JPH0898687A - 酢酸キナーゼ組成物 - Google Patents
酢酸キナーゼ組成物Info
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- JPH0898687A JPH0898687A JP8741995A JP8741995A JPH0898687A JP H0898687 A JPH0898687 A JP H0898687A JP 8741995 A JP8741995 A JP 8741995A JP 8741995 A JP8741995 A JP 8741995A JP H0898687 A JPH0898687 A JP H0898687A
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- acetate kinase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 安定化された酢酸キナーゼ組成物を提供す
る。 【構成】 少なくとも酢酸キナーゼを主成分の一とし、
被検試料中の酢酸又は被検試料中の物質より誘導される
酢酸を測定する測定用組成物において、安定化剤として
低分子チオール化合物を含有する。 【効果】 各種用途の組成物として安定性に問題のあっ
た酢酸キナーゼを安定な状態で含有する酢酸キナーゼ組
成物を提供することが可能となった。
る。 【構成】 少なくとも酢酸キナーゼを主成分の一とし、
被検試料中の酢酸又は被検試料中の物質より誘導される
酢酸を測定する測定用組成物において、安定化剤として
低分子チオール化合物を含有する。 【効果】 各種用途の組成物として安定性に問題のあっ
た酢酸キナーゼを安定な状態で含有する酢酸キナーゼ組
成物を提供することが可能となった。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酢酸キナーゼ組成物に
関する。
関する。
【０００２】
【従来の技術】酢酸キナーゼ（以下ＡＫと略す）は以下
の反応
の反応
【化１】 を触媒する酵素で、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと
略す）の再生産用酵素として、また診断等の測定用試薬
の酵素として注目、利用されている。例えば被検試料中
の酢酸を測定するための試薬や、診断用試薬として以下
の反応 によって誘導された酢酸に前記反応式と同様にＡＫとＡ
ＴＰを作用させ、生成したアデノシン二リン酸を公知の
手段により測定することによるコリンエステラーゼの測
定用試薬等に応用され、その重要性がますます増加して
いる。ＡＫの起源としてB.stearothermophilus及びE.co
li等が知られている。特にB.stearothermophilus等の好
熱菌より分離精製されたＡＫは、耐熱酵素でもありその
性質は非常に良好で熱安定性も６５℃まで保証されてい
る。しかし多くのＡＫは診断用試薬としてのＡＫ含有組
成物を形成した場合に安定性に欠け、とりわけ凍結乾燥
等を行った場合、その安定性が更に損なわれてしまうこ
とが判明し、製品化への障害となっていた。
略す）の再生産用酵素として、また診断等の測定用試薬
の酵素として注目、利用されている。例えば被検試料中
の酢酸を測定するための試薬や、診断用試薬として以下
の反応 によって誘導された酢酸に前記反応式と同様にＡＫとＡ
ＴＰを作用させ、生成したアデノシン二リン酸を公知の
手段により測定することによるコリンエステラーゼの測
定用試薬等に応用され、その重要性がますます増加して
いる。ＡＫの起源としてB.stearothermophilus及びE.co
li等が知られている。特にB.stearothermophilus等の好
熱菌より分離精製されたＡＫは、耐熱酵素でもありその
性質は非常に良好で熱安定性も６５℃まで保証されてい
る。しかし多くのＡＫは診断用試薬としてのＡＫ含有組
成物を形成した場合に安定性に欠け、とりわけ凍結乾燥
等を行った場合、その安定性が更に損なわれてしまうこ
とが判明し、製品化への障害となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は上記に鑑
み、安定なＡＫ組成物を求めるべく鋭意検討した結果、
安定剤としてＳＨ基を持つ化合物、特に低分子チオール
化合物を見い出し、本発明に到達した。
み、安定なＡＫ組成物を求めるべく鋭意検討した結果、
安定剤としてＳＨ基を持つ化合物、特に低分子チオール
化合物を見い出し、本発明に到達した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は少な
くとも酢酸キナーゼを主成分の一とし、被検試料中の酢
酸又は被検試料中の物質より誘導される酢酸を測定する
測定用組成物において、安定化剤として低分子チオール
化合物を含有することを特徴とする酢酸キナーゼ組成物
に関する。
くとも酢酸キナーゼを主成分の一とし、被検試料中の酢
酸又は被検試料中の物質より誘導される酢酸を測定する
測定用組成物において、安定化剤として低分子チオール
化合物を含有することを特徴とする酢酸キナーゼ組成物
に関する。
【０００５】本発明において使用できるＳＨ基含有化合
物としては、Ｎ−アセチル−システイン、システイン、
グルタチオン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリト
ール、メルカプトエタノール等の低分子チオール化合物
で、これらの１種又は２種以上が使用できる。好ましく
は安定性の点からＮ−アセチルシステインである。緩衝
剤としては、通常のものが使用でき、該水性組成物のｐ
Ｈは１０を越えるとチオール化合物の安定性が悪くな
り、６未満では系内の酵素を害するので通常６〜１０と
することが好ましい。また低分子チオール化合物の使用
濃度は安定化効果の点から１ｍＭ以上であるが、好まし
くは１０ｍＭ以上である。本発明のＡＫ含有製剤には必
要に応じて他の成分を加えることができる。なお、低分
子チオール化合物を酸化する強酸化剤は除かれる。
物としては、Ｎ−アセチル−システイン、システイン、
グルタチオン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリト
ール、メルカプトエタノール等の低分子チオール化合物
で、これらの１種又は２種以上が使用できる。好ましく
は安定性の点からＮ−アセチルシステインである。緩衝
剤としては、通常のものが使用でき、該水性組成物のｐ
Ｈは１０を越えるとチオール化合物の安定性が悪くな
り、６未満では系内の酵素を害するので通常６〜１０と
することが好ましい。また低分子チオール化合物の使用
濃度は安定化効果の点から１ｍＭ以上であるが、好まし
くは１０ｍＭ以上である。本発明のＡＫ含有製剤には必
要に応じて他の成分を加えることができる。なお、低分
子チオール化合物を酸化する強酸化剤は除かれる。
【０００６】本発明のＡＫ含有組成物は、水性組成物と
して、又は凍結乾燥組成物として、どちらの形態でも支
障なく使用することができる。ＡＫを含有する水性組成
物は本発明によって長期にわたって使用することができ
るようになり、本発明の優位性が認められている。ま
た、凍結乾燥組成物は、ＡＫ含有水性組成物を通常の方
法によって凍結乾燥することにより得ることができる
が、本発明により、凍結乾燥工程での酵素の失活といっ
た問題も発生せず、しかも、得られた凍結乾燥組成物と
してのＡＫの安定性も著しく高い。水性組成物である場
合にもＡＫの安定性も著しく高められている。
して、又は凍結乾燥組成物として、どちらの形態でも支
障なく使用することができる。ＡＫを含有する水性組成
物は本発明によって長期にわたって使用することができ
るようになり、本発明の優位性が認められている。ま
た、凍結乾燥組成物は、ＡＫ含有水性組成物を通常の方
法によって凍結乾燥することにより得ることができる
が、本発明により、凍結乾燥工程での酵素の失活といっ
た問題も発生せず、しかも、得られた凍結乾燥組成物と
してのＡＫの安定性も著しく高い。水性組成物である場
合にもＡＫの安定性も著しく高められている。
【０００７】次にＡＫの酵素活性測定は次の方法によっ
た。 イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２） ７１．２５ｍＭ ＡＴＰ １２．５ｍＭ ＰＥＰ ４．２５ｍＭ 塩化マグネシウム ２５ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３２５ｍＭ 塩化カリウム ９３．７５ｍＭ ＰＫ １２．５単位／ｍｌ ＬＤＨ １３．７５単位／ｍｌ （ただしＰＥＰは、ホスホエノールピルビン酸、ＮＡＤ
Ｈは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、Ｐ
Ｋはピルビン酸キナーゼ、及びＬＤＨは乳酸脱水素酵素
の略である。） 上記濃度の反応液２．０ｍｌにＡＫ酵素溶液２０μｌを
加え、３０℃で５分間予加温した後、２Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液を０．５ｍｌ加え、反応を開始し、３４０ｎｍの
吸光度を１分目から１分間測定する。 ΔＥ：１分間の吸光度変化
た。 イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２） ７１．２５ｍＭ ＡＴＰ １２．５ｍＭ ＰＥＰ ４．２５ｍＭ 塩化マグネシウム ２５ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３２５ｍＭ 塩化カリウム ９３．７５ｍＭ ＰＫ １２．５単位／ｍｌ ＬＤＨ １３．７５単位／ｍｌ （ただしＰＥＰは、ホスホエノールピルビン酸、ＮＡＤ
Ｈは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、Ｐ
Ｋはピルビン酸キナーゼ、及びＬＤＨは乳酸脱水素酵素
の略である。） 上記濃度の反応液２．０ｍｌにＡＫ酵素溶液２０μｌを
加え、３０℃で５分間予加温した後、２Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液を０．５ｍｌ加え、反応を開始し、３４０ｎｍの
吸光度を１分目から１分間測定する。 ΔＥ：１分間の吸光度変化
【０００８】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ トリス(ヒト゛ロキシメチル)アミノメタン-マレイン酸(pH9.0) １００ｍＭ 硫酸マグネシウム １２．５ｍＭ 塩化カリウム ３１．２５ｍＭ ＡＴＰ ６．２５ｍＭ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３２５ｍＭ ＡＫ ３７．５ｕ／ｍｌ ＰＫ １２．５ｕ／ｍｌ ＬＤＨ ６．２５ｕ／ｍｌ 上記の溶液に低分子チオール化合物の各添加剤を表１に
示す濃度で加え、２５℃で４日間保存した結果を表１に
示す。ただし、保存開始時のＡＫ活性を１００％とし
た。表１から明らかなように、溶液組成物において安定
化効果が認められた。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ トリス(ヒト゛ロキシメチル)アミノメタン-マレイン酸(pH9.0) １００ｍＭ 硫酸マグネシウム １２．５ｍＭ 塩化カリウム ３１．２５ｍＭ ＡＴＰ ６．２５ｍＭ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３２５ｍＭ ＡＫ ３７．５ｕ／ｍｌ ＰＫ １２．５ｕ／ｍｌ ＬＤＨ ６．２５ｕ／ｍｌ 上記の溶液に低分子チオール化合物の各添加剤を表１に
示す濃度で加え、２５℃で４日間保存した結果を表１に
示す。ただし、保存開始時のＡＫ活性を１００％とし
た。表１から明らかなように、溶液組成物において安定
化効果が認められた。
【０００９】
【表１】 水溶液での保存安定性（２５℃，４日間） 添加剤 濃度 残存活性（％） 無添加 − ７６ Ｎ−アセチルシステイン ２．５ｍＭ １００ グルタチオン ２．５ｍＭ ８９ システイン ２．５ｍＭ ９７
【００１０】実施例２ ＡＫ ２×１０4 単位 ＰＫ １×１０4 単位 ＬＤＨ １×１０3 単位 ＡＴＰ １ｇ ＰＥＰ ０．０５ｇ ＮＡＤＨ ０．１４ｇ 上記各成分をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２５ｍ
ｌに溶解する。更に低分子チオール化合物やその他の添
加剤を加えた凍結乾燥原液を調製し、凍結乾燥を行っ
た。凍結乾燥前後のＡＫ活性の安定性を検討し、表２に
示す。ただし、凍結乾燥前の原液の酵素活性を１００％
とした。表２から明らかなように、無添加と比較し、低
分子チオール化合物によりＡＫは大きく安定化された。
ｌに溶解する。更に低分子チオール化合物やその他の添
加剤を加えた凍結乾燥原液を調製し、凍結乾燥を行っ
た。凍結乾燥前後のＡＫ活性の安定性を検討し、表２に
示す。ただし、凍結乾燥前の原液の酵素活性を１００％
とした。表２から明らかなように、無添加と比較し、低
分子チオール化合物によりＡＫは大きく安定化された。
【００１１】
【表２】 添加剤 濃度 凍結乾燥後 残存活性（％） 無添加 − ６６ Ｎ−アセチルシステイン １０ｍＭ ９５ グルタチオン １０ｍＭ ９３ システイン １０ｍＭ ９２ ジチオスレイトール １０ｍＭ ９３ ジチオエリスリトール １０ｍＭ ９０ グリセロール １％ ５８ 牛血清アルブミン １％ ６９ フラクトース二リン酸 １０ｍＭ ６９ コーエンザイムＡ ０．２５ｍＭ ６８
【００１２】実施例３ 実施例２にて調製された本発明の凍結乾燥品を３７℃に
て１ヶ月保存した結果を表３に示す。ただし凍結乾燥直
後のＡＫ活性を１００％とした。表３から明らかなよう
に、無添加では大きく失活しているがチオール低分子化
合物を添加した場合は失活の度合は非常に小さかった。
て１ヶ月保存した結果を表３に示す。ただし凍結乾燥直
後のＡＫ活性を１００％とした。表３から明らかなよう
に、無添加では大きく失活しているがチオール低分子化
合物を添加した場合は失活の度合は非常に小さかった。
【００１３】
【表３】 ＦＤ品での保存安定性（３７℃，１ヶ月） 添加剤 濃度 残存活性（％） 無添加 − ３９ Ｎ−アセチルシステイン １０ｍＭ ９６ グルタチオン １０ｍＭ ９５ システイン １０ｍＭ ９３ ジチオスレイトール １０ｍＭ ９４ ジチオエリスリトール １０ｍＭ ９３
【００１４】実施例４ 実施例２の原液組成の低分子チオール化合物（Ｎ−アセ
チルシステイン）の濃度を変化させて凍結乾燥原液を調
製し、凍結乾燥前後のＡＫ活性を測定した。結果は図１
に表示した。図１のグラフから明らかなように、Ｎ−ア
セチルシステインを１ｍＭ加えることにより約８５％の
活性残存が認められ、１０ｍＭ以上にすることにより９
０％以上の活性残存が認められる。
チルシステイン）の濃度を変化させて凍結乾燥原液を調
製し、凍結乾燥前後のＡＫ活性を測定した。結果は図１
に表示した。図１のグラフから明らかなように、Ｎ−ア
セチルシステインを１ｍＭ加えることにより約８５％の
活性残存が認められ、１０ｍＭ以上にすることにより９
０％以上の活性残存が認められる。
【００１５】
【発明の効果】以上から明らかなように、本発明によれ
ば、従来、各種用途の組成物として安定性に問題のあっ
た酢酸キナーゼを安定な状態で含有する酢酸キナーゼ組
成物を提供することが可能となった。
ば、従来、各種用途の組成物として安定性に問題のあっ
た酢酸キナーゼを安定な状態で含有する酢酸キナーゼ組
成物を提供することが可能となった。
【図１】本発明によるＡＫ含有組成物の凍結乾燥後にお
ける、ＡＫ活性の残存の度合と、低分子チオール化合物
（Ｎ−アセチルシステイン）の濃度（凍結乾燥原液で
の）との関係を示すグラフである。
ける、ＡＫ活性の残存の度合と、低分子チオール化合物
（Ｎ−アセチルシステイン）の濃度（凍結乾燥原液で
の）との関係を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】本発明において使用できるＳＨ基含有化合
物としては、Ｎ−アセチル−システイン、システイン、
グルタチオンなどのシステイン含有ジ−若しくはトリ−
ペプチド、ジチオスレイトール若しくはジチオエリスリ
トールなどのモノ−若しくはジ−ＳＨ置換のスレイトー
ル若しくはエリスリトール、又はメルカプトエタノール
などの低級アルキルチオールなどの分子量３１０以下の
低分子チオール化合物で、これらの１種又は２種以上が
使用できる。好ましくは安定性の点からＮ−アセチルシ
ステインである。緩衝剤としては、通常のものが使用で
き、該水性組成物のｐＨは１０を越えるとチオール化合
物の安定性が悪くなり、６未満では系内の酵素を害する
ので通常６〜１０とすることが好ましい。また低分子チ
オール化合物の使用濃度は安定化効果の点から１ｍＭ以
上であるが、好ましくは１０ｍＭ以上である。本発明の
ＡＫ含有製剤には必要に応じて他の成分を加えることが
できる。なお、低分子チオール化合物を酸化する強酸化
剤は除かれる。
物としては、Ｎ−アセチル−システイン、システイン、
グルタチオンなどのシステイン含有ジ−若しくはトリ−
ペプチド、ジチオスレイトール若しくはジチオエリスリ
トールなどのモノ−若しくはジ−ＳＨ置換のスレイトー
ル若しくはエリスリトール、又はメルカプトエタノール
などの低級アルキルチオールなどの分子量３１０以下の
低分子チオール化合物で、これらの１種又は２種以上が
使用できる。好ましくは安定性の点からＮ−アセチルシ
ステインである。緩衝剤としては、通常のものが使用で
き、該水性組成物のｐＨは１０を越えるとチオール化合
物の安定性が悪くなり、６未満では系内の酵素を害する
ので通常６〜１０とすることが好ましい。また低分子チ
オール化合物の使用濃度は安定化効果の点から１ｍＭ以
上であるが、好ましくは１０ｍＭ以上である。本発明の
ＡＫ含有製剤には必要に応じて他の成分を加えることが
できる。なお、低分子チオール化合物を酸化する強酸化
剤は除かれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 白石 登業 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 永田 和彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 松尾 隆明 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 少なくとも酢酸キナーゼを主成分の一と
し、被検試料中の酢酸又は被検試料中の物質より誘導さ
れる酢酸を測定する測定用組成物において、安定化剤と
して低分子チオール化合物を含有することを特徴とする
酢酸キナーゼ組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7087419A JP2551923B2 (ja) | 1995-03-20 | 1995-03-20 | 酢酸キナーゼ組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7087419A JP2551923B2 (ja) | 1995-03-20 | 1995-03-20 | 酢酸キナーゼ組成物 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60269182A Division JPH07110231B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | 酢酸キナーゼの安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0898687A true JPH0898687A (ja) | 1996-04-16 |
| JP2551923B2 JP2551923B2 (ja) | 1996-11-06 |
Family
ID=13914365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7087419A Expired - Lifetime JP2551923B2 (ja) | 1995-03-20 | 1995-03-20 | 酢酸キナーゼ組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2551923B2 (ja) |
-
1995
- 1995-03-20 JP JP7087419A patent/JP2551923B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2551923B2 (ja) | 1996-11-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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| S531 | Written request for registration of change of domicile |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |