JPH0892292A - イヌインターフェロン−βの生物活性を有するタンパク質 - Google Patents
イヌインターフェロン−βの生物活性を有するタンパク質Info
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- JPH0892292A JPH0892292A JP7181477A JP18147795A JPH0892292A JP H0892292 A JPH0892292 A JP H0892292A JP 7181477 A JP7181477 A JP 7181477A JP 18147795 A JP18147795 A JP 18147795A JP H0892292 A JPH0892292 A JP H0892292A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 イヌインタフェロン−βの生物活性を有する
タンパク質を産生することができるプラスミドにより形
質転換させた微生物を用いて同タンパク質を大量生産す
る。 【解決手段】 イヌインタフェロン−βの生物活性を有
するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝
子断片が組み込まれ、このタンパク質を産生することが
できる合成プラスミドにより形質転換された大腸菌を培
養し、産生される上記タンパク質を分離回収する。
タンパク質を産生することができるプラスミドにより形
質転換させた微生物を用いて同タンパク質を大量生産す
る。 【解決手段】 イヌインタフェロン−βの生物活性を有
するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝
子断片が組み込まれ、このタンパク質を産生することが
できる合成プラスミドにより形質転換された大腸菌を培
養し、産生される上記タンパク質を分離回収する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質の一次
構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターフェロン
−β（以下「ＣａＩＦＮ−β」と略記する場合がある）
の生物活性を有するタンパク質、及び該ＣａＩＦＮ−β
の生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子断片
に関し、また遺伝子操作技術によりこれを量産し、もっ
て医薬品とすることを目的として作出した合成プラスミ
ド、およびその形質転換した微生物に関するものであ
る。
構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターフェロン
−β（以下「ＣａＩＦＮ−β」と略記する場合がある）
の生物活性を有するタンパク質、及び該ＣａＩＦＮ−β
の生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子断片
に関し、また遺伝子操作技術によりこれを量産し、もっ
て医薬品とすることを目的として作出した合成プラスミ
ド、およびその形質転換した微生物に関するものであ
る。
【０００２】
【発明の背景と従来の技術】インターフェロン（以下
「ＩＦＮ」と略記する場合がある）はウイルス感染また
は他の刺激後に真核細胞によって分泌されるタンパク質
であって、細胞に作用してウイルスに対する抵抗性を誘
導し、あるいは免疫細胞においては調節作用を有し、更
に細胞の分化及び腫瘍等の成長に影響する物質として知
られている。
「ＩＦＮ」と略記する場合がある）はウイルス感染また
は他の刺激後に真核細胞によって分泌されるタンパク質
であって、細胞に作用してウイルスに対する抵抗性を誘
導し、あるいは免疫細胞においては調節作用を有し、更
に細胞の分化及び腫瘍等の成長に影響する物質として知
られている。
【０００３】現在では５種類のＩＦＮが知られ、それぞ
れＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、
ＩＦＮ−τと呼ばれてこれらは構造及び作用が相違す
る。
れＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、
ＩＦＮ−τと呼ばれてこれらは構造及び作用が相違す
る。
【０００４】そして遺伝子操作技術の進歩により、ヒト
のＩＦＮのみならず、数種の哺乳類のＩＦＮがクローニ
ングされている。これらのうちＩＦＮ−αは、ウシ（Va
lanet al,1985 J.Biol.Chem. 260:5498-5504 ）、ウマ
（Himmler et al,1987J.Interferon Res. 7:173-183
）、ネコ（Nakamura et al.1992, Bisoci.Biotech. Bi
ochem. 56:211-214）において、ＩＦＮ−βは、ウシ（L
eung et al,1984 Bio/Technology 2:458-464 ）、ウマ
（Himmler et al,1986 DNA 5:345-356）において遺伝子
が単離され、大量生産が可能となっている。その結果、
ウイルス病や腫瘍などの治療薬としてのＩＦＮの用途開
発研究が行われている例もある（特開昭５８−２２４６
９０号、特開昭６２−５０１４６９号、特開昭６３−２
３３７９４号、特開平２−１９５８８４号、特開平２−
３０４１００号）。
のＩＦＮのみならず、数種の哺乳類のＩＦＮがクローニ
ングされている。これらのうちＩＦＮ−αは、ウシ（Va
lanet al,1985 J.Biol.Chem. 260:5498-5504 ）、ウマ
（Himmler et al,1987J.Interferon Res. 7:173-183
）、ネコ（Nakamura et al.1992, Bisoci.Biotech. Bi
ochem. 56:211-214）において、ＩＦＮ−βは、ウシ（L
eung et al,1984 Bio/Technology 2:458-464 ）、ウマ
（Himmler et al,1986 DNA 5:345-356）において遺伝子
が単離され、大量生産が可能となっている。その結果、
ウイルス病や腫瘍などの治療薬としてのＩＦＮの用途開
発研究が行われている例もある（特開昭５８−２２４６
９０号、特開昭６２−５０１４６９号、特開昭６３−２
３３７９４号、特開平２−１９５８８４号、特開平２−
３０４１００号）。
【０００５】イヌについても、α、γ各タイプのＩＦＮ
遺伝子のクローニングが報告されている（Himmler et a
l,1987 J.Interferon Res. 7:173-183, Zuckeret al,19
92 J.Interferon Res. 12:191-194）。
遺伝子のクローニングが報告されている（Himmler et a
l,1987 J.Interferon Res. 7:173-183, Zuckeret al,19
92 J.Interferon Res. 12:191-194）。
【０００６】ところで、ＩＦＮはその遺伝子のクローニ
ングが報告されても、実際にＩＦＮを動物もしくは培養
細胞を用いて大量に生産する方法の確立は一般に困難で
あるが、ＣａＩＦＮ−βについてはその遺伝子のクロー
ニングについても報告もされていない。
ングが報告されても、実際にＩＦＮを動物もしくは培養
細胞を用いて大量に生産する方法の確立は一般に困難で
あるが、ＣａＩＦＮ−βについてはその遺伝子のクロー
ニングについても報告もされていない。
【０００７】しかし、イヌには多数のウイルス病が知ら
れ、またワクチン以外の有効な治療薬は知られていない
という現状からして仮に犬のＩＦＮが容易に入手可能と
なれば、犬の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤としての利用が期
待される。
れ、またワクチン以外の有効な治療薬は知られていない
という現状からして仮に犬のＩＦＮが容易に入手可能と
なれば、犬の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤としての利用が期
待される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
状況に鑑みて、ＣａＩＦＮ−βの遺伝子の単離・同定、
およびＣａＩＦＮ−βの大量生産のために研究を重ね、
ＣａＩＦＮ−β、及びこれをコードする遺伝子断片の特
定、及びこのＣａＩＦＮ−βの大量生産を可能とした形
質転換体を作出して本発明を完成させるに至ったもので
ある。
状況に鑑みて、ＣａＩＦＮ−βの遺伝子の単離・同定、
およびＣａＩＦＮ−βの大量生産のために研究を重ね、
ＣａＩＦＮ−β、及びこれをコードする遺伝子断片の特
定、及びこのＣａＩＦＮ−βの大量生産を可能とした形
質転換体を作出して本発明を完成させるに至ったもので
ある。
【０００９】すなわち本発明の第１の目的は、ＣａＩＦ
Ｎ−βの生物活性を有するタンパク質を提供し、また、
ＣａＩＦＮ−βの生物活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子断片を提供することを目的とするものであ
る。
Ｎ−βの生物活性を有するタンパク質を提供し、また、
ＣａＩＦＮ−βの生物活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子断片を提供することを目的とするものであ
る。
【００１０】また本発明の別の目的は、上記のＣａＩＦ
Ｎ−βの生物活性を有するタンパク質を産生することが
できるようにトランスフォームさせたプラスミドを作出
し、またこのプラスミドを有する形質転換させた微生物
を提供することを目的とするものである。
Ｎ−βの生物活性を有するタンパク質を産生することが
できるようにトランスフォームさせたプラスミドを作出
し、またこのプラスミドを有する形質転換させた微生物
を提供することを目的とするものである。
【００１１】更に本発明は、この形質転換した微生物を
用いてＣａＩＦＮ−βを大量産出することを可能とした
製造方法を提供することを目的とする。
用いてＣａＩＦＮ−βを大量産出することを可能とした
製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の特徴の一つは、
配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａＩＦＮ−βの生
物活性を有するタンパク質、およびこの配列番号１のア
ミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子断片
を提供するところにある。本発明において上記の配列番
号１のアミノ酸配列を有するタンパク質とは、ＣａＩＦ
Ｎ−βの生物活性を有する配列番号１のポリペプチドそ
のもの、あるいはこれを一部として含むポリペプチドを
意味し、また配列番号１のポリペプチドをコードする遺
伝子断片とは、該ポリペプチドをコードする遺伝子断片
そのもの、あるいはこれを発現するのに必要な配列、例
えばプロモータ，ターミネーターなどの該ポリペプチド
の発現のための自律的な単位として挙動するものをい
う。
配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａＩＦＮ−βの生
物活性を有するタンパク質、およびこの配列番号１のア
ミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子断片
を提供するところにある。本発明において上記の配列番
号１のアミノ酸配列を有するタンパク質とは、ＣａＩＦ
Ｎ−βの生物活性を有する配列番号１のポリペプチドそ
のもの、あるいはこれを一部として含むポリペプチドを
意味し、また配列番号１のポリペプチドをコードする遺
伝子断片とは、該ポリペプチドをコードする遺伝子断片
そのもの、あるいはこれを発現するのに必要な配列、例
えばプロモータ，ターミネーターなどの該ポリペプチド
の発現のための自律的な単位として挙動するものをい
う。
【００１３】
【発明の実施の形態】配列番号１のアミノ酸配列を有す
るイヌインターフェロン−β（ＣａＩＦＮ−β）の生物
活性を有するタンパク質は以下のように同定した。すな
わち、イヌの肝臓からＤＮＡを抽出し、他の哺乳類につ
いて既に単離されている遺伝子配列を元に作製した合成
ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ チェ
ーンリアクション）法により目的とする遺伝子領域を増
幅し、これを市販のベクターに組み込んで塩基配列を決
定し、他種のＩＦＮ−β遺伝子と相同性を有するクロー
ンを選択し、これを用いて市販の大腸菌を形質転換させ
て得た大腸菌で発現させ、抗ウイルス活性を有するタン
パク質を生産する能力のあるプラスミドを選び出した。
上記の活性を有するプラスミドをｐ３１−１、このプラ
スミドで形質転換された大腸菌を３１−１という。
るイヌインターフェロン−β（ＣａＩＦＮ−β）の生物
活性を有するタンパク質は以下のように同定した。すな
わち、イヌの肝臓からＤＮＡを抽出し、他の哺乳類につ
いて既に単離されている遺伝子配列を元に作製した合成
ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ チェ
ーンリアクション）法により目的とする遺伝子領域を増
幅し、これを市販のベクターに組み込んで塩基配列を決
定し、他種のＩＦＮ−β遺伝子と相同性を有するクロー
ンを選択し、これを用いて市販の大腸菌を形質転換させ
て得た大腸菌で発現させ、抗ウイルス活性を有するタン
パク質を生産する能力のあるプラスミドを選び出した。
上記の活性を有するプラスミドをｐ３１−１、このプラ
スミドで形質転換された大腸菌を３１−１という。
【００１４】なお以上の操作は、サムブロックら（Samb
rook et al,1989 Molecular cloning : a laboratory m
anual. 2nd edition cold spring harbor,New York: co
ldspring harbor press）等の既知の遺伝子操作技術・
細胞工学技術に従って行うことができる。また上記の抗
ウイルス活性の測定はイヌの培養細胞とＶＳＶ（Vesicu
lar stomatitis virus）とを用い、アームストロング
（Armstrong,1981 Meth.Enzymol. 78:381-387 ）のＣＰ
Ｅ法を用いて行なうことができる。
rook et al,1989 Molecular cloning : a laboratory m
anual. 2nd edition cold spring harbor,New York: co
ldspring harbor press）等の既知の遺伝子操作技術・
細胞工学技術に従って行うことができる。また上記の抗
ウイルス活性の測定はイヌの培養細胞とＶＳＶ（Vesicu
lar stomatitis virus）とを用い、アームストロング
（Armstrong,1981 Meth.Enzymol. 78:381-387 ）のＣＰ
Ｅ法を用いて行なうことができる。
【００１５】本発明の上記配列番号１のアミノ酸配列を
有するＣａＩＦＮ−βの生物活性を有するタンパク質
は、配列番号１の塩基配列、あるいはＣａＩＦＮ−βを
コードするゲノムから転写・翻訳されたものである必要
は必ずしもなく、例えば化学合成法や形質転換体の発現
等により生成されるものであってもよい。
有するＣａＩＦＮ−βの生物活性を有するタンパク質
は、配列番号１の塩基配列、あるいはＣａＩＦＮ−βを
コードするゲノムから転写・翻訳されたものである必要
は必ずしもなく、例えば化学合成法や形質転換体の発現
等により生成されるものであってもよい。
【００１６】また配列番号１のアミノ酸をコードする塩
基配列も、化学合成法、ＤＮＡ複製法、逆転写法、転写
法などいずれの方法によって得たものであってもよい。
基配列も、化学合成法、ＤＮＡ複製法、逆転写法、転写
法などいずれの方法によって得たものであってもよい。
【００１７】本発明の他の特徴の一つは、上記の配列番
号１のアミノ酸配列を有するＣａＩＦＮ−βの生物活性
を有するタンパク質をコードする遺伝子断片が組み込ま
れ、このタンパク質を産生することができる合成プラス
ミドにあり、このようなプラスミドは例えば上記ｐ３１
−１として提供される。
号１のアミノ酸配列を有するＣａＩＦＮ−βの生物活性
を有するタンパク質をコードする遺伝子断片が組み込ま
れ、このタンパク質を産生することができる合成プラス
ミドにあり、このようなプラスミドは例えば上記ｐ３１
−１として提供される。
【００１８】また本発明の更に他の特徴の一つは、上記
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
する遺伝子断片が組み込まれ、このタンパク質を産生す
ることができる合成プラスミドにより宿主細胞を形質転
換した微生物を提供することころにある。
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
する遺伝子断片が組み込まれ、このタンパク質を産生す
ることができる合成プラスミドにより宿主細胞を形質転
換した微生物を提供することころにある。
【００１９】このようなＣａＩＦＮ−β生産細胞は次の
ようにして作出することができる。宿主細胞が真核細胞
の場合は、例えば上記の３１−１から注出したＣａＩＦ
Ｎ−βの生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子断片をウイルス等のプロモータと結合させ、真核細胞
を形質転換させてＣａＩＦＮ−β生産細胞を作出するこ
とができる。また、バキュロウイルス等の組換えウイル
スベクターを用いた場合は、例えば、Smith らの方法
（Mol.Cell.Biol.3:2156〜2165 ）に基づいて、組換え
ウイルスベクターを作出することができる。すなわちＣ
ａＩＦＮ−βの生物活性を有するタンパク質をコードす
る遺伝子断片を、バキュロウイルスのトランファーベク
ターの多核体プロモータと連結し、そのトランファーベ
クターをバキュロウイルスＤＮＡと昆虫細胞に導入し、
得られた組換えバキュロウイルスのうち、ＣａＩＦＮ−
βの活性を生産する組換えクローンを選択し、その組換
えクローンを昆虫細胞もしくは昆虫に感染させ、ＣａＩ
ＦＮ−βタンパク質を生産することができる。
ようにして作出することができる。宿主細胞が真核細胞
の場合は、例えば上記の３１−１から注出したＣａＩＦ
Ｎ−βの生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子断片をウイルス等のプロモータと結合させ、真核細胞
を形質転換させてＣａＩＦＮ−β生産細胞を作出するこ
とができる。また、バキュロウイルス等の組換えウイル
スベクターを用いた場合は、例えば、Smith らの方法
（Mol.Cell.Biol.3:2156〜2165 ）に基づいて、組換え
ウイルスベクターを作出することができる。すなわちＣ
ａＩＦＮ−βの生物活性を有するタンパク質をコードす
る遺伝子断片を、バキュロウイルスのトランファーベク
ターの多核体プロモータと連結し、そのトランファーベ
クターをバキュロウイルスＤＮＡと昆虫細胞に導入し、
得られた組換えバキュロウイルスのうち、ＣａＩＦＮ−
βの活性を生産する組換えクローンを選択し、その組換
えクローンを昆虫細胞もしくは昆虫に感染させ、ＣａＩ
ＦＮ−βタンパク質を生産することができる。
【００２０】また宿主細胞が原核細胞である場合は、例
えば発現ベクターにＣａＩＦＮ−βの生物活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子断片を連結し、原核細胞
を形質転換させてＣａＩＦＮ−β生産細胞を作出するこ
とができる。
えば発現ベクターにＣａＩＦＮ−βの生物活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子断片を連結し、原核細胞
を形質転換させてＣａＩＦＮ−β生産細胞を作出するこ
とができる。
【００２１】このような微生物のうち最も好ましいもの
は大腸菌（Escherichia coli）であり、本出願人はその
典型的な菌株３１−１を平成６年７月１８日付けで通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３２号）の受託番号が付与され
ている。
は大腸菌（Escherichia coli）であり、本出願人はその
典型的な菌株３１−１を平成６年７月１８日付けで通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３２号）の受託番号が付与され
ている。
【００２２】本発明の更に他の特徴は、上記形質転換さ
れた微生物を培養し、産生されるＣａＩＦＮ−βの生物
活性を有する蛋白質を分離回収することによって該蛋白
質を製造する方法にある。
れた微生物を培養し、産生されるＣａＩＦＮ−βの生物
活性を有する蛋白質を分離回収することによって該蛋白
質を製造する方法にある。
【００２３】培養細胞からの上記蛋白質の分離は通常の
方法を用いることができるが、アフィニティクロマトグ
ラフィーによる方法、特には特異抗体を結合させた担体
を用いる方法が好ましく用いられる。
方法を用いることができるが、アフィニティクロマトグ
ラフィーによる方法、特には特異抗体を結合させた担体
を用いる方法が好ましく用いられる。
【００２４】本発明によれば、ＣａＩＦＮ−βの生物活
性を有するタンパク質を形質転換した微生物等を用いて
大量に製造することができる。
性を有するタンパク質を形質転換した微生物等を用いて
大量に製造することができる。
【００２５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００２６】（１）ＣａＩＦＮ−β遺伝子のＰＣＲによ
る増幅 生後５週令のイヌの肝臓を摘出し、外科用ハサミで細か
く切り、０．６％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を
含むＴＥ（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）−１
ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテー
ト））１００ｍｌに浮遊させ、１００μｇ／ｍｌになる
ようにプロテイナーゼＫを加え、スターラーで撹拌しな
がら３７℃で一晩タンパク質を消化した。この混合物を
フェノール・クロロホルム抽出を行い、水層をとり、１
０ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えたの
ち、２００ｍｌのエタノールを加えて−２０℃で２時間
冷却した。遠心分離により底部に生じたペレットを１０
ｍｌの滅菌蒸留水に溶解した。また、公知のヒト、マウ
ス、ウマ、ウシの塩基配列を基に、これらの動物種の間
で比較的保存された部分に、下記の塩基配列を有するＤ
ＮＡプライマー、ＣＯＭとＣＩＢ７を合成した。
る増幅 生後５週令のイヌの肝臓を摘出し、外科用ハサミで細か
く切り、０．６％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を
含むＴＥ（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）−１
ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテー
ト））１００ｍｌに浮遊させ、１００μｇ／ｍｌになる
ようにプロテイナーゼＫを加え、スターラーで撹拌しな
がら３７℃で一晩タンパク質を消化した。この混合物を
フェノール・クロロホルム抽出を行い、水層をとり、１
０ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えたの
ち、２００ｍｌのエタノールを加えて−２０℃で２時間
冷却した。遠心分離により底部に生じたペレットを１０
ｍｌの滅菌蒸留水に溶解した。また、公知のヒト、マウ
ス、ウマ、ウシの塩基配列を基に、これらの動物種の間
で比較的保存された部分に、下記の塩基配列を有するＤ
ＮＡプライマー、ＣＯＭとＣＩＢ７を合成した。
【００２７】 ＣＯＭ 5' - TGAAAGTGGGAAATTCCTCT ＣＩＢ７ 5' - TGTCCTTTCATATGCAGT そして、これらのプライマーを用いて犬のゲノムＤＮＡ
１μｇ、３μＭのそれぞれのプライマー、それぞれ２０
０μＭのデオキシヌクレオチド、１０ｍＭのＫＣｌ、１
０ｍＭのトリス−塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウムに、１
０ユニットの市販のＶｅｎｔ ポリメラーゼ（New Engl
and Biolab.Inc. 製）を加えて、パラフィンオイルを重
層し、９４℃で４５秒、５０℃で６０秒、７２℃で１２
０秒を１サイクルとしたＰＣＲを３０サイクル行った。
１μｇ、３μＭのそれぞれのプライマー、それぞれ２０
０μＭのデオキシヌクレオチド、１０ｍＭのＫＣｌ、１
０ｍＭのトリス−塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウムに、１
０ユニットの市販のＶｅｎｔ ポリメラーゼ（New Engl
and Biolab.Inc. 製）を加えて、パラフィンオイルを重
層し、９４℃で４５秒、５０℃で６０秒、７２℃で１２
０秒を１サイクルとしたＰＣＲを３０サイクル行った。
【００２８】その生成物からパラフィンオイルを除き、
増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動により解析した。すな
わち、アガロースゲル電気泳動を行い、約９００ベース
のＤＮＡ断片部分を切り出し、このＤＮＡ断片をクレノ
ウ酵素で平滑末端とし、リン酸化したあと、市販のｐＧ
ＥＭ３Ｚベクター（Promega Co. 製）のＳｍａＩ部位に
挿入して、組換プラスミドを得た。
増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動により解析した。すな
わち、アガロースゲル電気泳動を行い、約９００ベース
のＤＮＡ断片部分を切り出し、このＤＮＡ断片をクレノ
ウ酵素で平滑末端とし、リン酸化したあと、市販のｐＧ
ＥＭ３Ｚベクター（Promega Co. 製）のＳｍａＩ部位に
挿入して、組換プラスミドを得た。
【００２９】次にこの組換プラスミドを含む反応液をコ
ンピテント化した大腸菌ＪＭ１０９と混合し、形質転換
反応を行って形質転換体ＣａＩＢを得た。次に１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに生育する
クローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地２ｍｌで培養し（３７℃、一晩）、アルカリミニス
クリーン法でプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄIII で切断して目的の大きさのＤＮＡ断片を組み込ん
でいるクローンを選んだ。
ンピテント化した大腸菌ＪＭ１０９と混合し、形質転換
反応を行って形質転換体ＣａＩＢを得た。次に１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに生育する
クローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地２ｍｌで培養し（３７℃、一晩）、アルカリミニス
クリーン法でプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄIII で切断して目的の大きさのＤＮＡ断片を組み込ん
でいるクローンを選んだ。
【００３０】このうち１２クローンを選び、以下により
塩基配列を決定した。
塩基配列を決定した。
【００３１】（２）塩基配列の決定 上記得られた１２クローンより組換プラスミドを抽出，
精製し、市販のサイクルシークエンスキット（パーキン
・エルマー・ジャパン社製）を用いたジデオキシシーク
エンス法により、添付のプロトコールに従って反応を行
ないパーキン・エルマー・ジャパン社のシークエンサー
を用いて塩基配列を決定した。
精製し、市販のサイクルシークエンスキット（パーキン
・エルマー・ジャパン社製）を用いたジデオキシシーク
エンス法により、添付のプロトコールに従って反応を行
ないパーキン・エルマー・ジャパン社のシークエンサー
を用いて塩基配列を決定した。
【００３２】すなわち、まず上記ｐＧＥＭ３Ｚベクター
部分に相補的なシークエンスプライマーを用いて、挿入
したＤＮＡ断片の両端の塩基配列を決定した。次いで、
これらの１２クローンの中でヒトＩＦＮ−β遺伝子と相
同性のあった６クローンを選び、さらに挿入したＤＮＡ
断片の内側へ向けてシークエンスプライマーを合成し、
塩基配列を決定し、このような操作を繰り返して最終的
に、配列番号１に示すＤＮＡの塩基配列を決定した。６
クローンは全て同じ塩基配列をもつＤＮＡ断片を保持し
ていた。
部分に相補的なシークエンスプライマーを用いて、挿入
したＤＮＡ断片の両端の塩基配列を決定した。次いで、
これらの１２クローンの中でヒトＩＦＮ−β遺伝子と相
同性のあった６クローンを選び、さらに挿入したＤＮＡ
断片の内側へ向けてシークエンスプライマーを合成し、
塩基配列を決定し、このような操作を繰り返して最終的
に、配列番号１に示すＤＮＡの塩基配列を決定した。６
クローンは全て同じ塩基配列をもつＤＮＡ断片を保持し
ていた。
【００３３】このようにして得られた塩基配列のデータ
を、公知の他の４種のＩＦＮ−βの塩基配列と比較し、
その結果を図２〜図５と、図６に示し、その一致率を下
記表１にまとめた。なお図２〜図５は、ヒト，マウス，
ウマ，ウシＩＦＮ−β遺伝子とＣａＩＦＮ−β遺伝子の
塩基配列を相同部分が最大となるように並記した結果を
示し、また図６は、ヒト，マウス，ウマ，ウシＩＦＮ−
β遺伝子とＣａＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列から予想さ
れるアミノ酸配列を相同部分が最大となるように並記し
た結果を示し、これらの図中において「．」はＣａＩＦ
Ｎ−βと同じ塩基配列の場合、「−」は欠失が認められ
る場合を夫々示す。なお、ウシ、ウマにはそれぞれ３つ
もしくは２つのＩＦＮ−β遺伝子が存在するが、いずれ
もβ１遺伝子を代表として解析に用いた。
を、公知の他の４種のＩＦＮ−βの塩基配列と比較し、
その結果を図２〜図５と、図６に示し、その一致率を下
記表１にまとめた。なお図２〜図５は、ヒト，マウス，
ウマ，ウシＩＦＮ−β遺伝子とＣａＩＦＮ−β遺伝子の
塩基配列を相同部分が最大となるように並記した結果を
示し、また図６は、ヒト，マウス，ウマ，ウシＩＦＮ−
β遺伝子とＣａＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列から予想さ
れるアミノ酸配列を相同部分が最大となるように並記し
た結果を示し、これらの図中において「．」はＣａＩＦ
Ｎ−βと同じ塩基配列の場合、「−」は欠失が認められ
る場合を夫々示す。なお、ウシ、ウマにはそれぞれ３つ
もしくは２つのＩＦＮ−β遺伝子が存在するが、いずれ
もβ１遺伝子を代表として解析に用いた。
【００３４】
【表１】
【００３５】この結果から分かるように、得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列は、上記他の４種の哺乳類のＩＦＮ−
β遺伝子の塩基配列と７０％前後の相同性が認められ
た。また、予想されるアミノ酸配列も同様に４０〜６０
％の相同性を示した。
Ａ断片の塩基配列は、上記他の４種の哺乳類のＩＦＮ−
β遺伝子の塩基配列と７０％前後の相同性が認められ
た。また、予想されるアミノ酸配列も同様に４０〜６０
％の相同性を示した。
【００３６】また上記に示したアミノ酸配列の結果か
ら、ＣａＩＦＮ−β遺伝子はＮ末端のシグナル配列が他
種のＩＦＮ−βと比べて１１アミノ酸長いことが判明し
た。また、２次構造、３次構造に影響されるといわれて
いるシステイン残基の位置は３ヶ所とも保存されてい
た。さらに、分泌されるときに切断されるシグナルペプ
チドは１番目のアミノ酸から３１番目のアミノ酸までと
推定され、成熟分子は３２番目のメチオニンをＮ末端に
もつと推定された。
ら、ＣａＩＦＮ−β遺伝子はＮ末端のシグナル配列が他
種のＩＦＮ−βと比べて１１アミノ酸長いことが判明し
た。また、２次構造、３次構造に影響されるといわれて
いるシステイン残基の位置は３ヶ所とも保存されてい
た。さらに、分泌されるときに切断されるシグナルペプ
チドは１番目のアミノ酸から３１番目のアミノ酸までと
推定され、成熟分子は３２番目のメチオニンをＮ末端に
もつと推定された。
【００３７】なお上記したＤＮＡ断片由来のタンパク質
が抗ウイルス活性を持つか否かは、以下の（３）で作出
した大腸菌の産生するタンパク質を用いて調べた。
が抗ウイルス活性を持つか否かは、以下の（３）で作出
した大腸菌の産生するタンパク質を用いて調べた。
【００３８】（３）タンパク質生産菌の作出 図１に発現プラスミドの作製法を図示した。すなわち、
グルタチオン−Ｓ−転移酵素融合タンパク質として発現
させるｐＧＥＸ−２Ｔベクター（ファルマシア社製）の
ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの部分にグルタチオン−Ｓ−転
移酵素タンパク質とアミノ酸のフレームが一致するよう
に下記のＤＮＡプライマーＢＦ３、ＢＲ３を合成した。
グルタチオン−Ｓ−転移酵素融合タンパク質として発現
させるｐＧＥＸ−２Ｔベクター（ファルマシア社製）の
ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの部分にグルタチオン−Ｓ−転
移酵素タンパク質とアミノ酸のフレームが一致するよう
に下記のＤＮＡプライマーＢＦ３、ＢＲ３を合成した。
【００３９】 ＢＦ３ 5' -GCCGGGATCCATGAGCAACGACTTGCTTCG-3' ＢＲ３ 5' -GGCCGAATTCTCAGTTCTGGAGATAATCTG-3' 上記プラスミドのうちの一つ（ｐ３１）から、ＰＣＲ法
により目的とするＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をＢ
ａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、同様にＢａｍＨＩとＥ
ｃｏＲＩで切断したｐＧＥＸ−２ＴベクターとＴ４−リ
ガーゼでライゲーションして、プラスミドｐ３１−１を
得た。
により目的とするＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をＢ
ａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、同様にＢａｍＨＩとＥ
ｃｏＲＩで切断したｐＧＥＸ−２ＴベクターとＴ４−リ
ガーゼでライゲーションして、プラスミドｐ３１−１を
得た。
【００４０】この反応液をコンピテント化した大腸菌Ｊ
Ｍ１０９と混合し、形質転換反応を行なって形質転換体
を得た。次に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂプレートに生育するクローンを１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで培養し（３７℃、一
晩）、アルカリミニスクリーン法でプラスミドを抽出
し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断して目的の大きさの
ＤＮＡ断片を組み込んでいるクローン３１−１を選ん
だ。
Ｍ１０９と混合し、形質転換反応を行なって形質転換体
を得た。次に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂプレートに生育するクローンを１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで培養し（３７℃、一
晩）、アルカリミニスクリーン法でプラスミドを抽出
し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断して目的の大きさの
ＤＮＡ断片を組み込んでいるクローン３１−１を選ん
だ。
【００４１】（４）融合タンパク質としてのタンパク質
の生産 次に形質転換体である上記大腸菌３１−１を用いてＧＳ
Ｔ purificationmodul（ファルマシア社製）を使い、
添付のマニュアルに基づいて融合タンパク質の製造を行
なった。
の生産 次に形質転換体である上記大腸菌３１−１を用いてＧＳ
Ｔ purificationmodul（ファルマシア社製）を使い、
添付のマニュアルに基づいて融合タンパク質の製造を行
なった。
【００４２】すなわち、初濃度ＯＤ６００＝０．１より
１．５時間培養し、０．１ｍＭの濃度になるようにＩＰ
ＴＧ（isopropyl β-D-thiogalactoside）を加え、さら
に４時間２８℃で培養し、大腸菌内に融合タンパク質を
生産した。大腸菌を遠心分離により集菌し、ＰＢＳ
（−）に浮遊させた後超音波処理によって菌を破壊し
た。融合タンパク質を１％ザルコシン酸ナトリウムで溶
解した後、グルタチオンセファロースカラムにかけ、結
合させた。１０ｍＭグルタチオンを含むトリス緩衝液で
融合タンパク質を溶出した。トロンビンを１０ユニット
／ｍｇタンパク質になるように加え、室温で１８時間置
いてグルタチオン−Ｓ−転移酵素タンパク質とＣａＩＦ
Ｎ−βタンパク質を切り離した。透析でグルタチオンを
除去した後、グルタチオン−Ｓ−転移酵素とＣａＩＦＮ
−βの混合物をグルタチオンカラムにかけ、素通り分画
をＣａＩＦＮ−β検体とした。
１．５時間培養し、０．１ｍＭの濃度になるようにＩＰ
ＴＧ（isopropyl β-D-thiogalactoside）を加え、さら
に４時間２８℃で培養し、大腸菌内に融合タンパク質を
生産した。大腸菌を遠心分離により集菌し、ＰＢＳ
（−）に浮遊させた後超音波処理によって菌を破壊し
た。融合タンパク質を１％ザルコシン酸ナトリウムで溶
解した後、グルタチオンセファロースカラムにかけ、結
合させた。１０ｍＭグルタチオンを含むトリス緩衝液で
融合タンパク質を溶出した。トロンビンを１０ユニット
／ｍｇタンパク質になるように加え、室温で１８時間置
いてグルタチオン−Ｓ−転移酵素タンパク質とＣａＩＦ
Ｎ−βタンパク質を切り離した。透析でグルタチオンを
除去した後、グルタチオン−Ｓ−転移酵素とＣａＩＦＮ
−βの混合物をグルタチオンカラムにかけ、素通り分画
をＣａＩＦＮ−β検体とした。
【００４３】（５） 抗ウイルス活性測定法 上記のＣａＩＦＮ−β検体活性を、上述したアームスト
ロング（Armstrong,1981 Meth.Enzymol. 78:381-387 ）
に記載されている方法を参考にして下記のようにＭＤＣ
Ｋ細胞とＶＳＶ（Vesicular stomatitis virus）を用い
たＣＰＥ阻止の結果で測定した。
ロング（Armstrong,1981 Meth.Enzymol. 78:381-387 ）
に記載されている方法を参考にして下記のようにＭＤＣ
Ｋ細胞とＶＳＶ（Vesicular stomatitis virus）を用い
たＣＰＥ阻止の結果で測定した。
【００４４】すなわち、イヌ由来の培養細胞ＭＤＣＫを
１０5 個／ｍｌになるように０．５％牛胎児結成（ＦＢ
Ｓと略す）を含むダルベッコ変法イーグル最小必須培地
（ＤＭＥＭと略す）に浮遊させ、０．１ｍｌづつ９６穴
マルチウエルプレートのウエルに分注した。約１日培養
した後、培養液を捨て、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ
で稀釈したＣａＩＦＮ−β検体を加え、１日間検体をＭ
ＤＣＫ細胞に作用させた。培養液及び検体を捨て、０．
５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ存在下でＶＳＶを感染させ、
２日後にＶＳＶ感染増殖によって生ずる細胞変性を観察
し、ＭＤＣＫ細胞のシート全体の損傷の程度を数値化
し、グラフ化した。グラフより５０％の細胞変性を示す
と予想される検体の稀釈率の逆数をＩＦＮ活性として示
した。
１０5 個／ｍｌになるように０．５％牛胎児結成（ＦＢ
Ｓと略す）を含むダルベッコ変法イーグル最小必須培地
（ＤＭＥＭと略す）に浮遊させ、０．１ｍｌづつ９６穴
マルチウエルプレートのウエルに分注した。約１日培養
した後、培養液を捨て、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ
で稀釈したＣａＩＦＮ−β検体を加え、１日間検体をＭ
ＤＣＫ細胞に作用させた。培養液及び検体を捨て、０．
５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ存在下でＶＳＶを感染させ、
２日後にＶＳＶ感染増殖によって生ずる細胞変性を観察
し、ＭＤＣＫ細胞のシート全体の損傷の程度を数値化
し、グラフ化した。グラフより５０％の細胞変性を示す
と予想される検体の稀釈率の逆数をＩＦＮ活性として示
した。
【００４５】これによれば、精製したＣａＩＦＮ−β検
体のＩＦＮ活性はｍｇあたり１０8単位と測定され、ヒ
ト、マウスのＩＦＮ−βと似た値を示した。したがって
配列番号１のタンパク質は、ＣａＩＦＮ−βの生物活性
を有するタンパク質であることが確認された。
体のＩＦＮ活性はｍｇあたり１０8単位と測定され、ヒ
ト、マウスのＩＦＮ−βと似た値を示した。したがって
配列番号１のタンパク質は、ＣａＩＦＮ−βの生物活性
を有するタンパク質であることが確認された。
【００４６】（６）バキュロウイルストランスファーベ
クターの作製 図７にバキュロウイルストランスファーベクターを作製
する手順を図示した。すなわち、ＣａＩＦＮ−β遺伝子
のシグナルペプチドを含む全オープンリーディングフレ
ームを含むように下記のＤＮＡプライマーＢＦ−Ｂａ
ｃ、ＢＲ−Ｂａｃを合成した。なお、ＢＦ−Ｂａｃプラ
イマーの７番目から９番目の塩基、ＡＴＧは本遺伝子の
翻訳開始シグナルに相当する。また、ＢＲ−Ｂａｃプラ
イマーの５番目から１０番目の塩基、ＧＡＡＴＴＣは、
トランスファーベクター挿入後にプロモータに対して順
方向か逆方向かが区別できるように付け加えた制限酵素
ＥｃｏＲＩの認識配列である。
クターの作製 図７にバキュロウイルストランスファーベクターを作製
する手順を図示した。すなわち、ＣａＩＦＮ−β遺伝子
のシグナルペプチドを含む全オープンリーディングフレ
ームを含むように下記のＤＮＡプライマーＢＦ−Ｂａ
ｃ、ＢＲ−Ｂａｃを合成した。なお、ＢＦ−Ｂａｃプラ
イマーの７番目から９番目の塩基、ＡＴＧは本遺伝子の
翻訳開始シグナルに相当する。また、ＢＲ−Ｂａｃプラ
イマーの５番目から１０番目の塩基、ＧＡＡＴＴＣは、
トランスファーベクター挿入後にプロモータに対して順
方向か逆方向かが区別できるように付け加えた制限酵素
ＥｃｏＲＩの認識配列である。
【００４７】 ＢＦ−Ｂａｃ 5’−GGCCCCATGGTAATAGGTGAGACTCTTCCC− 3’ ＢＲ−Ｂａｃ 5’−GGCCGAATTCTCAGTTCTGGAGATAATCTG− 3’ すなわち、最初にＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をクローン化し
たプラスミドのうち、配列番号１にＦすイヌＩＦＮ−β
遺伝子の塩基配列を持つものを選び、それを鋳型とし
て、ＢＦ−Ｂａｃ、ＢＲ−Ｂａｃプライマーを用いてＰ
ＣＲ法により全オープンリーディングフレームを含むＤ
ＮＡ断片を増幅した。
たプラスミドのうち、配列番号１にＦすイヌＩＦＮ−β
遺伝子の塩基配列を持つものを選び、それを鋳型とし
て、ＢＦ−Ｂａｃ、ＢＲ−Ｂａｃプライマーを用いてＰ
ＣＲ法により全オープンリーディングフレームを含むＤ
ＮＡ断片を増幅した。
【００４８】すなわち、本プラスミド０．１μｇ／５０
μｌ、１μＭの各プライマー、それぞれ２００μＭのデ
オキシヌクレオチド、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭの塩化マグネ
シウムに、１０ユニットの市販のＶｅｎｔ ポリメラー
ゼ（New England Biolab. Inc ）を加えて総量５０μｌ
とし、パラフィンオイルを重層し、９４℃で４５秒、５
０℃で６０秒、７２℃で１２０秒を１サイクルとしたＰ
ＣＲを２０サイクル行った。クロロフォルムを加えてパ
ラフィンオイルを除去し、増幅されたＤＮＡ断片をアガ
ロース電気泳動で確認した。
μｌ、１μＭの各プライマー、それぞれ２００μＭのデ
オキシヌクレオチド、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭの塩化マグネ
シウムに、１０ユニットの市販のＶｅｎｔ ポリメラー
ゼ（New England Biolab. Inc ）を加えて総量５０μｌ
とし、パラフィンオイルを重層し、９４℃で４５秒、５
０℃で６０秒、７２℃で１２０秒を１サイクルとしたＰ
ＣＲを２０サイクル行った。クロロフォルムを加えてパ
ラフィンオイルを除去し、増幅されたＤＮＡ断片をアガ
ロース電気泳動で確認した。
【００４９】反応液に２ユニットのクレノウ酵素（宝酒
造社製）を加え、室温で２５分間静置してＤＮＡ断片を
平滑化した。フェノール抽出によりクレノウ酵素を除い
た後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡサンプルを濃縮し
た。１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする約
０．６ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースブロックを切
り出した。ＤＮＡ断片はジーンクリーンキットII（Bio
101, Inc社製）を用いて、添付のプロトコルに従い精製
した。
造社製）を加え、室温で２５分間静置してＤＮＡ断片を
平滑化した。フェノール抽出によりクレノウ酵素を除い
た後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡサンプルを濃縮し
た。１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする約
０．６ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースブロックを切
り出した。ＤＮＡ断片はジーンクリーンキットII（Bio
101, Inc社製）を用いて、添付のプロトコルに従い精製
した。
【００５０】ＤＮＡ断片を１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
８．０）、５ｍＭ 塩化マグネシウムを含むバッファに
溶解し、５ｍＭになるようにＡＴＰを加え、１０ユニッ
トのポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を用いて、ＤＮＡ断片の５’末端を燐酸化し
た。
８．０）、５ｍＭ 塩化マグネシウムを含むバッファに
溶解し、５ｍＭになるようにＡＴＰを加え、１０ユニッ
トのポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を用いて、ＤＮＡ断片の５’末端を燐酸化し
た。
【００５１】一方、トランスファーベクターＤＮＡは以
下のように調製した。ｐＢａｃＰＡＫ１トランスファー
ベクター（CLONOTECH Laboratories, Inc 社製）のＢａ
ｍＨＩサイトにＳｍａＩリンカーを挿入したトランスフ
ァーベクターｐＢａｃＰＡＫ−ＩＳをＳｍａＩで切断
し、２ユニットのバクテリア由来アルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＡＰ、宝酒造社製）で５’末端の燐酸基を除去
した。５５℃で３０分処理することでバクテリア由来ア
ルカリフォスファターゼを失活させ、フェノール抽出で
酵素を除いてエタノール沈澱によりベクターＤＮＡを濃
縮した。
下のように調製した。ｐＢａｃＰＡＫ１トランスファー
ベクター（CLONOTECH Laboratories, Inc 社製）のＢａ
ｍＨＩサイトにＳｍａＩリンカーを挿入したトランスフ
ァーベクターｐＢａｃＰＡＫ−ＩＳをＳｍａＩで切断
し、２ユニットのバクテリア由来アルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＡＰ、宝酒造社製）で５’末端の燐酸基を除去
した。５５℃で３０分処理することでバクテリア由来ア
ルカリフォスファターゼを失活させ、フェノール抽出で
酵素を除いてエタノール沈澱によりベクターＤＮＡを濃
縮した。
【００５２】ＰＣＲ増幅し、後処理を行ったＤＮＡ断片
１００ｆｍｏｌとｐＢａｃＰＡＫ−ＩＳベクターＤＮＡ
４０ｆｍｏｌを混合し、ライゲーション反応を行い、反
応液をコンピテント化した大腸菌Ｋ１２株由来ＴＢ１と
混和し、形質転換反応を行って形質転換体を得た。次に
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに
生育するクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、一晩培養し、アルカリミ
ニスクリーン法でプラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで切
断し、約０．６ｋｂのインサートを含むプラスミドを持
つクローンを選別し、Ｂａｃ−βシリーズとした。これ
らの形質転換体の持つプラスミドをｐＢａｃ−βシリー
ズと命名した。
１００ｆｍｏｌとｐＢａｃＰＡＫ−ＩＳベクターＤＮＡ
４０ｆｍｏｌを混合し、ライゲーション反応を行い、反
応液をコンピテント化した大腸菌Ｋ１２株由来ＴＢ１と
混和し、形質転換反応を行って形質転換体を得た。次に
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに
生育するクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、一晩培養し、アルカリミ
ニスクリーン法でプラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩで切
断し、約０．６ｋｂのインサートを含むプラスミドを持
つクローンを選別し、Ｂａｃ−βシリーズとした。これ
らの形質転換体の持つプラスミドをｐＢａｃ−βシリー
ズと命名した。
【００５３】挿入されたＤＮＡ断片は平滑末端でライゲ
ーションしたため、ｐＢａｃ−βシリーズのプラスミド
には、バキュロウイルス多核体プロモータに対して順方
向、逆方向に結合したインサートを持つプラスミドが
１：１で混合している（図８）。多核体タンパク質プロ
モータに対して順方向の場合には、ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄIII で切断した場合に４５０ｂｐのバンドが、同様に
逆方向の場合は１０４０ｂｐのバンドが出現する。そこ
で得られたプラスミドを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で
切断し、それぞれのＤＮＡクローンのインサートのプロ
モータに対する方向を決定した。
ーションしたため、ｐＢａｃ−βシリーズのプラスミド
には、バキュロウイルス多核体プロモータに対して順方
向、逆方向に結合したインサートを持つプラスミドが
１：１で混合している（図８）。多核体タンパク質プロ
モータに対して順方向の場合には、ＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄIII で切断した場合に４５０ｂｐのバンドが、同様に
逆方向の場合は１０４０ｂｐのバンドが出現する。そこ
で得られたプラスミドを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で
切断し、それぞれのＤＮＡクローンのインサートのプロ
モータに対する方向を決定した。
【００５４】プロモータに対して順方向のインサートを
持つプラスミドｐＢａｃ−β３を持つ大腸菌クローンＢ
ａｃ−β３を選び、１００ｍｌで培養し、プラスミドＤ
ＮＡをＱｉａｇｅｎカラム（DIAGEN, GmbH、 QIAGEN, In
c 社製）で添付のプロトコルに従って精製した。
持つプラスミドｐＢａｃ−β３を持つ大腸菌クローンＢ
ａｃ−β３を選び、１００ｍｌで培養し、プラスミドＤ
ＮＡをＱｉａｇｅｎカラム（DIAGEN, GmbH、 QIAGEN, In
c 社製）で添付のプロトコルに従って精製した。
【００５５】（７）組換えバキュロウイルスの作製 組換えバキュロウイルスの作製法の概略を図９に示す。
トランスファーベクターＤＮＡと制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ
で切断したウイルスＤＮＡをリポフェクチンに吸着さ
せ、Ｓｆ２１ＡＥ細胞に加えると、ＤＮＡ−リポフェク
チン複合体はＳｆ２１ＡＥ細胞に取り込まれ、低頻度で
はあるが、両ＤＮＡ間で相同組換えが生じ、トランスフ
ァーベクター中の組換え遺伝子がバキュロウイルスＤＮ
Ａに挿入され、同時にウイルスＤＮＡの制限酵素Ｂｓｕ
３６Ｉによる切断点が除去される。相同組換えを起こさ
なかった切断されたウイルスＤＮＡは、切断点を修復す
ることができず、増殖することはごく稀である。
トランスファーベクターＤＮＡと制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ
で切断したウイルスＤＮＡをリポフェクチンに吸着さ
せ、Ｓｆ２１ＡＥ細胞に加えると、ＤＮＡ−リポフェク
チン複合体はＳｆ２１ＡＥ細胞に取り込まれ、低頻度で
はあるが、両ＤＮＡ間で相同組換えが生じ、トランスフ
ァーベクター中の組換え遺伝子がバキュロウイルスＤＮ
Ａに挿入され、同時にウイルスＤＮＡの制限酵素Ｂｓｕ
３６Ｉによる切断点が除去される。相同組換えを起こさ
なかった切断されたウイルスＤＮＡは、切断点を修復す
ることができず、増殖することはごく稀である。
【００５６】したがって、組換えウイルスＤＮＡのみが
複製・増殖し、ウイルス粒子を形成し、細胞シート上に
明瞭なプラークを生じるため、そのプラークを指標に組
換えウイルスを単離することができる。この方法は一般
的に広く用いられている。
複製・増殖し、ウイルス粒子を形成し、細胞シート上に
明瞭なプラークを生じるため、そのプラークを指標に組
換えウイルスを単離することができる。この方法は一般
的に広く用いられている。
【００５７】以下に具体的な方法を示す。
【００５８】Ｓｆ２１ＡＥ細胞を１０％非動化牛胎児血
清（ＦＢＳ）と０．２６％のバクトトリプトースブロス
（ＢＴＢ）を含むグレース培地（ギブコ社製）で培養
し、１ｘ１０6／穴の数を６穴プレートに分注し、室温
で１時間以上培養し、細胞をプレート穴底面に接着させ
た。
清（ＦＢＳ）と０．２６％のバクトトリプトースブロス
（ＢＴＢ）を含むグレース培地（ギブコ社製）で培養
し、１ｘ１０6／穴の数を６穴プレートに分注し、室温
で１時間以上培養し、細胞をプレート穴底面に接着させ
た。
【００５９】一方、ｐＢａｃ−β３トランスファーベク
ターＤＮＡ１μｇと制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで切断したＢ
ａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡ（CLONOTECH Laboratorie
s, Inc 社製）２０ｎｇを混合し、全量を８μｌとし
た。リポフェクチン（ＢＲＬ社製）を８μｌ加え、混合
した後、約１５分間室温で静置し、ＤＮＡ−リポフェク
チン複合体を形成させた。
ターＤＮＡ１μｇと制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉで切断したＢ
ａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡ（CLONOTECH Laboratorie
s, Inc 社製）２０ｎｇを混合し、全量を８μｌとし
た。リポフェクチン（ＢＲＬ社製）を８μｌ加え、混合
した後、約１５分間室温で静置し、ＤＮＡ−リポフェク
チン複合体を形成させた。
【００６０】上記のように準備したＳｆ２１ＡＥ細胞を
血清を含まないグレース培地で洗浄し、１ｍｌグレース
培地を加えた。そこに１６μｌのＤＮＡ−リポフェクチ
ン複合体を加え、２７℃で５時間培養した。１ｍｌの１
０％ＦＢＳと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地を加
え、２７℃でさらに３日間培養し、プラークが形成され
るのを確認した。培養上清を無菌的にとり、一部でＩＦ
Ｎ活性を測定し、残りをプラーククローニングに用い
た。
血清を含まないグレース培地で洗浄し、１ｍｌグレース
培地を加えた。そこに１６μｌのＤＮＡ−リポフェクチ
ン複合体を加え、２７℃で５時間培養した。１ｍｌの１
０％ＦＢＳと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地を加
え、２７℃でさらに３日間培養し、プラークが形成され
るのを確認した。培養上清を無菌的にとり、一部でＩＦ
Ｎ活性を測定し、残りをプラーククローニングに用い
た。
【００６１】プラーククローニングは以下のように行っ
た。
た。
【００６２】培養上清を１０倍段階希釈し、６穴プレー
トに接着させたＳｆ２１ＡＥ細胞に希釈した培養上清を
２００μｌ加え、１時間静置し、ウイルスを細胞に吸着
させた。１％アガロースを含むグレース培地を２ｍｌ／
穴で重層し、さらに１ｍｌの１０％ＦＢＳと０．２６％
ＢＴＢを含むグレース培地を重層し、２７℃で３日間培
養した。出現したプラークを肉眼で容易に観察するため
に、０．０１％中性赤を含むＰＢＳ（−）を１ｍｌ重層
し、一晩静置した。多核体を生産していない明瞭なプラ
ークを選び、アガロース中に分泌されているウイルス粒
子をアガロースごと切り出し、０．５ｍｌの１０％ＦＢ
Ｓと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地にいれ、超音
波により分散させた。３０００ｒｐｍ×５分間遠心し、
その上清を組換えバキュロウイルスサンプルとして４℃
で保存し、一方で、次のプラーククローニングの材料と
した。
トに接着させたＳｆ２１ＡＥ細胞に希釈した培養上清を
２００μｌ加え、１時間静置し、ウイルスを細胞に吸着
させた。１％アガロースを含むグレース培地を２ｍｌ／
穴で重層し、さらに１ｍｌの１０％ＦＢＳと０．２６％
ＢＴＢを含むグレース培地を重層し、２７℃で３日間培
養した。出現したプラークを肉眼で容易に観察するため
に、０．０１％中性赤を含むＰＢＳ（−）を１ｍｌ重層
し、一晩静置した。多核体を生産していない明瞭なプラ
ークを選び、アガロース中に分泌されているウイルス粒
子をアガロースごと切り出し、０．５ｍｌの１０％ＦＢ
Ｓと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地にいれ、超音
波により分散させた。３０００ｒｐｍ×５分間遠心し、
その上清を組換えバキュロウイルスサンプルとして４℃
で保存し、一方で、次のプラーククローニングの材料と
した。
【００６３】この操作を３回繰り返し、クローン化され
た組換えバキュロウイルスＩＢａｃβ１とＩＢａｃβ２
を得た。
た組換えバキュロウイルスＩＢａｃβ１とＩＢａｃβ２
を得た。
【００６４】（８）組換えバキュロウイルスのＣａＩＦ
Ｎ−β産生 ＩＢａｃβ１とＩＢａｃβ２をｍｏｉ＝１０でＳｆ２１
ＡＥ細胞に感染させ、経時的に培養上清をサンプリング
し、ＩＦＮ活性の生産を調べた（表２）。ＩＦＮ活性は
Ａ７２細胞を用いて以下の手順で行った。
Ｎ−β産生 ＩＢａｃβ１とＩＢａｃβ２をｍｏｉ＝１０でＳｆ２１
ＡＥ細胞に感染させ、経時的に培養上清をサンプリング
し、ＩＦＮ活性の生産を調べた（表２）。ＩＦＮ活性は
Ａ７２細胞を用いて以下の手順で行った。
【００６５】
【表２】
【００６６】イヌ由来の培養細胞、Ａ７２（大日本製薬
（株）社より購入）を３×１０5 個／ｍｌになるように
２０％ＦＢＳを含むＬ−１５（大日本製薬（株）社製）
に浮遊させ、０．１ｍｌずつを９６穴マルチウェルプレ
ートに分注した。約１日培養した後、培養液を捨て、５
％ＦＢＳを含むＬ−１５で希釈した検体を加え、１日間
検体をＡ７２細胞に作用させた。培養液及び検体を捨
て、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と５％ＦＢＳ
を含むＬ−１５存在下でＶＳＶ（Vesicular stomatitis
virus）を感染させ、２４時間後にＶＳＶ感染増殖によ
って生じる細胞変性を観察し、Ａ７２細胞のシート全体
の損傷の程度を数値化し、グラフ化した。グラフより５
０％の細胞変性を示すと予想される検体の希釈率の逆数
をＩＦＮ活性として示した。
（株）社より購入）を３×１０5 個／ｍｌになるように
２０％ＦＢＳを含むＬ−１５（大日本製薬（株）社製）
に浮遊させ、０．１ｍｌずつを９６穴マルチウェルプレ
ートに分注した。約１日培養した後、培養液を捨て、５
％ＦＢＳを含むＬ−１５で希釈した検体を加え、１日間
検体をＡ７２細胞に作用させた。培養液及び検体を捨
て、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と５％ＦＢＳ
を含むＬ−１５存在下でＶＳＶ（Vesicular stomatitis
virus）を感染させ、２４時間後にＶＳＶ感染増殖によ
って生じる細胞変性を観察し、Ａ７２細胞のシート全体
の損傷の程度を数値化し、グラフ化した。グラフより５
０％の細胞変性を示すと予想される検体の希釈率の逆数
をＩＦＮ活性として示した。
【００６７】両組換えバキュロウイルス感染細胞の培養
液中には感染２４時間後からＩＦＮ活性が見いだされ、
７２時間後に最大となり、生産量は約１０5 ユニット／
ｍｌのＩＦＮ活性に達した。また、両クローンのＩＦＮ
活性生産量はほぼ同じだった。非感染対照の培養上清で
はＩＦＮ活性は見いだされなかった。
液中には感染２４時間後からＩＦＮ活性が見いだされ、
７２時間後に最大となり、生産量は約１０5 ユニット／
ｍｌのＩＦＮ活性に達した。また、両クローンのＩＦＮ
活性生産量はほぼ同じだった。非感染対照の培養上清で
はＩＦＮ活性は見いだされなかった。
【００６８】
【発明の効果】本発明によれば、ＣａＩＦＮ−βの生物
活性を有するタンパク質を形質転換した微生物を用いて
大量に製造することができ、ワクチン以外の有効な治療
薬は知られていない犬の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、この
タンパク質を移用することが期待できるという効果が得
られる。
活性を有するタンパク質を形質転換した微生物を用いて
大量に製造することができ、ワクチン以外の有効な治療
薬は知られていない犬の抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、この
タンパク質を移用することが期待できるという効果が得
られる。
【００６９】
【配列番号１】 10 20 30 40 50 60 TGGGAAATTCCTCTGCGATAGAAAGAGGACCATCCTGTATAAATAGGGCTACACTCCTGG 70 80 90 100 110 120 TAGAAGGGCATTTGCGCTCTGAACTCTCAGAGCTTTGGCTTCAGCATCGAGATGGTAATA MetValIle 130 140 150 160 170 180 GGTGAGACTCTTCCCATTTTCATCATGACCAGTAGATGCATCCTCCAAACAACTCTCCTG GlyGluThrLeuProIlePheIleMetThrSerArgCysIleLeuGlnThrThrLeuLeu 190 200 210 220 230 240 TTGTATTTCTCCACCATGGCTCTTGCCATGAGCAACGACTTGCTTCGATCCCAGCTAAGC LeuTyrPheSerThrMetAlaLeuAlaMetSerAsnAspLeuLeuArgSerGlnLeuSer 250 260 270 280 290 300 AGCAGCAGTTTGGAGTGTCAGGAGCTCCTATTACAGTTGAATGGAACCACTGAATATTGC SerSerSerLeuGluCysGlnGluLeuLeuLeuGlnLeuAsnGlyThrThrGluThrCys 310 320 330 340 350 360 CTCAAGGACAGGATAAACTTCGAGATCCCTGAGGAAATCGAGAAATCACGCCAGTTCCAG LeuLysAspArgIleAsnPheGluIleProGluGluIleGluLysSerArgGlnPheGln 370 380 390 400 410 420 AAGGAGGACATCATATTGATCACCCATGAGATGTTCCAGAAGATCTTTGATATTTTCAGG LysGluAspIleIleLeuIleThrHisGluMetPheGlnLysIlePheAspIlePheArg 430 440 450 460 470 480 AGAAATATCTCTAGAACAGGATGGAATGAGACCACTGTCGAGAACCTTCTTGTGAAGCTC ArgAsnIleSerArgThrGlyTrpAsnGluThrThrValGluAsnLeuLeuValLysLeu 490 500 510 520 530 540 CACTGGCAGAAGGAACATCTGGAGATAATCCTGGAGGACGTCAAAGAGAAGGAAAACTTC HisTrpGlnLysGluHisLeuGluIleIleLeuGluAspValLysGluLysGluAsnPhe 550 560 570 580 590 600 ACCTGGGACAACAGGACTCTTCTGCACCTGAAGAAATATTACTTAAGGATTGTGCAGTAC ThrTrpAspAsnArgThrLeuLeuHisLeuLysLysTyrTyrLeuArgIleValGlnTyr 610 620 630 640 650 660 CTGAAGGCCAAGGAGTACAGCATCTGTGCCTGGACAATAGTCCAAGCAGAAATCTGCAGG LeuLysAlaLysGluTyrSerIleCysAlaTrpThrIleValGlnAlaGluIleCysArg 670 680 690 700 710 720 AACTTTTTCTTCCTTAATATACTTACAGATTATCTCCAGAACTGAAGATCTCTCAGCCTC AsnPhePhePheLeuAsnIleLeuThrAspTyrLeuGlnAsn*** 730 740 750 760 770 780 TGCCTCTCGGAATGGACGATGCTTGACAAGGATTTCAGGCATTCCTCAACTGGCAGATGC 790 800 810 819 TCTGTAAGTGACAGCTAATGTACTGCATTTGAAAGGACA
【図１】ＣａＩＦＮ−β遺伝子を大腸菌で発現させたプ
ラスミドの構築を示す図。
ラスミドの構築を示す図。
【図２】ヒト、、マウス、ウマ、ウシＩＦＮ−β遺伝子
とＣａＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列を、相同部分が最大
となるように並記した結果を示す。但し、ＣａＩＦＮ−
β遺伝子と同じ塩基配列の場合は「．」で示し、欠失が
認められる場合は「- 」で示した。
とＣａＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列を、相同部分が最大
となるように並記した結果を示す。但し、ＣａＩＦＮ−
β遺伝子と同じ塩基配列の場合は「．」で示し、欠失が
認められる場合は「- 」で示した。
【図３】図２の続きを示す。
【図４】図３の続きを示す。
【図５】図４の続きを示す。
【図６】図２〜図５のヒト、マウス、ウマ、ウシＩＦＮ
−β遺伝子とＣａＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列から予想
されるアミノ酸配列を相同部分が最大となるように並記
した結果を示した図。
−β遺伝子とＣａＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列から予想
されるアミノ酸配列を相同部分が最大となるように並記
した結果を示した図。
【図７】バキュロウイルストランスフファベクターの作
成法を説明するための図。
成法を説明するための図。
【図８】図７の方法で挿入されたＤＮＡ断片の方向を調
べる方法を説明する図。
べる方法を説明する図。
【図９】組換えバキュロウイルスの作製法を説明するた
めの図。
めの図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 7/00 8931−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/21 ＡＤＵ ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＵ Ｆ ＡＤＹ Ｆ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列若しくはその
一部を有するイヌインターフェロン−βの生物活性を有
するタンパク質。 - 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列若しくはその一
部を有するタンパク質をコードする遺伝子断片。 - 【請求項３】 請求項１のアミノ酸配列若しくはその一
部を有するタンパク質をコードする遺伝子断片が組み込
まれ、そのタンパク質を産生することができる合成組換
えウイルスベクター。 - 【請求項４】 請求項１のアミノ酸配列若しくはその一
部を有するタンパク質をコードする遺伝子断片が組み込
まれ、このタンパク質を産生することができる合成プラ
スミド。 - 【請求項５】 請求項１のアミノ酸配列若しくはその一
部を有するタンパク質をコードする遺伝子断片が組み込
まれ、このタンパク質を産生することができる合成プラ
スミドにより宿主細胞を形質転換した真核細胞。 - 【請求項６】 請求項１のアミノ酸配列若しくはその一
部を有するタンパク質をコードする遺伝子断片が組み込
まれ、このタンパク質を産生することができる合成プラ
スミドにより宿主細胞を形質転換した原核細胞。 - 【請求項７】 請求項１のアミノ酸配列の一部を有する
タンパク質をコードする遺伝子断片が組み込まれ、この
タンパク質を産生することができる合成プラスミドによ
り形質転換された工業技術院生命工学工業技術研究所寄
託ＦＥＲＭＰ−１４４３２号の大腸菌。 - 【請求項８】 請求項３のウイルスベクターである組換
えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染し、あるいは請求
項５又は６の形質転換された細胞、または請求項７の大
腸菌を培養し、産生される請求項１に記載のタンパク質
を分離回収することを特徴とするイヌインターフェロン
−βの生物活性を有するタンパク質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7181477A JPH0892292A (ja) | 1994-07-21 | 1995-07-18 | イヌインターフェロン−βの生物活性を有するタンパク質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-169361 | 1994-07-21 | ||
| JP16936194 | 1994-07-21 | ||
| JP7181477A JPH0892292A (ja) | 1994-07-21 | 1995-07-18 | イヌインターフェロン−βの生物活性を有するタンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0892292A true JPH0892292A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=26492723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7181477A Pending JPH0892292A (ja) | 1994-07-21 | 1995-07-18 | イヌインターフェロン−βの生物活性を有するタンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0892292A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108424915A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-08-21 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法 |
| CN108486127A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-09-04 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用 |
-
1995
- 1995-07-18 JP JP7181477A patent/JPH0892292A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108424915A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-08-21 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 犬干扰素-α2重组蛋白的制备方法 |
| CN108486127A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-09-04 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041012 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050111 |