うことを説明するた
めです。一般的に核酸導入もこれと同じ方法で出来ま
す。しかし核酸導入に於ける本発明の主眼点は、連続し
た流れの状態での核酸導入にあるため、敢えてここでは
取り上げませんでした。

次に、第３図のフローチャンバー（容量50μ）を用
いて細胞融合とRNA導入（核酸感染）を行なった例につ
いて説明する。

第８図に細胞融合の場合のフローチャートを示す。ま
ずポンプを動作して50μの細胞試料を送液した後、AC
6Vを１分印加し細胞を数珠状に配列する。次に、AC2Vを
加えながら40V,50μｓのDCパルスを２回印加して細胞膜
の一時崩壊を引き起した後、AC2Vを１分印加して細胞融
合を生ぜしめる。次いで得られた融合セルを採取した
後、以上の過程を20回繰り返し、合計1ml,2×10⁵のプロ
トプラストを融合操作した。所望時間は１サイクル２分
×20回＝40分で、融合率は40％であった。

第９図はRNA導入（核酸感染）の場合のフローチャー
トを示した。２×10⁵/mlのプロトプラストにTMV−RNAを
10μg/ml加え、これを50μ/secの流量で連続送液しな
がら、40V,50μｓのDCパルスを10回／秒の割合で連続印
加した。この操作を80秒継続し、合計4ml,8×10⁵のプロ
トプラストを採取した。その結果感染率は96％、生存率
は85％であった。

発明の効果以上述べたように本発明によれば、大量の細胞操作が
可能となり、生物工学分野で必要な多数の細胞の融合や
核酸導入を効率よく迅速に操作することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は電気的細胞操作装置の全体構成を示すブロック
図、第２図は細胞融合の過程を説明するための図、第３
（ａ），（ｂ）図は本発明によるフローチャンバーの一
実施例の分解斜視図と組みたて後の使用状態を示す斜視
図、第４（ａ），（ｂ）図はフローチャンバーの他の一
実施例の分解斜視図と組みたて後の使用状態を示す斜視
図、第５図及び第６図は複数個のフローチャンバーを同
時に並列使用する場合を示すもので、第５図は、対電極
を多数ある間隔に配置したチャンバーを示す。Ａは電極
非電極等巾縞状電極を、Ｂは、非電極狭巾電極を示す。
第６図は試料の流れに対する並列結合の多連チャンバー
を示し、第７図は試料の流れに対する直列結合の多連チ
ャンバーの例を示す模式的説明図、第８図は細胞融合の
例を示すフローチャート、第９図はRNA導入（核酸感
染）の例を示すフローチャートである。 1,2;11,12;21,22……電極、3,13,23……スペーサー、４
……交流発振器、５……パルス発振器、６……オシロス
コープ、14,24……圧着手段（クリップ）、15,25……電
極線、16,26……チャンバースペース、18,19a,19b;27…
…細胞導入手段、18′19a′;28……細胞導出手段。

フロントページの続き (72)発明者風見武茨城県新治郡新治村藤沢1616 (56)参考文献特開昭61−173773（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−216583（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−219386（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−251871（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】チャンバーが鏡面研磨された平行平板の一
対で構成され、チャンバーの均一電場中に細胞が導入さ
れ、一旦細胞流を停止した状態で電気的処理により細胞
融合が行われ、処理細胞を排出すると同時に被融合細胞
をチャンバー内に導入することを繰り返し、大量の細胞
融合を行うと共に、上記チャンバー内で細胞内に核酸を
導入する際には細胞と核酸との混合液を連続してチャン
バー内を流しながら、パルス列のみによる均一電場内で
の処理により連続して大量の核酸導入を行うことを特徴
とする電気的細胞操作方法。
【請求項２】複数個のフローチャンバーを使用する特許
請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】複数個のチャンバーを試料の流れに対し直
列又は並列に連結し、各対電極に対し電気的操作を行う
ことにより大量の操作細胞を得る特許請求の範囲第２項
記載の方法。
【請求項４】複数個のフローチャンバー内に細胞をフロ
ーさせ、その後フローを停止した状態で細胞融合又は核
酸導入を行うための電気的処理を行い、その後フローさ
せて処理した細胞を流すと共に新しい細胞をフローチャ
ンバーに導入する一連の動作を、各チャンバ毎に順次切
替えて行う特許請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】細胞融合又は核酸導入に用いるスペースに
該当する分を切り取られた平板スペーサーと、該平板ス
ペーサーを挟み、鏡面研磨された二枚の平板電極を、組
立て分解が容易にできるように圧着手段で圧着すると共
に、上記平板スペーサーのスペースへ細胞を導く導入手
段と、スペース内の細胞を排出する導出手段とを備えた
構造を特徴とするフローチャンバー。
【請求項６】大きさ、厚さ、切り取ったスペースが異な
った複数の平板スペーサーと大きさの異なった複数の平
板電極を用意し、該平板スペーサを挟む二枚の該平板電
極を組みたて、各スペースへ細胞を導く導入手段と、各
スペース内の細胞を排出する導出手段とを設けることに
より、電極間の距離及びチャンバー容量を可変に出来る
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のフローチ
ャンバー。