JPH089961A - 培養器およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 容器底面に形成したコラーゲンゲル層を、加
温によりゾル状態となり冷却によりゲル状態となり、そ
の変換温度が４〜３９℃の範囲にあるコロイド溶液中に
包埋させた。 【効果】 コラーゲンゲル層が輸送中の振動によって液
状化するのを防止でき、培養特性も損なわれることがな
いので、予めコラーゲンゲル層を形成した培養器を直接
実験者に提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、主に細胞培養や組織培
養の分野で使用されるもので、長期間に亘って細胞の機
能を維持しながら培養を行なうこが可能な、軟らかいコ
ラーゲンゲル上での培養に用いる、コラーゲンゲル層を
形成した培養器に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】肝細胞や乳腺細胞など分泌や代謝の機能
などを有する機能性細胞は、コラーゲンゲル上で培養す
ると、細胞は細胞塊を形成して生体内に近い三次元的構
造をとり、生体内に近いレベルで機能し、培地の組成に
よっては長期に亘って機能を維持することが可能になっ
てきている。

【０００３】このコラーゲンゲルは９９％以上が水から
なり、非常に柔らかく、ゲルを形成した状態では輸送中
の振動によりゲルが液状化し、一旦液状化したコラーゲ
ンゲルは、再度ゲルを形成することはない。また、ゲル
を凍結乾燥させて輸送する方法もあるが、凍結乾燥した
場合、水中に浸漬してゲルに戻そうとしても、数日から
数週間という長期間にわたる浸漬が必要であり、ゲルの
状態に戻ったとしても、再形成したゲルは非常に硬く、
細胞に対してコラーゲンゲルとしての機能は果たさず、
この再形成したゲル上で細胞を培養しても、上記のよう
な細胞塊を形成せず、細胞の機能を維持することはでき
ない。そのため、コラーゲンゲルを細胞の培養に用いる
場合、培養を行なう度にコラーゲンゲルを調整しなけれ
ばならない。

【０００４】一般にコラーゲンゲルは、酸性の酸可溶化
コラーゲン溶液を中和して、架橋反応により形成させ
る。その際、ゲル内の塩類の濃度を培養に最適な条件に
するため、中和液の他に塩類調整液を加える。このよう
に、実験者はコラーゲンゲル調整の度に、中和液や塩類
調整液を調合しなければならないという煩わしさがあ
る。このような煩わしさを解消するため、試薬メーカー
から、酸性の酸可溶化コラーゲン溶液、中和液、塩類調
整液が必要量予めセットされたコラーゲンゲル形成用の
キットが市販されている。このようなキットを用いれ
ば、中和液および塩類調整液の調合をする必要はない
が、３種類の溶液を正しい割合で分取混合しなければな
らない。この混合比を間違えると、ゲルを形成しなかっ
たり、ゲルの硬さが違ってくる。

【０００５】また、中和の際の発熱のため、中和の途中
で部分的にゲルを形成し、均一なコラーゲンゲルが得ら
れないことがあり、予め、使用溶液類を氷冷し、中和操
作の際も氷冷下で少しづつ行なう必要がある。また、中
和されたコラーゲン溶液は、ゲルを形成する容器に分注
され、その後、均一なゲルを形成するためインキュベー
ター内で３７℃付近で加温しなければならない。

【０００６】コラーゲンゲルの輸送が難しく、ゲルとし
て予め形成されたものを市販することができないため、
コラーゲンゲル上で培養を行なう場合、実験者は上記の
ように自らコラーゲンゲル培養床を作製するために、本
来の操作である初代細胞の採取や細胞培養の他に、多大
な労力を要すると言う問題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、機能性細胞
の初代培養において、機能を維持した細胞塊を形成させ
ることができる軟らかいコラーゲンゲルの輸送中の液状
化を防止し、コラーゲンゲルの培養特性を損なわず、且
つ特別な装置等を必要とすることなく輸送でき、培養実
験者に、予めコラーゲンゲルを形成した培養器を提供す
ることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るために鋭意研究の結果、本発明者らは、一旦形成され
たコラーゲンゲルは振動を与えなければ液状化を起こさ
ず、培養条件下では溶解しないこと、および、ゼラチン
などのコロイド溶液は溶質の濃度により４〜３５℃の温
度ではゾル化せず、ゲル強度を保ち、ゲルが振動により
液状化を起こさず、また、通常の培養温度である３７℃
では速やかに溶解し、容易に除去できることを見いだし
本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち本発明は、容器底面にコラーゲンゲル
層を形成し、該コラーゲンゲル層を、加温によりゾル状
態となり冷却によりゲル状態となるコロイド溶液であっ
て、ゾル状態とゲル状態の変換温度が４〜３９℃の範囲
にあるコロイド溶液中に包埋させたことを特徴とする培
養器であり、さらには、コロイド溶液がゼラチンを主成
分とし、ゼラチンの濃度が１〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲
内であることを特徴とし、またさらには、コラーゲンゲ
ルが、テロペプチドを取り除いたタイプ１コラーゲンゲ
ル、または、還元剤で処理したタイプ１コラーゲンをゲ
ル化してなるコラーゲンゲルであることを特徴とする。

【００１０】また、容器底面にコラーゲンゲル層を形成
し、該コラーゲンゲル層の上に、加温によりゾル状態と
なり氷冷によりゲル状態となるコロイド溶液であって、
ゾル状態とゲル状態との変換温度が４〜３９℃の範囲内
にあるコロイド溶液を加え、該コロイド溶液がゾル状態
に変換する温度から４０℃の間の温度でインキュベート
し、コラーゲンゲル中の水分を該コロイド溶液で置換し
た後、該コロイド溶液をゲル化させることを特徴とする
培養器の製造方法である。

【００１１】本発明における培養器は、容器底面に形成
させたコラーゲンゲルをコロイド溶液で包埋しゲル化さ
せて、軟らかいコラーゲンゲルを補強し、コラーゲンゲ
ルを液状化させることなく輸送出来る培養器であること
が特徴である。

【００１２】ゲル状を呈し細胞毒性のない物質として寒
天やアルギン酸などで細胞を包埋させた例はあるが、こ
れらはゲルになると水に溶解しないか、溶解させるのに
高温を必要とするため、コラーゲンゲルを包埋する過程
でコラーゲンゲル中にはいり込んだ場合、コラーゲンゲ
ル中で固化し、コラーゲンゲル中より取り除くことが困
難である。この場合、コラーゲンゲルの構造が変化して
コラーゲンゲルが硬くなり、このようなコラーゲンゲル
上で細胞を培養すると細胞塊を形成せず単層となり、長
期に亘る細胞の機能維持は困難となり、本来のコラーゲ
ンゲル上での培養ができなくなる。

【００１３】コロイド溶液は、通常の輸送温度（常温）
ではゲル状態であり、一般的な細胞培養の温度である３
７℃では容易に溶解し、除去が容易で、細胞に対して毒
性がなければ特に問題はないが、そのようなコロイド溶
液としてはゼラチン溶液が挙げられる。特にゼラチン
は、細胞塊の形成をコラーゲンゲル上で行なった場合と
も、コラーゲンゲルの構造や硬さを変化させず、また、
ゼラチンは元々コラーゲンに由来するもので、蛋白の構
成はコラーゲンに近く、ゼラチンが残留したとしてもコ
ラーゲンゲル表面の性質を変化させることがないため、
本発明に使用するコロイド溶液としては最適である。

【００１４】次に、本培養器の作製方法を、ゼラチンの
コロイド溶液を用いた場合を例として説明する。まず、
通常の組織培養に用いるシャーレや複数のウェルを持っ
たプレートのウェル中に、酸性のコラーゲン溶液と、塩
類濃度調整溶液および中和用アルカリ溶液の混合液を分
注し、３７℃程度で加温して固化させ、ゼラチンのコロ
イド溶液によりコラーゲンゲルを包埋する。

【００１５】使用するゼラチンの由来は特に指定はな
く、一般に市販され入手しやすい豚や牛の真皮や骨由来
のもので使用が可能である。調整する溶液のゼラチン濃
度は１〜２０％が適当で、これより薄い濃度では形成さ
れるゼラチンゲルの強度が弱く、輸送中ゼラチンのゲル
が崩れる恐れがある。また、これより濃い溶液ではゼラ
チン溶液の粘度が高くなり、包埋時の溶液の分注作業お
よび培養開始時のゼラチン溶液の除去が難しくなる。

【００１６】ゼラチンのコロイド溶液調製時に使用する
水は、培養時における培地の塩類濃度の変化を防止する
ため、塩濃度調整の目的で、生理食塩水や生理的燐酸緩
衝液、無血清の各種培地等を用いるのがよい。また、コ
ロイド溶液のｐＨは、コラーゲンゲルの溶解を防止する
必要から７〜９に調整するのが良い。

【００１７】ゼラチンのコロイド溶液を分注した後、そ
のまま固化させてゼラチンのゲルを形成させてもよい
が、コラーゲンゲル自体の強度の補強のため、容器中に
ゼラチン溶液を分注した後、３７℃程度で数時間インキ
ュベートし、コラーゲンゲル内の水分をゼラチンコロイ
ド溶液で置換した後、固化してゼラチンのゲル層を形成
するのがよい。

【００１８】ゼラチンのゲルで包埋されたコラーゲンゲ
ル層は、０〜３０℃の温度ではゼラチンのゲルが補強お
よび衝撃の吸収材の働きをし、輸送中の振動や衝撃でコ
ラーゲンゲル層が液状化や崩壊を起こすことがない。

【００１９】本発明において使用する容器としては、シ
ャーレ、複数個のウェルをもったプレート、フラスコ
等、一般に組織培養や細胞培養に用いられる培養器が用
いられる。特殊なものとしては、筒の底面に細かいメッ
シュやメンブレンを張ったものが挙げられ、この場合、
コラーゲンゲル層の形成およびゼラチンゲルによる包埋
を容器中で行なえば可能であり、このように使用する容
器に特に制限はない。また、容器の材質も細胞毒性がな
ければ特に制限はない。

【００２０】コラーゲンゲル層の厚さは、容器中に十分
な厚さのゼラチンのゲル層が形成できれば特に制限はな
く、また、ゼラチンのゲル層の厚さは、コラーゲンゲル
層と同等以上あれば、コラーゲンゲル層の強度の補強は
可能である。

【００２１】次に、本培養容器の使用方法について説明
する。先ず、細胞を播種する前に、本培養器３７℃でイ
ンキュベートする。ゼラチンのゲル層はすぐに溶解する
ので、ゼラチンのコロイド溶液をピペットで取り除き、
目的の細胞の培養に使用する培地を加え、数時間インキ
ュベートしてコラーゲンゲル層内に培地をなじませる。
後は細胞を播種するだけでよく、コラーゲンゲル調製の
ための試薬類の調製は一切必要としない。

【００２２】

【実施例】次に実施例により、本発明をより具体的に説
明する。 実施例１ ０．３％酸性コラーゲン１型溶液、１０倍濃度ＰＢＳ
（生理的燐酸緩衝液）、および０．０１Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶液を、無菌的に氷冷下で８：１：１の割合で混
合し、射出成形した直径３５ｍｍのポリスチレン樹脂製
シャーレに１ｍｌ分注し、３７℃で加温してコラーゲン
ゲル層を形成した。

【００２３】一方、純水を用いて加温しながら１０％
（Ｗ／Ｖ）のゼラチンコロイド溶液を調製し、ＭＥＭ培
地粉末を９．４ｇ／ｌの割合で加えてオートクレーブ滅
菌を施し、３７℃に冷却した後、グルタミンを添加し、
重炭酸ナトリウムを加えてｐＨを７．４に調整し、ＭＥ
Ｍ培地含有ゼラチンコロイド溶液を調製した。このゼラ
チンコロイド溶液を、先にコラーゲンゲル層を形成させ
たシャーレ中に２ｍｌ分注し、３７℃において１０時間
加温し、コラーゲンゲル中の水分をゼラチンコロイド溶
液で置換し、室温で固化してゼラチンのゲルによりコラ
ーゲンゲルを包埋し、輸送試験を行なった後、培養試験
に供した。

【００２４】比較例１ 実施例１と同様にしてコラーゲンゲル層を形成したシャ
ーレをゼラチンコロイド溶液で包埋することなく、輸送
試験を行なった後、培養試験に供した。

【００２５】比較例２ 実施例１と同様にして形成したコラーゲンゲルを、ゼラ
チンコロイド溶液で包埋することなく、また輸送試験も
せず、そのまま培養試験のみに供した。

【００２６】 輸送試験 実施例１、および比較例１のシャーレを温調は特に施さ
ず、トラック便にて１３００キロを輸送した後、コラー
ゲンゲルの状況を調べた。実施例１については、輸送後
３７℃に加温してゼリー層を溶解し、ゼラチン溶液を除
去した後、Ｌ−１５培地を加えて３７℃１２時間インキ
ュベートを行なった。比較例１については、輸送後、Ｌ
−１５培地を加えて３７℃１２時間インキュベートを行
なった。比較例２については輸送は行なわず、Ｌ−１５
培地を加えて３７℃１２時間インキュベートを行なっ
た。それぞれ培地を除去した後、コラーゲンゲル層の重
量と厚さを測定し、比較例２を１００として実施例１お
よび比較例１について割合を算出した。

【００２７】この他、各試料について、下記の要領で細
胞形態試験を細胞機能試験を行なった。 細胞形態試験 コラゲナーゼ還流法により、ラット（ウィスター系，
雄，５週令）より肝実質細胞を採取し、１０％ＦＢＳ
（ウシ胎児血清）添加Ｌ−１５培地を用いて、シャーレ
あたり１×１０⁶ 個の細胞を播種し、播種後２時間で培
地交換を行ない、その後２日毎に培地交換を行なって７
日目に細胞の形態を観察した。 細胞機能試験 上記の細胞形態試験の実施と同時に、播種後３日および
７日における培地中のアルブミン量を測定し、比較例２
のアルブミン量を１００として示した。

【００２８】各観察、測定の結果は表１に示した通り
で、本発明によるコラーゲンゲル層を形成した培養器
は、コラーゲンゲル層を損なうことなく輸送することが
可能で、輸送後もコラーゲンゲルの培養特性が変わらず
維持されていることが明白である。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、コラーゲンゲル層が輸
送中の振動によって液状化するのを防止でき、培養特性
も損なわれることがないので、肝細胞などの機能性の細
胞の三次元培養が可能な、軟らかいコラーゲンゲルを形
成させた培養器を直接実験者に提供でき、実験者はコラ
ーゲンゲルの調製を行なう必要がなく、簡単にコラーゲ
ンゲル上培養が行なえる培養器として好適である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 容器底面にコラーゲンゲル層を形成し、
   該コラーゲンゲル層を、加温によりゾル状態となり冷却
   によりゲル状態となるコロイド溶液であって、ゾル状態
   とゲル状態との変換温度が４〜３９℃の範囲にあるコロ
   イド溶液中に包埋させたことを特徴とする培養器。
2. 【請求項２】 コロイド溶液がゼラチンを主成分とし、
   ゼラチンの濃度が１〜２０％の範囲内にあることを特徴
   とする、請求項（１）記載の培養器。
3. 【請求項３】 コロイド溶液のｐＨが７〜９の範囲にあ
   ることを特徴とする、請求項（１）もしくは請求項
   （２）記載の培養器。
4. 【請求項４】 コラーゲンゲルが、テロペプチドを取り
   除いたタイプ１コラーゲン、または還元剤で処理したタ
   イプ１コラーゲンをゲル化させたものであることを特徴
   とする、請求項（１）記載の培養器。
5. 【請求項５】 容器底面にコラーゲンゲル層を形成し、
   該コラーゲンゲル層の上に、加温によりゾル状態となり
   冷却によりゲル状態となるコロイド溶液であって、ゾル
   状態とゲル状態との変換温度が４〜３９℃の範囲にある
   コロイド溶液を加え、該コロイド溶液がゾル状態に変換
   する温度から４０℃の間の温度でインキュベートし、コ
   ラーゲンゲル中の水分を該コロイド溶液で置換した後、
   該コロイド溶液をゲル化させることを特徴とする培養器
   の製造方法。