JPH0898696A

JPH0898696A - 微生物による化合物の還元方法

Info

Publication number: JPH0898696A
Application number: JP23763594A
Authority: JP
Inventors: Hideo Araki; 秀雄荒木; Wataru Kugimiya; 渉釘宮
Original assignee: Fuji Oil Co Ltd
Current assignee: Fuji Oil Co Ltd (fka Fuji Oil Holdings Inc)
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 1996-04-16

Abstract

(57)【要約】【目的】常温、常圧下で反応を行うことができ、副生
物の生成が少なく、処理、操作が簡単で経済的なカルボ
ン酸及びその塩、カルボニル化合物並びにスルホキシド
化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物
の還元方法を提供することにある。【構成】カルボン酸及びその塩、カルボニル化合物並
びにスルホキシド化合物からなる群から選ばれる少なく
とも１種を、水素及び／又は一酸化炭素雰囲気中、電子
伝達体存在下に、水性媒体と実質的に水と不溶性ないし
難溶性の有機溶媒との液体二相系で、還元酵素を有する
微生物の休止菌体を用いて還元することを特徴とする前
記化合物の還元方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物の休止菌体を用
いた水性媒体と有機溶媒の液体二相系でのカルボン酸及
びその塩類、カルボニル化合物並びにスルホキシド化合
物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物の還
元方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、カルボン酸及びその塩類、カルボ
ニル化合物並びにスルホキシド化合物の還元は、化学的
方法によって行われている。ところが、化学的還元方法
は、一般的には、触媒コストの問題や、高圧、高温の条
件下で反応を行わせるため特別の設備が必要であるなど
の問題がある。かかる問題を解決する方法として微生物
を用いる方法があり、特開平6-88号公報には、親水性固
定化担体に微生物を付着し、該微生物の栄養源を含む水
性媒体存在下に、カルボニル化合物を含む有機溶媒を該
担体上の固定化菌体相と接触せしめることを特徴とする
カルボニル化合物の還元方法が開示されている。しかし
ながら、この方法は、微生物として増殖菌体を用いるこ
とから、糖を含む栄養源等を添加しなければならない等
処理、操作が煩雑であり、また、反応に関係ない副生物
が生じることから還元反応が阻害される等の問題があ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、高温、高圧の条件下で反応を行う必要がなく、即
ち、穏やかな条件下で反応を行うことができ、処理、操
作が簡単で、副生物の生成が少なく、効率的なカルボン
酸及びその塩類、カルボニル化合物並びにスルホキシド
化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物
の還元方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意検討を行った結果、水性媒体と
有機溶媒の液体二相系で、糖等の栄養源を必要としない
微生物の休止菌体を用いて還元を行うことにより、反応
を阻害するような副生物の生成を極力抑え、反応性を低
下させることなく基質濃度を上げることができ、また、
生成物を容易に分離できることを見出し本発明を完成す
るに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、カルボン酸及びその
塩類、カルボニル化合物並びにスルホキシド化合物から
なる群から選ばれる少なくとも１種を、水素及び／又は
一酸化炭素雰囲気中、電子伝達体存在下に、水性媒体と
実質的に水と不溶性ないし難溶性の有機溶媒との液体二
相系で、還元酵素を有する微生物の休止菌体を用いて還
元することを特徴とする前記化合物の還元方法を提供す
る。

【０００６】以下、本発明について詳述する。本発明で
使用する微生物としては、カルボキシル基、カルボニル
基及びスルフィニル基からなる群から選ばれる少なくと
も１種の基の還元能を有し、アルコールを生成する還元
酵素を含有する微生物を使用し、好ましくは、嫌気性菌
に属する微生物がよい。具体的には、例えば、クロスト
リジウム（Clostridium ）属、サーモアンアエロバクタ
ー（Thermoanaerobacter）属等に属する微生物が挙げら
れる。さらに具体的には、例えば、クロストリジウム
サーモアセチカム（Clostridium thermoaceticum）ATCC
35608及び39289 、クロストリジウムサーモオートト
ロピカム（Clostridium thermoautotrophicum ）ATCC 3
3924、サーモアンアエロバクターサーモヒドロスルフリ
カス（Thermoanaerobacter themohydrosulufuricus）AT
CC 35045、クロストリジウムサーモサッカロリティカム
（Clostridium thermosacchrolyticum）ATCC 7956 等が
挙げられる。

【０００７】本発明では、上記微生物の休止菌体を使用
する。休止菌体とは、増殖を行わない状態にある培養菌
体をいい、上記微生物の培養終了後、収穫して保存した
ものをいう。保存は、凍結、冷蔵、凍結乾燥等で行うこ
とができる。かかる休止菌体は、そのままか、或いは固
定化した形で使用する。固定化担体としては、一般に用
いられているものであれば何れでもよく、例えば、セル
ロース、アガロース、デキストラン、κ−カラギーナ
ン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖
類；例えば、グルテン等の天然高分子；例えば、活性
炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲ
ル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カル
シウム等の無機物；例えば、ポリアクリルアミド、ポリ
ビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ウレタ
ン等の合成高分子などが例示される。また、微生物の休
止菌体の粗抽出物を使用することもできる。上記微生物
の休止菌体は１種単独で、又は２種以上の組み合わせで
使用される。

【０００８】本発明の還元は、水性媒体と実質的に水と
不溶性ないし難溶性の有機溶媒との液体二相系で行われ
る。液体二相系で還元反応を行うことにより、還元生成
物であるアルコールを容易に分離することができ、ま
た、反応性が向上し、基質濃度を上げることができる。
これは、基質や還元生成物が水相中に蓄積せずに、有機
相に蓄積するためであると推定される。

【０００９】水性媒体は、上記の微生物の休止菌体を分
散させるためのものであり、通常、pH４〜８であり、好
ましくはpH５〜７である。また、水性媒体のpHを安定さ
せるために緩衝液を使用することもできる。さらに、pH
を調節するために、適宜酸、塩基を使用することもでき
る。

【００１０】実質的に水と不溶性ないし難溶性の有機溶
媒は、大部分の基質及び還元生成物を溶解するためのも
のであり、水と不溶性ないし難溶性である限り特に限定
されないが、通常は、log Ｐ値が 0.8以上、好ましくは
0.80〜4.00で、それ自身が基質として還元されないもの
を使用する。log Ｐ値は、有機溶媒の水に対する疎水性
の度合いを示すものであり、Rekker等が実験により決定
した疎水フラグメンタル定数 (hydrophobic fragmental
constant)から計算される値である（Biotechnology an
d Bioengineering, Vol.30, p.81〜87参照）。具体的に
は、例えば、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル
等のエーテル類；例えば、ペンタノール、ヘキサノール
等の好ましくは炭素原子数４〜12のアルコール類；例え
ば、ヘキサン、ヘプタン等の好ましくは炭素原子数５〜
８のアルカン類；ベンゼン；アミン類等が挙げられる。
これらは１種単独で又は２種以上の組合せで使用され
る。

【００１１】本発明において使用する電子伝達体は、天
然の補酵素の代わりに使用するものであり、酸化還元反
応において可逆的に酸化型及び還元型の状態で存在可能
な酸化還元系化合物であれば何れのものでも使用するこ
とができる。好ましくは標準酸化還元電位（pH７）が−
100 〜−500 mVのものを使用する。具体的には、例え
ば、メチルビオロゲン（標準酸化還元電位：−440 m
V）、ベンジルビオロゲン（同−358 mV）等のビオロゲ
ン化合物、アントラキノン-2,6- ジスルホン酸-2- ナト
リウム（同−184 mV）、ニュートラルレッド（同−325
mV）、フェノサフラニン（同−252 mV）等が用いられ
る。この電子伝達体は、そのまま反応系に添加するか、
或いは固定化した形で使用される。固定化担体として
は、一般に用いられているものであれば何れでもよく、
例えば、ポリエチレングリコール等の合成高分子；例え
ば、デキストラン等の天然高分子などが例示される。上
記電子伝達体の使用量は、上記休止菌体の湿菌体１ｇに
対して、通常、１〜30mgの範囲である。

【００１２】また、本発明においては、還元は、水素及
び／又は一酸化炭素雰囲気中で行われる。また、反応速
度を高めるために、水素及び／又は一酸化炭素の圧力を
高めることも可能である。かかる雰囲気中で還元を行う
ことにより、前記電子伝達体を酸化型から還元型に再生
することができる。また、水素及び／又は一酸化炭素を
不活性ガスで希釈して使用することも可能である。不活
性ガスとしては、例えば、ヘリウム、アルゴン、窒素、
二酸化炭素、水蒸気、メタン、プロパン、ブタン等が挙
げられ、これらは１種単独で、又は２種以上の組み合わ
せで使用される。

【００１３】本発明の還元方法に基質として供しうる化
合物は、カルボン酸及びその塩類、カルボニル化合物並
びにスルホキシド化合物からなる群から選ばれる少なく
とも１種である。

【００１４】カルボン酸及びその塩類として、例えば、
酢酸、プロピオン酸、酪酸、n-ヘキサン酸、n-カプリル
酸、3-クロロプロピオン酸等のモノカルボン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸等のジカルボン酸等の、好
ましくは炭素原子数２〜12の脂肪族カルボン酸及びその
塩類；例えば、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、メトキ
シ安息香酸、フェノキシ安息香酸、2-フェニルプロピオ
ン酸、2-フェニル酪酸、フタル酸、テレフタル酸、アニ
ス酸、サリチル酸、トルイル酸等の芳香族カルボン酸及
びその塩類等が例示される。

【００１５】また、カルボニル化合物としては、例え
ば、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、
2-ヘキサノン、2-オクタノン等のアルカノン、3-ケトブ
タン酸エステル等のケトエステル、アセチルアセトン等
のジケトン等の好ましくは炭素原子数３〜12の脂肪族ケ
トン類；例えば、アセトフェノン、4-フェニル-2- ブタ
ノン等の芳香族ケトン類；例えば、シクロヘキサノン等
の脂環式カルボニル化合物類；例えば、ブチルアルデヒ
ド、ヘキサナール、オクタナール、デカナール等の好ま
しくは炭素原子数２〜12の脂肪族アルデヒド類；例え
ば、2-フェニルプロピルアルデヒド、ケイ皮アルデヒ
ド、ベンズアルデヒド、シトロネラール、3,4-ジメトキ
シベンズアルデヒド、クロロベンズアルデヒド等の芳香
族アルデヒド類等が例示される。

【００１６】また、スルホキシド化合物としては、例え
ば、ジメチルスルホキシド、n-ブチルスルホキシド等の
好ましくは炭素原子数２〜12の脂肪族スルホキシド化合
物類；例えば、メチルフェニルスルホキシド、p-トルイ
ルスルホキシド等の芳香族スルホキシド化合物類等が例
示される。

【００１７】上記基質の濃度は、特に限定されない。こ
れらの化合物が水に不溶性ないし難溶性の場合は、その
濃度は有機溶媒に対する溶解性により決定される。基質
の有機溶媒中の濃度は、具体的には、通常、１〜20％(w
/v) であり、好ましくは１〜10％(w/v) である。

【００１８】以下、本発明の一般的な還元方法を例示す
る。まず、反応容器を密閉し、容器内の空気を窒素で置
換した後、水素及び／又は一酸化炭素で置換する。次
に、該反応容器内に微生物の休止菌体を分散した水性媒
体及び有機溶媒を注入する。続いて該反応容器に基質及
び電子伝達体を添加する。尚、前記基質の添加時期、方
法は特に限定されず、反応容器密閉前に単独で、又は前
記水性媒体又は有機溶媒に混合ないし分散させて添加し
てもよく、或いは、反応中に逐次添加したり、連続的に
添加することも可能である。また、前記電子伝達体の添
加時期、方法も特に限定されず、前記水性媒体及び／又
は有機溶媒に予め混合してから添加することも可能であ
る。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００２０】調製例１休止菌体１の調製内容積 125mlの容器に、表１に示す組成の培地（pH 7.
1） 100mlを入れて窒素気流下で殺菌した後、該容器内
を水素で置換し、クロストリジウムサーモアセチカム
（Clostridium thermoaceticum）ATCC 35608を接種して
58℃で静置培養を行った。このようにして種培養液を得
た。

【００２１】次いで、内容積２Ｌの容器に、前記と同様
の培地２Ｌを入れて窒素気流下で殺菌した後、該容器内
を二酸化炭素と水素の混合ガス（CO₂:H₂＝１：４）で
置換し、前記種培養液 100mlを添加して58℃で42時間静
置培養を行った。培養後、その培養液を遠心分離（1200
0G、20分間）した。遠心分離により回収した培養菌体
を、0.01Ｍのリン酸緩衝液（pH 7.0）を添加して洗浄し
た後、再度遠心分離して菌体22.5ｇを得た。得られた菌
体を凍結して保存した。このようにして、休止菌体１が
得られた。

【００２２】

【表１】

【００２３】休止菌体２の調製クロストリジウムサーモアセチカム（Clostridium th
ermoaceticum）ATCC 35608の代わりに、クロストリジウ
ムサーモオートトロピカム（Clostridium thermoauto
trophicum ）ATCC 33924を使用した以外は休止菌体１の
調製と同様の方法で休止菌体２を12.8ｇ得た。

【００２４】休止菌体３の調製クロストリジウムサーモアセチカム（Clostridium th
ermoaceticum）ATCC 35608の代わりに、サーモアンアエ
ロバクターサーモヒドロスルフリカス（Thermoanaero
bacter themohydrosulufuricus）ATCC 35045を使用した
以外は休止菌体１の調製と同様の方法で休止菌体３を2
4.0ｇ得た。

【００２５】休止菌体４の調製クロストリジウムサーモアセチカム（Clostridium th
ermoaceticum）ATCC 35608の代わりに、クロストリジウ
ムサーモサッカロリティカム（Clostridiumthermosac
chrolyticum）ATCC 7956 を使用した以外は休止菌体１
の調製と同様の方法で休止菌体４を18.2ｇ得た。

【００２６】実施例１（実験No.101〜104 ）各実験において、休止菌体１を用いて以下のようにして
還元を行った。尚、以下の操作はすべて窒素雰囲気下に
おいて嫌気的に行った。まず、内容積30mlのバイアル瓶
に基質として安息香酸ナトリウムを入れて、該バイアル
瓶をブチルゴム栓及びアルミシールで密閉した。尚、前
記バイアル瓶に入れた安息香酸ナトリウムの量は、後述
の菌体懸濁液 3.0mlに対する濃度が表２に示す濃度〔％
(w/v) 〕となるような量とした。次に、前記バイアル瓶
内を窒素で置換した後、水素で十分に置換した。次に、
休止菌体１ 0.4ｇに、加熱脱気後窒素置換した 0.1Ｍリ
ン酸塩緩衝液（pH 5.8）を添加して 3.0mlの菌体懸濁液
を調製し、これを前記バイアル瓶に注入した。次いで、
該バイアル瓶に減圧脱気したイソプロピルエーテル 3.0
mlを注入し、続いて、電子伝達体としてベンジルビオロ
ゲンの 0.3Ｍ水溶液を20μl 注入した。次いで、該バイ
アル瓶を振とうしながら55℃で23時間反応を行った。反
応終了後、水相及び有機相から１μl 採取して、各相に
含まれる還元生成物（ベンジルアルコール）量をガスク
ロマトグラフィにて測定した。表２に各相に含まれる還
元生成物量（mg）を示す。

【００２７】比較例１（実験No.105〜108 ）各実験において、イソプロピルエーテルを添加しなかっ
た以外は実施例１と同様の方法で還元反応を行った。水
相に含まれる還元生成物（ベンジルアルコール）量を表
２に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】実施例２（実験No.201〜205 ）各実験において、休止菌体１を用いて以下のようにして
還元を行った。尚、以下の操作はすべて窒素雰囲気下に
おいて嫌気的に行った。まず、内容積30mlのバイアル瓶
に基質として表３に示すカルボン酸又はカルボン酸塩を
入れて、該バイアル瓶をブチルゴム栓及びアルミシール
で密閉した。尚、前記バイアル瓶に入れた基質の量は、
後述のイソプロピルエーテル 3.0mlに対する濃度が２％
(w/v) となるような量とした。次に、前記バイアル瓶内
を窒素で置換した後、表３に示すガスで十分に置換し
た。次に、休止菌体１ 0.4ｇに、加熱脱気後窒素置換し
た 0.1Ｍリン酸塩緩衝液（pH 5.8）を添加して 3.0mlの
菌体懸濁液を調製し、これを前記バイアル瓶に注入し
た。次いで、該バイアル瓶に減圧脱気したイソプロピル
エーテル 3.0mlを注入し、続いて、電子伝達体としてベ
ンジルビオロゲンの 0.3Ｍ水溶液を20μl 注入した。ま
た、カルボン酸を添加したものについては１Ｍの重炭酸
アンモニウムを用いてpH 5.8に調整した。次いで、該バ
イアル瓶を振とうしながら55℃で21時間反応を行った。
反応終了後、有機相から１μl 採取して、表３に示す還
元生成物の量をガスクロマトグラフィにて測定し、還元
率を求めた。その結果を表３に示す。尚、還元率は、以
下の式により求めた。還元率（％）＝還元生成物量（μmol)÷基質（μmol)×
100

【００３０】

【表３】

【００３１】実施例３（実験No.301〜304 ）各実験において、表３に示す基質の代わりに表４に示す
アルデヒド化合物を基質として使用し、反応時間を26時
間とした以外は実施例２と同様の方法で還元反応を行っ
た。反応終了後、有機相から１μl 採取して、表４に示
す還元生成物の量をガスクロマトグラフィにて測定し、
還元率を求めた。その結果を表４に示す。

【００３２】

【表４】

【００３３】実施例４（実験No.401〜404 ）各実験において、休止菌体として表５に示す休止菌体１
〜３を使用し、表３に示す基質の代わりにアセトフェノ
ンを基質として使用し、さらに反応時間を25時間とした
以外は実施例２と同様の方法で還元反応を行った。反応
終了後、有機相から１μl 採取して、還元生成物（1-フ
ェニルエチルアルコール）量をガスクロマトグラフィに
て測定し、還元率を求めた。その結果を表５に示す。

【００３４】

【表５】

【００３５】実施例５（実験No.501〜504 ）各実験において、休止菌体として表６に示す休止菌体１
〜３を使用し、表３に示す基質の代わりにメチルフェニ
ルスルホキシドを基質として使用し、基質濃度を４％(w
/v) とし、さらに反応時間を24時間とした以外は実施例
２と同様の方法で還元反応を行った。反応終了後、有機
相から１μl 採取して、還元生成物（メチルフェニルス
ルフィド）量をガスクロマトグラフィにて測定し、還元
率を求めた。その結果を表６に示す。

【００３６】

【表６】

【００３７】実施例６（実験No.601〜603 ）各実験において、休止菌体として表７に示す休止菌体の
混合菌（各休止菌体 0.2ｇずつを混合した) を使用し、
基質として安息香酸ナトリウムを使用し、さらに反応時
間を21時間とした以外は実施例２と同様の方法で還元反
応を行った。反応終了後、有機相から１μl 採取して、
還元生成物（ベンジルアルコール）量をガスクロマトグ
ラフィにて測定し、還元率を求めた。その結果を表７に
示す。

【００３８】

【表７】

【００３９】

【発明の効果】本発明は、微生物を用いて還元を行うこ
とから、化学的方法により還元を行う場合と異なり多量
のエネルギーを必要とせず、高温、高圧のための特別の
設備も必要としないという利点がある。

【００４０】また、微生物の休止菌体を使用することか
ら、増殖菌体を用いる場合のように栄養源を添加する必
要がなく、処理・操作が容易である。また、かかる休止
菌体の量は任意に調節することができ、容易に反応速度
を制御することができる。更に、微生物中に含まれる補
酵素の代わりに人工の電子伝達体を使用することから天
然の補酵素を再生する際に必要な糖類、アルコール類等
が不要である。しかもかかる電子伝達体の再生には、再
生の結果生ずる副産物が水又は二酸化炭素である水素及
び／又は一酸化炭素を使用することができる。すなわ
ち、再生の結果反応を阻害するような副生物が生じるこ
とがなく、生じた副生物は還元生成物と容易に分離する
ことができるという利点がある。

【００４１】更に、本発明においては、還元は、水性媒
体と、実質的に水と不溶性ないし難溶性の有機溶媒との
液体二相系で行われることから、微生物菌体は水相に、
還元生成物の殆どは有機相に存在するため、微生物菌体
と還元生成物を分離するための膜等の装置を必要とせ
ず、還元生成物を容易に微生物菌体から分離することが
できる。また、液体二相系で反応を行うことから反応性
が向上し、基質及び還元生成物による還元反応阻害が軽
減されるために基質濃度を上げることができ、効率的に
還元を行うことができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カルボン酸及びその塩類、カルボニル化
合物並びにスルホキシド化合物からなる群から選ばれる
少なくとも１種を、水素及び／又は一酸化炭素雰囲気
中、電子伝達体存在下に、水性媒体と実質的に水と不溶
性ないし難溶性の有機溶媒との液体二相系で、還元酵素
を有する微生物の休止菌体を用いて還元することを特徴
とする前記化合物の還元方法。
【請求項２】微生物がクロストリジウム（Clostridiu
m ）属及びサーモアンアエロバクター（Thermoanaeroba
cter）属からなる群から選ばれる少なくとも１種の微生
物である請求項１に記載の還元方法。
【請求項３】水性媒体のpHが４〜８である請求項１に
記載の還元方法。
【請求項４】電子伝達体が、標準酸化還元電位−100
〜−500 mVの化合物である請求項１、２又は３に記載の
還元方法。