JPH0889298A - 遺伝子診断を用いた大麦又は麦芽の品種識別方法及びそのプライマー - Google Patents

遺伝子診断を用いた大麦又は麦芽の品種識別方法及びそのプライマー

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JPH0889298A
JPH0889298A JP6261286A JP26128694A JPH0889298A JP H0889298 A JPH0889298 A JP H0889298A JP 6261286 A JP6261286 A JP 6261286A JP 26128694 A JP26128694 A JP 26128694A JP H0889298 A JPH0889298 A JP H0889298A
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Abstract

(57)【要約】 【効果】 迅速かつ簡便で、より信頼性の高い、醸造用
大麦又は麦芽の品種識別を可能とする。 【構成】 醸造上重要な遺伝子に相補的な配列を持つプ
ライマーを用いて、ＰＣＲ法によって大麦又は麦芽のゲ
ノムＤＮＡを増幅し、該ＤＮＡの塩基配列の違いによっ
て大麦又は麦芽の品種を識別する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子診断を用いた醸
造用大麦又は麦芽の品種の識別方法及び該方法プライマ
ーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、大麦や麦芽の品種判定法として
は、ホルデインやエステラーゼのSDS-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動パターンを比較することにより品種の判
定を行う方法が試みられてきている。また、最近では、
遺伝子診断による識別方法も開発されてきている（例え
ば、Cheeら、J. Am. Soc. Brew. Chem., 51, 93 (199
3).）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ホルデ
インやエステラーゼの電気泳動パターンの比較による品
種判定方法は、大麦の生育条件や製麦中のブロテアーゼ
による分解などによって電気泳動のパターンに変化が生
じる場合があるため、必ずしも正確な判定法とは言い難
い。一方、遺伝子診断による識別方法の多くは、由来の
不明な遺伝子をプローブ又はプライマーとしているため
に、たとえ変異や他品種混入が示唆されたとしても、そ
の結果と醸造上の品質への影響とを直接結びつけること
が難しいため、満足のいく結果が得られるとは限らない
という問題があった。
【０００４】本発明は以上のような課題に鑑みなされた
ものであり、その目的は、醸造用大麦の育種あるいは醸
造用原料の品質管理という観点から、より満足のいく遺
伝子診断を用いた大麦又は麦芽の品種の識別方法の提供
することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記状況
に鑑み、より優れた大麦又は麦芽の品種の識別方法を見
い出すべく鋭意研究を重ねた結果、醸造上重要な遺伝子
において品種間で塩基配列に差異のある部位をつきと
め、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、下記に示した醸造上重要
な遺伝子における品種間で塩基配列に差異のある部位を
含むように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う
ことにより大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、該増
幅されたＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽
の品種の識別を行う方法を提供するものである。
【０００７】
【表１】 標的遺伝子 プライマー配列 β- アミラーゼ (1) 5'-TTCAAAGCAGCAGCAGCG-3' (2) 5'-TTCTTCTGGTGCGCTCATC-3' α- アミラーゼ (3) 5'-ATAAGTGGGCATCAATTCGGC-3' (4) 5'-GTGTGTCTGGCCAGGTAT-3' β- グルカナーゼ (5) 5'-CGTGAAAAAACCGCCGCCGA-3' (6) 5'-CTTTCTCTCTCTAGCTGCGT-3' B1-ホルデイン (7) 5'-CCACCATGAAGACCTTCCTC-3' (8) 5'-TCGCAGGATCCTGTACAACG-3' また本発明は、上記の品種識別方法のプライマーを提供
するものである。本発明に係るプライマーは、例えばβ
- シアノエチルホスホアミダイド法やチオホスファイト
法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって得ること
ができる。
【０００８】具体的には、本発明は、醸造上重要な遺伝
子に相補的な配列を持つプライマーを用いて、ＰＣＲ法
によって大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、該ＤＮ
Ａの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種を識別
する方法である（請求項１）。
【０００９】また、本発明は、 (1)5'-TTCAAAGCAGCAGCA
GCG-3'（配列番号１）及び(2)5'-TTCTTCTGGTGCGCTCATC-
3'（配列番号２）の配列からなるオリゴヌクレオチドも
しくはそれらの配列に相補的な配列を有するオリゴヌク
レオチドを必須プライマーとし、かつ、(3)5'-ATAAGTGG
GCATCAATTCGGC-3'（配列番号３）及び (4)5'-GTGTGTCTG
GCCAGGTAT-3'（配列番号４）の配列からなるオリゴヌク
レオチドもしくはそれらの配列に相補的な配列を有する
オリゴヌクレオチドを選択必須プライマーとし、前記２
個の必須プライマーの両方と前記２個の選択必須プライ
マーの両方若しくはいずれか一方とを用いてＰＣＲ法に
より大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、該ＤＮＡの
塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種を識別する
方法である（請求項２）。
【００１０】更に、本発明は、請求項２記載の方法にお
いて、 (5)5'-CGTGAAAAAACCGCCGCCGA-3'（配列番号
５）、 (6)5'-CTTTCTCTCTCTAGCTGCGT-3'（配列番号
６）、 (7)5'-CCACCATGAAGACCTTCCTC-3'（配列番号７）
及び (8)5'-TCGCAGGATCCTGTACAACG-3'（配列番号８）の
配列からなるオリゴヌクレオチドもしくはそれらの配列
に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを選択プラ
イマーとし、前記必須プライマー及び前記選択必須プラ
イマーに加えて、更に、前記選択プライマーのいずれか
一を用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡ
を増幅し、該ＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は
麦芽の品種を識別する方法である（請求項３）。
【００１１】また更に、本発明は、配列表１から６のい
ずれかに示される配列もしくはそれらに対応する相補的
な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプラ
イマーである（請求項４）。
【００１２】
【作用】本発明によれば、まず、サンプルとなる大麦又
は麦芽からゲノムＤＮＡを抽出する。サンプルからのゲ
ノムＤＮＡの抽出は、例えばCTAB法（Nucleic Acids Re
s., 8,4321 (1980) ）により行う。次に、該ゲノムＤＮ
Ａに本発明プライマーを作用させて、標的遺伝子の一部
を増幅させる。標的遺伝子の一部増幅は、例えばＰＣＲ
法（Science, 230, 1350 (1985) ）により行う。そし
て、このようにして得られた増幅ＤＮＡについて、塩基
配列を決定するか、または、変性勾配ゲルや温度勾配ゲ
ル電気泳動もしくは制限酵素切断パターンなどによって
塩基配列の差異を検出することによって、大麦又は麦芽
の品種の識別を行う。
【００１３】本方法は、醸造上重要な遺伝子をターゲッ
トにしていることに起因して、その結果が醸造上の品質
へ直接影響をおよぼす可能性が高くなるため、醸造用大
麦の育種あるいは醸造用原料の品質管理という観点から
より満足のいく識別方法となり得る。
【００１４】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
実施例により本願発明の技術的範囲が限定されるもので
はない。
【００１５】［実施例１；ゲノムＤＮＡの抽出］本実施
例においては、大麦又は麦芽の品種として、あまぎ二条
（以下、品種番号1 と記す）、はるな二条（以下、品種
番号2 と記す）、ミサトゴールデン（以下、品種番号3
と記す）、Clipper （以下、品種番号4 と記す）、Scho
oner（以下、品種番号5 と記す）、Stirling（以下、品
種番号6 と記す）、Harrington（以下、品種番号7 と記
す）、Manley（以下、品種番号8 と記す）、Ellice（以
下、品種番号9 と記す）、Alexis（以下、品種番号10と
記す）を用いた。
【００１６】上記の大麦の胚又は麦芽の葉芽を取り出
し、Clontech社製「植物ゲノム抽出キット」を用いてゲ
ノムＤＮＡを抽出した。
【００１７】［実施例２；プライマーの設計と合成］醸
造上重要な既知の大麦遺伝子の塩基配列（β- アミラー
ゼ; J. Biochem., 115, 47 (1994). α- アミラーゼ;
Plant Mol. Biol., 12, 119 (1989). β- グルカナー
ゼ; Eur.J. Biochem., 194, 831 (1990). B1- ホルデイ
ン; Nucleic Acids Res., 13, 7327 (1985). ）より様
々なプライマーを設計し、それらについてＰＣＲを行っ
た後、温度勾配ゲル電気泳動および塩基配列の決定によ
って品種間で塩基配列に差異のあるものを検索した。
【００１８】その結果、プライマー配列(1) 〜(8) を用
いることによって品種間で塩基配列に差異のある部位が
増幅でき、更にその部位に存在する制限酵素認識部位を
利用することで、大麦又は麦芽の品種の識別が可能にな
ることが判明した。プライマーの合成及び精製は、
（株）サワディー・テクノロジーに委託した。
【００１９】［実施例３；プライマー配列(1)(2)を用い
た品種の識別方法］ＰＣＲは、各品種10粒の大麦から抽
出したゲノムＤＮＡ100 ng、dNTPs 各20 nmol 、プライ
マー(1)(2)各10 pmol 、Taq DNA polymerase 2.5 Uを含
むＰＣＲ用反応液 100μl について、94℃ 1分、55℃ 2
分、72℃ 1分を33サイクル行った後、72℃ 5分処理を行
った。ＰＣＲ終了後、この反応液 8μl に制限酵素 Nco
I とEcoT22I各5 U と酵素反応用緩衝液を加え37℃で 1
時間処理した。これを、5%ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供し、エチジウムブロマイド染色後、UV照射にて
視覚化した。結果を図１に示す。10種類の大麦品種をA
からC'の5 タイプに識別することができた。なお、品種
番号5 と10については、更に１粒毎の分析を行った結
果、C とC'あるいはB とC のいずれかを持つことが明ら
かとなり、C/C'、B/C のように示した。
【００２０】［実施例４；プライマー配列(3)(4)を用い
た品種の識別方法］プライマー配列(1)(2)の代わりに
(3)(4)を用い、ＰＣＲを33から30サイクルに、制限酵素
反応をNcoIと EcoT22I／37℃から TaqI ／65℃に代えて
実施例３と同様の分析を行った結果、図２に示ように、
A〜C の3 タイプに識別することができた。
【００２１】［実施例５；プライマー配列(5)(6)を用い
た品種の識別方法］プライマー配列(1)(2)の代わりに
(5)(6)を用い、ＰＣＲを33から30サイクルに、制限酵素
反応をNcoIと EcoT22Iから HaeIII に代えて実施例３と
同様の分析を行った結果、図３に示すように、 AとB の
2 タイプに識別することができた。
【００２２】［実施例６；プライマー配列(7)(8)を用い
た品種の識別方法］プライマー配列(1)(2)のかわりに
(7)(8)を用いて、実施例３と同様の条件で、アニーリン
グを55℃から57℃に、33サイクルから30サイクルにかえ
てＰＣＲを行ったもの（図４の左半分）と、更に実施例
３と同様の条件で制限酵素 HaeIII 処理を行ったもの
（図４の右半分）の比較により、図４に示すように、 A
〜E の5タイプに識別することができた。
【００２３】［実施例７；総合評価による品種の識別方
法］実施例３〜６において行ったタイプ分けをまとめる
と表２のようになる。このような総合評価から、10種類
全ての品種を識別できるということがわかる。
【００２４】
【表２】 品種番号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 プライマー(1)(2) A A B C' C/C' C B B' B B/C プライマー(3)(4) A B C C A A C C A A プライマー(5)(6) A A B A B B A A B B プライマー(7)(8) A A A/B C B D B A B A/C/E ［実施例８；品種の純度検定］購入した大麦又は麦芽10
0 粒の胚又は葉芽をひとまとめにして実施例３〜６に示
したタイプを調査するようにすると、その品種のタイプ
とは別のタイプのＤＮＡ断片の混入が観察されるか否か
で品種の純度検定が行えることとなる。
【００２５】他品種混入が予想された場合には、そのと
きのバンドの濃さによってある程度純度が予想でき、さ
らにこのサンプルを一粒ずつ同様の分析を行えばどのよ
うな品種がどの程度混入しているかが明らかとなる。
【００２６】
【発明の効果】本発明に係るプライマーは醸造上重要な
遺伝子をターゲットにして作成されているため、その結
果が醸造上の品質へ直接影響をおよぼす可能性が高くな
る。このため、このようなプライマーを使用する本発明
に係る識別方法によれば、醸造用大麦の育種あるいは醸
造用原料の品質管理という観点からより満足のいく識別
をすることができる。
【００２７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：TTCAAAGCAG CAGCAGCG 18 配列番号：２ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：TTCTTCTGGT GCGCTCATC 19 配列番号：３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：ATAAGTGGGC ATCAATTCGG C 21 配列番号：４ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：GTGTGTCTGG CCAGGTAT 18 配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：CGTGAAAAAA CCGCCGCCGA 20 配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：CTTTCTCTCT CTAGCTGCGT 20 配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：CCACCATGAA GACCTTCCTC 20 配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列：TCGCAGGATC CTGTACAACG 20
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマー(1)(2)を用いてＰＣＲを行い、それ
を制限酵素で処理した後のポリアクリルアミドゲル電気
泳動パターンの写真である。図中、１〜１０は大麦品種
を、Ａ，Ｂ，Ｂ´，Ｃ，Ｃ´は電気泳動パターンのタイ
プを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マーカー9 を示
す。
【図２】プライマー(3)(4)を用いてＰＣＲを行い、それ
を制限酵素で処理した後のポリアクリルアミドゲル電気
泳動パターンの写真である。図中、Ａ，Ｂ，Ｃは電気泳
動パターンのタイプを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA M
W マーカー9 を示す。
【図３】プライマー(5)(6)を用いてＰＣＲを行い、それ
を制限酵素で処理した後のポリアクリルアミドゲル電気
泳動パターンの写真である。図中、Ａ，Ｂは電気泳動パ
ターンのタイプを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マ
ーカー9 を示す。
【図４】プライマー(7)(8)を用いてＰＣＲを行ったもの
（左半分Ａ〜Ｅ）と、それぞれを制限酵素HaeIIIで処理
したもの（右半分Ａ〜Ｅ）のポリアクリルアミドゲル電
気泳動パターンの写真である。図中、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，
Ｅはポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのタイプ
を、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マーカー9を、Ｍ
´はニッポンジーン社製 DNA MW マーカー2 を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 醸造上重要な遺伝子に相補的な配列を持
    つプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって大麦又は麦芽
    のゲノムＤＮＡを増幅し、該ＤＮＡの塩基配列の違いに
    よって大麦又は麦芽の品種を識別する方法。
  2. 【請求項２】(1)5'-TTCAAAGCAGCAGCAGCG-3' 及び(2)5'-
    TTCTTCTGGTGCGCTCATC-3'の配列からなるオリゴヌクレオ
    チドもしくはそれらの配列に相補的な配列を有するオリ
    ゴヌクレオチドを必須プライマーとし、 かつ、 (3)5'-ATAAGTGGGCATCAATTCGGC-3'及び(4)5'-GTGTGTCTGG
    CCAGGTAT-3' の配列からなるオリゴヌクレオチドもしく
    はそれらの配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオ
    チドを選択必須プライマーとし、 前記２個の必須プライマーの両方と前記２個の選択必須
    プライマーの両方若しくはいずれか一方とを用いてＰＣ
    Ｒ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、該Ｄ
    ＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種を識
    別する方法。
  3. 【請求項３】 請求項２記載の方法において、 (5)5'-CGTGAAAAAACCGCCGCCGA-3' 、(6)5'-CTTTCTCTCTCT
    AGCTGCGT-3' 、(7)5'-CCACCATGAAGACCTTCCTC-3' 及び
    (8)5'-TCGCAGGATCCTGTACAACG-3' の配列からなるオリゴ
    ヌクレオチドもしくはそれらの配列に相補的な配列を有
    するオリゴヌクレオチドを選択プライマーとし、前記必
    須プライマー及び前記選択必須プライマーに加えて、更
    に、前記選択プライマーのいずれか一つを用いてＰＣＲ
    法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、該ＤＮ
    Ａの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種を識別
    する方法。
  4. 【請求項４】 配列表１から６のいずれかに示される配
    列もしくはそれらに対応する相補的な配列を有するオリ
    ゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマー。
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