JPH0889271A - インジゴの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インジゴ生産菌またはその処理物を、インド
ールを含有する水性溶液に作用させて該水溶液中にイン
ジゴを生成蓄積させ、該水溶液からインジゴを採取する
インジゴの製造法において、該水溶液に酸化剤を添加す
ることを特徴とする方法。 【効果】 酵素法によりインジゴを効率よく製造するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インドールから、効率
よくインジゴを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、インジゴは、化学合成法により製
造され、工業用染料として広く利用されている。しかし
ながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収率が
悪く、また化学的分解による副産物が多い等の欠点があ
った。

【０００３】また、インジゴを製造する種々の方法の中
で有望視されている方法として、シュードモナス属微生
物を用いてインドールから製造する方法〔P. M. M. Gra
y :Proc. Royal Soc. London, ser. B, vol.102, p2263
-2279 (1928) 、特開平４−２８７６９１号公報〕、ミ
コバクテリウム属微生物を用いてインドールから製造す
る方法〔O. Sebck and H. Aeger : Nature, vol.196, p
79-795 (1962) 〕、マイクロコッカス属微生物を用いて
インドールから製造する方法〔M. Fujioka andH. Wada
: Biochimica et Biopysica Acta, vol.158, p70-78
(1968) 〕、シュードモナス属微生物由来のキシレンオ
キシゲナーゼまたはナフタレンオキシゲナーゼ遺伝子を
つないだプラスミドを含有する Escherichia coli を酵
素触媒として用い、インドールから製造する方法〔Burt
D. Ensley, Barry J. Ratzkin, Timthy D. Osslund an
d Mary J. Simon ; Science, vol.222, p167-169 (198
3) 〕、モルセラ属菌を用いてインドールから製造する
方法〔J. Eyal, Md. A. Mabud,and J. F. Walter ; App
lied Biochemistry and Biotechnology, vol.30, p303-
312 (1991) 〕、ロドコッカス属微生物由来遺伝子をつ
ないだプラスミドを含有する Escherichia coli を酵素
触媒として用い、インドールから製造する方法〔S. Har
t and D. R. Woods ： Journal of General Microbiolo
gy, vol.138, p205-509 (1992)〕、アシネトバクター属
菌を用いてインドールから製造する方法（特願平５−２
１０４３９号公報）等が挙げられるが、いずれも未だ実
際的な製造技術を確立するには至っておらず、効率よく
インジゴを製造する方法の開発が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、効率よく、
かつ高収率でインジゴを製造することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
インジゴを製造する方法を確立すべく、鋭意検討を行っ
た結果、インジゴ生産菌またはその処理物を、インドー
ルを含有する水溶液に作用させて該水溶液中にインジゴ
を生成蓄積させ、該水溶液からインジゴを採取するイン
ジゴの製造法において、該水溶液に酸化剤を添加するこ
とにより効率よくインジゴが生産可能なことを見出し、
本発明を完成するに到った。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
用いられるインジゴ生産菌は、インジゴ生成能を有する
微生物であればいかなる菌株でもよく、既知の菌株又は
新たに取得された菌株が用いられるが、これらの変異株
であってもよい。

【０００７】その具体例としては、アシネトバクター
（Acinetobacter) sp.ＭＹ−１５菌株（以下、これを
「ＭＹ−１５」と略称することがある）、アシネトバク
ター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceti
cus)ＡＴＣＣ １９６０６株（以下、これを「ＡＴＣＣ
１９６０６」と略称することがある）、アシネトバク
ターsp. ＶＡ−６６株（以下、これを「ＶＡ−６６」と
略称することがある）又はアシネトバクターsp. ＶＡ−
２５１株（以下、これを「ＶＡ−２５１」と略称するこ
とがある）、シュードモナス（Pseudkomonas) sp. ＭＹ
−６株（ＦＥＲＭＰ−１１９６３：特開平６−３８７８
２号参照。以下、これを「ＭＹ−６」と略称することが
ある）等が挙げられ、好ましくは、アシネトバクターs
p. ＭＹ−１５、シュードモナスsp. ＭＹ−６等が挙げ
られる。

【０００８】インジゴ生産菌は、下記の方法により取得
することができる。例えば、河川の水、草木および土壌
等のサンプルを滅菌水に懸濁した後、その一部を、キシ
レン、安息香酸等を主炭素源とする液体培地に接種し、
３０℃程度の中温で４８時間程度振盪培養し、その一部
を前記液体培地に植え継ぎ、同様に振盪培養を数回繰り
返す（集積培養）。その後、培養液を滅菌水等で適度に
希釈し、キシレン、安息香酸等を主炭素源とする平板培
地に塗布し、コロニーを単離する。単離されたコロニー
又は既知の保存菌株について、３０℃程度の中温で、後
記するインドール含有水溶液に作用させ、青色の色素を
生成するコロニーを選択することによりインジゴ生産菌
を選抜することができる。

【０００９】前記ＭＹ−１５、ＶＡ−６６及びＶＡ−２
５１は本発明者らにより新たに土壌から分離された菌株
で、その菌学的及び分類学的性質は以下の共通した性質
を有す。

【００１０】Ｉ．顕微鏡的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌、１×２μm （ｂ）多形態の有無：無し （ｃ）運動性：無し （ｄ）胞子の有無：無し （ｅ）グラム染色：陰性

【００１１】II．培養的性質 （ａ）肉汁寒天培地における生育：有り （ｂ）資化可能な炭素源：フマル酸、クエン酸、リンゴ
酸、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、エタノール、酢酸、
安息香酸等

【００１２】III.生育条件 （ａ）生育温度：中温 （ｂ）生育pH：中性 （ｃ）酸素要求性

【００１３】IV．生理学的性質 （ａ）オキシダーゼ：陰性 （ｂ）カタラーゼ：陽性 （ｃ）ゼラチン液化：陰性 （ｄ）硝酸塩還元：陰性 （ｅ）グルコース発酵性：陰性 （ｆ）尿素分解：陰性

【００１４】ＭＹ−１５は受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−
４６１３として、ＶＡ−６６はＦＥＲＭ ＢＰ−４７７
０として及びＶＡ−２５１はＦＥＲＭ ＢＰ−４７７１
として、いずれも工業技術院生命工学工業技術研究所に
国際寄託されている。

【００１５】インジゴ生産菌の培養に用いる培地の炭素
源は、使用する菌株によって異なるが、フマル酸、クエ
ン酸、リンゴ酸、酢酸等の有機酸、エタノール、安息香
酸、ｍ−キシレン等が利用できる。

【００１６】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム
等の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。

【００１７】無機物としては、リン酸カリウム、硫酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅等を用いることが
できる。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸また
は酵母エキス、ペプトン等の栄養源を添加することがで
きる。

【００１８】培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で
行い、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは３０〜３７
℃が適当である。培養途中のpHは６〜９、好ましくは７
〜８付近とすることができ、培養中のpHの調整は、酸又
はアルカリを添加して行うことができる。

【００１９】本発明の方法は、上記の如く培養すること
により得られる培養物、培養物から遠心分離等により回
収された菌体、又はそれらの処理物を用いて実施するこ
とができる。

【００２０】培養した菌体は、該菌体を予めリン酸緩衝
液等の緩衝液（pH７）で洗浄した後用いることもでき
る。洗浄用のリン酸緩衝液の濃度は０．０５M 〜０．２
M 程度が好適に用いられる。菌体は、そのまま使用する
ことができるし、該菌体を必要により固定化等の処理を
して用いることもできる。

【００２１】また、上記「処理物」とは、培養物又はそ
れから回収された菌体を固定化して得られる固定化物、
該菌体を超音波、圧擦等の手段で粉砕した粉砕物、該粉
砕物を水等で抽出した抽出物、該抽出物をさらに硫安塩
析、カラムクロマトグラフィー等の処理により得られる
酵素成分、さらにこれら粉砕物、抽出物、酵素成分等を
固定化して得られる固定化物を意味するものである。菌
体等の固定化は、それ自体既知の通常用いられる方法に
従い、ポリアクリルアミド、アルギン酸又はカラギーナ
ン等の適当な担体に固定化させる方法により行うことが
できる。

【００２２】かくして得られるインジゴ生産菌又はその
処理物を、インドールを含有する水性溶液に作用させる
ことにより、該水性溶液中にインジゴを生成蓄積させる
ことができる。

【００２３】該菌体またはその処理物をインドールと反
応させるには、通常の酵素反応と同様に、例えば０．１
M リン酸緩衝液（pH６〜９）あるいは水溶液（pH６〜
９）等の水性溶液中で、２０〜５０℃、好ましくは３０
〜４０℃の温度で、通常１０〜７２時間反応させる。本
水性溶液には、反応時に酸化剤を添加する。

【００２４】酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝
酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲ
ン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナ
トリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化
剤の種類によって異なるが、インジゴ生成を阻害しない
濃度で加えることが望ましく、通常、０．００１〜０．
０５％（W/V)、好ましくは０．００５〜０．０２％であ
る。

【００２５】反応は、通気攪拌等の好気的条件下で行
う。水性溶液中のインドール濃度は、インドールが酵素
反応により変換させられ、インジゴを生成し得る濃度で
あれば特に制限されないが、好ましくは、０．８mMを越
えないように一括あるいは逐次添加するのが好ましい。

【００２６】水性溶液に添加する菌体またはその処理物
の添加量は、特に制限されるものではないが、一般に
０．５〜１０％（W/V)が用いられる。

【００２７】上記した水性溶液における酵素反応温度は
２０〜４５℃、好ましくは３０〜３７℃が適当であり、
反応中の水性溶液のpHは６〜９、好ましくは７〜８付近
とすることができ、pHの調整は、酸又はアルカリを添加
して行うことができる。酵素反応は、通気撹拌、振盪等
の好気的条件下で、通常約５〜４８時間行うことができ
る。

【００２８】上記の如く酵素反応させることにより、水
性溶液中にインジゴを著量生成蓄積させることができ
る。

【００２９】上記の酵素反応によってインジゴを生成蓄
積させた後、水性溶液からインジゴを採取するには、そ
れ自体既知の通常用いられる分離、精製法に従って行う
ことができ、例えば、酢酸エチル、ジメチルスルホキシ
ド、クロロホルム等の溶媒にインジゴを溶解させ、溶媒
を蒸発させ、インジゴ結晶を得る方法、又はアルカリ条
件下に亜二チオン酸ナトリウムを加えた水溶液にインジ
ゴを溶解させ、還元条件下に膜等を用いて菌体を分離
し、空気で酸化してインジゴ結晶を得る方法等を用いる
ことができる。

【００３０】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。

【００３１】実施例１ （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ：３ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ：０．５ｇ、Ｋ
₂ ＨＰＯ₄ ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ：０．５
ｇ、ＮａＣｌ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ：１０m
g、ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ：１０mg、酵母エキス１ｇお
よび蒸留水：１，０００ml（pH７．０）の培地１００ml
を、５００ml容の三角フラスコ２本に分注し、１２０
℃、１５分間滅菌処理したものに、それぞれエタノール
１mlを添加後、アシネトバクター sp.ＭＹ−１５菌株を
植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。

【００３２】また、上記と同様の培地１，０００mlを５
L 容の三角フラスコに入れ、１２０℃、１５分間滅菌処
理したものに、エタノール１０mlを添加後、上記振とう
培養液２０mlを接種し、これを３０℃にて２４時間振と
うした。得られた培養液を遠心分離（８，０００rpm 、
１５分、４℃）して集菌した菌体を、以下のとおり反応
に供試した。

【００３３】回収した菌体を０．１M リン酸緩衝液（pH
７）２００mlで１回洗浄した後、同液に表−１の酸化剤
を加えた反応液５００mlに懸濁し、１００mgインドール
を添加し、３０℃で２４時間反応させた。途中、１２時
間後にインドール１００mgを添加した。反応後、生成さ
れたインジゴは、酢酸エチルを加えて抽出し、酢酸エチ
ル画分を分取して得た。結果を、表−１に示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、効率よく、かつ
高収率でインジゴを製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インジゴ生産菌またはその処理物を、イ
   ンドールを含有する水性溶液に作用させて該水性溶液中
   にインジゴを生成蓄積させ、該水性溶液からインジゴを
   採取するインジゴの製造法において、該水性溶液に酸化
   剤を添加することを特徴とする方法。