JPH0889256A

JPH0889256A - ヒトＦａｓリガンド遺伝子

Info

Publication number: JPH0889256A
Application number: JP6251436A
Authority: JP
Inventors: Norio Hayashi; 紀夫林; Eiji Mita; 英治三田; Yasukazu Omoto; 安一大本
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1994-09-19
Publication date: 1996-04-09

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、配列番号：１で示されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むヒトＦａｓリガンド遺伝
子を提供する。【効果】本発明遺伝子は、その利用によりヒトＦａｓリ
ガンドを発現でき、該蛋白はこれを抗原として用いてＣ
型肝炎等の病態診断に有用な所定の抗体を製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＦａｓリガンド遺
伝子、より詳しくは例えば自己免疫疾患、Ｃ型肝炎、糖
尿病等の病態診断等に有用なヒトＦａｓリガンド遺伝子
に関する。

【０００２】

【従来技術とその課題】近年、ウイルス性肝炎組織にお
けるピースミールネクローシス（piecemeal necrosis）
がアポトーシス（apoptosis ）であることが示されてい
る。Ｃ型慢性肝炎患者の肝組織を検索すると、肝臓障害
の悪化程度は肝細胞上のＦａｓ抗原の発現の高さに相関
しており、Ｆａｓ抗原陽性肝細胞は肝浸潤リンパ球によ
って取り巻かれていることが認められる。

【０００３】これらのリンパ球はＦａｓリガンドを発現
し、アポトーシスを誘導するものと考えられ、該Ｆａｓ
リガンド遺伝子の単離、構造解析、これを抗原とする抗
体の作製、該抗体を利用したＦａｓリガンドの測定技術
の開発等が、上記Ｃ型肝炎を始めとする自己免疫疾患の
病態診断に役立ち、ひいてはこれら自己免疫疾患等の治
療法も確立可能となると考えられる。

【０００４】しかしながら、ヒトＦａｓリガンドのかか
る解析は、その遺伝子が単離されておらず未知であるが
故に、不可能な現状にある。

【０００５】上記の点については、以下の報告が参照さ
れる。

【０００６】＊Lancet, 2, 827-828 (1979) ＊J. Gastroenterol. Hepatol., 2, 77-96 (1987) ＊Hepatology, 19, 1360-1365 (1994) ＊Cell, 75, 1169-1178 (1993)

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは種々研究の
結果、既知のラットＦａｓリガンドのｃＤＮＡをもとに
設定したプライマーを用いて、ヒトＦａｓリガンドｃＤ
ＮＡのクローニングに成功し、ここに本発明を完成する
に至った。

【０００８】即ち、本発明によれば、配列番号：１で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヒトＦ
ａｓリガンド遺伝子が提供される。

【０００９】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【００１０】本発明により提供される遺伝子は、ヒトＦ
ａｓリガンド、即ち上記配列番号：１に示されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を含むことにおいて特徴付
けられる。かかる遺伝子の１具体例は、後記実施例に示
す、約１．９ｋｂのｃＤＮＡクローンであり、その塩基
配列は配列番号：２に示されるとおりである。該ｃＤＮ
Ａは、２８１アミノ酸をコードする８４３ヌクレオチド
（核酸）のオープンリーディングフレームを有してい
る。

【００１１】上記ヒトＦａｓリガンドは、Ｎ端から、細
胞内ドメイン（１−７９）、膜貫通ドメイン（８０−１
０２）及び細胞外ドメイン（１０３−２８１）よりな
り、Ｆａｓ抗原と相互作用すると考えられている細胞外
ドメインは、アミノ酸レベルで、ラットのそれと７８％
及びマウスのそれと８１％の相同性を有している。

【００１２】本発明遺伝子は、例えば上記配列番号：２
に示されるように、一本鎖ＤＮＡ配列で表されるが、本
発明はかかる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列や
これらの両者を含むコンポーネントもまた包含する。
尚、上記配列番号：２に示す本発明遺伝子の配列は、こ
れによりコードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一
つの組合わせ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、
上記アミノ酸配列を変えることなく各アミノ酸残基に対
して任意のコドンを組合わせ選択したＤＮＡ塩基配列を
有することも勿論可能である。該コドンの選択は常法に
従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度
を考慮することができる［Nucleic AcidsResearch, 9,
43-74 (1981) ］。

【００１３】更に本発明遺伝子には、上記で示されるア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換し
たり、欠失したり、これらに更に他のアミノ酸乃至アミ
ノ差配列を付加させたりして改変してなり、ヒトＦａｓ
リガンドと同様の活性を有する同効物をコードするＤＮ
Ａ配列もまた包含される。これら改変されたポリペプチ
ドは天然に生じることもあり、また翻訳後の修飾によ
り、或は遺伝子工学的手法により天然の遺伝子（本発明
遺伝子）を、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲ
ネシス［Methods in Enzymology, 154, p350, 367-382
(1987)；同 100,p468 (1983) ；Nucleic Acids Researc
h, 12, p9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研
究法ＩＩ」、日本生化学会編, p105 (1986) ］等の方法
により改変したり、リン酸トリエステル法やリン酸アミ
ダイト法等の化学合成手段［J. Am.Chem. Soc.,89, p48
01 (1967)；同91, p3350 (1969)；Science, 150, p178
(1968) ；Tetrahedron Lett.,22, p1859 (1981)；同24,
p245 (1983) ］により変異させたＤＮＡを合成した
り、それらの組合せにより、製造、収得することができ
る。

【００１４】本発明遺伝子は、これを利用して、例えば
これを微生物のベクターに組込み、形質転換された微生
物を培養することによって、ヒトＦａｓリガンドを容易
にかつ安定して発現できる。本発明の遺伝子を利用して
得られるヒトＦａｓリガンドは、これを用いて、ヒトＦ
ａｓリガンドに特異的な抗体を作成することもできる。
ここで抗原として用いられるコンポーネントは、上記遺
伝子工学的手法に従って大量に産生される蛋白を用いる
ことができ、得られる抗体はポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体のいずれでもよく、之等抗体は該蛋白
の精製、測定、識別等に有利に利用できる。

【００１５】また、本発明遺伝子は、その一部又は全部
の塩基配列を利用することによって、各種ヒト組織にお
けるヒトＦａｓリガンド遺伝子の発現を検出する上で極
めて良好に使用できる。

【００１６】本発明遺伝子の製造は、本発明によって開
示された本発明遺伝子についての配列情報に従って、一
般的な遺伝子工学的手法に基づき行ない得る［Molecula
r Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ」、日本生化学会編 (1986) 等参照］。例え
ばヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒトＦａｓリガンドをコ
ードする遺伝子を含む適当な起源細胞より常法に従い調
製されたもの）から、本発明遺伝子に特有の適当なプロ
ーブや抗体を用いて、所望クローンを選択することによ
り実施できる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, p661
3 (1981) ; Science, 222, p778 (1983)等］。

【００１７】上記方法において、起源細胞としては、ヒ
トＦａｓリガンド遺伝子を発現する各種の細胞、組織や
之等に由来する培養細胞等が例示され、これらからの全
ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変
換（合成）とそのクローニング等はいずれも常法に従い
実施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されて
もおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリ
ー、例えばクローンテック社（Clontech Lab. Inc.）よ
り市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等、を用いることも
できる。

【００１８】ｃＤＮＡライブラリーからの本発明遺伝子
のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施するこ
とができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃ
ＤＮＡの産生する蛋白質に対して、ヒトＦａｓリガンド
特異抗体を使用した免疫学的スクリーニングにより、対
応するｃＤＮＡクローンを選択する方法や目的のＤＮＡ
配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイ
ブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション
等及び之等の組合せを例示できる。ここで用いられるプ
ローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報
を基にして化学合成されたＤＮＡ等を用いるのが一般的
であり、勿論既に取得された本発明遺伝子やその断片も
かかるプローブとして利用できる。

【００１９】また、本発明遺伝子の取得に際しては、Ｐ
ＣＲ法［Science, 230, 1350-1354(1985)］によるＤＮ
Ａ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリ
ーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合、レース
法（ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；実
験医学、12(6), 35-38 (1994))の採用が好適であり、後
述するように本発明においても当初遺伝子はかかるレー
ス法の採用によってはじめて全長ｃＤＮＡとして収得で
きたものである。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用さ
れるプライマーも、既に本発明によって明らかにされた
本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することが
でき、これは常法に従い合成することができる。

【００２０】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は前記のとおり常法に従うことができ、例えばゲル
電気泳動法等によればよい。

【００２１】上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮ
Ａ断片等の塩基配列の決定も常法に従うことができ、例
えばジデオキシ鎖法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
4, 5463-5467 (1977)］やマキサム−ギルバート法［Met
hods in Enzymology,65, p499(1980) ］等により行なう
ことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシーク
エンスキット等を用いても容易に行ない得る。

【００２２】本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝
子組換え技術［例えば、Science, 224, p1431 (1984) ;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, p692 (1985) ；
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, p5990 (1983)及び前
記引用文献等参照］に従うことにより、組換え体ヒトＦ
ａｓリガンドを得ることができる。該ヒトＦａｓリガン
ドの製造は、より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中
で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に
導入して形質転換し、該形質転換体を培養することによ
り行なわれる。

【００２３】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細
胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細
胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞［Cel
l, 23, 175-182 (1981)］やチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株［Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)］等
がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。

【００２４】脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発
現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、
ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写
終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要
により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの
例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保
有するｐＳＶ２dhfr［Mol. Cell. Biol., 1, 854-764］
等を例示できる。

【００２５】また、真核微生物としては、酵母が一般に
よく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を有利に利
用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとして
は、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモー
ターを有するｐＡＭ８２［Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 80, 1-5 (1983)］等を利用できる。

【００２６】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられる。之等を宿主とする場合、本発
明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベク
ターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現でき
るように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤ
イン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開
始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現
プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての
大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般
にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる
が、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクターを
も利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプト
ファン（ｔｒｐ）プロモーター、lpp プロモーター、la
c プロモーター、ＰL/R プロモーター等を使用できる。

【００２７】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法として
も、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺
伝子によりコードされる目的のヒトＦａｓリガンドが生
産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採
用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選
択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下
で実施できる。

【００２８】上記により、形質転換体の細胞内、細胞外
乃至は細胞膜上に目的とする組換えヒトＦａｓリガンド
蛋白が発現、生産、蓄積乃至分泌される。

【００２９】組換えヒトＦａｓリガンドは、所望によ
り、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分
離操作［「生化学データーブックＩＩ」、1175-1259
頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同
人発行；Biochemistry, 25(25),8274-8277 (1986)；Eu
r. J. Biochem., 163, 313-321 (1987) 等参照］により
分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば
通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、
遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、
分子篩クロマトグラフィー（ゲル瀘過）、吸着クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、之等の組合せ等を例示できる。

【００３０】本発明によって明らかにされた本発明遺伝
子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は
全部の塩基配列を利用することにより、各種のヒト組織
におけるヒトＦａｓリガンド遺伝子の発現の検出を行な
うことができる。これは常法に従い行なうことができ、
例えばＲＴ−ＰＣＲ［Kawasaki, E.S., Amplification
of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and ap
plications, AcademicPress, Inc., SanDiego, 21-27
(1991)］によるＲＮＡ増幅により、またノーザンブロッ
ティング解析［Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
r Laboratory (1989) ］等により良好に実施し得る。

【００３１】尚、ＰＣＲ法を採用する場合において、プ
ライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる本
発明遺伝子に特有のものである限りにおいて、何等制限
はなく、本発明情報に基づき適宜設定することができ
る。これは常法に従い、通常、１５〜３０ヌクレオチド
程度の部分配列を有するものであることができ、かかる
プライマー設定の１例としての好適な具体例は、後述の
実施例に示すとおりである。

【００３２】本発明は、かかるヒトＦａｓリガンド遺伝
子の検出に有用なプライマー及び／又はプローブをも提
供するものである。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、ヒトＦａｓリガンド遺
伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、ヒトＦａｓリガ
ンド遺伝子の各組織での発現の検出やヒトＦａｓリガン
ドの遺伝子工学的製造ができ、これらにより各種の自己
免疫疾患、Ｃ型肝炎、糖尿病等の発生機序や病態の解
明、更にはこれら疾患の病態診断、治療及び予防等の研
究等に役立つものである。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００３５】

【実施例１】ヒトＦａｓリガンドのクローニングＴＮＦリセプターファミリーと相同性の高いラットＦａ
ｓリガンドのアミノ酸配列を基に、下記のオリゴヌクレ
オチド（３’端付近で縮重を有する２つのセンスプライ
マーＬＳ２及びＬＳ３と１つのアンチセンスプライマー
ＬＡ１）を合成した。

【００３６】ＬＳ２：５’−ＴＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＴＴＹＣＧＮＧＧ−３’ （センス、アミノ酸配列１９０−１９６に相当）ＬＳ３：５’−ＣＴＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＴＮＴＡＹＡＴＧ−３’ （センス、アミノ酸配列２０４−２１０に相当）ＬＡ１：５’−ＧＴＡＧＣＴＧＣＴＲＴＧＮＧＣＣＣＡ−３’ （アンチセンス、アミノ酸配列２４１−２３６に相当）但し、上記各プライマーにおいて、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又は
Ｔを、ＲはＡ又はＧを、ＹはＣ又はＴをそれぞれ示す。

【００３７】ヒト肺ｍＲＮＡ（クローンテック社）の１
μｇを、オリゴ（ｄＴ）_12-18（ファルマシアＰ−Ｌバ
イオケミカル社）の１０ピコモルでプライムし、モロニ
ーネズミ白血病ウイルス（Moloney murine leucemia vi
rus;ＭＭｕＬＶ）逆転写酵素（ベセスダリサーチ社）を
用いて、同社の指示書に従って、第１のストランドを合
成した。

【００３８】得られたｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッド
を、ＬＳ２及びＬＡ１を用いてＰＣＲ法（９４℃−３０
秒、５５℃−１分、７２℃−２分の３０サイクル）にて
増幅した。生成物を更にＬＳ３及びＬＡ１を用いてネス
テッドＰＣＲ法（同上パラメーター）にて増幅した。

【００３９】得られたＰＣＲ産物を、３％ NuSieve GTG
アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社）ゲル電気泳
動にて溶解、溶出させ、pBluescript II SK(+)（ストラ
タジェンクローニングシステムズ社）の SmaＩサイトに
クローン化した。

【００４０】両ストランドを自動ＤＮＡシークエンサー
（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズ社）を
用いて、ジデオキシ鎖終結法により配列決定した。

【００４１】得られたクローンの核酸配列に従って、下
記２つのアンチセンスプライマー（ＬＡ４及びＬＡ５）
を合成した。また、部分縮重センスプライマー（ＬＳ
６）は、プロリン豊富領域（ラットＦａｓリガンドの４
５−５２アミノ酸配列に相当）に設けた。ＬＡ４：５’−ＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＡＣＴ−３’ ＬＡ５：５’−ＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣ−３’ ＬＳ６：５’−ＣＣＮＣＣＮＣＣＮＣＣＮＣＣＮＣＣＮＣＣ−３’ 但し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。

【００４２】上記のオリゴ（ｄＴ）−プライムドｃＤＮ
Ａ／ｍＲＮＡハイブリッドを、上記に準じてＬＳ６及び
ＬＡ５を用いたＰＣＲの３０サイクルにて増幅させた。
生成物を更にＬＳ６及びＬＡ４を用いたＰＣＲの３０サ
イクルにて増幅させ、pBluescript II SK(+)の Sma Iサ
イトにクローン化し、同様に配列決定した。

【００４３】新たに見出された配列に基いて、下記２つ
のアンチセンス−オリゴヌクレオチドＬＡ６及びＬＡ７
を、５’−ＲＡＣＥのために合成した。ＬＡ６：５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＣ−３’ ＬＡ７：５’−ＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＣ−３’

【００４４】また下記２つのセンスオリゴヌクレオチド
ＬＳ３及びＬＳ４を、３’−ＲＡＣＥのために合成し
た。ＬＳ４：５’−ＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧ−３’ ＬＳ５：５’−ＴＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡＴＧＴＧ−３’

【００４５】更に、下記２つのプライマーＤＴ及びＮＥ
もまた、ポリＡ⁺テイルのプライミングのために作製し
た。ＤＴ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴ₁₄−３’ ＮＥ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴ₅−３’

【００４６】５’−ＲＡＣＥのために、１μｇヒト肺ｍ
ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）_12-18とプライミングし、ｃＤ
ＮＡをＭＭｕＬＶ−逆転写酵素を用いて合成した。該ｃ
ＤＮＡの３’端にポリＡ配列をターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼ（東洋紡社）により加え
た。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼを熱不活性後、第１のＰＣＲを３０サイクル行ない
（ＬＡ７及びＤＴ使用）、次のネステッドＰＣＲを３０
サイクル行なった（ＬＡ６及びＮＥ使用）。

【００４７】一方、３’−ＲＡＣＥのために、１μｇヒ
ト肺ｍＲＮＡをＤＴの１０ピコモルとプライミングし、
これらのｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドを、ＰＣＲの
３０サイクル（ＬＳ４及びＤＴ使用）及び次のネステッ
ドＰＣＲを３０サイクル（ＬＳ５及びＮＥ使用）行なっ
て増幅させた。

【００４８】５’−及び３’−ＲＡＣＥ生成物を、前記
と同様にしてクローン化及び配列決定した。Ｔａｑポリ
メラーゼによる誤訳（misreading）を除くために、少な
くとも３つの独立したクローンを単離した。

【００４９】かくして、本発明遺伝子としてのｃＤＮＡ
を担うクローンを単離した。

【００５０】該ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号：２に
示されるとおりであり、これは配列番号：１に示される
２８１アミノ酸からなるヒトＦａｓリガンドをコードす
ることにより特徴付けられる。

【００５１】

【実施例２】ｍＲＮＡ発現の検出抗ＨＣＶ抗体陽性（オーソダイアグノスティックシステ
ム社）で他の肝臓疾患の兆候のない、Ｃ型慢性肝炎患者
５名の肝組織サンプルをＰＢＳ中で洗浄し、肝浸潤単核
球（liver-infiltrating mononuclear cells）をフィコ
ール−ハイパーク（ナカライテスク社）密度勾配遠心分
離により分離しカウントした。ヘパリン採血した血液を
ＰＢＳにて希釈し、同様にして末梢血単核球を得た。

【００５２】全ＲＮＡを、グアニジニュームチオシアネ
ートフェノールクロロフォルム法［Anal. Biochem., 16
2, 156-159 (1987) ］に従い、上記肝組織及び単核球か
ら抽出した。

【００５３】尚、肝浸潤単核球においてはその数が少な
く（３×１０⁴−６×１０⁴）、このＲＮＡは、１０μ
ｇのｔＲＮＡ（シグマケミカル社）をキャリヤーとする
エタノール沈殿によった。

【００５４】３種のサンプル間の調整は、グリセロアル
デヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ３Ｐ
ＤＨ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）の
増幅物（human G3PDH control amplimer set :クロンー
ンテック社、使用）をコントロールとして標準化した。
即ち、肝組織及び末梢血単核球からのＲＮＡサンプル
は、希釈して（約１００〜５００倍）使用された。

【００５５】ヒトＦａｓリガンド転写物の検出のため
に、前記と同様に、ＲＮＡを１０ピコモルのオリゴ（ｄ
Ｔ）_12-18でプライムし、ＭＭｕＬＶ−逆転写酵素の５
単位を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたＲＮＡ／ｃ
ＤＮＡハイブリッドを鋳型として、各１０ピコモルのプ
ライマー（ＬＳ７：５’−ＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＴＴＣ
ＡＧＣＴＣＴＴＣ−３’及び前記ＬＡ７）を用い、５単
位のＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス
社）により、３０サイクルのＰＣＲを行った。電気泳動
による分離後、増幅物をナイロン膜（Hybond-N＋、アマ
シャム社）にトランスファーし、³²Ｐ標識したヒトＦａ
ｓリガンドｃＤＮＡをプローブとするサザンブロット分
析（Southern blot analysis）に供した。

【００５６】その結果、Ｃ型肝炎肝組織より得た浸潤単
核球と末梢血単核球においてヒトＦａｓリガンド転写物
の増幅シグナルが確認された。一方、肝組織において
は、かかるシグナルは認められなかった。

【００５７】肝機能異常の強い症例ほど、肝細胞におけ
るＦａｓ抗原の表出が強いこと［Hepatology, 19, 1360
-1365 (1994)］を考慮すると、ヒトＦａｓリガンド転写
物を発現している肝浸潤リンパ球が、ヒトＦａｓ抗原を
発現している肝細胞にアポトーシスを誘導しているもの
と考えられた。

【００５８】

【実施例３】ヒトＦａｓリガンドの発現と抗体の製造原核生物を用いた発現系では、大腸菌を用いた系が最も
多くの組換え蛋白を発現することができる。ここでは、
ヒトＦａｓリガンドに対する抗体を作製するために、ヒ
トＦａｓリガンドの細胞外ドメインを、マウスＤＨＦＲ
（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）との融合蛋白の形で大腸
菌Ｍ１５株にて発現させた（Qiaexpressキット、フナコ
シ社、使用。

【００５９】即ち、ヒトＦａｓリガンドｃＤＮＡを鋳型
として、プライマー（ＬＢ：５’−ＧＧＧＡＴＣＣＣＡ
ＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧ−３’及びＬＨ：
５’−ＡＡＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡ
ＣＧＴ−３’）を用いてＰＣＲ（２０サイクル：９４℃
−３０秒、５５℃−１分、７２℃−２分）にて増幅を行
なった。を、副産物を、BamH Iと Hind III にて消化し
たのち、ｐＱＥ４０の Bgl Iと Hind III の間にクロー
ニングし、発現ベクターｐＱＥ−ＦＬを構築した。ｐＱ
Ｅ−ＦＬの塩基配列が正しいことは、ジデオキシ鎖法に
て確認した。

【００６０】キットの指示書に従い発現、精製した融合
蛋白を用いて、ヒトＦａｓリガンドに対する抗体（抗血
清）を製造した。即ち、５羽の家兎に上記免疫抗原とし
ての融合蛋白をフロインドの完全アジュバンドと混合し
て、約１００μｇ蛋白量／１羽にて２週間間隔で７回免
疫し、７回免疫後に全採血し、所望の抗血清（ＯＣＴ４
５０１〜４５０５と略称する）を得た。

【００６１】６回免疫後に部分採血し、その抗体価を測
定した結果を下記表１に示す。

【００６２】尚、抗体価の測定は、前記免疫抗原を９６
ウエルプレートに固相化し、スキムミルクでブロック
後、１％スキムミルク及び０．０５％ＮａＮ₃を含むＰ
ＢＳにて段階希釈した抗血清を反応させ、ウエルに結合
した抗体をパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩ
ｇＧ抗体により検出することにより行った。抗血清の力
価は、ＯＤが１．０を取るときの血清希釈倍率により表
示した。

【００６３】

【表１】

【００６４】尚、各抗血清の特異反応性は、上記したｐ
ＱＥ−ＦＬ発現物を用いたウエスタンブロティングによ
り確認した。かくして、ヒトＦａｓリガンドの細胞外ド
メインに特異反応性を有する所望の抗体を得た。

【００６５】上記免疫原の利用によれば、常法［例え
ば、Milstein等の報告：Methods in Enzymology, 73. p
3 (1981)等参照］に従うことにより、ヒトＦａｓリガン
ド特異性の所望のモノクローナル抗体を製造することが
できる。

【００６６】

【配列表】

【００６７】配列番号：１配列の長さ：２８１配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：蛋白配列： Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro 50 55 60 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 65 70 75 80 Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly 85 90 95 Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala 100 105 110 Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu 115 120 125 Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg 130 135 140 Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu 145 150 155 160 Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr 165 170 175 Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 180 185 190 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser 195 200 205 His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met 210 215 220 Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 225 230 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His 245 250 255 Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280

【００６８】配列番号：２配列の長さ：８４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：ｃＤＮＡ配列： ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC 60 TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT 120 GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG 180 CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC 240 CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG 300 ATGTTTCAGC TCTTCCACCT ACAGAAGGAG CTGGCAGAAC TCCGAGAGTC TACCAGCCAG 360 ATGCACACAG CATCATCTTT GGAGAAGCAA ATAGGCCACC CCAGTCCACC CCCTGAAAAA 420 AAGGAGCTGA GGAAAGTGGC CCATTTAACA GGCAAGTCCA ACTCAAGGTC CATGCCTCTG 480 GAATGGGAAG ACACCTATGG AATTGTCCTG CTTTCTGGAG TGAAGTATAA GAAGGGTGGC 540 CTTGTGATCA ATGAAACTGG GCTGTACTTT GTATATTCCA AAGTATACTT CCGGGGTCAA 600 TCTTGCAACA ACCTGCCCCT GAGCCACAAG GTCTACATGA GGAACTCTAA GTATCCCCAG 660 GATCTGGTGA TGATGGAGGG GAAGATGATG AGCTACTGCA CTACTGGGCA GATGTGGGCC 720 CGCAGCAGCT ACCTGGGGGC AGTGTTCAAT CTTACCAGTG CTGATCATTT ATATGTCAAC 780 GTATCTGAGC TCTCTCTGGT CAATTTTGAG GAATCTCAGA CGTTTTTCGG CTTATATAAG 840 CTC 843

【００６９】配列番号：３配列の長さ：１９０６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：ｃＤＮＡ直接の起源ライブラリー名：ヒト肺ｍＲＮＡライブラリークローン名：ＨＦａｓ配列の特徴：特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：１８９−１０３４特徴を決定した方法：Ｓ配列： AAACAGAGAG AGATAGAGAA AGAGAAAGAC AGAGGTGTTT CCCTTAGCTA TGGAAACTCT 60 ATAAGAGAGA TCCAGCTTGC CTCCTCTTGA GCAGTCAGCA ACAGGGTCCC GTCCTTGACA 120 CCTCAGCCTC TACAGGACTG AGAAGAAGTA AAACCGTTTG CTGGGGCTGG CCTGACTCAC 180 CAGCTGCC ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT CCC CAG ATC TAC TGG 230 Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp 1 5 10 GTG GAC AGC AGT GCC AGC TCT CCC TGG GCC CCT CCA GGC ACA GTT CTT 278 Val Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 15 20 25 30 CCC TGT CCA ACC TCT GTG CCC AGA AGG CCT GGT CAA AGG AGG CCA CCA 326 Pro Cys Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro 35 40 45 CCA CCA CCG CCA CCG CCA CCA CTA CCA CCT CCG CCG CCG CCG CCA CCA 374 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 CTG CCT CCA CTA CCG CTG CCA CCC CTG AAG AAG AGA GGG AAC CAC AGC 422 Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser 65 70 75 ACA GGC CTG TGT CTC CTT GTG ATG TTT TTC ATG GTT CTG GTT GCC TTG 470 Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu 80 85 90 GTA GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CAG CTC TTC CAC CTA CAG AAG GAG 518 Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu 95 100 105 110 CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG ATG CAC ACA GCA TCA TCT 566 Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser 115 120 125 TTG GAG AAG CAA ATA GGC CAC CCC AGT CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG 614 Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu 130 135 140 CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG 662 Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met 145 150 155 CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG 710 Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val 160 165 170 AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT 758 Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe 175 180 185 190 GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC 806 Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro 195 200 205 CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG 854 Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu 210 215 220 GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG 902 Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met 225 230 235 TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT 950 Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala 240 245 250 GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG 998 Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 255 260 265 270 GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC TAAGAGAAGC ACTTTGGGA 1051 Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 TCTTTCCATT ATGATTCTTT GTTACAGGCA CCGAGAATGT TGTATTCAGT GAGGGTCTTC 1111 TTACATGCAT TTGAGGTCAA GTAAGAAGAC ATGAACCAAG TGGACCTTGA GACCACAGGG 1171 TTCAAAATGT CTGTAGCTCC TCAACTCACC TAATGTTTAT GAGCCAGACA AATGGAGGAA 1231 TATGACGGAA GAACATAGAA CTCTGGGCTG CCATGTGAAG AGGGAGAAGC ATGAAAAAGC 1291 AGCTACCCAG GTGTTCTACA CTCATCTTAG TGCCTGAGAG TATTTAGGCA GATTGAAAAG 1351 GACACCTTTT AACTCACCTC TCAAGGTGGG CCTTGCTACC TCAAGGGGGA CTGTCTTTCA 1411 GATACATGGT TGTGACCTGA GGATTTAAGG GATGGAAAAG GAAGACTAGA GGCTTGCATA 1471 ATAAGCTAAA GAGGCTGAAA GAGGCCAATG CCCCACTGGC AGCATCTTCA CTTCTAAATG 1531 CATATCCTGA GCCATCGGTG AAACTAACAG ATAAGCAAGA GAGATGTTTT GGGGACTCAT 1591 TTCATTCCTA ACACAGCATG TGTATTTCCA GTGCCAATTG TAGGGGTGTG TGTGTGTGTG 1651 TGTGTGTGTG TGTATGACTA AAGAGAGAAT GTAGATATTG TGAAGTACAT ATTAGGAAAA 1711 TATGGGTTGC ATTTGGTCAA GATTTTGAAT GCTTCCTGAC AATCAACTCT AATAGTGCTT 1771 AAAAATCATT GATTGTCAGC TACTAATGAT GTTTTCCTAT AATATAATAA ATATTTATGT 1831 AGATGTGCAT TTTTGTGAAA TGAAAACATG TAATAAAAAG TATATGTTAG GATACAAATA 1891 AAAAAAAAAA AAAAA 1906

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含むことを特徴とするヒトＦａｓリ
ガンド遺伝子。