JPH0898694A - ブリオニア ジオイカ由来のブリオジン１をエンコードする遺伝子のクローニング及び発現 - Google Patents

ブリオニア ジオイカ由来のブリオジン１をエンコードする遺伝子のクローニング及び発現

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JPH0898694A
JPH0898694A JP7141365A JP14136595A JPH0898694A JP H0898694 A JPH0898694 A JP H0898694A JP 7141365 A JP7141365 A JP 7141365A JP 14136595 A JP14136595 A JP 14136595A JP H0898694 A JPH0898694 A JP H0898694A
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bryodin
recombinant
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Clay B Siegall
ビー．シーガル クレイ
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Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は植物ブリオニア ジオイカ（Ｂｒｙ
ｏｎｉａ ｄｉｏｉｃａ）由来のリボソーム不活性化性
タンパク質をエンコードするオリゴヌクレオチドの提供
を目的とする。 【構成】 本発明はブリオニア ジオイカ（Ｂｒｙｏｎ
ｉａ ｄｉｏｉｃａ）由来のリボソーム不活性化性タン
パク質をエンコードする単離されたオリゴヌクレオチド
配列であって、そのタンパク質が配列番号２のアミノ酸
配列を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド
配列又はこのオリゴヌクレオチド配列の相補体に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は植物ブリオニア ジオイ
カ（Bryonia dioica）由来のリボソーム不活性化性タン
パク質をエンコードするオリゴヌクレオチド配列の単離
及び特性化に関する。本発明はまた、適当な転写及び翻
訳コントロール配列に作動連結した精製されたこのオリ
ゴヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクター、形質転
換宿主細胞、並びに組換発現されたリボソーム不活性化
性タンパク質にも関連する。リボソーム不活性化性タン
パク質（ＲＩＰ）の発現のための、及び融合タンパク質
の構築におけるこのリボソーム不活性化性タンパク質を
エンコードする精製オリゴヌクレオチドの利用も本発明
の一部と考える。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質合成を阻害するタンパク質は
植物、細菌及び菌類を含む様々な生物から単離されてい
る。このようなタンパク質毒素はそれを生産する生物の
増殖にとって特異的な利点を供するためにその生物によ
り生産されるものと考えられる。このようなタンパク質
毒素の発見されている生物の様々な進化的背景にもかか
わらず、ほとんどの毒素は驚くべきほどに似たような作
用メカニズムを有している。ある特定の毒素の群は伸長
因子２（ＥＦ２）を直接改変せしめることにより、又は
ＥＦ２がタンパク質合成において機能し得なくなるよう
にリボソーム自体を改変せしめることのいづれかによ
り、タンパク質合成を阻止することを介してその作用を
及ぼしている。この毒素のクラス、リボソーム不活性化
性タンパク質（ＲＩＰ）はいく種かの科の植物から単離
できている。
【０００３】植物リボソーム不活性化性タンパク質のそ
の構造に基づき２つの群に分類されている。Ｉ型リボソ
ーム不活性化性タンパク質（Ｉ型ＲＩＰ）はリボソーム
不活性化活性を有する一本鎖を含む。Ｉ型ＲＩＰの例に
は、ゲロニン、サポリン、トリコサンチン及びブリオジ
ンが含まれる。II型リボソーム不活性化性タンパク質
（II型ＲＩＰ）は２本の鎖、即ち、ＥＦ−２を不活性化
できるＡ鎖と、レクチン様特性を有する細胞結合性ドメ
インを含むＢ鎖とを含んで成る。その結合性ドメインは
Ｉ型ＲＩＰが様々なタイプの細胞に結合し、そしてそれ
らを殺傷せしめることを可能にする。II型ＲＩＰの例は
リシン及びアブリンである。
【０００４】この２つのタイプのリボソーム不活性化性
タンパク質はその構造が相違するが、両タイプとも２８
Ｓ ｒＲＮＡの４３２４位にあるアデニン残基のＮ−グ
リコシド結合の切断を通じて真核系リボソームの６０Ｓ
サブユニットを不活性化することにより、タンパク質合
成を阻害する（EndoとTsurugi 1987, J.Biol Chem. 26
2：8128-8130 ; Stirpe, F.ら1988, Nucl.Acid.Res. 16
: 1349-1357 ）。
【０００５】リボソーム不活性化性タンパク質は、ナデ
シコ科（Cariophyllaceae ）、ウリ科（Cucurbitaceae
）、トウダイグサ科（Euphorbiaceae ）及びヤマゴボ
ウ科（Phytolaccaceae）を含むいく種かの植物の科から
単離されている。ゲロニウムマルチフロルム（Gelonium
multiflorum ）（トウダイグサ科）、ツルレイシ（Mo
mordica charantia ）（ウリ科）、ブリオニア ジオ
イカ（ウリ科）、サボンソウ（Saponaria officinali
s ）（サポリン−５ａ、サポリン−５ｂ、サポリン−６
ａ、サポリン−６ｂ）（ナデシコ科）の種子、及びサボ
レソウ（サポリン−１）の葉から単離されたＲＩＰのＮ
末端アミノ酸配列の対比がなされている。完全アミノ酸
配列がキカラスウリ（Trichosanthes kirilowii max
im）由来のＩ型ＲＩＰ及び大麦（Barley）種子タンパク
質合成インヒビターについて決定されている。これらの
対比は、毒素ブリオジン及びモモルジン（ウリ科の構成
員）の少なくともＮ末端領域が、トウダイグサ科の構成
員であるリシンＡ鎖及びゲノニンと高度の類似性を示す
ことを示唆する。この類似性は類似の進化起源の結果で
あると考えられる。ウリ科及びトウダイグサ科のＲＩＰ
と、ヤマゴボウ科又はナデシコ科のそれとの間では非常
にわずかな類似性しか認められていない（Montecucchi
ら、1989, Int.J.Peptide Protein Res. 33 : 263-267
）。同一の種から単離されたＲＩＰのＮ−末端領域の
アミノ酸配列間において類似性が認められているが、同
一の植物の個別の組織から単離された毒素間で特に数多
くの相違が存在している。
【０００６】ブリオジンと呼ばれる植物タンパク質毒素
ははじめ、ブリオニア ジオイカの根から単離された２
７〜３０kDalのタンパク質として同定された（英国特許
出願ＧＢ２，１９４，９４８号；１９８８年３月２３日
公開）。この毒素は、一本の鎖と、伸長因子２との生産
性相互作用を阻止することによってリボソームを不活性
化せしめる作用メカニズムとを有するＩ型リボソーム不
活性化性タンパク質である。その他のタイプのＩ型ＲＩ
Ｐと違って細胞結合性ドメインを有さないことで、ブリ
オジンは通常哺乳動物細胞には結合しない。このタンパ
ク質は、ゲル濾過により約２７，３００ダルトン、そし
てポリアクリルアミドゲル電気泳動によっては約２８，
８００ダルトンの分子量を有し、更に９．５の等電点を
有することが示されている。この毒素は、３．６ng／ml
（ＩＤ50）において小麦胚芽リボソームを有するウサギ
網状赤血球リゼート系におけるタンパク質合成を阻害
し、そして腹腔内的に投与したときに１４．５mg／kgの
マウスにおけるＬＤ50を有することが見い出されてい
る。そのＮ−末端アミノ酸配列は次の通りであると決定
されている。
【０００７】
【化１】
【０００８】第二のリボソーム不活性化性タンパク質が
Ｂ．ジオイカ（欧州特許公開ＥＰＯ３９０，０４０号、
１９９０年１０月３日公開）の葉から単離されている。
この分子はゲル濾過によっては２７，３００ダルトン、
そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によっては２
８，８００ダルトンの分子量を有し、そして９．５の等
電点を有することが記載されており、そしてブリオジン
−Ｌと命名されている。この形態のブリオジンは０．１
nM（３．６ng／ml）のＥＣ50でウサギ網状赤血球系にお
けるタンパク質合成を阻害し、そして腹腔内的に投与し
たときに１０mg／kgのマウスにおけるＬＤ50を有するこ
とが見い出されている。アミノ酸分析も紹介されている
が、しかしこの分子についてのアミノ酸配列又はヌクレ
オチド配列については開示されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】リボソーム結合性タン
パク質は「免疫毒素」の成分としてのその有用性を理由
に感心がもたられている。免疫毒素は特異的な標的細胞
に向けて毒素を選択的に標的化させることを可能とする
抗体に連結された毒素成分より成る。潜在的な標的細胞
には有害な細胞、即ち、腫瘍性、ウィルス感染化、免疫
応答性又は寄生細胞が含まれる。本発明において規定す
る免疫毒素は、リボソーム不活性化性タンパク質の如く
の毒性分子に連結した細胞特異性リガンドの化学コンジ
ュゲートであってよい。数多くの様々なリボソーム不活
性化性タンパク質が知られていること及び新規の毒素が
開発されていることの事実は、コンジュゲート化されて
いないときに完全細胞に対する様々なレベルの固有毒性
を有する様々な毒性成分を供し、且つ、患者が、投与し
たもとの免疫毒素に対して、長期間のインビボ処置の最
中に免疫応答を生じせしめるであろう他の毒素の有用な
起源を供する。更に、いくつかの免疫毒素、サポリン６
及び抗−Ｔｈｙ１．１抗体又はそのＦ（ａｂ′）2 フラ
グメントは遊離毒素よりも毒性であるため、新規の、且
つ異なる毒素分子についての要望がある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明はブリオニア ジ
オイカから単離した植物タンパク質毒素をエンコードす
る精製オリゴヌクレオチドを提供する。また、本発明は
発現ベクターも提供し、それにおいてはこの精製オリゴ
ヌクレオチド配列は、適当な宿主細胞を形質転換せしめ
るのに用いたときに大量の植物タンパク質毒素を発現さ
せる宿主細胞の適当な転写及び翻訳コントロール配列に
作動連結されている。更に、このオリゴヌクレオチド配
列は、毒素と標的細胞にとって特異的なリガンドとを含
んで成る融合分子をエンコードするオリゴヌクレオチド
分子を構築するのに利用できる。この免疫コンジュゲー
トは標的細胞に対して毒性であり、従って特異的な細胞
殺傷にとって有用な組成物を供する。
【００１１】植物ブリオニア ジオイカから単離された
リボソーム不活性化性タンパク質ブリオジン１（ＢＤ
１）をエンコードする完全ヌクレオチド配列を本明細書
において開示する。これは本発明の基礎を担う。本発明
はブリオジン１をエンコードする精製オリゴヌクレオチ
ドを開示する態様を含む。また、ブリオジン１をエンコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成るプラスミド、及び適当
な転写コントロール配列に作動連結されたブリオジン１
をエンコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクタ
ー、及び形質転換宿主細胞を開示する態様も含まれる。
【００１２】更に、本発明は組換手段によってブリオジ
ン１を生産する方法に関する。この組換的に生産された
タンパク質はブリオジン１、リボソーム不活性化性活性
を有するブリオジン１のフラグメント又は誘導体、並び
に融合タンパク質でありうる。融合タンパク質は特定の
細胞タイプに対して特異的なリガンドと、ブリオジン１
を細胞標的に対して特異的に誘導せしめることを可能と
するブリオジン１の機能部分とを含んで成りうる。
【００１３】本発明は植物ブリオニア ジオイカから単
離したリボソーム不活性化性タンパク質ブリオジン１を
エンコードする実質的に精製されたオリゴヌクレオチド
又はその相補体に関する。このオリゴヌクレオチドは、
ｃＤＮＡ、単離された、精製されたゲノムＤＮＡ，ＲＮ
Ａ又はアンチセンスＲＮＡでありうる。少なくとも、ブ
リオジン１、又はその生物学的に活性なフラグメント及
び誘導体をエンコードするオリゴヌクレオチドを含んで
成るプラスミド及び発現ベクターも、本発明に含まれ
る。このオリゴヌクレオチドは本発明の発現ベクターの
中の転写及び翻訳コントロール配列に作動連結されてい
る。このプラスミド及び発現ベクターで形質転換された
宿主細胞も本発明の一部と考えられる。上記の組成物は
形質転換宿主細胞による大量のブリオジン１又はその生
物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体の組換発現
のために利用できる。
【００１４】リボソーム不活性化性タンパク質であるブ
リオジン１（ＢＤ１）はブリオニアジオイカの根から単
離される。ＢＤ１はその他の植物リボソーム不活性化性
タンパク質と似たような細胞に対する毒性を示し、それ
が特に細胞特異性分子のリガンドにより規定の細胞集団
へと誘導されたのなら、細胞の殺傷において有用であり
うることを示唆する。かかるリガンドには抗体又は細胞
表層レセプターのリガンド（即ち、トランスフェリン、
ヘレグリン及びその他の当業によく知られているもの）
が含まれうる。ＢＤ１は、細胞特異性分子のリガンド
と、免疫症状の処置において有用であろう毒素とを含ん
で成るコンジュゲート又は融合分子の構築においても使
用できうる。
【００１５】精製ブリオジン１は、還元及び非還元条件
下で約２９，０００ダルトンの分子量の単一バンドとし
て検出される。ここに記載のＢＤ１の完全一次構造は、
ｃＤＮＡクローニング及び推定アミノ酸配列の決定によ
り決定した。配列分析は、ＢＤ１がウリ科のその他のリ
ボソーム不活性化性タンパク質、例えばトリコサンシン
及びα−モモルシャリンと若干の類似性は有するが異な
るＩ型リボソーム不活性化性タンパク質であることを示
した（Montecucchi ら、1989, Int.J.PeptideProtein R
es. 33 : 263-267 ）。これらのタンパク質は全て、一
本鎖ペプチドである、２５〜３０kDa の分子量である及
び約９．０〜１０．０の等電点を有するものであるが如
くのＩ型リボソーム不活性化性タンパク質の一定の共通
の特徴的な特性を示す（Stirpe and Barbieri, 1986, F
EBS Lett. 196 : 1-8 ; Jimenezand Vasquez, D., 198
5, Ann.Rev.Microbiol. 39 : 649-672）。
【００１６】ＢＤ１は組換ＤＮＡ工学又は化学合成法に
より製造できうる。組換法によりＢＤ１を製造するの
に、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製のためのメッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はＢＤ１を生産する細胞起源
から獲得することができ、一方ＢＤ１についてゲノム配
列は組織の種類に関係なくブリオニア ジオイカの任意
の細胞から獲得することができる。例えば、Ｂ．ジオイ
カの根はＢＤ１についてのコード配列の起源として及び
／又はｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーを作るため
に利用できうる。起源系列由来の全ＤＮＡ又はＲＮＡに
より形質転換された又はトランスフェクトされた遺伝子
操作微生物又は細胞系はスクリーングのためのＤＮＡの
便利な起源として利用できうる。
【００１７】ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのいづれ
も当業界に公知の技術を利用して作られたＤＮＡフラグ
メントから調製されうる。ＢＤ１をエンコードするフラ
グメントは、Ｎ末端ＢＤ１アミノ酸配列（配列番号２）
の一部に相同性のアミノ酸配列をエンコードするであろ
うヌクレオチドプローブによってその調製ライブラリー
をスクリーニングすることにより同定されうる。コード
配列の一部はクローニング及び発現のために利用されう
るため、全長クローン、即ち、ＢＤ１についてコード領
域全体を含むものが発現にとって好適でありうる。従っ
て、様々な方法による、ＤＮＡの単離、適当なフラグメ
ントの作製、クローン及びライブラリーの構築、並びに
組換体をスクリーニングするための当業界に公知の方法
が利用できうる。例えば、Sambrookら、1989, Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual第２版、Cold Spring
Harbor, NYに記載の技術を参照のこと。
【００１８】ヌクレオチドコード配列の縮重性に基づ
き、ＢＤ１についての類似のアミノ酸配列をエンコード
する他のＤＮＡ配列をＢＤ１遺伝子のクローニング及び
発現のための本発明の実施のうえで利用できうる。その
変更には、同一又は機能的に同等な遺伝子産物をもたら
す欠失、付加又は異なるヌクレオチド残基の置換が含ま
れる。この遺伝子産物はその配列内に、サイレント変
更、即ち、生物学的に活性な産物をもたらしめるような
アミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含みうる。本明細
書でいう生物活性は、遺伝子産物がタンパク質合成を阻
害する能力によって測定される。
【００１９】任意のアミノ酸置換が、関与する残基の極
性、電荷、溶解度、疎水性／親水性及び／又は両親媒体
の類似性を基礎になされうる。例えば、負に帯電したア
ミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ
る。正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが
含まれる。類似の親水価を有する無帯電極性頭部基を有
するアミノ酸には下記のものが含まれる：ロイシン、イ
ソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギ
ン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニ
ン、チロシン。
【００２０】生物学的に活性なブリオジン１を発現する
ため、ＢＤ１をエンコードするヌクレオチド配列又は機
能的に同等なヌクレオチド配列を、適当なベクター、即
ち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳にとって必須
の要素を含むベクターの中に挿入する。ＢＤ１配列の改
良バージョンを、発現産物の安定性、生産性、純度、収
量又は毒性を高めるために操作できうる。例えば、ＢＤ
１と異種タンパク質とを含んで成る融合タンパク質又は
切断可能融合タンパク質の発現は操作されうる。かかる
融合タンパク質は、それがアフィニティークロマトグラ
フィーにより容易に単離されうるように（例えば異種タ
ンパク質に特異的なカラム上への固定化を介して）デザ
インされうる。ＢＤ１成分と異種タンパク質との間の切
断部位を操作する場合、ＢＤ１タンパク質はその切断部
位を崩壊する適当な酵素又は試薬による処理によってカ
ラムクロマトグラフィーカラムから遊離させることがで
きる（例えば、Booth ら、1988, Immunol.Lett. 19：65
-70 ; 及びGardellaら、1990, J.Biol.Chem. 265：1585
4-15859 を参照のこと）。
【００２１】当業者に公知の方法を、ＢＤ１コード配列
及び適当な転写／翻訳コントロールシグナルを含む発現
ベクターを構築するのに利用することができる。これら
の方法には、インビトロ組換ＤＮＡ技術、合成技術及び
インビボ組換／遺伝子技術が含まれる。例えば、Sambro
okら、1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manua
l 第２版、Cold Spring Harbor, Laboratory, NYを参照
のこと。
【００２２】様々な宿主発現系がＢＤ１コード配列を発
現させるために利用できうる。これらには、限定するこ
となく、微生物、例えばＢＤ１コード配列を含む組換バ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミ
ドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；ＢＤ
１コード配列を含む組換酵母発現ベクターで形質転換さ
れた酵母；ＢＤ１コード配列を含む、組換ウィルス発現
ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス、Ｃａ
ＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）で感染された
又はＴｉプラスミドの如くの組換プラスミド発現ベクタ
ーで形質転換された植物細胞系が含まれる。哺乳動物発
現系を利用するには、ＢＤ１リボソーム不活性化活性
は、宿主細胞をこのＢＤ１の毒性作用から守るために、
培養培地の中での宿主細胞溶解もしくは培養培地の中へ
のＢＤ１の分泌まで、ブロックもしくはマスクしておか
ねばならないか、又はブリオジンに対して耐性な突然変
異宿主細胞を使用しなくてはならない。
【００２３】使用する宿主／ベクター系に依存して、い
ろいろな適当な転写及び翻訳要素、例えば構成及び誘発
性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネ
ーター等を、発現ベクターにおいて利用してよい（例え
ば、Bitterら、1987, Methods in Enzymol. 153 : 516-
544 を参照のこと）。例えば、細菌系の中にクローング
するとき、誘発性プロモーター、例えばバクテリオファ
ージλのｐＬ；ｐｌａｃ，ｐｔｒｐ，ｐｔａｃ（ｐｔｒ
ｐ−ｌａｃハイブリドプロモーター）等を使用してよ
い。組換ＤＮＡ又は合成技術によって作ったプロモータ
ーも、挿入されたＢＤ１コード配列の制御、且つ高レベ
ルな転写を担うために利用してよい。
【００２４】細菌系において、発現すべくＢＤ１の意図
する用途に依存していくつかの発現ベクターが好適に選
定されうる。例えば、大量のＢＤ１を所望するとき、高
レベルのタンパク質産物の発現を誘発するベクター、可
能としてはタンパク質産物が簡単に精製されうる細菌の
ペリプラズマ又は培養培地へと発現産物を誘導する疎水
性シグナル配列を有する融合体が所望されうる。ＢＤ１
の回収に役立つように特異的な切断部位により操作され
た所定の融合タンパク質も所望されうる。かかる操作に
適用可能なベクターは、限定することなく、Ｅ．コリ
（E. coli ）発現ベクターのｐＥＴシリーズである（St
udier ら、1990, Methods in Enzymol. 185 : 60-89
）。
【００２５】酵母においては、構成又は誘発性プロモー
ターを含むいくつかのベクターが利用できる。参考のた
め、Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2,
1988 、編 Ausubelら、Greene Publish.Assoc. & Wile
y Interscience, ch.13 ; Grant ら、1987、「Expressi
on and Secretion Vectors for Yeast」Methods in Enz
ymol. 153 : 516-544 ; Glover, 1986, DNA Cloning, V
ol.II, IRL Press, Wash., D.C., Ch.3 ; 及びBitter,
1987, 「Heterologous Gene Expression in Yeast 」Me
thods in Enzymol. 152 : 673-684 を参照のこと。構成
酵母プロモーター、例えばＡＤＨもしくはＬｅｕ２、又
は誘発性プロモーター、例えばＧＡＬが使用できうる
（「Cloning in Yeast」ch.3, R.Rothstein In ; DNA C
loning, Vol.II, A Practical Approach, Ed.D.M.Glove
r, 1986, IRL Press, Wash.D.C. ）。他方、酵母染色体
への外来ＤＮＡ配列の組込みを促進するベクターを利用
することができる。
【００２６】植物発現ベクターを使用する場合におい
て、ＢＤ１コード配列の発現はいろいろなプロモーター
によって作動されうる。例えば、ウィルスプロモータ
ー、例えばＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮ
Ａ（Brisson ら、1984, Nature 310：511-514 ）又はＴ
ＭＶのコートタンパク質プロモーター（Takamatsu ら、
1987, EMBO J. 6 : 307-311 ）が利用されうる。他方、
植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニ
ット（Coruzzi ら、1984, EMBO J. 3 : 1671-1680; Bro
gliら、1984, Science 224 : 838-843 ）；又は熱ショ
ックプロモーター、例えば大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅもし
くはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Gurleyら、1986,Mol.Cell.Bi
ol. 6 : 559-565）が利用されうる。これらの構築体
は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウィルスベ
クター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクショ
ン、エレクトロポレーション及び当業者に公知のその他
の技術を利用して植物細胞の中に導入することができ
る。例えば、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods f
or Plant Molecular Biology, Academic Press, NY. 第
VIII章、pp421-463 ; 及びGuerson & Corey, 1988, Pla
nt Molecular Biology、第２版、Blackie, London, Ch.
7-9 を参照のこと。
【００２７】その他の発現系、例えば昆虫及び哺乳動物
宿主細胞系が当業界に公知であるが、しかし毒性分子を
生産するには改良又は適合化させねばならないであろ
う。改良のための一の有効な手法は、上記の通りＢＤ１
に対して耐性な突然変異昆虫又は哺乳動物細胞系を単離
することであろう。
【００２８】組換技術によってブリオジンを生産するこ
とに加えて、ＢＤ１は決定アミノ酸配列に基づき全体的
に、又は部分的に、固相化学合成技術でも生産させるこ
とができる（Creighton, 1983, Protein Structures an
d Molecular Principles, W.H.Freeman and Co., N.Y.,
pp50-60 ; Stewart and Young, 1984, Peptide Synthe
sis 、第２版、Pierce Chemical Co. ）。この手法はＢ
Ｄ１の１又は複数の生物学的活性領域に対応するセグメ
ント又はフラグメントを作製するうえで特に有用であ
る。
【００２９】本発明の別の観点において、発現組換ブリ
オジン１又は機能的同等物は、特定の細胞集団をその毒
素が標的とするように、細胞表層レセプターに対するリ
ガンドと一緒に、毒素リガンドコンジュゲートとして利
用できる。
【００３０】当業者は、「リガンド」なる語が、その範
囲の中に、任意の分子であって、レセプター又は一定の
標的細胞集団に結合したその他の受容成分に特異的に結
合する、又は反応的に会合する、又は複合するものを含
むことを理解している。コンジュゲート中のリンカーを
介して毒素が連結しているこの細胞反応性分子又はリガ
ンドは、治療的又はそうでなければ生物学的に影響を及
ぼしめるべき細胞集団に結合する、複合する、又は反応
する任意の分子であってよい。この細胞反応性分子はそ
のリガンドが反応する特定の標的細胞集団に毒素を輸送
するのに働く。かかる分子には、限定することなく、高
分子量タンパク質（一般１０，０００ダルトンより
大）、例えば抗体又は接着分子、低分子量タンパク質
（一般に、１０，０００ダルトン未満）、ポリペプチド
又はペプチドリガンド、及び非ペプチジルリガンドが含
まれる。
【００３１】本発明のコンジュゲートを形成するのに利
用できうる非免疫反応性タンパク質、ポリペプチド又は
ペプチドリガンドには、限定することなく、トランスフ
ェリン、表皮成長因子、ボンベシン、ガストリン、ガス
トリン放出性ペプチド、血小板由来成長因子、ＩＬ−
２，ＩＬ−６、又は腫瘍増殖因子、例えばＴＧＦ−α及
びＴＧＦ−βが含まれる。非ペプチジルリガンド、例え
ばステロイド、炭水化物及びレクチンが含まれうる。
【００３２】免疫反応性リガンドは、抗原認識性イムノ
グロブリン（又は抗体）又はその抗原認識性フラグメン
トを含んで成る。特に好適なイムノグロブリンは内在化
可能な腫瘍関連抗原を認識できるようなイムノグロブリ
ンである。「イムノグロブリン」とは、イムノグロブリ
ンの任意の認知されているクラス又はサブクラス、例え
ばＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ又はＩｇＥを意味し
うる。好適なイムノグロブリンはイムノグロブリンのＩ
ｇＧクラスに属するものである。このイムノグロブリン
は任意の種に由来しうる。しかしながら、好適には、こ
のイムノグロブリンはヒト又はネズミ起源のものであ
る。更に、イムノグロブリンはポリクローナル又はモノ
クローナルであってよいが、好ましくはモノクローナル
である。
【００３３】前述の通り、当業者は、本発明が抗原認識
性イムノグロブリンフラグメントの利用をも包括してい
ることを理解するであろう。かかるイムノグロブリンフ
ラグメントには、例えばＦａｂ′，Ｆ（ａｂ′）2 ，Ｆ
ｖ又はＦａｂフラグメント、又はその他の抗原認識性イ
ムノグロブリンフラグメントが含まれる。かかるイムノ
グロブリンフラグメントは、例えばタンパク質分解酵素
消化、例えばペプシンもしくはパパイン消化、還元アル
キル化、又は組換技術によって調製されうる。イムノグ
ロブリンフラグメントを調製するための材料及び方法は
当業者によく知られている。一般的には、Parham, 198
3, J.Immunol. 131 : 2895 ; Laymoye ら、1983, J.Imm
unol.Methods 56 : 235 ; Parham, 1982, J.Immunol.Me
thods 53: 133 及びMatthen ら、1982, J.Immunol.Meth
ods 50 : 239を参照のこと。
【００３４】イムノグロブリンは当業界において認知さ
れている語の「キメラ」であってもよい。更に、イムノ
グロブリンは「二価」又は「ハイブリド」抗体、即ち、
一の抗原部位、例えば腫瘍関連抗原に対する特異性を有
する一の「腕」と、別の標的、例えば第二細胞タイプ特
異的レセプター分子を認識する別の腕とを有しうる抗体
であってよい。どちらのケースにおいても、ハイブリド
抗体は、例えば腫瘍、感染性生物又はその他の疾患症状
にかかわる抗原の如きの標的抗原に特異的な１又は複数
の結合部位を好適に有する二重特異性を有している。
【００３５】二価抗体は例えば欧州特許公開ＥＰＡ０，
１０５，３６０号に記載されている。かかるハイブリド
又は二価抗体は公知の通り、細胞融合技術により、又は
化学的に、特に架橋剤又はジスルフィド橋形成試薬によ
り誘導することができ、そして完体抗体及び／又はその
フラグメントを含んで成りうる。かかるハイブリド抗体
を獲得するための方法は例えば１９８３年１０月２７日
公開のＰＣＴ出願ＷＯ８３／０３６９９、及び１９８７
年４月８日公開の欧州特許公開ＥＰＡ０，２１７，５７
７号に記載されている。それらは共に引用することで本
明細書に組入れる。
【００３６】更に、このイムノグロブリンは一本鎖抗体
（「ＳＣＡ」）であってよい。これらは一本鎖Ｆｖフラ
グメント（「ｓｃＦＶ」）より成り（Wardら、1989, Na
ture341 : 544）、それにおいては可変軽ドメイン
（「ＶL 」）及び可変重ドメイン（「ＶH 」）はペプチ
ド結合又はジスルフィド結合によって連結されている。
また、イムノグロブリンは抗原結合活性を保有する一本
のＶH ドメイン（ｄＡｂ）より成ってよい。例えば、Wi
nter and Milstein, 1991, Nature 349 : 295 及びGloc
kshaber ら、1990, Biochemistry 29 : 1362を参照のこ
と。更に、イムノグロブリンはジスルフィド安定化Ｆｖ
ｓより成っていてもよい（Brinkmanら、1993, Proc.Nat
l.Acad.Sci. 90：7538）。
【００３７】本発明において使用するためのリガンド／
毒素コンジュゲートの一部としての免疫学的リガンドの
好適な態様はキメラモノクローナル抗体、好ましくは腫
瘍関連抗原に対して特異性を有しているようなキメラ抗
体である。ここで用いている「キメラ抗体」なる語は、
組換ＤＮＡ技術によって通常に調製される、一の起源又
は種に由来する可変領域、即ち、結合性領域と、別の起
源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含ん
で成るモノクローナル抗体を意味する。ネズミ可変領域
とヒト定常領域とを含んで成るキメラ抗体が、本発明の
所定用途、特にヒトの治療において好ましい。かかるネ
ズミ／ヒトキメラ抗体は、ネズミイムノグロブリン可変
領域をエンコードするＤＮＡセグメントと、ヒトイムノ
グロブリン定常領域をエンコードするＤＮＡセグメント
とを含んで成る発現イムノグロブリン遺伝子の産物であ
る。本発明に包括されるその他の形態の「キメラ抗体」
は、そのクラス又はサブクラスがオリジナル抗体のそれ
から改変又は変更したものである。かかる「キメラ」抗
体は「クラススイッチ化抗体」とも呼ばれる。キメラ抗
体を作るための方法は、現在、当業界において公知の慣
用の組換ＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を
包括する。例えば、Morrisonら、1984, Proc.Natl.Aca
d.Sci. USA 81：6851；米国特許第５，２０２，２３８
号及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照のこと。
【００３８】「キメラ抗体」なる語に包括されるのは、
「ヒト型抗体」、即ち、そのフレームワーク又は「相補
性決定領域」（ＣＤＲ）が、親イムノグロブリンのそれ
と対比して異なる特異性のイムノグロブリンのＣＤＲを
含んで成るように改変されている抗体の概念である。好
適な態様において、ネズミＣＤＲは「ヒト型抗体」を調
製するためにヒト抗体のフレームワーク領域にグラフト
させている。例えば、Riechmann ら、1988, Nature 332
: 323；及びNeubererら、1985, Nature 314 :268を参
照のこと。特に好適なＣＤＲは、キメラ及び二価抗体に
ついて上記した抗原を認識する配列を示すものに該当す
る。
【００３９】当業者は、二価キメラ抗体が、キメラ又は
ヒト型抗体の低い免疫原性の利点と、上記した二価抗体
の特に治療的用途のための多様性とを有するであろうよ
うに調製されうることを認識するであろう。かかる二価
キメラ抗体は例えば架橋剤を利用する化学合成及び／又
は上記したタイプの組換法によって合成できうる。どの
状況においても、本発明は、二価、キメラ、二価−キメ
ラ、ヒト型又はその抗原認識フラグメントもしくは誘導
体に関係なく、抗体の製造のためのあらゆる特定の方法
により限定されることはない。
【００４０】更に、上記した通り、本発明において用い
るイムノグロブリン又はそのフラグメントは天然のポリ
クローナル又はモノクローナルでありうる。しかしなが
ら、モノクローナル抗体が好適なイムノグロブリンであ
る。かかるポリクローナル又はモノクローナル抗体の調
製は、本発明において使用されうる有用なイムノグロブ
リンを製造することが完全にできる当業者に公知であ
る。例えば、Kohler andMilstein, 1975, Nature 256 :
495 を参照のこと。更に、ハイブリドーマ及び／又は
かかるハイブリドーマにより産生され、且つ本発明の実
施において有用であるモノクローナル抗体は、アメリカ
ン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）、
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 2502の如きの起
源から公的に入手できるか、又はBoehringer-Mannheim
Biochemicals, P.O.Box 50816, Indianapolis, IN 4625
0 より市販されている。
【００４１】本発明の特に好適なモノクローナル抗体は
腫瘍関連細胞表層抗原に結合し、且つ内在化可能なもの
である。本発明の特別な態様においては、この毒素を、
１９９０年６月２６日提出の米国特許第０７／５４４，
２４６号及び対応明細書である１９９１年１月１０日公
開のＰＣＴ公開出願ＷＯ９１／００２９５に開示されて
いるキメラ抗体ＢＲ９６（「ｃｈｉＢＲ９６」）にコン
ジュゲートする。ｃｈｉＢＲ９６は内在性ネズミ／ヒト
キメラ抗体であり、そして乳、肺、結腸及び卵巣癌腫の
如きのヒト癌細胞により発現されたフコシル化ルイスＹ
抗原と反応性である。キメラＢＲ９６を発現し、且つｃ
ｈｉＢＲ９６と特定されているハイブリドーマはブダペ
スト条約の規則に従い、アメリカン タイプ カルチャ
ー コレクションに１９９０年５月２３日に寄託してあ
り、ＡＴＣＣ ＨＢ １０４６０で認定されている。
【００４２】本発明の免疫毒素を作るための好適な方法
の一つは、本発明の組換ブリオジン１毒素を、リガン
ド、好ましくは前述のモノクローナル抗体又はそのフラ
グメントに化学的にコンジュゲートさせることによる。
数多くの化学コンジュゲーションの方法が当業者に公知
である。例えばVitetta ら、1987, Science 238 : 109
8; Pastan ら、1986, Cell 47 : 641 ; 及びThorpeら、
1987, Cancer Res. 47：5924を参照のこと。これらの方
法は一般に、毒素と抗体とを、それら２つのタンパク質
の間にジスルフィド結合を導入する架橋剤を介してコン
ジュゲートさせている。還元不能な結合により調製した
免疫毒素は、ジスルフィド結合によって架橋した類似の
毒素よりも一慣して低い細胞障害性であることが示され
ている。
【００４３】一の好適な方法は、Ｎ−スクシニミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）及び２−イミノチオラン塩酸塩（２ＩＴ）を使用す
る。その他の好適な試薬は、ナトリウム Ｓ−４−スク
シニミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオ
スルフェート（ＳＭＢＴ）と２ＩＴ、又はスクシニミジ
ルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルチ
オ）−トルエンと２ＩＴである。各グループの試薬は、
毒素と抗体との間に還元性であるジスルフィド結合を導
入するが、しかしその結合はインビトロ及びインビボで
のこのコンジュゲートの安定性を担うように切断に対し
ても耐性である。標的細胞によるリソゾーム又はエンド
ソームの中への内在化により、この結合は還元され、そ
してこの毒素はサイトプラズマの中に侵入し、伸長因子
２に結合し、タンパク質合成を妨害する。
【００４４】本発明の別の好適な態様は組換免疫毒素、
特に一本鎖免疫毒素である。これらの分子は毒素−抗体
コンジュゲート（免疫毒素）に比べ、そのコンジュゲー
トよりも簡単に製造でき、そして毒素分子の均一な集合
物、即ち、同一のアミノ酸残基より成る単独種のペプチ
ドが作製される点で有利である。
【００４５】親抗体の一本鎖誘導体に相当するアミノ酸
配列をエンコードするＤＮＡ配列をクローニング及び発
現させるための技術は上記の通り、当業によく知られて
いる。ブリオジン１のヌクレオチド配列は本発明によっ
て紹介され、そして組換毒素融合タンパク質を構築する
様々な方法は、Pastan and Fitzgerald, 1991, Science
254, 1173 ; Siegallら、1988, Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85：9738 ; Batraら、1991, Mol.Cell Biol. 11 :
2200；O'Hareら、1990, FEBS Lett. 273：200; Westby
ら、1992, Bioconj.Chem. 3 : 375 に記載されている。
【００４６】本発明の組換リボソーム不活性化性毒素
は、その単離形態において、並びにリガンド毒素コンジ
ュゲートとして、及び組換毒素融合タンパク質として、
インビトロ及びインビボの両方において、治療用途にと
って有用である。ウリ科の植物から単離したリボソーム
不活性化性タンパク質はとりわけ、堕胎薬、免疫抑制
剤、抗腫瘍剤及び抗ウィルス剤（Ngら、1992, Gen Phar
mac. 23 : 575-590 ）又は抗マラリア剤（Amorimら、19
91, Mem.Inst.Oswaldo Cruz 86 : 177）として有用であ
ることが見い出されている。
【００４７】組換ブリオジン１は、リガンド−毒素コン
ジュゲート又は組換毒素融合タンパク質として特に有用
であり、なぜならＢＤ１は免疫毒素を構築するために用
いた数多くの他のタンパク質毒素及びリボソーム不活性
化タンパク質よりも毒性が低く、且つ細胞の内側に入る
とタンパク質合成を阻害することにおいて特に有効であ
るからである。リガンド−毒素コンジュゲート及び組換
毒素融合タンパク質は、身体から取出した細胞を処置し
て所望の細胞集団を排除もしくは殺傷し、その後患者に
残留細胞を再移植するか、又は所望の細胞集団を排除も
しくは殺傷するために患者に組換毒素融合体を直接投与
するインビトロ処置の両方において使用できうる。
【００４８】生体外用途のためには、例えば骨髄を、癌
に苦しむ患者から取出し、次いでその骨髄をリガンド−
毒素コンジュゲート又は融合タンパク質による処置にか
けてよい。処置後、その骨髄を患者に戻す（例えば、Ra
msayら、1988, J.Clin.Immunol. 8 : 81-88 を参照のこ
と）。
【００４９】生体内用途にとっては、本発明は、リガン
ド、又はリガンド−毒素コンジュゲートもしくは融合分
子の機能同等物に特異的に結合する抗原を発現する細
胞、即ち、腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法を提供す
る。この方法は、薬理学的に有効な量の本発明の少なく
とも一のリガンド−組換毒素コンジュゲート又は融合分
子を含む組成物を対象体に投与することによって、組換
毒素コンジュゲート又は融合分子を腫瘍細胞と反応させ
ることを含んで成る。
【００５０】本発明に従い、対象体はヒト、ウマ、ブ
タ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ及びサルであってよい。
その他の温血動物も本発明の範囲に属する。
【００５１】請求項記載の発明は哺乳類腫瘍細胞の繁殖
を阻止する方法も提供する。この方法は、哺乳類腫瘍細
胞を、繁殖阻止量の（即ち、有効量）、腫瘍関連抗原に
特異的なリガンドに連結された腫瘍標的化組換毒素と接
触させ、哺乳類腫瘍細胞の繁殖を阻止することを含んで
成る。
【００５２】以下の実施例は本発明の例示のために紹介
し、本発明を限定するものではない。
【００５３】
【実施例】実施例１ ブリオニア ジオイカ由来のブリオジン１の精製 本実施例は、ブリオニア ジオイカの根からの全タンパ
ク質の調製及び新規タンパク質ブリオジン１を含むリボ
ソーム不活性化性タンパク質の分離を述べる。
【００５４】ブリオニア ジオイカの根（Poyntzfield
Herb Nursery, Ross-shire, Scotland）を清浄にし、む
き、ちぎり、そしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１リッ
トルのＰＢＳ：５５０ｇの根材料）の中でＷａｒｉｎｇ
ブレンダーを用いてホモナイズした。得られるスラリー
を４℃で１６時間撹拌し、そしてチーズクロスで濾過し
た。植物材料の除去後、その濾液を１５×ｇで４℃で１
５分遠心して大粒子を除き、次いで５０×ｇで２０分２
回遠心して清澄にした。次にその上清液を無菌０．２２
ミクロンフィルターで濾過し、そして５mMのリン酸ナト
リウムバッファー、pH６．５に対して透析した。
【００５５】次に植物タンパク質をその電荷及びサイズ
を基礎に、５段階手順を利用して分離した。まず、透析
した根抽出物を、５mMのリン酸ナトリウムpH６．５に平
衡化させておいたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ph
armacia, Uppsala, Sweden）に載せた。タンパク質を０
〜０．３ＭのＮａＣｌの塩勾配を利用してそのカラムか
ら溶離させた。次に、４mlの画分を集め、そしてその溶
離液の光学密度を２８０nmでモニターした（図１）。そ
のクロマトグラフィー画分を電気泳動により評価した。
それぞれの回収画分のうちの１５μｌのアリコートをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに加え、１００℃で
５分煮沸し、そして４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配
ゲルで分離させた（Laemmili, 1970, Nature 227 : 680
-685）。このゲルをクマジーブルーで染色して、分離し
たタンパク質を解析した（図２）。
【００５６】第三の精製工程において、２９kDa のタン
パク質バンドを含む画分９〜１５をプールし、次いでＣ
ｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０（Amicon, Bedford, MA ）を
用いて８ml未満の容量にまで濃縮した。第四の工程は、
その濃縮物をサイズ排除カラムＴＳＫ−３０００（Toso
Haas, Inc., Philadelphia, PA）に載せ、次いで植物タ
ンパク質をイソクラチック的に溶離させることである。
３mlの画分を集め、そしてその溶離を２８０nmでモニタ
ーした（図３）。サイズ排除クロマトグラフィーの後、
この精製工程の第五工程は、上記の通りにＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによってその画分を分析することにあるが、ただし
１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用した。タンパク質
をクマジーブルー染色により解析した。２９kDa 及び２
７kDa で泳動する２つの独立のタンパク質バンドがピー
ク画分５８〜６４において認められた（図４）。これら
の画分を別々にプールし、そしてこの材料を更なる特性
化のために使用した。
【００５７】実施例２ ブリオジンのＮ−末端アミノ酸配列分析 本実施例においては、プール画分の中に含まれている２
９kDa のタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定し
た。この２９kDa タンパク質の最初の３２個のアミノ酸
残基が明確に決定され、そしてStirpeにより述べられて
いるブリオジン（ブリオジン１）と同一であることが認
められた。
【００５８】Ｎ−末端アミノ酸配列は簡単に説明する以
下の方法により決定した。このタンパク質バンドは、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから、ミニ−トランスブ
ロット電気泳動転写セル（Bio Rad Laboratories, Rich
mond, CA）を用いてＰｒｏｂｌｏｔｔ膜（Applied Bios
ystems, Foster City, CA ）上にエレクトロブロットす
ることにより個別に回収した（Matsudaira, 1987, J.Bi
ol.Chem. 262 : 10035-10038）。この膜をクマジーブリ
リアントブルーで染色し、次いで脱色し、そして２９kD
a のバンドをその後のアミノ末端配列分析のために切り
出した。
【００５９】サンプルを鉛直クロス−フロー反応カート
リッジの付いたパルス式液相タンパク質シーケンサー
（Model 476A, Applied Biosystems）において、その製
造者の示すサイクルプログラムを利用して配列決定し
た。フェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体を逆相Ｈ
ＰＬＣにより、ＰＴＨ Ｃ１８カラム（Applied Biosys
tems）で、酢酸ナトリウム／テトラヒドロフラン／アセ
トニトリル勾配を溶離のために用いて、分析した（Temp
st and Reviere, 1989, Anal.Biochem. 183 : 290-300
）。データーの削減及び定量化はＭｏｄｅｌ ６１０
Ａクロマトグラフィー分析ソフトウェア（Applied Bios
ystems）を用いて行った。
【００６０】ＢＤ１のアミノ末端アミノ酸配列決定は、
Ｐｒｏｂｌｏｔｔ膜にエレクトロブロットして、４７pm
ole （同定Ｖａｌ−１の初期収量を基礎）で行った。単
独のアミノ酸配列が得られ、そしてＰＴＨ−アミノ酸誘
導体の明確な同定が残基３２に至るまで可能であった
（配列番号１）。
【００６１】実施例３ ブリオジン１のｃＤＮＡクローニング 本実施例においては、ブリオニア ジオイカの葉由来の
全ＲＮＡをブリオジン１のｃＤＮＡクローニングのため
に用いた。簡単に述べると、全ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Mo
lecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH ）を
用い、その製造者のプロトコールに従い、２．１ｇの葉
材料から抽出した。凍結葉を破砕し、ＴＲＩ試薬の中に
溶かし、そしてホモジナイズした。全ＲＮＡをクロロホ
ルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、そしてエ
タノールの中で洗った。得られる全ＲＮＡをＨ2 Ｏの中
に再懸濁し、秤量し、そしてホルムアルデヒド−アガロ
ースゲルにおける電気泳動により分析し、そして臭化エ
チジウムで染色することによって視覚化した。およその
収量は０．９mgの全ＲＮＡ／葉材料ｇであった。
【００６２】オリゴ（ｄＴ）−プライマ化ｃＤＮＡ（鋳
型として全ＲＮＡを使用）を縮重オリゴヌクレオチド混
合物ＢＤ１−ｐ２０（配列番号３）及びＢＤ１−ｐ２２
（配列番号４）を用いてＰＣＲにより増幅し、アミノ酸
７〜３０のＢＤ１配列を抽出した。ＰＣＲ反応の生成物
をベクターｐＣＲII（Invitrogen Corp., San Diego,CA
）の中に、その製造者のプロトコールに従い、ＴＡク
ローニングキットを用いてサブクローンした。簡単に述
べると、３′一本鎖デオキシアデノシンを含むＰＣＲ増
幅生成物を、ＥｃｏＲＩ部位において、３′ｄＴ突出を
伴って調製したｐＣＲIIベクターにリゲートした。この
リゲーション生成物をＤＨ５αＥ．コリ細胞の中に形質
転換させた（Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Lab
oratory, NY ）。
【００６３】アガロースゲル電気泳動の決定に従い、１
００〜１２０塩基対（bp）のインサートの存在を基礎
に、ＤＮＡ配列分析のために組換クローンを選別した
（Sambrookら、前掲）。ＤＮＡ配列決定（Sangerら、19
77, Proc.Nat'l.Acad.Sci. 74, 5463 ）をＳｅｑｕｅｎ
ａｓｅ（United States Biochemical Corp., Clevelan
d,OH）を用い、ジデオキシヌクレオチド停止により実施
した。ＢＤ１のアミノ末端配列に対合する適正なヌクレ
オチドを含む一のクローンが、８１の個々のクローンの
配列分析を経て同定された。
【００６４】ＢＤ１遺伝子の３′末端を以下の通りにし
て３′ＲＡＣＥにより増幅させた。オリゴヌクレオチド
ＸＳＣ−Ｔ１７（配列番号９）及びＸＳＣ（配列番号１
０）により全ＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡを増幅し、そして
上記の通りにｐＣＲIIにクローンする。ＢＤ１配列を含
むクローンを、〔32Ｐ〕−ラベル化ＢＤ１−Ｅｘ４（配
列番号６）、即ち、ＰＣＲプライマーＢＤ１−Ｅｘ２の
下流にまさに位置するＢＤ１遺伝子の領域のヌクレオチ
ド配列を有するオリゴヌクレオチドでプローブしたナイ
ロンフィルター上でのハイブリダイゼーションにより選
別した。ＢＤ１遺伝子オープンリーディングフレームを
エンコードする２つのクローンがＤＮＡ配列決定により
同定された。
【００６５】ＢＤ１遺伝子のまさに５′末端を同定する
ため、５′ＲＡＣＥを 5′RACE System (Gibco BRL, Ga
ithersburg, MD）を用い、その製造者のプロトコールに
従い行った。簡単に述べると、第一鎖ｃＤＮＡをオリゴ
ヌクレオチドプライマーＢＤ１−Ｆｕｌｌ（配列番号
７）を用いて合成し、ｄＣＴＰでテール化し、そして得
られる第一鎖をオリゴヌクレオチドプライマーＢＤ１−
ｐ２（アミノ酸残基２６−３６をエンコードする配列番
号８）及びＡＰ（ポリ−Ｃテールに結合するポリ−Ｇア
ダプターをエンコードする配列番号１１）でＰＣＲ増幅
させた。得られる増幅ＤＮＡフラグメントを上記の通り
にプラスミドｐＣＲIIの中にサブクローンした。ＢＤ１
エンコードクローンを、〔32Ｐ〕−ラベル化ＢＤ１−Ｅ
ｘ２（配列番号５）でプローブしたナイロンフィルター
上でのハイブリダイゼーションにより選別した。ＤＮＡ
配列決定のため、ＢＤ１，ｐＣＲII ＢＤ１ ｃ１．１
及びｐＣＲII ＢＤ１ ｃ１．６をエンコードするｃＤ
ＮＡを含む２つの陽性クローンを選別した。ＢＤ１をエ
ンコードする完全ＤＮＡ配列を図５に示す。
【００６６】ＢＤ１をｃＤＮＡクローニングするのに用
いたオリゴヌクレオチドは下記の通りであり、ここで中
かっこ内の配列は縮重を示し、そして小かっこ内の配列
は対応のアミノ酸配列を示す。
【００６７】
【化２】
【００６８】
【化３】
【００６９】
【化４】
【００７０】
【化５】
【００７１】
【化６】
【００７２】
【化７】
【００７３】
【化８】
【００７４】
【化９】
【００７５】
【化１０】
【００７６】実施例４ 発現プラスミドの構築及び組換ＢＤ１の発現 本実施例においては、組換ブリオジン１（ｒＢＤ１Ｆ１
及びｒＢＤ１Ｆ２、それぞれ）をエンコードし、且つ発
現する２つのプラスミド（ｐＳＥ１４．０及びｐＳＥ１
３．０）を構築した。また、本実施例において、このプ
ラスミドにより発現させたブリオジン１を精製し、そし
てタンパク質合成を阻害することを証明している。
【００７７】簡単に述べると、ｐＳＥ１３．０を以下の
通りにして構築した。プラスミドｐＣＲII ＢＤ１ ｃ
１．１によりエンコードされるｃＤＮＡ配列を、プライ
マー１
【００７８】
【化１１】
【００７９】及びプライマー２
【００８０】
【化１２】
【００８１】を用い、７７０bpのＤＮＡフラグメントを
ＰＣＲ増幅するために用いた。
【００８２】５′ＰＣＲプライマー（プライマー１）
は、ＡＴＧ開始コドンに隣接する固有ＮｃｏＩ制限部位
及びＢＤ１遺伝子の最初の１４のコドンをエンコードす
るようにデザインした。３′ＰＲＣプライマー（プライ
マー２）は、成熟ＢＤ１タンパク質のカルボキシル末端
に対応するＢＤ１遺伝子の最後の９コドンにアニールす
るようにデザインした。３′プライマーは２つの連続停
止コドン、それに続くＥｃｏＲＩ制限部位を含む。
【００８３】ＲＣＲ増幅並びにＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ
による消化の後、７４７bpのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラ
グメントを、Ｔ７プロモーターの転写コントロール下に
あるプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen, Madison, WI）
から調製した５４６５bpのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩベクタ
ーフラグメントの中にリゲートした。このリゲーション
の生成物はｐＳＥ１０．０と命名する中間ベクターであ
り、これはＴ７プロモーター、ＰｅｌＢリーダー配列及
びＢＤ１をエンコードするｃＤＮＡ配列を含む。
【００８４】ＰｅｌＢリーダー配列抜きのＢＤ１をエン
コードするｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターｐＳＥ１
３．０を制限酵素ＸｂａＩ及びＮｃｏＩによりベクター
ｐＳＥ１０．０を消化することにより構築した。消化の
後、６１０６bpのフラグメントを、プライマー３及びプ
ライマー４のアニールによって作ったオリゴ二量体とリ
ゲートさせた。
【００８５】
【化１３】
【００８６】
【化１４】
【００８７】プラスミドｐＳＥ１４．０をｐＳＥ１３．
０と同じようにして構築した。プラスミドｐＣＲII Ｂ
Ｄ ｃ１．１．１によりエンコードされるｃＤＮＡ配列
をプライマー１（配列番号１２）及びプライマー５によ
りＰＣＲ増幅させた。
【００８８】
【化１５】
【００８９】３′プライマー（プライマー５）は固有Ｅ
ｃｏＲＩ制限部位をエンコードし、そして完全ＢＤ１タ
ンパク質のカルボキシル末端に相当するＢＤ１遺伝子の
最後の１７コドンにアニールする。この３′プライマー
はＥｃｏＲＩ部位の前に２つの停止コドンも含む。ＰＣ
Ｒ増幅及びＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ消化の後、８０７bpの
フラグメントをｐＳＥ１３．０についてまさに説明した
通りにｐＥＴ２２ｂの中にリゲートし、中間プラスミド
ｐＳＥ１１．０を得た。ｐＳＥ１１．０のＰｅｌＢリー
ダー配列をｐＳＥ１３．０についてまさに説明した通り
に除去し、完全ＢＤ１形態（ＢＤ１Ｆ１）をエンコード
する発現プラスミドｐＳＥ１４．０を得た。
【００９０】プラスミドｐＳＥ１４．０及びｐＳＥ１
３．０それぞれからの発現は、５０μｇ／mlのアンピシ
リンの添加及びＩＰＴＧ（１mM）の誘発を伴ってＴブロ
スの中で３７℃で１．５時間増幅させたＥ．コリＢＬ２
１（λＤＥ３）の１リットル培養物の中で行った。細胞
ペレットを遠心により集め、そして２通りの方法の一方
により処理した。第一の方法においては、細胞を１０mM
のトリス、pH７．４、１００mMのＫＣｌ、２０mMのＥＤ
ＴＡ、１０mMの２−メルカプトエタノール、０．０５％
のＮＰ−４０及び５mgのリゾチーム／培養物１リットル
の中で、氷上で３０分かけて溶解させた。この細胞懸濁
物を３回凍結／融解し、音波処理し、そして１５，００
０RPM で３０分遠心した。第二の方法においては、細胞
ペレットを２０％のスクロース、３０mMのトリスＨＣｌ
pH７．５及び１mMのＥＤＴＡの中に氷上で１０分再懸
濁し、そして８，０００RPM で１５分遠心した。このペ
レット（又はスフェロプラスト）を５０mMのトリスＨＣ
ｌ（pH８．０）及び１mMのＥＤＴＡの中に再懸濁し、音
波処理し、そして３０Ｋで４５分遠心した。両方の方法
により集めたペレットを７Ｍのグアニジン、１００mMの
トリスpH７．４及び１mMのＥＤＴＡの中に１時間溶か
し、音波処理し、そして２５，０００RPM で３０分遠心
した。
【００９１】ｐＳＥ３３．０又はｐＳＥ１４．０より発
現させ、単離した変性組換ブリオジン１（ＢＤ１）タン
パク質を０．４ＭのＬ−アルギニンＰＢＳ及び７０mMの
グアニジンの中で８０μｇ／mlのタンパク質濃度で４℃
で２４時間以上かけて再折りたたみさせた。このタンパ
ク質を５mMのＮａＨ2 ＰＯ4 に対して過剰に透析し、そ
して０〜０．３ＭのＮａＣｌ勾配を利用してＣＭ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（弱カチオン交換）により単離した。組
換ＢＤ１Ｆ１及びＢＤ１Ｆ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウ
サギ抗−ＢＤ１ポリクローナル抗体を利用するウェスタ
ンブロット分析によって分析し、そして天然ＢＤ１と対
比させた（図７及び８）。
【００９２】両回収方法１及び２により精製した組換Ｂ
Ｄ１の活性を以下の通りの無細胞ウサギ網状赤血球アッ
セイ（Promega Biotec, Madison, WI ）で試験した。簡
単には、毒性タンパク質を２５μｌの容量のウサギ網状
赤血球リゼート（反応容量の７０％）、１mM全アミノ酸
（ロイシンを除く）の混合物、０．５mCi ／mlの〔 3Ｈ
−ロイシン〕、及び基質としての（０．５μｇ）ブロー
ムモザイクウィルスＲＮＡ（Shihら、1973, Proc.Nat'
l.Acad.Sci. USA 70 : 1799-1803 ）の中に混合した。
その反応物を３０℃で３０分インキュベートし、そして
１ＭのＮａＯＨ、２％のＨ2 Ｏ2 により停止させた。そ
の翻訳産物を氷冷の２５％のトリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）、２％のカスアミノ酸を用い、氷上で３０min かけ
て沈殿させた。ラジオラベル化タンパク質をガラスファ
イバーフィルター上に集め、５％のＴＣＡですすぎ、エ
タノールで洗い、乾かし、そしてシンチレーションカウ
ンターを用いて定量した。両回収方法により単離した組
換ＢＤ１はタンパク質合成の有能なインヒビターであ
り、そして３〜４pMのＥＣ50値を伴うことで天然ＢＤ１
のそれと本質的に同等であることが認められた（図
９）。
【００９３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１０９４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ ヒポセティカル：ＮＯ 起源：ブリオニア ジオイカ 配列 TCATCGAAAT TCATCAAGAC TGAATTGAAA GAGTAAAAAA AAAATGATCA 50 AATTGTTAGT CCTTTGGTTG CTAATTCTCA CCATATTCCT CAAATCTCCA 100 ACTGTTGAGG GCGATGTTAG CTTCCGTTTA TCAGGTGCTA CAACCACATC 150 CTATGGAGTT TTCATTAAAA ATCTGAGAGA AGCTCTTCCA TACGAAAGGA 200 AAGTGTACAA TATACCGCTA TTACGTTCAA GTATTTCAGG TTCAGGACGC 250 TACACATTAC TCCATCTCAC AAATTACGCG GATGAAACCA TCTCAGTGGC 300 AGTAGACGTA ACAAACGTCT ATATTATGGG GTATCTTGCC GGTGATGTGT 350 CCTATTTTTT CAACGAGGCT TCAGCAACAG AAGCTGCAAA ATTCGTATTC 400 AAAGATGCTA AGAAAAAAGT GACGCTTCCA TATTCAGGCA ATTACGAAAG 450 GCTTCAAACT GCTGCAGGAA AAATAAGAGA AAATATTCCA CTTGGACTCC 500 CAGCTTTGGA CAGTGCCATT ACCACTTTGT ATTACTACAC CGCCAGTTCT 550 GCGGCTTCTG CACTTCTTGT ACTCATTCAA TCCACGGCTG AATCTGCAAG 600 GTATAAATTT ATTGAACAAC AAATTGGAAA GCGTGTAGAC AAAACTTTTT 650 TACCAAGTTT AGCAACTATT AGTTTGGAAA ATAATTGGTC TGCTCTGTCC 700 AAGCAAATTC AGATAGCCAG TACCAATAAT GGACAATTTG AGAGTCCTGT 750 TGTGCTTATA GATGGTAACA ACCAACGAGT CTCTATAACC AATGCTAGTG 800 CTCGAGTTGT AACCTCCAAC ATAGCGTTGC TGCTAAACAG AAATAATATT 850 GCAGCCATTG GAGAGGACAT TTCTATGACA CTCATCGGCT TTGAACATGG 900 ACTTTATGGT ATATAGTGTA AGTTTAAAGC TATGGACAAG CACAAACTCC 950 ACCTGAAGAA CAATCTGTTG TTCTTCGAGA GGTTAATCTA CTTGTATAAA 1000 TAAAGAATGT TCATGTGATC TATCTACGTT AATTCTGTCT GTTGTTGTTG 1050 CTTTAAATAA TAAAAAGTGT GGAGTCCTTC TATAAAAAAA AAAA 1094
【００９４】配列番号：２ 配列の長さ：２９０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖 分子の種類：タンパク質 フラグメントの種類：Ｎ末端 起源：ブリオニア ジオカ 配列 Met Ile Lys Ieu Leu Val Leu Trp Leu Leu Ile Leu Thr Ile Phe 1 5 10 15 Leu Lys Ser Pro Thr Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser 20 25 30 Gly Ala Thr Thr Thr Ser Tyr Gly Val Phe Ile Lys Asn Leu Arg 35 40 45 Glu Ala Leu Pro Tyr Glu Arg Lys Val Tyr Asn Ile Pro Leu Leu 50 55 60 Arg Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Tyr Thr Leu Leu His Leu 65 70 75 Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala Val Asp Val Thr 80 85 90 Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Val Ser Tyr Phe 95 100 105 Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Phe Val Phe Lys 110 115 120 Asp Ala Lys Lys Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu 125 130 135 Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu 140 145 150 Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Tyr Tyr 155 160 165 Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Ser 170 175 180 Thr Ala Glu Ser Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly 185 190 195 Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser 200 205 210 Leu Glu Asn Asn Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala 215 220 225 Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asp 230 235 240 Gly Asn Asn Gln Arg Val Ser Ile Thr Asn Ala Ser Ala Arg Val 245 250 255 Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ile Ala 260 265 270 Ala Ile Gly Glu Asp Ile Ser Met Thr Leu Ile Gly Phe Glu His 275 280 285 Gly Leu Tyr Gly Ile 290
【００９５】配列番号：３ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CCTAGCCCAT GGATGTKAGC TTYCGTTT 28
【００９６】配列番号：４ 配列の長さ：３３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CCTAGCGAAT TCCTASAGAG GKATRTTGTA SAC 33
【００９７】配列番号：５ 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 TTATCAGGTG CTACAACCAC ATCC 24
【００９８】配列番号：６ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GAAGCTCTTC CATACGAAAG G 21
【００９９】配列番号：７ 配列の長さ：７５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CAAAGATCCT CTGAATTCTT ACTATATACC ATAAAGTCCA TGTTCAAAGC 50 CGATGAGTGT CATAGAAATG TCCTC 75
【０１００】配列番号：８ 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GAGAGGTATG TTGTAGACTT TCCT 24
【０１０１】配列番号：９ 配列の長さ：３５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GACTCGAGTC GACATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35
【０１０２】配列番号：１０ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GACTCGAGTC GACATCG 17
【０１０３】配列番号：１１ 配列の長さ：３６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGII GGGIIG 36
【０１０４】配列番号：１２ 配列の長さ：５６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GTCAGAGTTC CATGGATGTG AGCTTTCGTT TATCAGGTGC TACAACCACA 50 TCCTAT 56
【０１０５】配列番号：１３ 配列の長さ：５０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CAAAGATCCT CTGAATTCTT ATTATGCAAT ATTATTTCTG TTAGCAGCAA 50
【０１０６】配列番号：１４ 配列の長さ：３７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATAC 37
【０１０７】配列番号：１５ 配列の長さ：３７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CATGGTATCT CCTTCTTAAA GTTAAACAAA ATTATTT 37
【０１０８】配列番号：１６ 配列の長さ：７５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CAAAGATCCT CTGAATTCTT ACTATATACC ATAAAGTCCA TGTTCAAAGC 50 CGATGAGTGT CATAGAAATG TCCTC 75
【図面の簡単な説明】
【図１】ブリオニア ジオイカの根から単離したタンパ
ク質のＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーか
らの吸収値の結果である。
【図２】ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー
分離に由来する画分９〜１５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の
結果である。レーンＭは分子量標準品：オバルブミン
（４３，０００MW）、カルボニックアンヒドラーゼ（２
９，０００MW）、β−ラクトグロブリン（１８，０００
MW）、リゾチーム（１４，０００MW）、牛トリプシンイ
ンヒビター（６，０００MW）及びインスリン（２，００
０MW）を含む。
【図３】ＴＳＫ−３０００サイズ排除カラムから得たク
ロマトグラフィーである。２９kDa のバンドを含む画分
をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー分離よ
りプールし、そして８ml未満に濃縮した。その濃縮物を
カラムに載せ、そして２８０nmでの吸収をモニターし
た。
【図４】部分精製ブリオジンのサイズ排除クロマトグラ
フィーに由来する画分５８〜６４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析について得られた結果である。レーンＭは分子量標準
品：オバルミン（４３，０００MW）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（２９，０００MW）及びβ−ラクトグロブリ
ン（１８，０００MW）を含む。
【図５】ブリオジン１をエンコードするＤＮＡ配列を示
す。この配列は、残基１〜２９０由来の５′非コード配
列及びヌクレオチド１〜１０９４で出発して、番号を付
した。ヌクレオチド９１４−９１６は停止コドンを示
し、そして９１７−１０９４は３′非コード配列を示
す。３′非コード領域における２つの下線を付したヘキ
サヌクレオチド配列は２つの個別のクローンの中で見い
出せるポリアデニル化シグナルに対応する。アミノ酸２
４にある矢印は成熟ＢＤ１アミノ末端の開始部に相当す
る。残基２７１及び２９０のアミノ酸にある矢印は、推
定成熟タンパク質（Ｆ２）及び全プロタンパク質（Ｆ
１）をエンコードするＢＤ１の２つの形態（Ｆ２及びＦ
１のそれぞれ）に対応する。
【図６】Ａ及びＢはＢＤ１発現プラスミドｐＳＥ１３．
０及びｐＳＥ１４．０の模式図である。
【図７】Ａ，Ｂ及びＣはそれぞれ、変性し、そして再折
りたたみに付した組換ＢＤ１Ｆ１（アミノ酸残基２４−
２９０）の、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフ
ィープロフィール（Ａ）、クマジーブルー染色によるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）及び抗ＢＤ１ポリクローナル抗体
（ウサギ）を用いるウェスタンブロット（Ｃ）である。
クロマトグラフィープロフィールにおける画分はゲル上
の画分番号に対応する。Ｎ＝天然ＢＤ１。
【図８】Ａ，Ｂ及びＣはそれぞれ、組換ＢＤ１Ｆ２（ア
ミノ酸残基２４−２７０）の精製の結果（Ａ）；ＣＭ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィープロフィール
（Ｂ）；クマジーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
を示す。
【図９】インビトロ無細胞ウサギ網状赤血球翻訳アッセ
イを利用した、組換ＢＤ１Ｆ１及びＢＤ１Ｆ２、対、天
然ＢＤ１のタンパク質合成阻害活性のデーターである。
タンパク質合成は、リボソーム不活性化性タンパク質処
理及び未処理翻訳産物の〔 3Ｈ〕−ロイシン取込みとし
て測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/46 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ブリオニア ジオイカ（Bryonia dioi
    ca）由来のリボソーム不活性化性タンパク質をエンコー
    ドする単離されたオリゴヌクレオチド配列であって、そ
    のタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る
    ことを特徴とする、オリゴヌクレオチド配列又はこのオ
    リゴヌクレオチド配列の相補体。
  2. 【請求項２】 配列番号１のおよそのヌクレオチド番号
    ４４からおよそのヌクレオチド番号９１３に至るまでの
    ヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の単離さ
    れたオリゴヌクレオチド配列。
  3. 【請求項３】 配列番号１のおよそのヌクレオチド番号
    １１３からおよそのヌクレオチド番号９１３に至るまで
    のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の単離
    されたオリゴヌクレオチド配列。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列が、インビトロで
    タンパク質合成を阻害するブリオジン１の生物学的に活
    性なフラグメントをエンコードする、請求項１記載の単
    離されたヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】 ブリオニア ジオイカ由来のリゾソーム
    不活性化性タンパク質をエンコードするオリゴヌクレオ
    チド配列を含んで成り、このタンパク質が配列番号２の
    アミノ配列を含んで成ることを特徴とする組換ベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】 前記リボソーム不活性化性タンパク質を
    エンコードするオリゴヌクレオチド配列に作動連結して
    いる転写及び翻訳コントロール配列を更に含んで成る、
    請求項５記載の組換ベクター。
  7. 【請求項７】 前記ベクターがＡＴＣＣ ６９６２０と
    命名されているものである、請求項５記載の組換ベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項５記載の組換ベクターでトランス
    フェクトされた宿主細胞。
  9. 【請求項９】 請求項７記載の組換ベクターでトランス
    フェクトされた宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 ブリオジン１の組換発現のための方法
    であって、宿主細胞を、配列番号２の連続アミノ酸配列
    をエンコードするオリゴヌクレオチド配列を含んで成る
    発現ベクターでトランスフェクトし、このトランスフェ
    クト宿主細胞を増殖させ、ブリオジン１を発現するよう
    にこのトランスフェクト宿主細胞を誘発させ、そして発
    現した組換ブリオジン１を単離することを含んで成る方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記宿主細胞が細菌、植物細胞、酵母
    又は哺乳動物細胞である、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 組換ブリオジン１−リガンド融合タン
    パク質を作るための方法であって、リガンドをエンコー
    ドするオリゴヌクレオチド配列に作動連結した配列番号
    ２の連続アミノ酸配列をエンコードするオリゴヌクレオ
    チド配列を含んで成る発現ベクターで宿主細胞をトラン
    スフェクトし、この組換ブリオジン１−リガンド融合タ
    ンパク質を発現するようにこのトランスフェクト宿主細
    胞を誘発させ、そして発現したこの組換ブリオジン１−
    リガンド融合タンパク質を単離することを含んで成る方
    法。
  13. 【請求項１３】 前記宿主細胞が細菌、植物、酵母又は
    哺乳動物細胞である、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記リガンドが高分子量タンパク質、
    低分子量タンパク質、ポリペプチド又はペプチドリガン
    ドである、請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記リガンドが免疫反応性リガンド、
    トランスフェリン、表皮成長因子、ボンベシン、ガスト
    リン、ガストリン放出性ペプチド、血小板由来成長因
    子、ＩＬ−２，ＩＬ−６又は腫瘍増殖因子である、請求
    項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記免疫反応性リガンドが、抗原認識
    性イムノグロブリン、その抗原認識性フラグメント、キ
    メラ抗体、二価抗体、ハイブリド抗体又は一本鎖抗体で
    ある、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記免疫反応性リガンドの抗原認識性
    フラグメントが、イムノグロブリンのＦａｂ′，Ｆ（ａ
    ｂ′）2 ，Ｆｖ又はＦａｂフラグメントである、請求項
    １６記載の方法。
JP7141365A 1994-05-17 1995-05-17 ブリオニア ジオイカ由来のブリオジン１をエンコードする遺伝子のクローニング及び発現 Pending JPH0898694A (ja)

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