JPH0889299A

JPH0889299A - 二本鎖核酸の検出方法及び試験キット

Info

Publication number: JPH0889299A
Application number: JP7107468A
Authority: JP
Inventors: John W Sutherland; ダブリュ．サザーランドジョン; David R Patterson; アール．パターソンデイビッド
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-05-01
Publication date: 1996-04-09
Anticipated expiration: 2024-04-30
Also published as: CA2148140A1; JP4260903B2; CN1100884C; DE69533660T2; CN1114359A; CA2148140C; EP0684316B1; KR100388732B1; ATE280243T1; US5563037A; EP0684316A1; KR950032641A; DE69533660D1

Abstract

(57)【要約】【目的】増幅核酸の定量的検定を可能にする均質系に
よる高感度アッセイ法を提供すること。【構成】二本鎖標的核酸を増幅する工程、得られた増
幅二本鎖標的核酸と、前記二本鎖標的核酸に結合した場
合に前記二本鎖標的核酸の一本鎖に結合されているとき
に発生する信号又は遊離形における信号と比較して検出
可能な信号を示す蛍光色素とを、接触させる工程、並び
に前記検出可能な信号を、前記二本鎖標的核酸の存在又
は量を示す測定値として検出又は監視する工程を含み、
前記蛍光色素が、二本鎖核酸との結合定数が約１×１０
⁴〜約５×１０⁵モル^-1である非対称シアニン系色素で
ある、均質系による二本鎖標的核酸の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、標的とする二本鎖核酸
を検出するための均質系によるアッセイ法に関する。こ
のようなアッセイは、各種の診断、調査及び研究手順
に、とりわけ感染性因子の検出に有用である。さらに本
発明は、このようなアッセイに有用な試験キットにも関
する。

【０００２】

【従来の技術】最近、核酸の検出は、ヒトや動物の被検
体中に非常に少量で存在する染色体の特徴、感染性因子
及び各種生物を早期に検出するための手段として成長し
ている。検出手順は、通常、（ヌクレオチド対として知
られている）相補的ヌクレオチド間の水素結合及びその
他の力によって２本のＤＮＡ鎖が一緒に結合する相補性
の概念に基づくものである。ＤＮＡ分子は、通常はかな
り安定であるが、その鎖は、加熱などの特定の条件によ
って分離又は変性させることができる。変性された鎖
は、相補的配列を有する別のヌクレオチド鎖とのみ再会
合する。

【０００３】分子数の非常に少ないＤＮＡを検出するた
めの方法を見い出すため、多大な研究が行われてきた。
検出のために被検体中の核酸数を増幅する又は大幅に増
やす各種の手法が知られており、ほぼ１０年間にわたり
用いられている。このような増幅技法には、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、
その他開発の遅れている方法が含まれる。ＰＣＲ法が最
もよく知られている方法であって、ＤＮＡ重合剤とデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸を存在させた適当な条件
下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイズさせる
工程を含む。複数回のサイクルを通してプライマー伸長
生成物が形成されて、最初の標的鎖の数が指数的に増加
することになる。ＰＣＲに関する詳細は、米国特許出願
第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，
６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６
５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されている。

【０００４】ＰＣＲのような増幅手順は少量の標的核酸
を検出するための機会を提供するが、同時に、反応容器
毎に人工的に発生するオリゴヌクレオチドによる汚染と
いう問題を生ぜしめる。新規被検体の標的核酸と一緒に
汚染物が増幅されると、偽陽性の結果が得られる恐れが
ある。このことは、特に感染性因子を調査する場合に重
大な結論をもたらすことがある。このような汚染を減少
させるため、当該産業界では物理的封込め法や化学的
「滅菌」技法が考えられている。物理的封込め法は利点
もあるが、反応容器の設計やエンジニアリングがかなり
複雑にならざるをえない。化学的滅菌法については、当
該技術分野で議論はされているが、いまだに成功した例
はない。

【０００５】反応容器毎に汚染性物質について心配する
ことのない増幅方法を簡素化する方法を見い出すことは
有用である。また、定量性をもつことができる増幅方法
があれば望ましい。このような方法は、単なる疾病の検
出ではなくその処置にも有用となりうる。

【０００６】定量性があると見なされている均質系によ
る増幅方法が、欧州特許出願公開第４８７２１８号公報
（１９９２年５月２７日、Ｔｏｓｏｈ）に記載されてお
り、これによると、増幅工程中又は増幅工程後に二本鎖
ＤＮＡと結合させるための特殊な蛍光色素を使用してい
る。結合による蛍光信号の変化量が、被検体中の標的核
酸量に相関していることが明らかである。Ｔｏｓｏｈの
特許出願公開公報において有用であると考えられている
種類の蛍光色素は、エチジウムブロミド、アクリジンオ
レンジ、ビス−ベンズイミダゾール（例、Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ３３２５８）、ジアミノフェニルインドール、アク
チノマイシン、チアゾールオレンジ及びクロモマイシン
である。「均質系による」とは、検出すべき標的核酸と
非標的物質とを分離する必要のないことを意味する。

【０００７】米国特許出願第５，０４９，４９０号明細
書（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら）に記載されているよう
に、同じ種類の色素がＤＮＡポリメラーゼの検出にも有
用である。上記の色素（例えば、エチジウムブロミドや
Ｈｏｅｃｈｓｔ色素）はＤＮＡに容易に結合するが、そ
れらの使用から明らかなバックグラウンドが高すぎるた
めに有意な感度が得られない場合が多い。このため、Ｄ
ＮＡに良好に結合はするが、示される感度がより高く且
つバックグラウンドがより低くなるような色素を見い出
すことが望まれている。

【０００８】増幅された核酸を染色するための感受性色
素として、例えば、Mansfield らのBioTechniques 15
(2) 、第 274〜279 頁(1993)に、ある種のビス−挿入性
(bis-intercalating) 色素が記載されている。このよう
な色素は、核酸を染色するのに有用であり且つ上記のバ
ックグラウンドの問題を克服するものであるが、核酸の
増幅工程を阻害するほど強く核酸に結合してしまう。こ
のため、これらの色素は、増幅工程中には使用できず、
増幅終了時にしか使用することができない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】増幅された標的核酸を
定量検出するために封じ込められた系において使用する
ことができ、よって汚染物の問題を防止することができ
るより感度の高い均質系によるアッセイが望まれる。こ
のようなアッセイは、低濃度の核酸に対して高感度であ
りしかも製造や使用が容易でなければならない。さらに
また、増幅中に存在するように取り込まれた検出手段に
よって増幅の進行を監視することができれば望ましい。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記の問題は、均質系に
よる二本鎖標的核酸の検出方法であって、Ａ）二本鎖標的核酸を増幅する工程、Ｂ）得られた増幅二本鎖標的核酸と、前記二本鎖標的核
酸に結合した場合に前記二本鎖標的核酸の一本鎖に結合
されているときに発生する信号又は遊離形における信号
と比較して検出可能な信号を示す蛍光色素とを、接触さ
せる工程、並びにＣ）前記検出可能な信号を、前記二本鎖標的核酸の存在
又は量を示す測定値として検出又は監視する工程を含
み、前記蛍光色素は、二本鎖核酸との結合定数（Ｋ_b）
が約１×１０⁴〜約５×１０⁵である非対称シアニン系
色素であって、以下の構造式（Ｉ）：

【００１１】

【化１０】

【００１２】（上式中、Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｅ
−、＝ＣＨ−又は−ＮＲ¹−であり、Ｙは−ＣＨ＝ＣＨ
−であり、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ
¹は水素又は炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ²
及びＲ⁶は、各々独立に、炭素原子数１〜１０のアルキ
レンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立に、炭素
原子数１〜６のアルキルであり、Ｚ¹は、最大で３個ま
での芳香族炭素環式環又は複素環式環が縮合されていて
もよい５員又は６員の複素環式環を完成するのに必要な
炭素原子と異種原子を含み、Ｚ²は、最大で２個までの
芳香族炭素環式環又は複素環式環が縮合されていてもよ
い５員又は６員の芳香族環を完成するのに必要な炭素原
子と異種原子を含み、Ｑは酸アニオンであり、ｎは０、
１又は２であり、ｍ、ｐ及びｑは、各々独立に、０又は
１であるが、但しｐとｑが同じ値であることはなく、ｒ
は１又は２であり、そしてｔは０、１又は２である）で
示され、前記検出又は監視は、前記増幅二本鎖標的核酸
を捕捉プローブへハイブリダイズすることなく行われ
る、そのような均質系による二本鎖標的核酸の検出方法
によって解決された。

【００１３】本発明はまた、二本鎖標的核酸の増幅を監
視する方法であって、Ａ）前記二本鎖標的核酸に結合した場合に前記二本鎖標
的核酸の一本鎖に結合されているときに発生する信号又
は遊離形における信号と比較して検出可能な信号を示す
蛍光色素の存在下で、前記二本鎖標的核酸を増幅する工
程、並びにＢ）前記検出可能な信号を、前記二本鎖標的核酸の存在
又は量を示す測定値として前記増幅工程中に検出又は監
視する工程を含み、前記蛍光色素は、先に前記の方法に
ついて記載した通りであり、前記検出又は監視は、前記
増幅二本鎖標的核酸を捕捉プローブへ結合させることな
く行われる、二本鎖標的核酸の増幅を監視する方法をも
提供する。

【００１４】さらに本発明は、１）二本鎖標的核酸に結合した場合に、前記二本鎖標的
核酸の一本鎖に結合されているときに発生する信号又は
遊離形における信号と比較して検出可能な信号を示す蛍
光色素であって、先に本発明の方法について記載した蛍
光色素、及び２）少なくとも１種の増幅試薬、を同じ又は別個のパッ
ケージに含む二本鎖標的核酸の均質系による増幅及び検
出のための試験キットを提供する。

【００１５】本発明は、増幅中又は増幅後の標的核酸を
検出するための、より簡単な、高感度の、均質系による
アッセイ法を提供するものである。このため、本発明の
方法を使用すると、工程中の任意の時点における核酸の
量及び増幅を定量的に監視することができる。また、本
発明の方法を使用すると、増幅終了時の核酸の量を検出
することもできる。本発明の方法は均質系であるため、
不均質系で一般的な分離工程や捕捉工程を施す必要もな
く、適当な任意の格納容器の中で容易に実施することが
できる。増幅後に反応容器から試薬を除去する必要がな
いため、ある容器から別の容器への汚染が回避される。
最も重要なことは、本発明のアッセイ法が、エチジウム
ブロミドやＨｏｅｓｃｈｔ３３２５８系色素のような
通常の蛍光色素を用いた従来より報告されているアッセ
イ法よりも、バックグラウンド信号が低いために感度が
高いということである。

【００１６】これらの利点は、特別な範囲において増幅
及び検出される二本鎖核酸に対して高い親和性を有する
特殊な蛍光色素を使用することによって達成される。こ
の結合親和性は、多くの通常の蛍光色素よりも高いもの
であるが、標的核酸の増幅を阻害するほど高いというも
のではない。これらの色素は、少なくとも２価、すなわ
ち１分子当たり２個以上の陽イオン電荷を有する。これ
らの色素について以下詳細に説明する。

【００１７】ポリメラーゼ連鎖反応を利用して核酸を増
幅及び検出するための一般原理及び条件についてはよく
知られている。その詳細については、米国特許出願第
４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び
同第４，９６５，１８８号明細書（上記）をはじめとす
る多くの文献に記載されており、本明細書ではそのすべ
てを参照することにより取り入れることとする。当該技
術分野における教示と本明細書に記載した特別な教示と
を鑑みれば、当業者であれば本明細書に記載に従い本発
明を実施して１種以上の核酸を増幅することは容易であ
る。

【００１８】本発明の実施に採用することができる他の
増幅方法として、例えば欧州特許出願公開第３２０３０
８号公報（１９８７年１２月公開）及び同第４３９１８
２号公報（１９９０年１月公開）に記載のリガーゼ連鎖
反応、例えばＢｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒらのＪ．Ｖｉｒｏ
ｌ．Ｍｅｔｈ．３５，ｐｐ．１１７−１２６（１９９
１）に記載の自己支持配列複製(self-sustained sequen
ce replication) 、「Ｇａｐ−ＬＣＲ」及びその変型並
びに当業者には明白であろう他の方法が挙げられる。本
明細書の残部はＰＣＲを採用して本発明を実施すること
に関するが、分子生物学における当業者であれば他の有
用な増幅技法へ本明細書の教示をどのように適用できる
かについては容易に想到できる。

【００１９】本発明は、被検体中の１種以上の標的核酸
中に存在する１種以上の特異的な核酸配列を増幅又は検
出することに関する。被検体は、細胞、ウイルス、毛
髪、体液又は検出可能な遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡを含有
する他の材料であることができる。検出の主な目的は診
断用とすることができるが、本発明を利用して、ＤＮＡ
やメッセンジャーＲＮＡのクローニング効率を改善する
こと、或いは化学合成から得られる核酸混合物から所望
の配列を大量に獲得することも可能である。

【００２０】増幅される核酸は、プラスミドや、（細
菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物又はヒトなどの）
何らかのソースから得られる天然ＤＮＡ又はＲＮＡをは
じめとする様々なソースから得ることができる。それ
は、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、当該技術分
野で知られている他の組織材料又は他のソースをはじめ
とする様々な組織から周知の方法で抽出されることがで
きる。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、菌類ＤＮ
Ａ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌若しくはウイルスに感染
された細胞中のＤＮＡ若しくはＲＮＡに存在する核酸配
列の増幅及び検出に特に有用である。さらに、本発明を
利用して、癌に係わる核酸を増幅及び検出することも可
能である。

【００２１】検出可能な細菌には、ヒトの血液中にある
細菌、サルモネラ種、クラミジア種、淋菌種、シゲラ種
及びマイコバクテリウム種が含まれるが、これらに限定
はされない。検出可能なウイルスには、単純ヘルペスウ
イルス、エプスタインバールウイルス、ヒトサイトメガ
ロウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス並
びにＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−Ｉ及びＨ
ＩＶ−ＩＩのようなレトロウイルスが含まれるが、これ
らに限定はされない。原生動物の寄生虫、酵母及びカビ
もまた検出可能である。当業者であればその他の検出可
能な種は明らかである。

【００２２】「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必要と考え
られるすべての試薬、すなわち、各標的核酸の対向鎖に
対する一組のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、Ｄ
ＮＡポリメラーゼコファクターと、２種以上のデオキシ
リボヌクレオシド−５’−三リン酸とを意味する。「プ
ライマー」とは、核酸鎖（すなわち、鋳型）に相補的な
プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置か
れた場合にその合成開始点として作用しうる、天然の又
は合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。このよう
な条件には、他のＰＣＲ試薬の存在並びに好適な温度及
びｐＨが含まれる。

【００２３】プライマーは、増幅効率を最大限に引き出
すためには一本鎖であることが好ましいが、所望であれ
ば二本鎖であってもよい。プライマーは、ＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下で伸長生成物の合成を引き起こすに十分
な長さを有する必要がある。各プライマーの正確なサイ
ズは、使用法、標的配列の複雑さ、反応温度及びプライ
マーの出所によって変わる。一般に、本発明において用
いられるプライマーは、ヌクレオチドを１０〜６０個、
好ましくは１８〜４５個有する。

【００２４】本発明において用いられるプライマーは、
増幅すべき特異的配列の個別の鎖に対して「実質的に相
補的」であるように選ばれる。このことは、プライマー
がそれぞれの鎖にハイブリダイズするに十分な相補性を
示し、所望のハイブリダイズされた生成物を形成した後
にＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能でなければなら
ないことを意味する。プライマーが標的核酸に対して厳
密に相補的である状況が好ましく且つ最も実用的であ
る。

【００２５】本発明において有用なプライマーは、多数
の出所から入手すること、或いは、例えば、ＡＢＩＤ
ＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍより
入手可能）又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ８６００シリーズ
若しくは８８００シリーズの合成機（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ
−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社より入手可能）をはじめとする
周知の技法及び装置並びにそれらの使用方法（例えば、
上記の米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記
載されている）を利用して合成することができる。ま
た、生物学的ソースから単離された天然のプライマー
（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）も有用であ
る。本明細書で用いる「プライマー」には、プライマー
の混合物も含まれる。

【００２６】ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型
の複合体におけるプライマーの３’−ヒドロキシ末端に
デオキシヌクレオシド一リン酸を付加する酵素である
が、この付加は鋳型依存性（すなわち、鋳型における特
異的ヌクレオチドに依存する）である。有用なＤＮＡポ
リメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼ、逆転写酵素、その他当該技術分野で知られている
ものが含まれる。

【００２７】ＤＮＡポリメラーゼは、「耐熱性」である
ことが好ましい。耐熱性とは、高温、特にＤＮＡ鎖の変
性に用いられる高温において一般に安定であり且つ優先
的に活性であることを意味する。より詳細には、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いられる高温におい
て実質的には不活性化されない。このような温度は、ｐ
Ｈ、塩濃度、その他当該技術分野で知られている条件を
はじめとする幾つかの反応条件によって変わる。

【００２８】当該技術分野では幾つかの耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼが報告されており、米国特許出願第４，９６
５，１８８号明細書（上記）及び同第４，８８９，８１
８号明細書（Ｇｅｌｆａｎｄら、１９８９年１２月２６
日発行）に詳細に記載されているものが含まれるが、本
明細書ではこれらを参照することにより取り入れること
とする。特に有用なポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ細
菌種から得られるものである。好ましい耐熱性酵素は、
Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕ
ｓ又はＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから
得られるＤＮＡポリメラーゼである。他の有用な耐熱性
ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｅ
ｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕ
ｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｓｐ．及び国際特許出願公
開ＷＯ−Ａ−８９／０６６９１号公報（１９８９年７月
２７日公開）に記載されているものをはじめとする他の
様々な微生物源から得られる。有用な酵素の中には市販
されているものもある。生物から天然のポリメラーゼを
単離するための技法がいくつか知られており、また組換
え技術によるポリメラーゼを調製するためのクローニン
グ法やその他の合成法も、先に引用した技術文献から知
られている。

【００２９】ＤＮＡポリメラーゼコファクターとは、酵
素活性に影響を与える非タンパク質化合物をさす。当該
技術分野ではこのような物質がいくつか知られており、
水性反応混合物中に２価のマンガン又はマグネシウムイ
オンを放出するマンガン又はマグネシウム化合物が含ま
れる。有用なコファクターとして、マンガン及びマグネ
シウムの塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪
酸塩が含まれるが、これらに限定はされない。塩化物、
硫酸塩及び酢酸塩といった小さな塩が好ましい。最も好
ましい塩は塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウムであ
る。

【００３０】ＰＣＲにはまた、２種以上のデオキシリボ
ヌクレオシド−５’−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰのうちの２種
以上が必要である。ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰの
ようなアナログも有用である。ＰＣＲにおいて、通常の
４種類の三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び
ｄＴＴＰ）を一緒に使用することが好ましい。本明細書
に記載したＰＣＲ試薬は、ＰＣＲにおいて標的核酸を増
幅するのに適した濃度で提供され且つ用いられる。

【００３１】ＤＮＡポリメラーゼの最少量は、溶液１０
０μｌ当たり、一般に約０．５単位以上、好ましくは約
２〜約２５単位、より好ましくは約７〜約２０単位であ
る。特定の増幅系にはこれ以外の量が有用なこともあ
る。ここで、「単位」とは、７４℃において伸長してい
る核酸中へ３０分間で１０ナノモルの全ヌクレオシド
（ｄＮＴＰ）を取り込ませるに必要な酵素活性量として
定義される。各プライマーの濃度は約０．０１μモル以
上であり、中でも約０．２〜約１μモルが好ましい。特
定の増幅系ではこれ以外の量が有用なこともある。複数
種のプライマーは、同じ量で存在しても異なる量で存在
してもよい。

【００３２】反応混合物中、ＤＮＡポリメラーゼコファ
クターは一般に約０．５〜約２０ミリモルの量で存在
し、また各ｄＮＴＰは一般に約０．１〜約２ミリモルの
量で存在する。特定の増幅系では、これ以外の量のコフ
ァクターやｄＮＴＰが有用なこともある。

【００３３】ＰＣＲ試薬は、個別に供給すること、又は
適当な何らかの緩衝液を用いてｐＨを約７〜約９にした
緩衝化溶液において各種の組合せで若しくは全部一緒に
して供給することができ、このことについては当該技術
分野では大方知られている。増幅に用いられる反応混合
物も一般には同様に緩衝化されるが、特定の増幅系では
これ以外のｐＨ値を採用することもある。

【００３４】上記のように、標的核酸は様々な出所源か
ら得られる。一般に、標的核酸は、プライマー、その他
の反応物質との接触に利用できるように抽出されなけれ
ばならない。このことは、通常、望ましくないタンパク
質や細胞物質を被検体から適当な方法で除去することを
意味する。当該技術分野では、ＬａｕｒｅらのＴｈｅＬ
ａｎｃｅｔ，ｐｐ．５３８−５４０（１９８８年９月３
日）、ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）、Ｇｒｏｓｓ−
ＢｅｌｌａｎｄらのＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３
６，３２（１９７３）及び米国特許出願第４，９６５，
１８８号明細書（上記）に記載されているものをはじめ
とする様々な方法が知られている。全血又はその成分か
らＤＮＡを抽出する方法については、例えば、欧州特許
出願公開第３９３７４４号公報（１９９０年１０月２４
日公開）、ＢｅｌｌらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８（９），ｐｐ．５７５９−５
７６３（１９８１）、ＳａｉｋｉらのＢｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，３，ｐｐ．１００８−１０１２（１９８
５）及び米国特許出願第５，２３１，０１５号明細書
（Ｃｕｍｍｉｎｓら）に記載されている。

【００３５】通常、増幅や検出されるべき標的核酸は二
本鎖形にあるため、この二本鎖が分離（すなわち、変
性）されなければプライミングは起こらない。プライミ
ングは、抽出工程中に行うことも、またその後の別工程
とすることもできる。好ましい変性手段は、好適な温度
（本明細書では「第一温度」と称する）へ加熱すること
である。一般に、この第一温度は約８５℃〜約１００℃
の範囲にあり、この温度で最長で数分間、一般には、例
えば約１〜約４０秒の処理を行う。

【００３６】次いで、変性された鎖を、適当な組合せの
プライマーを用いて、その反応混合物を一般に約５５〜
約７５℃の範囲にある第二温度へ冷却することによりプ
ライムする。冷却は、最長で数分間までの適当な時間で
行うが、一般には６０秒以内、より好ましくは約５〜約
２５秒間行う。

【００３７】変性された鎖を冷却したら、ＰＣＲ試薬を
含有する反応混合物を第三温度において最長で数分間イ
ンキュベートする。より一般的には、インキュベーショ
ンを１〜約８０秒間、好ましくは１〜約４０秒間行い、
プライマー伸長生成物を形成させる。一般に、この第三
温度は約５５〜約７５℃の範囲にあり、好ましくは約６
２〜約６８℃の範囲にある。

【００３８】最も好ましい実施態様では、第二温度と第
三温度を同じにし、約６２〜約６８℃の範囲とする。こ
うして、プライミングとプライマー伸長を、同じ温度に
おいて、最長で数分までの適当な時間で実施することが
できる。この時間は約５〜約１２０秒が好ましく、中で
も約１０〜約９０秒がより好ましい。プライマー伸長生
成物の形成後、反応混合物を最長で数分間の適当な時間
をかけて加熱し、プライマー伸長生成物を変性させる。
一般には、反応混合物を約５〜約２０秒間加熱し、そし
てその温度で約１〜約８０秒間維持して生成物を変性さ
せる。これで一つの増幅サイクルが完成する。

【００３９】一般に、ＰＣＲは２０サイクル以上、好ま
しくは２０〜５０サイクル行われる。各サイクルは、一
般に約２０〜約３６０秒のサイクル時間であるが、中で
も約３０〜約１２０秒が好ましく、さらに約３０〜約９
０秒がより好ましい。特定の増幅系ではさらに長いサイ
クル時間が有用な場合もある。

【００４０】増幅系及び増幅法を不連続様式で実施する
こと、すなわち、サイクルの時間が異なる様式や、試薬
の添加、試料の採取のために中断する様式などを採用す
ることはできるが、本発明の方法は、所望の回数につい
て制御された様式で反応混合物の温度を周期変動させる
ように自動化された連続様式で実施することが好まし
い。このために開発された装置がいくつかあり、当業者
であれば周知である。

【００４１】この目的のための装置の一つが、米国特許
出願第４，９６５，１８８号明細書及び欧州特許出願公
開第２３６，０６９号公報にかなり詳しく記載されてい
る。一般に、この装置は、反応混合物を含有する複数の
反応管を保持するための熱伝導性容器と、加熱手段と、
冷却手段と、温度維持手段と、増幅配列、温度及びタイ
ミングの変化を制御するための信号を発生する計算手段
とを含む。

【００４２】欧州特許出願公開第４０２，９９４号公報
は、米国特許出願第５，０８９，２３３号明細書（上
記）に記載された装置を用いて処理することができる有
用な化学試験パックについて詳細に記載している。その
中には、本発明の方法に適した反復インターバルで（す
なわち、サイクルにより）試験パックを加熱／冷却する
ための手段についても記載されている。有用なＰＣＲ処
理装置に関するさらなる詳細は、当該技術分野の重要な
文献から入手することができ、当業者であれば容易に確
認することができる。

【００４３】上記の化学試験パックの他、本発明の方法
は、米国特許出願第４，９０２，６２４号明細書（Ｃｏ
ｌｕｍｂｕｓら）や同第４，６８３，１９５号明細書
（上記）に記載されているような他の容器、及び当業者
であれば明白なその他の適当な容器においても実施する
ことができる。本発明の主な利点は、増幅及び検出を密
閉容器内で実施することにより汚染を排除できる点にあ
る。このため、この目的で設計された密閉容器は本発明
の均質系による方法を実施するのに適している。検出
は、蛍光色素からの発光を測定することにより行われる
ので、容器はこのような測定を可能にするようなもので
なければならない。こうして、容器は、ガラス製である
か、当業者であれば容易に想到する透過性ポリマー製で
あることができる。

【００４４】上記のように、本明細書に記載した蛍光色
素を増幅工程中又は増幅工程後の任意の時点で使用し
て、標的核酸を検出することができる。この色素は、増
幅の進行を終始監視できるように、方法の始めから存在
させることが好ましい。特定の蛍光色素は、二本鎖標的
核酸に結合した場合に、その色素が標的核酸の一本鎖に
結合されているときに発生する信号と比較して検出可能
な信号を示す。別様式では、二本鎖標的核酸に結合した
蛍光色素からの信号は、その色素が遊離形（すなわち、
一本鎖核酸にも二本鎖核酸にも結合されていない形態）
にある場合に提供される信号と比較することができる。
本明細書でいう「検出可能な信号」とは、例えば、発光
強度が増大又は低下する変化、励起波長はシフトしない
が発光極大波長が（どちらかの方向に）５ｎｍ以上シフ
トする変化、発光波長はシフトしないが励起極大波長が
（どちらかの方向に）シフトする変化、励起極大波長と
発光極大波長の両方がシフトする変化、又はこれら効果
のいずれかの組合せ、のような検出可能な何らかの信号
変化を意味する。この検出可能な信号は、発光強度の増
大によって明らかになることが好ましい。

【００４５】検出可能な信号は、特定の蛍光色素の特定
の励起波長及び発光波長に適した何らかの蛍光分光光度
計を用いて監視又は検出される。検出可能な信号は、増
幅工程中の任意の時点において、すなわち任意の増幅サ
イクル後に、又は最後の増幅サイクル後に、監視するこ
とができる。前者の場合には、少なくともいくつかのサ
イクルにおいて、増幅を蛍光色素の存在下で実際に行
う。

【００４６】本発明において有用な蛍光色素は、一般
に、結合定数（Ｋ_b）が約１×１０⁴〜約５×１０
⁵（モル^-1）である非対称シアニン系色素として定義さ
れる。Ｋ_bを定義するために用いられている「約」と
は、１０％の変動を意味する。また、蛍光色素は、水性
反応混合物中の核酸と結合できるように水溶性又は水分
散性でもある。用いられる陰イオンによって、蛍光色素
は水混和性溶剤に溶解させることができる。

【００４７】その上、本発明に有用な蛍光色素は、変数
「ＫＣ」によってさらに定義される。このＫＣは、下
式：ＫＣ＝Ｋ_p×色素濃度（Ｃ）×２を用いて計算される。ここで、Ｋ_pは分配係数である。
有用な蛍光色素は、約２０以下の「ＫＣ」値を示す。こ
こで、「約」とは１０％の変動を意味する。有用ないく
つかの色素、及び本発明の範囲外にあるいくつかの色素
についてのＫＣ値を、以下の実施例３に記載する。より
詳細には、有用な蛍光色素は以下の構造式（Ｉ）で定義
される。

【００４８】

【化１１】

【００４９】上式中、Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｅ−、
＝ＣＨ−又は−ＮＲ¹−であるが、好ましくは−Ｓ−又
は−Ｏ−である。また、上記構造式（Ｉ）において、Ｙ
は−ＣＨ＝ＣＨ−である。Ｒは炭素原子数１〜６の置換
又は未置換アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、
イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル及びヘキ
シル）である。好ましくは、Ｒは炭素原子数１〜３の置
換又は未置換アルキルであり、より好ましくは、Ｒはメ
チル又はエチルであり、最も好ましくは、Ｒはメチルで
ある。Ｒ¹は、水素又は先にＲについて定義した炭素原
子数１〜６の置換又は未置換アルキルであることができ
る。より好ましくは、Ｒ¹は水素又は先に定義した炭素
原子数１〜３の置換又は未置換アルキルであり、最も好
ましくは、Ｒ¹は水素である。

【００５０】Ｒ²及びＲ⁶は、各々独立に、炭素原子数
１〜１０の置換又は未置換アルキレン（例、メチレン、
エチレン、トリメチレン、イソプロピレン、ｎ−ヘキシ
レン、ｎ−ペンチレン、ｎ−ヘキシレン、ｎ−オクチレ
ン及びｎ−デシレン）である。好ましくは、Ｒ²及びＲ
⁶は、各々独立に、炭素原子数１〜４の置換又は未置換
アルキレンであり、中でもトリメチレンが最も好まし
い。Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立に、炭素原子数１
〜６の置換又は未置換アルキル（例、先にＲ及びＲ¹に
ついて定義したもの）である。好ましくは、これらの基
は、各々独立に、炭素原子数１〜３の置換又は未置換ア
ルキルであり、また各々がメチルであることが最も好ま
しい。

【００５１】Ｚ¹は、５員又は６員の複素環式環、例え
ば、ベンゾオキサゾリウム、ベンゾチアゾリウム、ベン
ゾイミダゾリウム、キノリノ〔２，３−ｄ〕チアゾリウ
ム、ナフト〔２，３−ｄ〕チアゾリウム、ナフト〔１，
２−ｄ〕チアゾリウム、ベンゾセレナゾリウム、ピリジ
ニウム及びキノリニウム、を完成するのに必要な炭素原
子と異種原子を含む。Ｚ¹により形成された複素環式環
には、さらに５員又は６員の芳香族縮合環（炭素環式又
は複素環式）が最大で３個まで結合されていてもよい。
当業者には、他の環構造についても明白であろう。ベン
ゾオキサゾリウム環、ベンゾチアゾリウム環及びベンゾ
イミダゾリウム環が好ましく、中でも最初の２種の環が
より好ましい。これらの環は、その様々な位置におい
て、低級アルキル（炭素原子数１〜３個）又は当業者に
は明白な別の何らかの置換基で置換されていてもよい
が、但し、このような置換基が、本発明にとって重要な
蛍光色素と核酸の結合特性に悪影響を及ぼしたり、水溶
液系での化合物の拡散性を望ましくないほど低下させる
ことがあってはならない。

【００５２】構造式（Ｉ）中、Ｚ²は、示されている複
素環式環に結合されている５員又は６員の芳香族環を完
成するのに必要な炭素原子と異種原子を含む。Ｚ²に
は、さらに芳香族縮合環（炭素環式又は複素環式）が最
大で２個まで結合されていてもよい。完成した環がベン
ゾ環又はナフト環であることが好ましいが、中でもキノ
リン環をもたらすベンゾ環であることがより好ましい。

【００５３】また、構造式（Ｉ）中、ｎは０、１又は
２、好ましくは０又は１である。さらに、ｍ、ｐ及びｑ
は、各々独立に、０又は１であるが、但しｐとｑは同じ
ではない。ｐとｑの少なくとも一方が１であることが好
ましく、またｐが０で且つｑが１であることが最も好ま
しい。また、ｔは０、１又は２であり、好ましくは０で
ある。

【００５４】Ｑは、適当な電荷を有する適当な酸アニオ
ンである。このようなアニオンには、塩化物、臭化物、
ｐ−トルエンスルホネート、メトスルフェート、スルフ
ェート、ニトレート及び当業者には明白なその他、が含
まれる。上記構造式中、ｒは１又は２である。

【００５５】特に有用な蛍光色素は、以下の表１に記載
した商品名とＫ_p値を有する、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ社から市販されているものである。しかしな
がら、本発明は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社
の色素に特に限定されるものではなく、これらは単に好
ましい色素である。これらの好ましい色素のカチオン
を、以下の化学構造式に例示する。これらの化合物は、
適当な任意の２価アニオン又は２個の１価アニオンを含
むことができる。ヨウ化物が好ましい。

【００５６】

【化１２】

【００５７】

【化１３】

【００５８】

【表１】

【００５９】表中のＫ_b値は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ社のカタログ第２２４頁に報告されている分
配係数（Ｋ_p）を水のモル濃度５５で割って算出された
値である。

【００６０】本発明を実施する際の蛍光色素の使用量
は、結合定数や発光強度が異なるので色素の種類によっ
て変わるし、また存在が疑わしい標的核酸の量によって
も変わる。しかしながら、一般には、その使用量は約１
０^-9モル以上、好ましくは約１０^-8〜約１０^-5モルであ
る。実用上の上限は約１０^-5モルであるが、本発明はこ
れらの値に限定されるものではない。ここでいう「約」
とは、１０％の変動を意味する。これらの色素は、ジメ
チルスルホキシドといった水混和性の有機溶剤を少量含
有する水溶液として供給されてもよい。

【００６１】蛍光色素と増幅された標的核酸との接触
は、適当ないずれの温度で行ってもよいが、好ましくは
室温で行われる。色素と核酸の間の反応は、完了まで数
分から最長で数時間かかることがあるが、特定のアッセ
イではこれより短時間又は長時間が有用なこともある。

【００６２】以下の実施例は、本発明の実施を説明する
ためのものであり、本発明を限定するものではない。特
に断らない限り、パーセントはすべて重量基準とした。

【００６３】

【実施例】実施例についての材料および方法実施例１および２で用いたプライマーは、ＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡのｇａｇ領域に相補的である以下の配列を有する
ものとした。配列番号：１：５′-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-３′ 配列番号：２：５′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-３′ 実施例３で用いたプライマーは、ＨＩＶ−ＩＤＮＡの
ｇａｇ領域に相補的である以下の配列を有するものとし
た。配列番号：３：５′-X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-３′ 配列番号：４：５′-X-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-３′

【００６４】前記プライマー中、Ｘは、米国特許第 4,9
62,029号明細書（Levenson他）に記載された技法を用い
て、２つのアミノテトラエチレングリコール・スペーサ
ー基を介してオリゴヌクレオチドに付加されたビオチニ
ル部分を表す。実施例１および２、ならびに実施例３の
アッセイで用いた捕捉プローブは、それぞれ以下の配列
を有するものとした。配列番号：５：５′-X-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C- ３′ 配列番号：６：５′-X-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-３′

【００６５】これらのプローブを、従来の乳化重合法を
用いてポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジル
チオ）プロピオン酸〕（95:5重量パーセント，平均直径
１μｍ）から調製したポリマー粒子（平均直径１μｍ）
に共有結合させた。粒子を水に懸濁させた懸濁液を、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ 0.1モ
ル，pH６）で洗浄し、そして固形分が約10％となるよう
に懸濁させた。洗浄した粒子の試料（ 3.3mL）を希釈し
て、緩衝液中固形分が3.33％（ 0.1モル）となるように
し、それを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミド塩酸塩（2.1mL, 84mg/mL, 水で調
製）およびプローブ（ 983μＬ， 44.44OD/mL,ナノ純水
で調製）と混合させた。得られた懸濁液を水浴中50℃で
約２時間断続的に混合しながら加熱し、そして遠心分離
した。次いで、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリ
ウム塩（0.0001モル）を含むトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝液（0.01モル，pH８）で粒子を３
回洗浄し、そしてそれに再懸濁して固形分４％となるよ
うにした。粒子上のプローブの最終飽和状態は、約75％
であった。

【００６６】固形分２％に希釈して、捕捉試薬を、緩衝
液中、ポリ〔メチルアクリレート−コ−２−アクリルア
ミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−
２−アセトアセトキシエチルメタクリレート〕（90:4:6
重量パーセント）から生成したポリマー接着剤（ 0.2
％）と混合し、そして実施例２に記載したパウチに付着
させた。サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticu
s ）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、従来の方法を
用いて入手した。10％ジメチルスルホキシド中のＹＯ−
ＰＲＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−
ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯＴＯ−１およびＴ
ＯＴＯ−３蛍光色素は、Molecular Probes, Inc.より入
手した。

【００６７】グリセロールおよびトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン緩衝液は、Sigma Chemicalより入手
した。ＨＩＶ−Ｉ標的ＤＮＡは、Bernie Poiesz of Syr
acuse Universityより入手したHUT78/HIV AAV 細胞から
得た。各細胞は、ほぼ１つのＨＩＶ−Ｉコピーを有する
ものであった。ポリビニルピロリドン（ 112ミリモル）
およびリン酸ナトリウム，一塩基，一水和物（10ミリモ
ル）を含むものであった。

【００６８】実施例２で用いたコンジュゲート溶液は、
市販のストレプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシ
ダーゼのコンジュゲート（Zymed Laboratories, Inc.,
酵素対ストレプトアビジン比２：１）（ 126μL/L ，
総タンパク質1.25ｇ）、カゼイン（ 0.5％）およびメル
チオレート（ 0.5％）を３−（４−モルホリノ）プロパ
ンスルホン酸緩衝液（ 0.1モル）に含むものであった。
実施例２で用いた洗浄溶液は、塩化ナトリウム（ 373ミ
リモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム
塩（ 2.5ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（38ミリモ
ル）、およびエチル水銀チオサリチル酸，ナトリウム塩
（25マイクロモル）を、リン酸ナトリウム，一塩基，一
水和物緩衝液（25ミリモル，pH7.4 ）に含むものであっ
た。残りの試薬および材料は、市販のものを使用した
か、または従来の方法を用いてEastman Kodak Company
で調製した。

【００６９】実施例１：増幅したＨＩＶ−ＩＤＮＡの
検出本例は、ＰＣＲにより増幅したＨＩＶ−ＩＤＮＡを検
出するという本発明を具体的に示すものである。最終Ｐ
ＣＲ反応混合物は、配列番号：１および配列番号：２の
プライマー（各々 0.4マイクロモル）、塩化マグネシウ
ム（10ミリモル）、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＴＰ，ｄＧＴＰお
よびｄＴＴＰすべて（各々 1.5ミリモル）、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（10ミリモル，pH
８）、エチレンジアミン四酢酸（0.1ミリモル）、塩化
カリウム（50ミリモル）、ＤＮＡポリメラーゼ（ 160単
位／mL）ならびにKodak 超高純度ヒトＤＮＡ（Kodak Ul
trapure Human DNA ）（0.22μg/μL ）、グリセロール
（ 7.5％）を含むものであった。

【００７０】ＹＯ−ＰＲＯ−１色素（10マイクロモル）
（前記化合物Ｅ）は、ジメチルスルホキシド（１ミリモ
ル）への保存溶液から、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸塩（10ミリモル）およびエチレンジアミ
ン四酢酸（１ミリモル）緩衝溶液で希釈することにより
調製した。緩衝溶液を反応混合物に添加して、色素濃度
を１マイクロモルにした。標的ＨＩＶ−ＩＤＮＡ（10
コピー／μＬ）の試料（ 200μＬ）のＰＣＲによる増幅
は、Ericomp サーマル・サイクラーおよび以下のＰＣＲ
プロトコールを用いてミクロ試験管（ 0.5mL）で実施し
た。ＰＣＲプロトコール：１）95℃で15秒間予備加熱して変性させる。２）各サイクルは、63.5℃で40秒間プライミングおよび
伸長させ、そして95℃で15秒間変性させる。３）95℃で60秒間最終変性を行う。

【００７１】ＤＮＡポリメラーゼを除くすべての試薬
を、前記緩衝溶液と混合させた。得られた混合物を２つ
のミクロ試験管に等分した（1672μＬ／試験管）。緩衝
溶液（220μＬ）を一方の試験管に添加した（試料Ａ）
（これは、蛍光色素を含まないものであった）。ＹＯ−
ＰＲＯ−１色素保存溶液（ 220μＬ）を第２の試験管に
添加した（試料Ｂ）。次いで、ＤＮＡポリメラーゼ（88
μＬ）および標的核酸（220μＬ）を各試料に添加し
た。各試料の内容物を各々 200μＬずつの10のアリコー
トに分割し、別々のミクロ試験管に入れ、そして前記の
ようなＰＣＲにかけた。各々０、５、10、15、20、25、
30、40および45サイクル行った後に、試験管を開けた。
次いでその試験管の内容物を希釈して（反応混合物 100
μＬと濃度１マイクロモルの色素溶液3900μＬとを蛍光
計のキュベットに入れて最終流体容量４mLとした）、そ
の蛍光を市販のPerkin-Elmer LS-5B分光蛍光計（ 491nm
で励起、 509nmで発光）で測定した。

【００７２】これらの測定結果を、蛍光強度対ＰＣＲサ
イクル数のプロットである図面に示す。曲線１は、開始
時には色素を全く存在させなかったが、所定のＰＣＲサ
イクル数後に試料を取り出したときに色素を添加した、
試料Ａについての結果を表すものである。曲線２は、増
幅工程全体を通して色素を存在させた、試料Ｂについて
の結果を表すものである。ＹＯ−ＰＲＯ−１色素は、増
幅工程全体を通して存在させた場合でも、ＰＣＲに悪影
響を及ぼさなかったことが認められる。バックグラウン
ドの蛍光は、30回目のＰＣＲサイクルまでは、約７〜９
蛍光単位のレベルでほぼ一定であったが、その後蛍光が
増加し始め、45回目のＰＣＲサイクルで約20蛍光単位に
到達した。これは、最初のバックグラウンド信号とは明
らかに区別される。

【００７３】実施例２：比較例本発明の方法を、前記緩衝溶液中でＹＯＹＯ−１（最終
濃度１マイクロモル）および４価の蛍光色素を用いて実
施した、本発明の範囲外の増幅および検出方法と比較し
た。この色素は以下の構造を有する。

【００７４】

【化１４】

【００７５】自蔵式化学パウチ、例えば、米国特許第
5,229,297号明細書（Schnipelsky 他）に記載されてい
るものを用いて増幅を実施した。これらのパウチには、
配列番号：５の捕捉プローブを付着させた粒子を、反応
が起こる検出チャネルに固定化した。以下のように、パ
ウチに試薬を充填した。実施例１のＰＣＲ反応混合物
（ＤＮＡポリメラーゼを除く）を容量5472μＬほど調製
した。得られた混合物を、それぞれ試料Ａ、ＢおよびＣ
を代表する試験管Ａ、ＢおよびＣに等分した（各々1824
μＬ）。試験管Ａ中の試料を緩衝液（ 220μＬ）で希釈
し、そしていかなる蛍光色素も存在させることなく増幅
させた。得られた生成物を定量的に検出するために、増
幅の最後に色素を添加した。

【００７６】ＰＣＲ試薬に加えて、試験管Ｂ中の試料に
は、ＹＯＹＯ−１蛍光色素（ 0.1マイクロモル）を増幅
の前に添加して（10マイクロモル溶液を 220μＬ）含ま
せた。また、試験管Ｃ中の試料には、ＹＯ−ＰＲＯ−１
蛍光色素（ 0.1マイクロモル）を増幅の前に添加して
（10マイクロモル溶液を 220μＬ）含ませた。次いで、
ＤＮＡポリメラーゼ（88μＬ）および標的ＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡ標的核酸（ 220μＬ）を各試験管に添加し、そし
て３つの試験管の各々の内容物を用いて、８つのパウチ
のＰＣＲ試薬室を満たした。実施例１と同じ方法を用い
て、増幅を実施した。ＰＣＲプロトコールは、以下のサ
ーマル・サイクラーを用いて40サイクルを同様に実施し
た。１）95℃で60秒間予備加熱して変性させる。２）各サイクルは、63.5℃で40秒間プライミングおよび
伸長させ、そして95℃で10秒間変性させる。３）95℃で60秒間最終変性を行う。

【００７７】増幅の結果を、３種の方法：（１）０（信
号なし）から10（最高信号濃度）までのカラー色素スコ
アを目視的に評価すること、（２）エチジウムブロミド
染色電気泳動ゲル、および（３）市販のPerkin Elmer蛍
光計での蛍光の測定、により検出した。パウチに固定化
された捕捉プローブを用いて、５分間42℃でインキュベ
ーションする間に増幅した標的をハイブリダイズして、
前記色スコアを得た。固定化標的をコンジュゲート溶液
（前記）と１分間30℃で接触させ、続いて洗浄溶液と１
分間55℃で接触させた。次いで、ロイコ色素溶液を30℃
で添加し、そして２分間30℃でインキュベーションした
後、得られた色シグナルを観察した。

【００７８】電気泳動は、市販のNuSieve 1.5 ％／Seak
em Agarose１％ゲル（ 2.5％アガロースに改質）および
エチジウムブロミド染料を用いて実施した。試料を、従
来のＴＢＥ緩衝液（４μＬ／ 100μＬ）中のゲルに塗布
した。各試料（Ａ、ＢおよびＣ）の三重反復アッセイ
を、各検出手段を用いて実施した。各検出手段について
の平均結果は以下の通りであった。

【００７９】

【表２】

【００８０】これらの結果は、試料ＣではＹＯ−ＰＲＯ
−１色素の存在により増幅が悪影響を受けなかったこと
を示している。しかしながら、試料ＢではＹＯＹＯ−１
色素の存在が増幅を阻害した。試料Ａは陽性対照として
用いた。

【００８１】

【表３】

【００８２】これらの結果は、前記色スコアと一致す
る。また、試料Ａは陽性対照として用いた。試料Ｂで用
いたＹＯＹＯ−１色素は増幅を停止させるが、一方試料
Ｃで用いたＹＯ−ＰＲＯ−１色素は増幅を促進させた。両方の色素について以下の波長：励起： 491nm 発光： 509nm で、Perkin-Elmer LS-5B蛍光計を用いて蛍光信号を発生
させた。各増幅生成物の混合物を、各色素溶液へ添加し
て 100×に希釈した（最終濃度１μモル）。増幅試薬混
合物および各色素の混合物より、バックグラウンド信号
が得られた。これらの結果を以下に示す。

【００８３】

【表４】

【００８４】 ★ 増幅の後にＹＯ−ＰＲＯ−１を添加した。 ★★ 増幅の後にＹＯＹＯ−１を添加した。これらの結果は、ＹＯＹＯ−１が高い核酸染色性を有す
ると同時に、それが増幅過程を著しく阻害するので増幅
中に使用することができないことを示している。ＹＯ−
ＰＲＯ−１は全体の信号は低いが、増幅中に試薬混合物
の中にそれを含ませることができる。前記増幅プロトコ
ールを、（ａ）サイクルを60回行うこと、（ｂ）各サイ
クルの変性時間を20秒間に延ばすこと、または（ｃ）プ
ライミング／伸長工程を60秒間に延ばすこと、により改
変することにより、別の増幅および検出実験を実施し
た。これらのプロトコールの変更により、（ａ）のみが
ＹＯＹＯ−１の存在下でいずれか測定可能な差異を生じ
させるようであった。その差異は小さく、蛍光で検出可
能であるが、しかしゲル電気泳動もしくは色信号では検
出不可能であった。

【００８５】実施例３：蛍光色素のさらなる比較実施例２の実験と同様な増幅実験を実施して、幾つかの
別の蛍光色素染料の有用性を評価した。これらのアッセ
イでは、前記配列番号：３および配列番号：４のプライ
マーを使用し、そして前記配列番号：６のプローブを使
用した。色スコアを作製して、所定の実験で増幅が起こ
ったことまたは起こらなかったことを確認した。共通な
最低限の信号を提供するように、すべての増幅した試料
をＹＯＹＯ−１の溶液（0.1マイクロモル）と混合した
ことを除いて、実施例２に記載したように蛍光を測定し
た。本発明の実施に際して有用であることが見出された
蛍光色素は、ＹＯ−ＰＲＯ−１（化合物Ｅ）、ＢＯ−Ｐ
ＲＯ−１（化合物Ｃ）、ＴＯ−ＰＲＯ−１（化合物Ｇ）
およびＴＯ−ＰＲＯ−３（化合物Ｈ）であった。概ねＰ
ＣＲを阻害したために有用ではない色素は、ＹＯＹＯ−
１（前記）および以下に示されるものであった。

【００８６】

【化１５】

【００８７】下記第II表に、本例の実験において試験し
た色素についての蛍光信号および「ＫＣ」値を列挙す
る。これらの20以下の「ＫＣ」値を有する色素が、受け
入れられる蛍光信号を提供したことは明らかである。

【００８８】

【表５】

【００８９】★ ＴＯＴＯ−３はある実験で高い蛍光信
号を提供したが、反復可能な結果を得ることは難しく、
一方、別の色素由来の結果は反復可能であった。従っ
て、ＴＯＴＯ−３についての前記値の信頼性は低い。本
発明をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載して
きたが、変更および修正が本発明の精神および範囲内で
可能であることは理解されるであろう。

【００９０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド（HIV-
I DNA のプライマー）ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28

【００９１】配列番号：２配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド（HIV-
I DNA のプライマー）ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28

【００９２】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド（HIV-
I DNA のプライマー）ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA 28

【００９３】配列番号：４配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド（HIV-
I DNA のプライマー）ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC 30

【００９４】配列番号：５配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド（HIV-
I DNA のプローブ）ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41

【００９５】配列番号：６配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド（HIV-
I DNA のプローブ）ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT 28

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＰＣＲサイクル数に対して蛍光強度を
プロットしたグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｚ 9280−4ＨＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 21/64 Ｚ 21/78 Ｃ 33/58 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】均質系による二本鎖標的核酸の検出方法
であって、Ａ）二本鎖標的核酸を増幅する工程、Ｂ）得られた増幅二本鎖標的核酸と、前記二本鎖標的核
酸に結合した場合に前記二本鎖標的核酸の一本鎖に結合
されているときに発生する信号又は遊離形における信号
と比較して検出可能な信号を示す蛍光色素とを、接触さ
せる工程、並びにＣ）前記検出可能な信号を、前記二本鎖標的核酸の存在
又は量を示す測定値として検出又は監視する工程を含
み、前記蛍光色素は、二本鎖核酸との結合定数（Ｋ_b）が約
１×１０⁴〜約５×１０⁵モル^-1である非対称シアニン
系色素であって、以下の構造式（Ｉ）：【化１】（上式中、Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｅ−、＝ＣＨ−又
は−ＮＲ¹−であり、Ｙは−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ¹は水素又は炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ²及びＲ⁶は、各々独立に、炭素原子数１〜１０のア
ルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立に、炭素原子数１〜６
のアルキルであり、Ｚ¹は、５員又は６員の複素環式環を完成するのに必要
な炭素原子と異種原子を含み、Ｚ²は、５員又は６員の芳香族環を完成するのに必要な
炭素原子と異種原子を含み、Ｑは酸アニオンであり、ｎは０、１又は２であり、ｍ、ｐ及びｑは、各々独立に、０又は１であるが、但し
ｐとｑは同じではなく、ｒは１又は２であり、そしてｔは０、１又は２である）
で示され、前記検出又は監視は、前記増幅二本鎖標的核酸を捕捉プ
ローブへハイブリダイズすることなく行われる、均質系
による二本鎖標的核酸の検出方法。
【請求項２】Ｘが−Ｓ−又は−Ｏ−であり、Ｒが炭素
原子数１〜３のアルキルであり、Ｒ¹が水素又は炭素原
子数１〜３のアルキルであり、Ｒ²が炭素原子数１〜４
のアルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵が、各々独立
に、炭素原子数１〜３のアルキルであり、Ｚ¹が、ベン
ゾオキサゾリウム環又はベンゾチアゾリウム環を完成す
るのに必要な炭素原子を含み、Ｚ²が、ベンゾ環を完成
するのに必要な炭素原子を含み、ｎが０又は１であり、
ｔが０又は１であり、そしてｐとｑの少なくとも一方は
１であるがその両方が共に１であることはない、請求項
１記載の方法。
【請求項３】Ｒがメチル又はエチルであり、Ｒ²が炭
素原子数３のアルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵の
各々がメチルであり、ｐが０であり、ｑが１であり、そ
してｔが０である、請求項２記載の方法。
【請求項４】前記蛍光色素が以下の化合物Ａ〜Ｈのい
ずれかである、請求項１記載の方法。【化２】【化３】
【請求項５】前記増幅工程（Ａ）をポリメラーゼ連鎖
反応により行う、請求項１記載の方法。
【請求項６】二本鎖標的核酸の増幅を監視する方法で
あって、Ａ）前記二本鎖標的核酸に結合した場合に前記二本鎖標
的核酸の一本鎖に結合されているときに発生する信号又
は遊離形における信号と比較して検出可能な信号を示す
蛍光色素の存在下で、前記二本鎖標的核酸を増幅する工
程、並びにＢ）前記検出可能な信号を、前記二本鎖標的
核酸の存在又は量を示す測定値として前記増幅工程中に
検出又は監視する工程を含み、前記蛍光色素は、二本鎖核酸との結合定数（Ｋ_b）が約
１×１０⁴〜約５×１０⁵モル^-1である非対称シアニン
系色素であって、以下の構造式（Ｉ）：【化４】（上式中、Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｅ−、＝ＣＨ−又
は−ＮＲ¹−であり、Ｙは−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ¹は水素又は炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ²及びＲ⁶は、各々独立に、炭素原子数１〜１０のア
ルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立に、炭素原子数１〜６
のアルキルであり、Ｚ¹は、５員又は６員の複素環式環を完成するのに必要
な炭素原子と異種原子を含み、Ｚ²は、５員又は６員の芳香族環を完成するのに必要な
炭素原子と異種原子を含み、Ｑは酸アニオンであり、ｎは０、１又は２であり、ｍ、ｐ及びｑは、各々独立に、０又は１であるが、但し
ｐとｑは同じではなく、ｒは１又は２であり、そしてｔは０、１又は２である）
で示され、前記検出又は監視は、前記増幅二本鎖標的核酸を捕捉プ
ローブへ結合させることなく行われる、二本鎖標的核酸
の増幅を監視する方法。
【請求項７】Ｘが−Ｓ−又は−Ｏ−であり、Ｒが炭素
原子数１〜３のアルキルであり、Ｒ¹が水素又は炭素原
子数１〜３のアルキルであり、Ｒ²が炭素原子数１〜４
のアルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵が、各々独立
に、炭素原子数１〜３のアルキルであり、Ｚ¹が、ベン
ゾオキサゾリウム環又はベンゾチアゾリウム環を完成す
るのに必要な炭素原子を含み、Ｚ²が、ベンゾ環を完成
するのに必要な炭素原子を含み、ｎが０又は１であり、
ｔが０又は１であり、そしてｐとｑの少なくとも一方は
１であるがその両方が共に１であることはない、請求項
６記載の方法。
【請求項８】Ｒがメチル又はエチルであり、Ｒ²が炭
素原子数３のアルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵の
各々がメチルであり、ｐが０であり、ｑが１であり、そ
してｔが０である、請求項７記載の方法。
【請求項９】前記蛍光色素が以下の化合物Ａ〜Ｈのい
ずれかである、請求項６記載の方法。【化５】【化６】
【請求項１０】前記増幅工程（Ａ）をポリメラーゼ連
鎖反応により行う、請求項１記載の方法。
【請求項１１】前記蛍光色素が約１０^-9モル以上の濃
度で存在する、請求項６記載の方法。
【請求項１２】前記検出可能な信号が発光強度の増加
である、請求項６記載の方法。
【請求項１３】１）二本鎖標的核酸に結合した場合
に、前記二本鎖標的核酸の一本鎖に結合されているとき
に発生する信号又は遊離形における信号と比較して検出
可能な信号を示す蛍光色素であって、二本鎖核酸との結合定数（Ｋ_b）が約１×１０⁴〜約５
×１０⁵モル^-1である非対称シアニン系色素であり、以
下の構造式（Ｉ）：【化７】（上式中、Ｘは−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｅ−、＝ＣＨ−又
は−ＮＲ¹−であり、Ｙは−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ¹は水素又は炭素原子数１〜６のアルキルであり、Ｒ²及びＲ⁶は、各々独立に、炭素原子数１〜１０のア
ルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、各々独立に、炭素原子数１〜６
のアルキルであり、Ｚ¹は、５員又は６員の複素環式環を完成するのに必要
な炭素原子と異種原子を含み、Ｚ²は、５員又は６員の芳香族環を完成するのに必要な
炭素原子と異種原子を含み、Ｑは酸アニオンであり、ｎは０、１又は２であり、ｍ、ｐ及びｑは、各々独立に、０又は１であるが、但し
ｐとｑは同じではなく、ｒは１又は２であり、そしてｔは０、１又は２である）
で示される蛍光色素、並びに２）少なくとも１種の増幅試薬、を同じ又は別個のパッケージに含む二本鎖標的核酸の均
質系による増幅及び検出のための試験キット。
【請求項１４】前記増幅試薬がＰＣＲ試薬であり、且
つ前記ＰＣＲ試薬と前記蛍光色素が同じパッケージに含
まれた、請求項１３記載の試験キット。
【請求項１５】前記ＰＣＲ試薬が、前記標的核酸に対
するプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ
又はＤＮＡポリメラーゼコファクターである、請求項１
４記載の試験キット。
【請求項１６】前記ＰＣＲ試薬のすべてが同じ緩衝化
反応混合物の中にある、請求項１５記載の試験キット。
【請求項１７】前記標的核酸の増幅及び検出を行うた
めの反応容器をさらに含む、請求項１５記載の試験キッ
ト。
【請求項１８】Ｘが−Ｓ−又は−Ｏ−であり、Ｒが炭
素原子数１〜３のアルキルであり、Ｒ¹が水素又は炭素
原子数１〜３のアルキルであり、Ｒ²が炭素原子数１〜
４のアルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵が、各々独
立に、炭素原子数１〜３のアルキルであり、Ｚ¹が、ベ
ンゾオキサゾリウム環又はベンゾチアゾリウム環を完成
するのに必要な炭素原子を含み、Ｚ²が、ベンゾ環を完
成するのに必要な炭素原子を含み、ｎが０又は１であ
り、ｔが０又は１であり、そしてｐとｑの少なくとも一
方は１であるがその両方が共に１であることはない、請
求項１５記載の試験キット。
【請求項１９】Ｒがメチル又はエチルであり、Ｒ²が
炭素原子数３のアルキレンであり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵
の各々がメチルであり、ｐが０であり、ｑが１であり、
そしてｔが０である、請求項１８記載の試験キット。
【請求項２０】前記蛍光色素が以下の化合物Ａ〜Ｈの
いずれかである、請求項１５記載の試験キット。【化８】【化９】