JPH0898679A - 原始造血前駆細胞の増殖及び分化の阻害のためのインターフェロンγの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 原始造血前駆細胞の増殖及び分化の阻害への
インターフェロンγの使用に関する。 【解決手段】 本発明は原始造血前駆細胞及び造血幹細
胞を含有する試料をＩＦＮ−γとともにインキュベート
することによる上記細胞の増殖の阻害方法を提供する。
本方法は、細胞毒性処理を用いた浄化技法中に上記細胞
を保護するのに、そしてｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性処理中
に上記細胞を保護するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、原始造血前駆細胞
及び造血幹細胞の増殖及び分化の阻害のためのインター
フェロンγの使用、並びに細胞毒性処理に対する上記細
胞のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ保護における
その使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの癌患者が、その腫瘍細胞を根絶す
るために強力な化学−及び／又は放射線療法を受ける。
これは、種々の種類の化学療法又は放射線照射のいくつ
かのコースで構成されている。これらのコースは患者の
骨髄に高負担を課す：循環骨髄前駆体は損傷を受け、そ
して原始造血前駆細胞及び造血幹細胞は高分化ストレス
を受け、上記細胞枯渇の最大の危険を生じる。したがっ
て患者の骨髄を譲り及び／又は化学−又は放射線療法を
増強するために、保護手段が是認される。

【０００３】骨髄の自己移植は、例えばある種の急性白
血病、ホジキン及び非ホジキン病性リンパ腫、多発性骨
髄腫及び選択的固体腫瘍に対する強力な化学／放射線療
法から患者を護るのに重要な役割を演じる。慢性骨髄性
白血病のための培養自己骨髄の移植、精製造血幹細胞の
移植、臍帯血の移植、及び遺伝子工学処理造血幹細胞を
用いた遺伝子組み換え療法の分野において、有望な実験
的研究が広く行われている。骨髄移植のためにこれらを
使用するにはすべて、受容者に注入される前の骨髄の特
別な処理を要件とする。

【０００４】その理由は、患者が完全臨床寛解である場
合でさえ、何名かの研究者は骨髄からコロニー原性腫瘍
細胞を培養することができたからである。再発はいくつ
かの場合には骨髄を再注入した汚染腫瘍細胞により誘発
されるので、骨髄注入前にこれらの細胞を除去しようと
することは理に適っている。この技法は "浄化" と呼ば
れる。浄化は、もちろん造血前駆細胞を損なうことなく
行わねばならない。採取自己骨髄からの微量クローン原
性腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ浄化のために多くの技術
が開発されてきた。それらは免疫学的及び非免疫学的手
法として広範囲に類別される（Areman et al, (51)) 。

【０００５】非免疫学的方法では、細胞毒性剤は、非関
与造血前駆細胞を節約する一方でクローン原性白血病細
胞を根絶する手段として用いられてきた。４−ヒドロベ
ルオキシシクロホスファミド、ＡＳＴＡ−Ｚ（マフォス
ファミド）のようなシクロホスファミドの誘導体、並び
に他の化学療法薬が広範に用いられてきた。浄化は、一
般に精製単核球を薬剤とともに骨髄中で適切な時間イン
キュベーションとし、その後骨髄を洗浄し、寒冷保存す
ることにより実施する。

【０００６】放射性同位元素、光活性化染料及び照射も
用いられる。しかしながら、このような物質及び照射は
骨髄細胞をある程度損傷する。したがってｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで浄化操作中及び／又は癌治療のためのｉｎ ｖｉ
ｖｏ化学療法薬投与中は、幹細胞の保護のための方法が
必要である。血液保護獲得のいくつかの方法は、過去に
提言されている。２つの主な試験的方法が研究された。
第一の方法は、治療利益を達成するために腫瘍細胞又は
正常組織の状態を改質するための化学的改質剤の使用に
よるものである。これらはほとんどが、電離放射線又は
アルキル化剤化学療法の作用により生成される反応酸素
種並びにそれらの生成物を除去又は解毒するために薬剤
の酸化防止特性を基礎にしている。

【０００７】この群には以下のものが含まれる： １）遊離基掃去特性を有する化合物を含有する多数のス
ルフヒドリル、例えば ａ）アミノ酸システイン及びアセチルシステイン（Seli
g et al.(1)) ｂ）チオール、例えば ｂ１）システアミン（Vacek et al.(2)) ｂ２）ＷＲ２７２１（−アミフォスチン−エチオフォ
ス）＝５−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルホ
スホロチオ酸（Capizzi et al.(4)) ｂ３）ＤＤＴＣ＝ジエチルジチオカルバメート（Hanson
and Ainsworth (5))

【０００８】この種の化合物と非ステロイド系抗炎症
薬、例えばシクロオキシゲナーゼ阻害薬インドメタシン
（Hanson and Ainsworth (5)) 又はジクロフェナック
（Kozubik el at.(3))との組み合わせが記載されてい
る。この背後にある論理的根拠は、これらの薬剤がプロ
スタグランジン合成を阻害するという事実である（Hans
on and Ainsworth (5)) 。プロスタグランジンはコロニ
ー刺激因子（ＣＳＦ）合成の負の調節剤であることが公
知であり、このようなものとしてこれらの薬剤は残存造
血細胞の増殖を増大する。

【０００９】２）アラキドン酸に由来する生物学的活性
化合物であるエイコサアノイド。保護のメカニズムは、
おそらく（一部は）低酸素による（Walden (6)) 。これ
らの化合物のうち、ロイコトリエンが最も保護的である
と思われる。 ３）脂肪親和性酸化防止剤であるリポ酸は放射線保護性
であることが報告されている（Ramakrishnan et al.
(7))。

【００１０】４）カルシウム拮抗薬は致死用量の電離放
射線に対してマウスを保護することが報告されている
（Floersheim (8)) 。保護は、放射線誘発性遊離基後の
カルシウムの損傷細胞流入の妨害によるか、又はそれら
の直接不活性化による。 ５）Ｌ−ヒスチジンアミノ酸の類似体であるＬ−ヒスチ
ジノール。その作用は細胞循環中への正常細胞の流入の
選択的防止（タンパク質欠乏による）によるが、一方悪
性細胞（タンパク質飢餓に寛大である）は循環を続ける
（Edelstein (9))。第二の方法は、複合免疫学的及び造
血工程と直接相互作用する生物学的反応改質剤（免疫調
節剤）を用いることによるものである。

【００１１】これはサイトカイン及び／又は造血性成長
及び／又は阻害因子の合成を間接的に妨害することによ
るか又はこれらの因子の量を直接調節することによるも
ので、今日は組換え体形態で使用できる。免疫調節剤の
この群には、以下のものが含まれる： １）内毒素（ＬＰＳ）。細網内皮系統の細胞を刺激す
る。その病理生理学的作用は、ＩＬ−１、ＴＮＦアルフ
ァ、ＩＬ−６、ＣＳＦｓ及びインターフェロン（ＩＦ
Ｎ′ｓ）のようなサイトカインにより媒介される（Ains
worth (10)) 。

【００１２】２）微生物剤グルカン（Hofer et al. (1
1))。造血再集団を増強する免疫及び造血刺激剤。上記
のスルフヒドリル化合物又は抗炎症化合物と併用しう
る。 ３）免疫調節剤ＡＳ１０１。種々のサイトカイン（例え
ばＩＬ−１）の産生を刺激する（Kalechman et al.(1
2)) 。

【００１３】４）造血幹細胞増殖を阻害する阻害ペプチ
ドの一種： ４ａ）ｐＥＥＤＣＫ又はＩＩＰ５ｂ（Paukovits et al.
(13)) ４ｂ）Ｌｔｒｉｐ（Migliore-Samour et al.(14)) ４ｃ）ＡｃＳＤＫＰ（Bonnet et al.(15)) ５）造血刺激及び／又は阻害成長因子あるいはサイトカ
イン： ５ａ）ＩＬ−１（Bastgate et al.(16)) ５ｂ）ＴＮＦ−アルファ（Warren et al.(17))。

【００１４】これら２つのサイトカインの放射線保護作
用は、酸化防止酵素ＭｎＳＯＤの導入に関連していた
（Bastgate et al.(16))。ＴＮＦ−アルファも細胞循環
中断を誘発する（Warren et al.(17))。 ５ｃ）ＴＧＦ−ベータ（Pierce and Coffey (18)) ５ｄ）ＭＩＰ−１−アルファ（Baves et al.(19))

【００１５】ＴＧＦベータ及びＭＩＰ１アルファはとも
に、成熟状態によって骨髄前駆体に及ぼす差別的作用を
有すると思われる：初期前駆体は循環からそがいされ、
一方後期前駆体は刺激を受けたものである。 ５ｅ）Ｉ１６（Neta et al.(20)) ５ｆ）ＫＬ（Zsebo et al.(21)) ５ｇ）Ｇ−及び／又はＧＭ−ＣＳＦ（Grant et al.(2
2))

【００１６】これらの因子は真の幹細胞保護剤ではな
い：それらを投与して再生を増強し、血液形成不全の期
間を短くする。 ５ｈ）ＢＦＧＦ（Gallicchio et al.(23)) ５ｉ）インターフェロン誘導タンパク質１０（Sarris e
t al.(25))。

【００１７】いくつかの報告は前駆細胞に及ぼすＩＦＮ
−γの抑圧作用を示した（Zoumboset al.(39)), Broxme
yer et al.(40), Rigby et al.(41))。しかしこれらの
報告においては、種々の粗製ならし培地を用いて前駆細
胞増殖を刺激し、実験は相対的非精製骨髄集団を用いて
実施し、そして単一細胞検定は行われなかったので、多
くは間接的作用が恐らくは測定されたものと思われる。

【００１８】Richman et al.(24)から、インターフェロ
ンγは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの正常ヒト顆粒球／マクロフ
ァージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）を、Ａｒａ−
Ｃ曝露前１時間にＩＦＮ−γで処理した場合、Ａｒａ−
Ｃ細胞毒性から保護することが公知である。しかしなが
ら細胞残存率の増大は、非情に有意というわけではない
（２９±５％〜４５±２％）。さらにＣＦＵ−ＧＭは後
期前駆細胞であり、したがって多能性前駆細胞でない参
与細胞である。

【００１９】最後に、臨床的背景では、骨髄保護剤はそ
の作用に際して選択的であるべきであり、即ちそれら
は、腫瘍細胞は保護せずに、あるいは少なくとも低度に
しか保護せずに、特に幹細胞試料を保護すべきであるこ
とが好ましい。

【００２０】態様において、本明細書の本発明は、原始
造血細胞及び造血幹細胞を有効量のＩＦＮ−γとともに
インキュベートすることによる上記細胞の増殖のｉｎ
ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害のための方法に関す
る。本発明はさらに、好ましくはＩＦＮ−γを用いた培
養操作中の原始造血細胞及び造血幹細胞の化学保護及び
放射線保護のための方法を包含する。

【００２１】Ｉｎ ｖｉｔｒｏ浄化手法のためには約１
００〜１０，０００Ｕ／mlの濃度範囲で、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ保護のためには約１，０００，０００Ｕ／体表面積１
m²（化学療法前及び最中に週３回皮下投与される）の用
量で、保護剤としてインターフェロンγを用いるのが好
ましい。

【００２２】本発明の方法により特に提供される利点を
以下に示す： １）ＩＦＮ−γは選択的阻害剤である。 ２）その作用は完全に可逆的である。 ３）ＩＦＮ−γはそれが阻害している細胞の生存力を維
持する。 ４）ヒトにおけるＩＦＮ−γの薬物動態及び動力学は十
分公知である（例えば慢性肉芽腫性疾患の処置（New En
gland Journal of Medicine (53)) における、例えば難
治性散在性非結核性ミコバクテリア感染（Holland et a
l.(54));そして最後に ５）ＩＦＮ−γがいくつかの場合に抗腫瘍作用を有する
ことは既に立証されている。

【００２３】本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの原始造血前駆細胞及び造血幹細胞を有効量の
ＩＦＮ−γとともにインキュベートすることによる上記
細胞の増殖の阻害のための方法を提供する。有効量は、
阻害される細胞／mlの量に、そして細胞培地並びに細胞
毒性測定の種類及び量に依る。このような細胞毒性測定
は、例えば細胞毒性剤のような物質の付加、または光放
射の使用である。しかしながら、１００〜１０，０００
Ｕ／ml、好ましくは５００〜５０００Ｕ／mlの濃度で、
又は最も好ましくは約１０００Ｕ／mlの濃度（ＥＭＣ−
ウイルス／Ｌ−細胞標準系による活性）でＩＦＮ−γを
用いるのが有用である。

【００２４】有効量は、原始造血前駆細胞及び造血幹細
胞の適用濃度、並びに適用浄化法に依る。しかしなが
ら、上記細胞の血液保護が如何に有効であるかを測定す
ることにより、それは容易に検出できる。このような方
法は、当業界では公知である。例えばＩＦＮ−γによる
血液保護は、化学療法薬（例えばアドリアマイシン）と
組み合わせたＩＦＮ−γを用いて上記細胞を予備インキ
ュベートし、その後古典的予備ＣＦＵ検定（薬剤及びＩ
ＦＮ−γを洗浄後）することにより評価し得る。

【００２５】原始造血前駆細胞及び造血幹細胞に及ぼす
ＩＦＮ−γ作用の保護効力は十分に可逆的である。した
がってＩＦＮ−γを細胞から除去後、上記細胞は適切な
条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで増殖
し、分化する。初期造血細胞に関して検定する（即ち予
備ＣＦＵ検定）ＩＦＮ−γを除去し、結果を対照実験
（ＩＦＮ−γを付加しない）と比較することにより、可
逆性を確証しうる。

【００２６】本発明はさらに、クローン原性腫瘍細胞を
除去するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉ
ｖｏ造血細胞試料（即ち骨髄又は可動化末梢血前駆細胞
及び／又は幹細胞）を浄化する方法であって、上記細胞
の増殖を刺激中に、そして好ましくは分化中にも、好ま
しくはサイトカインにより、原始造血前駆細胞及び造血
幹細胞の増殖を約７０％、好ましくは約１００％の程度
まで、阻害する量のＩＦＮ−γの存在下で浄化が行われ
ることを特徴とする方法を提供する。

【００２７】このようなサイトカインは、例えばＩＬ−
３，ＩＬ−１，ＩＬ−０，ＫＬ，ＥＰＯ，ＧＥＳＦ及び
／又はＧＭ−ＣＳＦである。意外にも、ＩＦＮ−γは、
さらに幹細胞残存増強作用を有することが判明した。４
日後に、ＩＦＮ−γを含有する原始造血前駆細胞及び造
血幹細胞の培養中で１００細胞のうち６８が初期に残存
を示した。ＩＦＮ−γの支持を何ら伴わない対照実験
中、１００細胞のうち３１だけが初期に残存を示した。

【００２８】細胞増殖の刺激下での浄化中のＩＦＮ−γ
処理の一利点は、極初期の幹細胞（原始造血前駆細胞及
び造血幹細胞）のみが残存することである。顆粒球／マ
クロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）として
の前駆細胞は相当程度まで（好ましくは少なくとも約７
０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％又は９
５％以上の程度まで）死亡する。

【００２９】したがって本発明の浄化方法は、さらに完
全且つ明確な腫瘍細胞（前駆細胞の段階にある）の破壊
を与えるという利点を提供する。本発明のさらなる態様
は、クローン原性腫瘍細胞を除去するために造血細胞試
料（即ち骨髄又は可動化末梢血前駆細胞及び／又は幹細
胞）を浄化する方法であって、かなりの程度まで（好ま
しくは少なくとも約７０％、好ましくは８０％、最も好
ましくは９０％以上の程度まで）関与前駆細胞を殺害す
る高用量の細胞毒性剤の存在下で、原始造血前駆細胞及
び造血幹細胞の増殖を約７０％の程度まで、好ましくは
約１００％阻害する量のＩＦＮ−γの存在下で浄化が行
われることを特徴とする方法である。

【００３０】本発明のさらに別の態様は、細胞培養中の
原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の生存率を増大する方
法であって、ＩＦＮ−γの存在下で細胞培養を実施する
ことを特徴とする方法である。本発明のさらなる態様
は、原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の増殖を阻害する
量のＩＦＮ−γの存在下で且つ上記細胞の増殖の刺激中
に、又は高用量の細胞毒性剤の存在下で、細胞毒性剤を
用いて浄化することによる、クローン原性腫瘍細胞を実
質的に含有しない原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の試
料の調製方法である。浄化技術は、Areman et al.(51)
に記載されており、この記載内容は参照により本明細書
中に含めるものとする。

【００３１】本発明のさらに別の態様は、造血細胞試料
（即ち骨髄又は可動化末梢血前駆細胞及び／又は幹細
胞）の浄化中の原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の増殖
の阻害並びに上記細胞の増殖の刺激中又は高用量の細胞
毒性剤の存在下での細胞死からの原始造血前駆細胞及び
造血幹細胞の保護のための治療薬の製造のためのＩＦＮ
−γの使用である。さらに別の態様は、癌に対する化学
療法の細胞毒性作用に対する上記細胞の保護を達成する
ためのｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのＩＦＮ−γの使用で
ある。

【００３２】本発明のさらに別の態様は、化学療法的細
胞毒性処理中の幹細胞区画の枯渇の防止のための治療薬
の製造のためのＩＦＮ−γの使用である。腫瘍治療のた
めのヒトの化学療法処置は、細胞毒性化学療法薬が数サ
イクルで、サイクル間に３〜４週間の中断を置いて適用
されるような方式で実施される。この細胞毒性処理によ
り、殆どの前駆細胞が殺害される。したがって幹細胞は
サイクル間のじかん増殖し、分化する。この結果とし
て、数サイクルの化学療法後、幹細胞区画の枯渇が患者
に観察される。ＩＦＮ−γを化学療法前、最中、及び後
に投与すると、このような枯渇が防止される。一次化学
療法サイクルの少なくとも３〜２４時間前、サイクル
中、そして好ましくはサイクル後１〜２時間までにＩＦ
Ｎ−γを投与するのが好ましい。化学療法サイクル間に
約３〜４週間の中断がある場合、これは患者が化学療法
無しの期間の半分までＩＦＮ−γを投与されることを意
味する。

【００３３】好ましい用量は、上記のように、約１，０
００，０００Ｕ／体表面積１m²である。さらに週に３回
ＩＦＮ−γを投与するのが好ましい。さらに治療薬とし
てサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦと組
み合わせてＩＦＮ−γを用いるのが好ましい。

【００３４】原始造血前駆細胞及び造血幹細胞（ＣＤ３
４＋＋ＣＤ３８−細胞）は、高増殖潜在力を有する細胞
で、関与クローン形成細胞の前駆体であって、後者は半
固体培地中で古典的クローン原性決定で検定する（Pluz
nik and Sachs (55); Ichikawa et al.(49)); Bradley
and Metcalf (50)) 。ＩＦＮ−γによるＣＤ３４＋＋Ｃ
Ｄ３８−細胞増殖の阻害は、例えば懸濁培養中で測定さ
れる。ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞をＩＦＮ−γを用い
て及び用いずに増殖させる。１週間後、残存細胞を計数
する。有効量のＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−γを含有しない
対照に対して少なくとも７０％、好ましくは約１００％
の上記の細胞を阻害する。

【００３５】原始ヒト造血前駆細胞及び造血幹細胞は、
ＣＤ３４の高発現及びＣＤ３８発現の非存在（ＣＤ３４
＋＋ＣＤ３８−細胞）を特徴とする。分化及び血統関与
に際して、ＣＤ３８の発現は増大し、一方ＣＤ３４の発
現は低減する（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞）（Terstapp
en et al.(33), Huang and Terstappen (34)) 。これら
の極原始ヒト前駆細胞の発達の初期段階に及ぼすＩＦＮ
−γの作用を調べるたに、我々は前コロニー形成細胞
（前ＣＦＣ）検定を用いた（Iscove et al.(35),Smith
et al.(36))が、この場合は二次コロニー形成細胞（Ｃ
ＦＣ）の排出に及ぼすＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の一
次培養中のＩＦＮ−γの存在の効力を調べた。ＩＦＮ−
γは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞ではなくＣＤ３４＋＋
ＣＤ３８−細胞の有力且つ選択的直接阻害剤である。Ｉ
ＦＮ−γは、造血ストレスの情況における枯渇から幹細
胞を保護するに際してある役割を演じ、癌のための化学
療法に対する造血幹細胞の特異的保護に有用である。
"原始造血前駆細胞及び造血幹細胞" 並びに "ＣＤ３４
＋ＣＤ３８＋細胞" という用語は、本出願においては同
義語として用いる。

【００３６】半固体培地中でコロニーを形成してなＣＤ
３４＋＋ＣＤ３８−細胞は刺激されて懸濁培養中でＣＦ
Ｃに分化しないため、用いた検定はＣＦＣの極原始前駆
体を同定した。本発明のデータによれば極初期前駆体で
あると考えられる（Bradleyand Hogson (37), McNiece
et al.(38))ＨＰＰ−ＣＦＣの前駆体を含有するＣＤ３
４＋＋ＣＤ３８−細胞は、最原始造血前駆体の一つであ
ることが公知である（Terstappen et al.(33), Huang a
nd Terstappen (34)) 。二次培養中では主にマクロファ
ージを含有するコロニーを回収したという事実は、ここ
では原始細胞が殆ど検出されないことを示す。しかしな
がら、ＨＰＰ−ＣＦＣは主に大型マクロファージ様細胞
で構成されるということを多くの著者が示している（Br
adley and Hogson (37), McNiece et al.(38))。さらに
Lu et al.(52) は、原始ＣＤ３４＋＋索血細胞から生じ
た高再プレート化能力を有するコロニーが主に大型マク
ロファージ様細胞で構成されることを示した。これらの
ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定における幹細胞の発達はしたがっ
て、マクロファージ血統に偏るものと思われる。これは
二段階培養系であるため、この検定により、分化の最終
段階（ＣＦＣから成熟細胞へ）に及ぼすＩＦＮ−γのい
かなる作用の妨害もなしに、原始前駆細胞の（前ＣＦＣ
からＣＦＣへの）発達の初期相に及ぼすＩＦＮ−γの直
接作用が特性付けられるが、この場合、ＩＦＮ−γは刺
激作用を有することが示されていた（Caux et al.(27),
Kawano et al.(28), Snoeck et al.(29), Shlohara et
al.(30), Muro hashi and Hoang (31))。

【００３７】原始造血前駆細胞の分化及び増殖は、コロ
ニー刺激因子（ＣＳＦ）により、そしてＣＳＦと共働し
て作用して前駆細胞の成熟細胞への発達を刺激するサイ
トカインによりしっかり調節される（Ogawa (26)) 。近
年、いくつかの報告が、インターロイキン（ＩＬ）−３
（Caux et al.(27), Kawano et al.(28), Snoeck etal.
(29))、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Caux
et al.(27), Kawanoet al.(28), Snoeck et al.(29))、
ｃ−キット配位子（ＫＬ）（Shiohara et al.(30))及び
ＩＬ−３とエリスロポイエチン（ｅｐｏ）との組み合わ
せ（Murohashi and Hoang (31)) といった他の血液調節
サイトカインと共働した造血前駆細胞に及ぼすインター
フェロンγの直接刺激作用を立証した。さらに、ＩＦＮ
−γは、ＩＬ−３，ＩＬ−６，ＩＬ−１，ｅｐｏ及びＫ
Ｌにより誘発される前駆細胞の増殖を刺激し（Brugger
et al.(32)) 、ＩＬ−３により支持される急性骨髄芽球
白血病の成長（Murohashi and Hoang (31)) を刺激す
る。しかしながらＧＣＳＦ反応性顆粒球前駆体の成長
は、ＩＦＮ−γにより直接阻害される（Snoeck et al.
(29))。

【００３８】本発明は意外にも、ＩＦＮ−γが極原始Ｃ
Ｄ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の増殖及び分化の初期段階を
直接刺激するがＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞に及ぼす阻害
作用は示さないという事実により立証されるように、そ
の阻害作用が極原始前駆及び幹細胞に対する非情に強力
な特異性を示す造血の直接二方向性調節剤としてＩＦＮ
−γを同定する。ＩＬ−３＋ＫＬにより支持されるＣＤ
３４＋＋ＣＤ３８−細胞の一次培養におけるＩＦＮ−γ
により誘発される二次コロニー形成における小さな低減
は（図２Ａ）、このサイトカイン組み合わせにより刺激
されるＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞がおそらく増殖する
ために３又は４個のサイトカインの組み合わせを要する
細胞よりも原始性が低いために、同一情況で説明され
る。これらの作用はさらに、それらが単一細胞培養実験
において認められたため、疑いなく直接作用である。

【００３９】多数の細菌の報告（Snoeck et al.(29))
が、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦと共働してヒト造血前駆
細胞に及ぼすＩＦＮ−γの直接刺激作用を立証してい
る。幾つかの報告は、ＩＦＮ−γがネズミ系におけるよ
り原始的な前駆体に及ぼす選択的刺激作用を有すること
を示唆しさえする（Shiohara et al.(30))。しかしなが
らこれらの報告においては、単一ＣＳＦに反応する前駆
細胞に及ぼすＩＦＮ−γの作用が査定されており、この
ことはより成熟した前駆細胞が試験されたことを示す。

【００４０】意外にも、本発明によれば、ＩＬ−３，Ｉ
Ｌ−１，ＩＬ−６及びＫＬ及びｅｐｏにより刺激される
より成熟したＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団の増殖及び
分化をＩＦＮ−γは阻害しないし、刺激もしない。ＩＦ
Ｎ−γが末梢血ＣＤ３４＋細胞を用いた同一の４つのサ
イトカイン組み合わせにより誘発されるＣＦＣの増殖を
刺激することを示したBrugger et al.(32)のデータは、
ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞に関しては確証できない。
標的細胞集団及び純度における、又は細胞単離操作及び
培養における差異は、この矛盾を説明す。造血の負の調
節剤として同定された他のサイトカイン、即ちＴＧＢ−
β（Ohta et al.(42), Keller et al.(43), Sing et a
l.(44))、及びサイトカインのケモキン族のいくつかの
成員（その１つであるＭＩＰ−１α）（Graham et al.
(45), Broxmeyer et al.(46), Broxmeyer et al.(47))
はＩＦＮ−γに対比して原始前駆細胞の阻害に対する選
択性を示す傾向がある（Caux et al.(27), Kawano et a
l.(28), Snoeck et al.(29))が、それらはさらに、単一
ＣＳＦに又は２つの成長因子の組み合わせに反応する関
連初期ヒト赤血球及び骨髄球様前駆細胞を阻害する（Si
ng et al.(44), Grahamet al.(45), Broxmeyer et al.
(46)) 。より成熟した前駆細胞の中で、中性球血統に関
与する相対的に成熟した前駆体のＧ−ＣＳＦ誘発性増殖
のみがＩＦＮ−γに直接阻害される（Snoeck et al.(2
9))。

【００４１】全く意外なことに、ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８
−細胞の成長因子誘発性増殖を阻害する上に、ＩＦＮ−
γはさらに他のサイトカインの非存在下でのそれらの生
存率を維持する。このような現象はＴＧＦ−β及びＭＩ
Ｐ−１αに関しては記載されていない。ＩＦＮ−γがよ
り成熟したヒト関連赤血球及び骨髄球様前駆細胞の残存
を促すことは既に示された（Snoeck et al.(48))。ＩＦ
Ｎ−γはおそらく前駆細胞の枯死を阻害する。しかしな
がら骨髄試料から単離され得るＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−
細胞数が極く限られているために、このメカニズムはＤ
ＮＡ梯子を立証する事によっても又は流動血球計算によ
っても確証できない。

【００４２】ＩＦＮ−γは同時に極原始的な前駆細胞の
増殖及び細胞死を阻害し、より成熟した前駆体の増殖を
刺激する炎症性サイトカインであるため、感染、炎症及
び血液損失といったような血液細胞に対する要求が増大
する情況では、それは関与前駆細胞の拡張、並びにそれ
らの成熟細胞への増殖及び分化を刺激し（Caux et al.
(27), Kawano et al.(28), Snoeck et al.(29), Shioha
ra et al.(30), Murohashi and Hoang (31), Brugger e
t al.(32)) 、一方同時に漸増から極原始的幹細胞区画
の細胞を節約し、したがってこの区画を枯渇から護る。
したがつてＩＦＮ−γは、細胞サイクル特異的薬剤に対
する幹細胞保護剤として癌に対する化学療法の場合に有
用である。

【００４３】さらに別の本発明の態様において、ＣＤ３
４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞を実質的に含有しない原始
造血前駆細胞と造血幹細胞の混合物の調製方法であっ
て、造血細胞試料（即ち骨髄又は可動化末梢血前駆細胞
及び／又は幹細胞）に細胞毒性処理を施し、そして原始
造血前駆細胞及び造血幹細胞を死ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋
造血前駆細胞から分離することを特徴とする方法が提供
される。分離は、当業界に公知の方法で実施する。例え
ば密度勾配、抗ＣＤ３４抗体を含有するカラム、又はマ
ーカー分離を用いる。このような混合物は、少なくとも
６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の程
度までＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞を含有しない。本試料
は、この試料が腫瘍細胞を含有しないという高確実性を
有するため、特に自己又は同種異系幹細胞移植に有用で
ある。

【００４４】本発明の好ましい態様において、細胞成
長、細胞毒性処理及び／又は浄化は、ＩＬ−１，ＩＬ−
３，ＩＬ−６，ＫＬ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ及び／
又はＥＰＯといったようなサイトカインの存在下で実施
する。以下に実施例で本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明の真の範囲は請求の範囲に記載されている。
本発明の精神から逸脱しないかぎりにおいて、手法の修
正がなされ得ると理解される。

【００４５】

【実施例】

実施例１ 骨髄細胞の単離 骨髄試料を、心臓手術を施されている血液学的に正常な
患者から、アントワープ大学の倫理委員会Bthics Commi
ttee of the University of Autwerp の規定に従ったイ
ンフォームドコンセント後に、胸骨穿刺により２ml Ｉ
ｓｃｏｖｅの修正ダルベッコ培地（IMDM, GIBCO, Paisl
ey, UK) 及び５Ｕ／ml防腐剤無含有ヘパリン（Novo Ind
ustries, Denmark) を含有する試験管内に吸引した。細
胞をリンパ球分離培地（LSM, Boehringer Mannheim Gmb
H, Germany) 密度勾配上で分離し、２回洗浄した。残り
のＲＢＣをＮＨ₄ Ｃｌ含有溶解液を用いて溶解した。

【００４６】実施例２ サイトカイン及びモノクローナル抗体 ＵＳＰ４，７１４，６８０；４，９６５，２０４及び
５，０３５，９９４にしたがって抗ＣＤ３４抗体を産生
した。ＦＩＴＣ抱合ウサギ抗マウスイムノグロブリンＦ
（ａｂ′）２断片（ＲＡＭ）をDako (Glostrup, Denmar
k)から購入した。フィコエリトリン（ＰＥ）−及びＰＥ
−抱合抗ＣＤ３８（ＩｇＧＩ）抗体、並びに特定の同種
の対照抗体はBecton Dickinson (Erembodegem, Belgiu
m) から購入した。モノクローナル中和抗ＩＦＮ−γ
（モノクローナル抗インターフェロン抗体、ヒトＩｇ
Ｇ、カタログ番号１２９６８２５）及び無関係な対照抗
体（モノクローナル抗ジゴキシゲニン抗体ＩｇＧ、カタ
ログ番号１３３３０６２）は、Boehringer Mannheim Gm
bH, Germany から入手した。組換え体ヒトＩＦＮ−γ
（特異的活性２．１０⁷ Ｕ／mg）、ＩＬ−６（１０⁸ Ｕ
／mg）及びＩＬ−１（５．１０ ⁷ Ｕ／mg）もBoehringer
Mannheim GmbH, Germany から入手した。エリトロポイ
エチンはCilag (Brussels, Belgium, １０⁵ Ｕ／mg）か
ら購入した。

【００４７】実施例３ 細胞分類 骨髄細胞を、１０⁷ 細胞／mlで１／１０希釈液中で４３
Ａ１上清とともに４℃で２０分間インキュベートし、２
％ＦＣＦを含有するＩＭＤＭで２回洗浄して、フルオレ
セイン処理したＲＡＭ（１／５０希釈液）とともに４℃
で２０分間インキュベートし、再び２回洗浄した。細胞
をＩＭＤＭ＋２％ＦＣＦで２回洗浄後、それらを空冷ア
ルゴンイオンレーザーＩＬＴモデル５５００Ａ（Ion La
ser Technoloygy, Salt Lake City, UT)を装備したＦＡ
ＣＳｔａｒＰＬＵＳ細胞分類機（Becton Dickinson, Er
embodegem, Belgium) で分類した。アルゴンイオンレー
ザーを装備したＦＡＣＳｔａｒＰＬｕｓ細胞分類機（Ｂ
ＤＩＳ）を用いて、低〜中前方散乱、低側散乱、対照抗
体で標識した平均蛍光より低い高度陽性緑（ＣＤ３４）
蛍光及び橙（ＣＤ３８）蛍光シグナル＋２標準偏差を分
類した。純度は常に＞９５％であった。

【００４８】実施例４ 予備ＣＦＵ検定 Ｉｓｃｏｖｅの修正ダルベッコ培地、１０％ウシ胎児血
清及び以下の組換え体ヒトサイトカイン：１００ng／ml
ＩＬ−１、２００Ｕ／ml ＩＬ−６、１００ng／ml
Ｇ−ＣＳＦ、３０Ｕml／ml ＩＬ−３、１００ng／ml
ＫＬ、及び種々の濃度のＩＦＮ−γ中で、１００細胞／
ウエルで９６ウエル平底プレート中で二通りに一次液体
培養を実施した。１４日の一次培養液、各ウエル中の細
胞数を倒立顕微鏡を用いて２５０倍で計数し、その後細
胞を採集して、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＦで３回洗浄後、
２０％ＦＣＦ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１
０ ^-5Ｍ２−メルカプトエタノール、３０Ｕ／ml ＩＬ−
３、１００ng／ml Ｇ−ＣＳＦ、１００Ｕ／ml ＧＭ−
ＣＳＦ及び２Ｕ／ml ｅｐｏを補充した二次メチルセル
ロース培地（０．９％）中に広げた。これは予備実験に
おけるコロニー形成に対して最適濃度であった。これら
の培養は、１４日培養後及び２１日培養後に３７℃で５
％Ｏ₂ 及び５％ＣＯ₂ 中で十分湿潤インキュベーター中
で、コロニー形成に関して顕微鏡でスコアリングした。

【００４９】これらの実験におけるＩＦＮ−γの作用が
直接的であったことを確かめるために、単一細胞レベル
で同一実験を実施した。ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞を
９６ウエルＶ底プレート中で１細胞／ウエルで分類した
（２プレート／サイトカイン組み合わせ）。蛍光ミクロ
ビーズを用いた試験分類において、平均して２％未満の
ウエルがビーズを含有せず、１より多いビーズを含有し
たウエルは検出されなかった。各ウエルは、ＩＭＤＭ、
１０％ＦＣＦ、ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−３及びＫＬ
（図１に記載の一次培養と同じ濃度）で構成され、ＩＦ
Ｎ−γを含まないか又は１０００Ｕ／mlのＩＦＮ−γを
含む１００μｌの培地を含有した。１４日培養（３７
℃、５％Ｏ₂ 及び５％ＣＯ₂ 中で十分湿潤インキュベー
ター中で）後、成長が起きた（一次コロニー）ウエルの
数を倒立顕微鏡を用いてスコアリングし、一次コロニー
を採集して、４回洗浄し、上記のように二次メチルセル
ロース培地（０．９％）中に個々に広げた。二次コロニ
ー形成は、１４日及び２１日二次培養後に観察された。
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞（ＣＤ３４＋細胞の残りを構
成）を用いて、平行実験を実施した。

【００５０】多数の実験において、細胞を先ずＩＦＮ−
γの存在下又は非存在下で、いかなる他のサイトカイン
も用いずに、９６ウエル平底プレート中で４日間培養
し、その後、残存細胞数を位相差顕微鏡（２５０倍）を
用いて計数した。縮んで外見がハッキリせず、細胞膜に
しわが寄った細胞は、死細胞であると考えられて、計数
しなかった。次に細胞を採集して、洗浄し、液体培地中
でＫＬ（１００ng／ml）ＩＬ−１（１００ng／ml）、Ｉ
Ｌ−６（２００Ｕ／ml）及びＩＬ−３（３０Ｕ／ml）の
存在下で１４日間培養した。１４日間培養後、細胞を採
集し、洗浄して、上記のように二次メチルセルロース培
養中に広げた。全実験で、対合試料に関してスチューデ
ントｔ検定を用いた。

【００５１】実施例５ ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞分画は、０．０１〜０．０
５％のヒト骨髄細胞及び１〜５％のＣＤ３４＋細胞を包
含する。これらの細胞は、インターロイキン（ＩＬ）−
３のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロ
ファージＣＳＦ、及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、
並びにエリトロポイエチン（ｅｐｏ）の組み合わせの存
在下で半固体メチルセルロース培養中に直接広げると、
いかなるコロニーもほとんど形成しない（クローニング
効率２％未満。結果は示していない）。しかしながら、
一次液体培養中で多数初期作用因子の組み合わせ（再検
討のために、（２６）参照）の存在下で１４日間培養す
ると、ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞は前駆細胞を生じ、
これは二次メチルセルロース培養中にコロニーを形成す
る（二次コロニー形成細胞（ＣＦＣ））。二次ＣＦＣを
生成するために、ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞は一次液
体培養中に少なくともＩＬ−３、ｃ−キット配位子（Ｋ
Ｌ）及び，ＩＬ−１，ＩＬ−６又はＧ−ＣＳＦの存在を
要する（図１）。二次ＣＦＣはＩＬ−３又はＫＬの非存
在下では生成せす（図１）、２〜３の二次ＣＦＣのみが
ＩＬ−３又はＫＬの存在下で、一次液体培養中にいかな
る他の共働因子も含有せずに産生した（図１）。ＣＤ３
４＋＋ＣＤ３８−細胞から生成した二次コロニーは、主
に骨髄球コロニーで、赤血球又は赤血球／骨髄球混合コ
ロニーは２％未満であった。骨髄球コロニーはほとんど
が大型マクロファージで構成された。一次培養にｅｐｏ
を付加しても、二次コロニーの数又は形態には何ら影響
を及ぼさなかった。二次培養を２１日目にスコリングす
ると、二次高増殖性ＣＦＣ（ＨＰＰ−ＣＦＣ、密度中心
で直径＞２mmの肉眼的コロニーと定義。主に大型マクロ
ファージ様細胞から成る）が認められた（図２）。これ
らのＨＰＰ−ＣＦＣは、他の型のコロニーより原始的な
前駆細胞から生じたと考えられる（Bradley and Hogson
(37), McNiece et al.(38))。

【００５２】実施例６ 単一細胞培養におけるＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞及び
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞に及ぼすＩＦＮ−γの作用 ａ）ＩＦＮ−γはＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の増殖及
び分化を阻害する ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の増殖を誘発するサイトカ
イン組合わせにより刺激されるＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−
細胞の一次液体培養（１００細胞／ウエル）にＩＦＮ−
γを付加すると（図１参照）、細胞増殖、並びに二次Ｃ
ＦＣ及び二次ＨＰＰ−ＣＦＣの世代が、用量依存的に顕
著に阻害され、５０００Ｕ／mlでほぼ完全な阻害が生じ
た（図２及び図３〜５）。ＩＦＮ−γの阻害作用はあま
り顕著ではなかったが、しかしＩＬ−３＋ＫＬにより刺
激された培養においては依然として統計的に有意であっ
た（図２）。ＩＦＮ−γの阻害作用は、ヒトＩＦＮ−γ
に対する中和抗体を培養に加えることにより遮断された
（図３〜５）。

【００５３】この阻害がＩＦＮ−γの直接作用であるか
否かをみるために、ＩＬ−３，ＩＬ−１，ＩＬ−６及び
ＫＬの存在下で、ＩＦＮ−γを含んで又は含まずに、９
６ウエルプレート中に１細胞／ウエルでＣＤ３４＋＋Ｃ
Ｄ３８−細胞を分類することにより、一次液体培養を単
一細胞レベルで実施した。顕微鏡評価で査定した場合に
成長が起きていた（一次コロニー）ウエルを取り出し
て、洗浄し、ＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ及び
ｃｐｏを補充したメチルセルロース培養中に個別に広げ
た。これらの単一細胞培養実験において、一次培養中の
ＩＦＮ−γの存在が、ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞を１
００細胞／ウエルで培養した実験の場合と同じ程度に二
次ＣＦＣの総数を阻害した（それぞれ１０００Ｕ／mlの
濃度で−６７．５±１３．７％対−６９．１％±４．３
％、ｎ＝４）が、これはＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の
増殖に及ぼすＩＦＮ−γの阻害作用が直接的なものであ
ったことを示す。ＩＦＮ−γは主に、一次コロニーを形
成するＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の数を阻害し（表１
Ａ）、一方個々の一次コロニー当たりの二次ＣＦＣの数
は低度に阻害された（表１Ｂ）。

【００５４】表１ 単一細胞培養におけるＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞及び
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞に及ぼすＩＦＮ−γの作用 Ａ．ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−３及びＫＬにより支持
される単一細胞液体培養中の１００細胞当たりの一次コ
ロニー数

【００５５】

【表１】 Ｂ．一次コロニー当たりの二次ＣＦＣ数

【００５６】

【表２】 （１）ＩＦＮ−γ濃度：１０００Ｕ／ml^-1 （２）ＩＦＮ−γを含有しない培養と比較して％に換算
した相対的差として表した平均差（Ｄ） （３）個々の実験の数 （４）用いた統計法：対合試料に関するスチューデント
ｔ検定

【００５７】ｂ）ＩＦＮ−γはより成熟したＣＤ３４＋
ＣＤ３８＋細胞を阻害しないＣＤ３４＋ＣＤ３８＋骨髄
細胞（残りのＣＤ３４＋細胞を構成する）を用いて、同
一単一細胞培養実験を実施した（表１）。際立って、Ｉ
Ｌ−３，ＩＬ−１，ＩＬ−６及びＫＬの存在下でこの集
団から生成された６．７±２．５％の一次コロニーだけ
が、二次ＣＦＣを含有し（ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−集団
由来の一次コロニーに関する９５．３±２．４％と比
較、ｐ＝０．０００１）、われわれはＣＤ３４＋ＣＤ３
８＋細胞に由来する個々の一次コロニー当たり１０以上
の二次ＣＦＣも観察せず、あるいはいかなる二次ＨＰＰ
−ＣＦＣも観察しなかった。これは、この培養系が極原
始的ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞とより成熟したＣＤ３
４＋ＣＤ３８＋細胞とを非常に明確に機能的に区別する
ことを示す。ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞に及ぼすＩＦ
Ｎ−γの作用に対比して、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞の
一次培養にＩＦＮ−γを付加しても、一次コロニー数
に、あるいは二次ＣＦＣ数に影響はなかった（表１）。
さらにＩＦＮ−γは、ｅｐｏ，ＩＬ−１，ＩＬ−６，Ｋ
Ｌ及びＩＬ−３により支持されるＣＤ３４＋ＣＤ３８＋
細胞の単一細胞メチルセルロース培養におけるコロニー
形成を阻害しなかった（１０³ Ｕ／ml ＩＦＮ−γを含
まない平均クローニング効率３０．８±２．６％；ＩＦ
Ｎ−γ含有効率：２７．５±３．２、ｎ＝６、ｐ＝０．
３５）。合わせて考えると、これらのデータはＩＦＮ−
γが、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞ではなく、極原始的Ｃ
Ｄ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の増殖及び分化の高選択性及
び直接阻害剤であることを示す。

【００５８】ｃ）ＩＦＮ−γはＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−
細胞の生存を刺激する ＩＦＮ−γ中でのＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞の予備イ
ンキュベーションがそれらのその後の二次ＣＦＣを生成
する能力に作用するか否かをみるために、培地（ＩＭＤ
Ｍ、１０％ＦＣＳ）中で又はＩＦＮ−γを含有する培地
中でＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞を先ず４日間培養し、
その後細胞を洗浄して、上記のように予備ＣＦＣ検定を
実施した。サイトカインを含有しない培地中で、又はＩ
ＦＮ−γ（１０³ Ｕ／ml）を含有する培地中で４日間の
予備培養後、細胞を洗浄して、ＩＬ−３，ＫＬ，ＩＬ−
６及びＩＬ−１の存在下でさらに１４日間培養した結
果、ＩＦＮ−γの非存在下の場合よりも、ＩＦＮ−γの
存在下で４日間予備培養した細胞から有意により多くの
二次ＣＦＣを回収下（平均差＋１１７±２６％、ｐ＝
０．０２、ｎ＝４）。２５０倍の位相差顕微鏡で培養ウ
エル中で計数して確定されたように、サイトカイン含有
しない４日間培養後より多くの形態学的無傷の細胞がＩ
ＦＮ−γを含有する４日間培養後に回収されたため（そ
れぞれ投入細胞数の６８．５±２．９％及び３１±４．
８％、ｐ＝０．０００８、ｎ＝５、１０³Ｕ／ml ＩＦ
Ｎ−γ）、この作用はＩＦＮ−γの生存増強作用に依
る。細胞数に及ぼす、そして二次ＣＦＣを生成する能力
に及ぼす作用はともに、５０Ｕ／mlのＩＦＮ−γ濃度で
プラトーに達した（即ち予備ＣＦＣの増殖及び分化の完
全阻害が認められるより２対数低い濃度）（図２参
照）。これらのデータは、ＩＦＮ−γがＣＤ３４＋＋Ｃ
Ｄ３８−細胞の生存を促進し、ＩＦＮ−γ中での予備イ
ンキュベーションはそれらのその後の増殖能力を阻害し
ないことを示す。

【００５９】実施例７ インターフェロンγ存在下での４−ヒドロベルオキシシ
クロホスファミドによる軟膜細胞の処理（浄化） 自己移植のための骨髄試料から、残存骨髄腫細胞を浄化
した。次に浄化骨髄を凍結し、全身照射を用いて又は用
いずに、骨髄致死化学療法で患者を処置した。浄化骨髄
を解水し、化学療法から患者を護るために注入した。

【００６０】骨髄を採集し、E.M.Areman et al.(51) に
したがって軟膜細胞を調製した。E.M.Areman et al.(5
1) にしたがって４−ＨＣによる軟膜の処理を実施した
が、但しＩＦＮ−γを付加し、予備インキュベートし
た。ＩＦＮ−γを１０００Ｕ／mlの最終濃度で付加後、
４−ＨＣを加える前に軟膜試料を３７℃水浴中に１時間
入れた。４−ＨＣ（２００mgバイアル）を２０mlの室温
Ｔｃ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ３２０−１１５１）中に再
構築した。この結果、１０mgの４−ＨＣ／mlを含有する
溶液を生じた。

【００６１】適切な量の溶解４−ＨＣ（詳細に関して
は、Areman et al.(51), 236-239) ページ参照）を注射
器に取り付けた０．２２μｍのフィルターを通してイン
キュベーション袋中に付加した。３０分間インキュベー
ション後、細胞を６００ml袋に移した。袋を４℃で１０
分間、２９００rpm で遠心分離して、血漿表示機に入れ
た。細胞を失わないようにして、できるだけ多くの培地
を除去した。標準的手法により、移植片を最後に凍結し
た。

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【図面の簡単な説明】

【図１】二次ＣＦＣの世代に及ぼすＹ軸上に記載したサ
イトカイン組み合わせの存在下での精製ＣＤ３４＋＋Ｃ
Ｄ３８−骨髄細胞の一次培養の作用。結果は１００個の
ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８−細胞当たりの二次ＣＦＣの数と
して表した（平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）。個々の
実験の数値を図の右手側に示す（ｎ）。

【図２】二次コロニーの世代に及ぼすＹ軸上に記載した
サイトカイン組み合わせにより支持されるＣＤ３４＋＋
ＣＤ３８−細胞の１４日一次液体培養におけるＩＦＮ−
γにより誘発される相対的阻害（結果は平均±ＳＥＭと
して表す）。個々の実験の数値を図の右手側に示す
（ｎ）。ＩＦＮ−γ誘発性阻害は、全手の場合において
統計的に有意であってた（ｐ＜０．０５、対合試料に関
するスチューデントｔ検定）。

【図３】ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−３及びＫＬを伴う
ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８細胞の１４日一次液体培養後の全
一次液体培養細胞数に及ぼすＩＦＮ−γ（△）、ＩＦＮ
−γ＋中和抗ＩＦＮ−γ抗体（○）及びＩＦＮ−γ＋無
関係な対照抗体（●）の作用の用量反応曲線。結果（平
均±ＳＥＭ）は、ＩＦＮ−γを含有しない一次培養と比
較した阻害のパーセンテージを表した。ＩＦＮ−γを含
有しない１４日一次培養後の細胞数は１３１８±３５
４、二次１４日目ＣＦＣの数は４７３±６４及び二次２
１日目ＨＰＰ−ＣＦＣは６１±１０／１００ＣＤ３４＋
＋ＣＤ３８−細胞の投入量であった（二通りに実施した
５つの個々の実験のプール結果）。

【図４】ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−３及びＫＬを伴う
ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８細胞の二次１４日目ＣＦＣに及ぼ
す個々のＩＦＮの用量反応曲線を示す。

【図５】ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−３及びＫＬを伴う
ＣＤ３４＋＋ＣＤ３８細胞の二次２１日目ＰＰ−ＣＦＣ
に及ぼす個々のＩＦＮの用量反応曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ディルク ファン ボックステール ベルギー国，ベ−2650 エデゲム，パウル ギルソンラーン 27 (72)発明者 ハンス−ビレム スノエック ベルギー国，ベ−2000 アントベルペン, クロネンボルグストラート 28

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 原始造血前駆細胞及び造血幹細胞を有効
   量のＩＦＮ−γとともにインキュベートすることによる
   前記細胞の増殖の阻害方法。
2. 【請求項２】 クローン原性腫瘍細胞を除去するために
   造血細胞試料、即ち骨髄又は可動化末梢血前駆細胞及び
   ／又は幹細胞を浄化する方法であって、前記細胞の増殖
   を刺激中に、原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の増殖を
   阻害する量のＩＦＮ−γの存在下で浄化が行われること
   を特徴とする方法。
3. 【請求項３】 クローン原性腫瘍細胞を除去するために
   造血細胞試料、即ち骨髄又は可動化末梢血前駆細胞及び
   ／又は幹細胞を浄化する方法であって、かなりの程度ま
   で関与前駆細胞を殺害する高用量の細胞毒性剤の存在下
   で、原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の増殖を阻害する
   量のＩＦＮ−γの存在下で浄化が行われることを特徴と
   する方法。
4. 【請求項４】 前記細胞の増殖を刺激中に有効量のＩＦ
   Ｎ−γとともに、又はかなりの程度まで関与前駆細胞を
   殺害する高用量の細胞毒性剤の存在下で、前記細胞を含
   有する試料をインキュベートすることにより原始造血前
   駆細胞及び造血幹細胞の増殖を阻害するための治療薬の
   製造のためのＩＦＮ−γの使用。
5. 【請求項５】 原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の増殖
   を阻害する量のＩＦＮ−γの存在下で且つ上記細胞の増
   殖の刺激中に、又はかなりの程度まで関与前駆細胞を殺
   害する高用量の細胞毒性剤の存在下で、細胞毒性剤を用
   いて浄化することによる、クローン原性腫瘍細胞を実質
   的に含有しない造血細胞試料、即ち骨髄又は可動化末梢
   血前駆細胞及び／又は幹細胞の調製方法。
6. 【請求項６】 ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞を実
   質的に含有しない原始造血前駆細胞と造血幹細胞の混合
   物の調製方法であって、造血細胞試料、即ち骨髄又は可
   動化末梢血前駆細胞及び／又は幹細胞に細胞毒性処理を
   施し、そして原始造血前駆細胞及び造血幹細胞を死ＣＤ
   ３４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞から分離することを特徴
   とする方法。
7. 【請求項７】 ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞を実
   質的に含有しない、そして造血細胞試料、即ち骨髄又は
   可動化末梢血前駆細胞及び／又は幹細胞に細胞毒性処理
   を施し、そして原始造血前駆細胞及び造血幹細胞を死Ｃ
   Ｄ３４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞から分離することによ
   り調製される原始造血前駆細胞及び造血幹細胞の混合
   物。
8. 【請求項８】 化学療法細胞毒性処理中の幹細胞区画の
   枯渇を防止するための治療薬の製造のためのＩＦＮ−γ
   の使用。