JPH089973A - 新規アミノペプチダーゼ - Google Patents
新規アミノペプチダーゼInfo
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- JPH089973A JPH089973A JP6173569A JP17356994A JPH089973A JP H089973 A JPH089973 A JP H089973A JP 6173569 A JP6173569 A JP 6173569A JP 17356994 A JP17356994 A JP 17356994A JP H089973 A JPH089973 A JP H089973A
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- helveticus
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobaci
llus helveticus) から産生され、通常のアミノペプチ
ダーゼが分解するペプチドに加えてペプチドのアミノ末
端のプロリンの結合を切断することのできる新規なアミ
ノペプチダーゼ。分子量約95KDa 、等電点約4.9 、至適
温度約50℃及び至適pH６〜８である。 【効果】 ペプチドのアミノ末端のプロリンの結合を切
断する性質を利用して飲食品、医薬品の苦味の原因とな
っているこのようなペプチドを分解し、苦味を除去する
ことができる。
llus helveticus) から産生され、通常のアミノペプチ
ダーゼが分解するペプチドに加えてペプチドのアミノ末
端のプロリンの結合を切断することのできる新規なアミ
ノペプチダーゼ。分子量約95KDa 、等電点約4.9 、至適
温度約50℃及び至適pH６〜８である。 【効果】 ペプチドのアミノ末端のプロリンの結合を切
断する性質を利用して飲食品、医薬品の苦味の原因とな
っているこのようなペプチドを分解し、苦味を除去する
ことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳酸桿菌のラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) か
ら産生される新規なアミノペプチダーゼに関する。本発
明のアミノペプチダーゼは、苦味の原因となる通常のア
ミノペプチダーゼが分解するペプチドに加えてアミノ末
端にプロリンを有するペプチドのプロリンを特異的に分
解する性質がある。従って飲食品、医薬等で苦味の原因
となるこのようなペプチドを分解してその苦味を除去す
ることができる。
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) か
ら産生される新規なアミノペプチダーゼに関する。本発
明のアミノペプチダーゼは、苦味の原因となる通常のア
ミノペプチダーゼが分解するペプチドに加えてアミノ末
端にプロリンを有するペプチドのプロリンを特異的に分
解する性質がある。従って飲食品、医薬等で苦味の原因
となるこのようなペプチドを分解してその苦味を除去す
ることができる。
【０００２】
【従来の技術】従来より、様々な起源のたんぱく質分解
酵素が知られており、それらの酵素が種々の分野で利用
されている。その中で乳酸球菌由来のたんぱく質分解酵
素は、安全性の面から食品加工などの分野で利用されて
いる。特に、乳酸球菌が生産するアミノペプチダーゼ
は、苦味の原因となるペプチドを分解する作用を有する
ので、チーズの風味改善など、たんぱく質加水分解物の
苦味を消去して風味を改善する試みがなされている〔Ap
plied and Environmental Microbiology, Vol.59,1430
(1993)〕。そして、乳酸球菌のラクトコッカス・ラクチ
ス・サブスピーシイズ・クレモリス(Lactococcus lact
is subsp. cremoris Wg 2)が生産するアミノペプチダー
ゼが精製され、その性質が明らかにされている〔Applie
d Microbiological Biotechnology, Vol.23, 79(1985)
、Applied and Environmental Microbiology, Vol.56,
526(1990) 〕。一方、乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘ
ルベティカス(Lactobacillus helveticus) が産生する
アミノペプチダーゼも精製されており、その性質が明ら
かにされている〔Journal of Dairy Science, Vol.75,
27(1992)〕。しかし、これらのペプチダーゼは、たんぱ
く質加水分解物の苦味の原因となるプロリン(Pro) をア
ミノ末端（Ｎ末端）に含むペプチドを分解できず、苦味
が残存するという欠点があった。
酵素が知られており、それらの酵素が種々の分野で利用
されている。その中で乳酸球菌由来のたんぱく質分解酵
素は、安全性の面から食品加工などの分野で利用されて
いる。特に、乳酸球菌が生産するアミノペプチダーゼ
は、苦味の原因となるペプチドを分解する作用を有する
ので、チーズの風味改善など、たんぱく質加水分解物の
苦味を消去して風味を改善する試みがなされている〔Ap
plied and Environmental Microbiology, Vol.59,1430
(1993)〕。そして、乳酸球菌のラクトコッカス・ラクチ
ス・サブスピーシイズ・クレモリス(Lactococcus lact
is subsp. cremoris Wg 2)が生産するアミノペプチダー
ゼが精製され、その性質が明らかにされている〔Applie
d Microbiological Biotechnology, Vol.23, 79(1985)
、Applied and Environmental Microbiology, Vol.56,
526(1990) 〕。一方、乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘ
ルベティカス(Lactobacillus helveticus) が産生する
アミノペプチダーゼも精製されており、その性質が明ら
かにされている〔Journal of Dairy Science, Vol.75,
27(1992)〕。しかし、これらのペプチダーゼは、たんぱ
く質加水分解物の苦味の原因となるプロリン(Pro) をア
ミノ末端（Ｎ末端）に含むペプチドを分解できず、苦味
が残存するという欠点があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
欠点を解決するべく、乳酸桿菌の産生するたんぱく質分
解酵素について鋭意研究を進めたところ、たんぱく質分
解力が高く、プロリン(Pro) をＮ末端に含むペプチドを
分解することができるアミノペプチダーゼをラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)が産
生することを見出し、本発明を完成するに至った。した
がって、本発明は、たんぱく質分解力が高く、通常のア
ミノペプチダーゼが分解するペプチドに加えてプロリン
(Pro) をＮ末端側に含むペプチドを分解することができ
るラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus he
lveticus) 由来のアミノペプチダーゼを提供することを
課題とする。
欠点を解決するべく、乳酸桿菌の産生するたんぱく質分
解酵素について鋭意研究を進めたところ、たんぱく質分
解力が高く、プロリン(Pro) をＮ末端に含むペプチドを
分解することができるアミノペプチダーゼをラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)が産
生することを見出し、本発明を完成するに至った。した
がって、本発明は、たんぱく質分解力が高く、通常のア
ミノペプチダーゼが分解するペプチドに加えてプロリン
(Pro) をＮ末端側に含むペプチドを分解することができ
るラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus he
lveticus) 由来のアミノペプチダーゼを提供することを
課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明のアミノペプチダ
ーゼは、通常行われている方法に従ってラクトバチルス
・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) を培養
し、その培養液から菌体を回収した後、この菌体を破砕
し、これから酵素を採取精製することによって得ること
ができる。菌体を破砕するには、リゾチームなどを用い
た酵素処理、超音波処理、凍結乾燥処理、ボールミル処
理、フレンチプレスなどの機械的処理、有機溶媒などを
用いた化学的処理などの通常の菌体の破砕手段が用いら
れる。また、菌体破砕部からアミノペプチダーゼを採取
精製するには、各種クロマトグラフィー、塩析、電気泳
動、イムノブロット法など通常行われている採取精製方
法に従って得ることができる。
ーゼは、通常行われている方法に従ってラクトバチルス
・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) を培養
し、その培養液から菌体を回収した後、この菌体を破砕
し、これから酵素を採取精製することによって得ること
ができる。菌体を破砕するには、リゾチームなどを用い
た酵素処理、超音波処理、凍結乾燥処理、ボールミル処
理、フレンチプレスなどの機械的処理、有機溶媒などを
用いた化学的処理などの通常の菌体の破砕手段が用いら
れる。また、菌体破砕部からアミノペプチダーゼを採取
精製するには、各種クロマトグラフィー、塩析、電気泳
動、イムノブロット法など通常行われている採取精製方
法に従って得ることができる。
【０００５】このようにして得られた本発明のアミノペ
プチダーゼは、以下のような性質を有している。 （１）分子量：約 95kDa（ＳＤＳ電気泳動）、約 93kDa
（アミノ酸分析） （２）等電点：約 4.9 （３）至適温度：約 50 ℃ （４）至適pH：６〜８ （５）Km値及びVmax値：基質Pro-pNA の分解においてKm
値約0.6mM 、Vmax値約 2.5μmol/min/mg、基質Lys-pNA
の分解においてKm値約0.003mM 、Vmax約37.5μmol/min/
mgを示す。 （６）基質特異性：通常のアミノペプチダーゼが有する
基質特異性を有する。さらに、Pro-βＮＡ、Pro-ｐＮ
Ａ、Pro-Phe 、Pro-Tyr 、Pro-Leu-Gly-Gly 、Pro-Phe-
Gly-Lys 及びPro-Gly-Lys-Ala-Arg などのＮ末端にプロ
リン(Pro) を含むペプチド及びアミノペプチダーゼ試験
用基質を分解する。なお、ｐＮＡは、パラニトロアニリ
ドを意味する。 （７）酵素阻害剤の影響：エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、ベスタチン（Bestatin）、p-chloromercurib
enzenesulfonic acid （ＰＣＭＢＳ）により活性が阻害
される。 （８）金属イオンの影響：Ｚｎ2+、Ｆｅ2+及びＣｕ2+に
より活性が阻害され、Ｃｏ2+により活性が増加される。
また、前記した乳酸球菌のラクトコッカス・ラクチス・
サブスピーシイズ・クレモリス(Lactococcus lactis s
ubsp. cremoris) Ｗｇ２株由来のアミノペプチダーゼと
は免疫的に異なる。
プチダーゼは、以下のような性質を有している。 （１）分子量：約 95kDa（ＳＤＳ電気泳動）、約 93kDa
（アミノ酸分析） （２）等電点：約 4.9 （３）至適温度：約 50 ℃ （４）至適pH：６〜８ （５）Km値及びVmax値：基質Pro-pNA の分解においてKm
値約0.6mM 、Vmax値約 2.5μmol/min/mg、基質Lys-pNA
の分解においてKm値約0.003mM 、Vmax約37.5μmol/min/
mgを示す。 （６）基質特異性：通常のアミノペプチダーゼが有する
基質特異性を有する。さらに、Pro-βＮＡ、Pro-ｐＮ
Ａ、Pro-Phe 、Pro-Tyr 、Pro-Leu-Gly-Gly 、Pro-Phe-
Gly-Lys 及びPro-Gly-Lys-Ala-Arg などのＮ末端にプロ
リン(Pro) を含むペプチド及びアミノペプチダーゼ試験
用基質を分解する。なお、ｐＮＡは、パラニトロアニリ
ドを意味する。 （７）酵素阻害剤の影響：エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、ベスタチン（Bestatin）、p-chloromercurib
enzenesulfonic acid （ＰＣＭＢＳ）により活性が阻害
される。 （８）金属イオンの影響：Ｚｎ2+、Ｆｅ2+及びＣｕ2+に
より活性が阻害され、Ｃｏ2+により活性が増加される。
また、前記した乳酸球菌のラクトコッカス・ラクチス・
サブスピーシイズ・クレモリス(Lactococcus lactis s
ubsp. cremoris) Ｗｇ２株由来のアミノペプチダーゼと
は免疫的に異なる。
【０００６】本発明のアミノペプチダーゼを産生する菌
株は、醗酵乳から次の方法で得ることができる。まず、
発酵乳１ｇを滅菌した生理食塩水に懸濁し、さらに滅菌
した生理食塩水で菌数106 〜107 となるように希釈した
懸濁液を調製する。そして、この懸濁液１mlを市販のＭ
ＲＳ培地に寒天を 1.5％となるように加えたＭＲＳ寒天
培地に塗株し、37℃で２日以上培養する。さらに出現し
たコロニーを採取してＭＲＳ培地に接種し、37℃１日間
培養して菌株を得る。このようにして得られた菌株の菌
学的特徴を次に示す。この菌学的性質からBergey's man
ual of systematic bacteriology Vol.2 pp.1222-1224
(1986) の記載を参酌して検索するとこの菌株は、ラク
トバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helvetic
us) と同定された。そして得られた菌株をラクトバチル
ス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2
171 (FERM P-14381)として工業技術院生命工業技術研究
所に寄託した。
株は、醗酵乳から次の方法で得ることができる。まず、
発酵乳１ｇを滅菌した生理食塩水に懸濁し、さらに滅菌
した生理食塩水で菌数106 〜107 となるように希釈した
懸濁液を調製する。そして、この懸濁液１mlを市販のＭ
ＲＳ培地に寒天を 1.5％となるように加えたＭＲＳ寒天
培地に塗株し、37℃で２日以上培養する。さらに出現し
たコロニーを採取してＭＲＳ培地に接種し、37℃１日間
培養して菌株を得る。このようにして得られた菌株の菌
学的特徴を次に示す。この菌学的性質からBergey's man
ual of systematic bacteriology Vol.2 pp.1222-1224
(1986) の記載を参酌して検索するとこの菌株は、ラク
トバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helvetic
us) と同定された。そして得られた菌株をラクトバチル
ス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2
171 (FERM P-14381)として工業技術院生命工業技術研究
所に寄託した。
【０００７】Ａ 形態的性状 （１）細胞の形： 桿菌 （２）運動性： なし （３）胞子の有無： なし （４）グラム染色性： 陽性
【０００８】Ｂ 培地上の生育状態 （１）培養温度15℃： 生育しない （２）培養温度45℃： 生育する
【０００９】Ｃ 生理学的性質 （１）カタラーゼ： 陰性 （２）グルコースよりガスを産生しない。 （３）グルコン酸よりガスを産生しない。 （４）グルコースより乳酸発酵によりＤＬ乳酸を産生す
る。 （５）各種炭水化物の分解性 １．リボース − ２．アラビノース − ３．キシロース − ４．ラムノース − ５．マンニトール − ６．ソルビトール − ７．リビトール − ８．グリセロール − ９．フラクトース − １０．マンノース ＋ １１．ガラクトース ＋ １２．グルコース ＋ １３．ラクトース ＋ １４．マルトース − １５．シュクロース − １６．トレハロース − １７．セロビオース − １８．ラフィノース − １９．メリビオース − ２０．メレジトース（メレチトース）− ２１．サリシン − ２２．グルコナート − （＋は分解するを示し、−は分解しないを示す）。
る。 （５）各種炭水化物の分解性 １．リボース − ２．アラビノース − ３．キシロース − ４．ラムノース − ５．マンニトール − ６．ソルビトール − ７．リビトール − ８．グリセロール − ９．フラクトース − １０．マンノース ＋ １１．ガラクトース ＋ １２．グルコース ＋ １３．ラクトース ＋ １４．マルトース − １５．シュクロース − １６．トレハロース − １７．セロビオース − １８．ラフィノース − １９．メリビオース − ２０．メレジトース（メレチトース）− ２１．サリシン − ２２．グルコナート − （＋は分解するを示し、−は分解しないを示す）。
【００１０】本発明のアミノペプチダーゼは粗酵素液あ
るいは精製酵素液または単離されたアミノペプチダーゼ
のいずれの形でも使用することができる。これらは、従
来のアミノペプチダーゼがチーズの風味改善に使用され
ていたのと同様にチーズの製造工程において原料に添加
したり、たんぱく質やペプチド等に添加してその苦味を
除去し、風味を改善することができる。従って、飲食品
や医薬品の素材として用いるたんぱく質やペプチドの加
水分解に有用である。また、前記したように従来、ラク
トバチルス・ヘルベティカスがアミノペプチダーゼを産
生しているが、このアミノペプチダーゼはペプチドのア
ミノ末端のプロリンの結合を全く切断しないのに対し、
本発明のアミノペプチダーゼはこれを切断する点におい
て両者は相違している。
るいは精製酵素液または単離されたアミノペプチダーゼ
のいずれの形でも使用することができる。これらは、従
来のアミノペプチダーゼがチーズの風味改善に使用され
ていたのと同様にチーズの製造工程において原料に添加
したり、たんぱく質やペプチド等に添加してその苦味を
除去し、風味を改善することができる。従って、飲食品
や医薬品の素材として用いるたんぱく質やペプチドの加
水分解に有用である。また、前記したように従来、ラク
トバチルス・ヘルベティカスがアミノペプチダーゼを産
生しているが、このアミノペプチダーゼはペプチドのア
ミノ末端のプロリンの結合を全く切断しないのに対し、
本発明のアミノペプチダーゼはこれを切断する点におい
て両者は相違している。
【００１１】
【実施例１】ラクトバチルス・ヘルベティカス (Lactob
acillus helveticus) SBT 2171株（FERM P-14381）
を改変ＭＲＳ培地10L(1L×10本）に接種し37℃で一晩
（10〜16時間）静置培養し、培養液の 650nmにおける濁
度が 1.0である対数増殖期後期の菌体を遠心分離(7,500
×ｇ、10分、４℃）によって集菌した。得られた菌体
を、15mMの塩化カルシウムを含む 50mM の4-(2- ヒドロ
キシエチル) -1- ピペラジン−エタンスルホン酸 (ＨＥ
ＰＥＳ）緩衝液(pH7.0)100mlで２回洗浄後、 120mlの同
緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各60mlを−10℃の冷
媒で冷却しながら、出力10パルス20％（１秒間に 0.2秒
間のみ出力) で、40分間、超音波破砕を行った。この操
作により、試料の濁度(650nm) は超音波破砕前の20％以
下となった。次いで、この破砕物を遠心分離 (30,000×
ｇ、10分、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。
培養液10L より得られた粗酵素液のたんぱく質は、ウシ
血清アルブミン換算で 10.3gであった。
acillus helveticus) SBT 2171株（FERM P-14381）
を改変ＭＲＳ培地10L(1L×10本）に接種し37℃で一晩
（10〜16時間）静置培養し、培養液の 650nmにおける濁
度が 1.0である対数増殖期後期の菌体を遠心分離(7,500
×ｇ、10分、４℃）によって集菌した。得られた菌体
を、15mMの塩化カルシウムを含む 50mM の4-(2- ヒドロ
キシエチル) -1- ピペラジン−エタンスルホン酸 (ＨＥ
ＰＥＳ）緩衝液(pH7.0)100mlで２回洗浄後、 120mlの同
緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各60mlを−10℃の冷
媒で冷却しながら、出力10パルス20％（１秒間に 0.2秒
間のみ出力) で、40分間、超音波破砕を行った。この操
作により、試料の濁度(650nm) は超音波破砕前の20％以
下となった。次いで、この破砕物を遠心分離 (30,000×
ｇ、10分、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。
培養液10L より得られた粗酵素液のたんぱく質は、ウシ
血清アルブミン換算で 10.3gであった。
【００１２】
【実施例２】ファースト プロティン リキッド クロ
マトグラフィー (Fast Protein Liquid Chromatograph
y) (Pharmacia社製）に、以下に示すカラムを設置し、
実施例１で得られたウシ血清アルブミン換算で1.246mg
のたんぱく質を含有する粗酵素液100ml を次の方法で精
製を行った。各精製段階は全て４℃で行い、供する試料
は全てポアサイズ0.22μm のフィルターで濾過した。ま
た、たんぱく質量は 280nmの吸光値から求め、活性はマ
イクロプレート リーダー モデル(MicroplateReader
Model)3550-UV (Bio-Rad 社製) を用い、基質Lys-ｐＮ
Ａから遊離した生成ｐＮＡ量を 405nmの吸光値から求め
た。
マトグラフィー (Fast Protein Liquid Chromatograph
y) (Pharmacia社製）に、以下に示すカラムを設置し、
実施例１で得られたウシ血清アルブミン換算で1.246mg
のたんぱく質を含有する粗酵素液100ml を次の方法で精
製を行った。各精製段階は全て４℃で行い、供する試料
は全てポアサイズ0.22μm のフィルターで濾過した。ま
た、たんぱく質量は 280nmの吸光値から求め、活性はマ
イクロプレート リーダー モデル(MicroplateReader
Model)3550-UV (Bio-Rad 社製) を用い、基質Lys-ｐＮ
Ａから遊離した生成ｐＮＡ量を 405nmの吸光値から求め
た。
【００１３】Q-セファロース(Sepharose) クロマトグラ
フィー Q-セファロース(Sepharose)HP 26/10 カラム(Pharmacia
社製) を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5) で平衡化した
後、粗酵素液を供した。次いで、流速2.0ml/min.で同緩
衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜1M) さ
せることにより溶出を行い、溶出液を４mlずつ分画し
た。活性画分は使用するまで−50℃で凍結保存した。
フィー Q-セファロース(Sepharose)HP 26/10 カラム(Pharmacia
社製) を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5) で平衡化した
後、粗酵素液を供した。次いで、流速2.0ml/min.で同緩
衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜1M) さ
せることにより溶出を行い、溶出液を４mlずつ分画し
た。活性画分は使用するまで−50℃で凍結保存した。
【００１４】フェニル スーパーロース (Phenyl Super
ose)クロマトグラフィー Q-セファロース(Sepharose) クロマトグラフィーで得ら
れた活性画分に同体積の3.4M硫酸アンモニウム溶液を滴
下し、最終濃度1.7Mの硫酸アンモニウムを含む試料を調
製した。フェニル スーパーロース(Phenyl Superose)H
R 5/5 カラム(Pharmacia社製) を1.7M硫酸アンモニウム
を含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した
後、調製した試料を吸着させた。溶出は、流速0.5ml/mi
n.とし、同緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に
減じることにより行い、溶出液を１mlずつ分画した。得
られた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱
塩及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
ose)クロマトグラフィー Q-セファロース(Sepharose) クロマトグラフィーで得ら
れた活性画分に同体積の3.4M硫酸アンモニウム溶液を滴
下し、最終濃度1.7Mの硫酸アンモニウムを含む試料を調
製した。フェニル スーパーロース(Phenyl Superose)H
R 5/5 カラム(Pharmacia社製) を1.7M硫酸アンモニウム
を含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した
後、調製した試料を吸着させた。溶出は、流速0.5ml/mi
n.とし、同緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に
減じることにより行い、溶出液を１mlずつ分画した。得
られた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱
塩及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
【００１５】ゲル濾過クロマトグラフィー セファクリル(Sephacryl)S-100HR 26/60カラム(Pharmac
ia社製) を0.2M塩化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝
液(pH7.5) で平衡化した後、フェニル スーパーロース
(Phenyl Superose) クロマトグラフィーで得られた活性
画分を供した。溶出は流速1.5ml/min.とし、同緩衝液で
行った。溶出液は３mlずつ分画して回収し、得られた活
性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩及び濃
縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
ia社製) を0.2M塩化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝
液(pH7.5) で平衡化した後、フェニル スーパーロース
(Phenyl Superose) クロマトグラフィーで得られた活性
画分を供した。溶出は流速1.5ml/min.とし、同緩衝液で
行った。溶出液は３mlずつ分画して回収し、得られた活
性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩及び濃
縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
【００１６】モノ(Mono)-Qクロマトグラフィー モノ(Mono)-Q 5/5カラム(Pharmacia社製) を20mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した後、ゲル濾過クロマ
トグラフィーで得られた活性画分を供した。次いで、流
速1.0ml/min.で同緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線
的に増加(0〜1M) させることにより溶出を行い、溶出液
を 0.5mlずつ分画した。得られた活性画分は、分画分子
量10,000の限外濾過膜で脱塩した後、−50℃で凍結保存
した。
−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した後、ゲル濾過クロマ
トグラフィーで得られた活性画分を供した。次いで、流
速1.0ml/min.で同緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線
的に増加(0〜1M) させることにより溶出を行い、溶出液
を 0.5mlずつ分画した。得られた活性画分は、分画分子
量10,000の限外濾過膜で脱塩した後、−50℃で凍結保存
した。
【００１７】以上のような操作を行なうことにより、Ｓ
ＤＳ電気泳動で単一な精製酵素1.38mgが回収率15.9％で
得られた。各精製段階における活性回収率、及び比活性
を示すと表１のとおりである。
ＤＳ電気泳動で単一な精製酵素1.38mgが回収率15.9％で
得られた。各精製段階における活性回収率、及び比活性
を示すと表１のとおりである。
【００１８】
【表１】
【００１９】得られた精製酵素のアミノ酸組成をHP 109
0 Aminoquant (Hewlett-Packard Co., Galif.)を用いて
分析した。その結果を表２に示す。
0 Aminoquant (Hewlett-Packard Co., Galif.)を用いて
分析した。その結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】この表からみて、酸性アミノ酸のアスパラ
ギン酸及びグルタミン酸が、それぞれ14.9％及び18.6％
と多く、塩基性アミノ酸のリジン及びアルギニンが、そ
れぞれ 1.1％及び 3.5％と少なく、これが等電点pH 4.9
と低かったことを裏付ける結果である。また、構成アミ
ノ酸より、本発明のアミノペプチダーゼは、 851残基
（トリプトファンを除く）から構成され、その分子量
は、93,086Daと算出された。
ギン酸及びグルタミン酸が、それぞれ14.9％及び18.6％
と多く、塩基性アミノ酸のリジン及びアルギニンが、そ
れぞれ 1.1％及び 3.5％と少なく、これが等電点pH 4.9
と低かったことを裏付ける結果である。また、構成アミ
ノ酸より、本発明のアミノペプチダーゼは、 851残基
（トリプトファンを除く）から構成され、その分子量
は、93,086Daと算出された。
【００２２】本発明の各精製段階における精製度をLaem
mli の方法〔Nature 227, 680-685(1970)〕によりＳＤ
Ｓ−電気泳動によって確認した。その結果を図１に示し
た。モノＱカラムクロマトグラフィー処理後には、本発
明のアミノペプチダーゼは分子量 97.4KDaのホスホリラ
ーゼｂのバンドより、わずかに低分子量側に泳動され、
約 95KDaの明確で単一のバンドを示した。また、自動電
気泳動装置、Phast Systemを用いて、等電点を測定した
ところ、等電点のマーカーとの比較により 4.9と測定さ
れた。
mli の方法〔Nature 227, 680-685(1970)〕によりＳＤ
Ｓ−電気泳動によって確認した。その結果を図１に示し
た。モノＱカラムクロマトグラフィー処理後には、本発
明のアミノペプチダーゼは分子量 97.4KDaのホスホリラ
ーゼｂのバンドより、わずかに低分子量側に泳動され、
約 95KDaの明確で単一のバンドを示した。また、自動電
気泳動装置、Phast Systemを用いて、等電点を測定した
ところ、等電点のマーカーとの比較により 4.9と測定さ
れた。
【００２３】pH 7.0において、Lys-pHA を基質として20
〜70℃の温度で、本発明のアミノペプチダーゼの温度特
性を測定した。その結果を図２に示した。図に示すよう
に酵素活性は、温度上昇とともに高くなり、50℃で最大
となった。また、30℃におけるLys-pNA を基質としてpH
４〜10の範囲の緩衝液（リンゴ酸、MES 、HEPES 及びホ
ウ酸を混合した緩衝液）中でのpH特性を測定した。その
結果を図３に示した。
〜70℃の温度で、本発明のアミノペプチダーゼの温度特
性を測定した。その結果を図２に示した。図に示すよう
に酵素活性は、温度上昇とともに高くなり、50℃で最大
となった。また、30℃におけるLys-pNA を基質としてpH
４〜10の範囲の緩衝液（リンゴ酸、MES 、HEPES 及びホ
ウ酸を混合した緩衝液）中でのpH特性を測定した。その
結果を図３に示した。
【００２４】Lys-pNA 及びPro-pNA に対する酵素反応の
最大速度（Vmax）及びミカエル定数（km）のランク・ウ
ィーバー・パークプロットを図４及び図５にそれぞれ示
した。それによると、Lys-pNA 分解活性におけるKm値は
0.003mM、Vmax値は37.5μmol/min/mgであり、一方、Pr
o-pNA 分解活性におけるKm値は 0.6mM、Vmax値は 2.5μ
mol/min/mgであった。
最大速度（Vmax）及びミカエル定数（km）のランク・ウ
ィーバー・パークプロットを図４及び図５にそれぞれ示
した。それによると、Lys-pNA 分解活性におけるKm値は
0.003mM、Vmax値は37.5μmol/min/mgであり、一方、Pr
o-pNA 分解活性におけるKm値は 0.6mM、Vmax値は 2.5μ
mol/min/mgであった。
【００２５】また、基質特異性については、相当する基
質の２〜５mM基質溶液（50mM HEPES緩衝液（pH7.01))に
本発明のアミノペプチダーゼを１μg/mlになるように加
え、30℃で25時間反応させ、酢酸を10％になるように加
えて反応を停止させ、薄層プレートでクロマトグラフィ
ーを行い、アミノ酸が遊離したか否かをニンヒドリン反
応で検出した。その結果、前記基質を分解することが判
明した。
質の２〜５mM基質溶液（50mM HEPES緩衝液（pH7.01))に
本発明のアミノペプチダーゼを１μg/mlになるように加
え、30℃で25時間反応させ、酢酸を10％になるように加
えて反応を停止させ、薄層プレートでクロマトグラフィ
ーを行い、アミノ酸が遊離したか否かをニンヒドリン反
応で検出した。その結果、前記基質を分解することが判
明した。
【００２６】さらに、酵素阻害剤の影響については、本
発明のアミノペプチダーゼを50mM HEPES (pH7.0)中に１
μg/mlの濃度になるように調製し、この酵素液に各酵素
阻害剤を0.02〜２mMとなるように加え、室温で10分間放
置した。次いで、あらかじめこの酵素液を５分間、30℃
に保った後、１mM Lys-pNAを加えて酵素反応を開始さ
せ、５分後に10％酢酸を加えて酵素反応を停止させ、基
質が分解されるか否かを上記と同様にして測定した。そ
の結果、前記したように、EDTA、ベスタチン、PCMBS で
活性が阻害された。また、金属イオンの影響について
も、上記と同様の方法で測定した。
発明のアミノペプチダーゼを50mM HEPES (pH7.0)中に１
μg/mlの濃度になるように調製し、この酵素液に各酵素
阻害剤を0.02〜２mMとなるように加え、室温で10分間放
置した。次いで、あらかじめこの酵素液を５分間、30℃
に保った後、１mM Lys-pNAを加えて酵素反応を開始さ
せ、５分後に10％酢酸を加えて酵素反応を停止させ、基
質が分解されるか否かを上記と同様にして測定した。そ
の結果、前記したように、EDTA、ベスタチン、PCMBS で
活性が阻害された。また、金属イオンの影響について
も、上記と同様の方法で測定した。
【００２７】
【発明の効果】本発明のアミノペプチダーゼは、飲食
品、飼料、化粧品及び医薬品などの素材として用いるた
んぱく質やペプチドを加水分解する際に用いることがで
きる。特に、苦味ペプチドを加水分解する作用を有する
ので、飲食品及び医薬品の素材として用いるたんぱく質
やペプチドを加水分解する際に有用である。また、本発
明のアミノペプチダーゼは酪農乳酸菌の産生する酵素で
あり、安全性の面でも優れているといえる。
品、飼料、化粧品及び医薬品などの素材として用いるた
んぱく質やペプチドを加水分解する際に用いることがで
きる。特に、苦味ペプチドを加水分解する作用を有する
ので、飲食品及び医薬品の素材として用いるたんぱく質
やペプチドを加水分解する際に有用である。また、本発
明のアミノペプチダーゼは酪農乳酸菌の産生する酵素で
あり、安全性の面でも優れているといえる。
【図１】本発明の実施例のアミノペプチダーゼの精製段
階におけるＳＤＳ─電気泳動の状態を示す。
階におけるＳＤＳ─電気泳動の状態を示す。
【図２】本発明のアミノペプチダーゼの温度特性を示
す。
す。
【図３】本発明のアミノペプチダーゼのpH特性を示す。
【図４】本発明のアミノペプチダーゼのLys-pNA に対す
るVmax値及びKm値を示すライン・ウィーバー・パークプ
ロットを示す。
るVmax値及びKm値を示すライン・ウィーバー・パークプ
ロットを示す。
【図５】本発明のアミノペプチダーゼのPro-pNA に対す
るVmax値及びKm値を示すライン・ウィーバー・パークプ
ロットを示す。
るVmax値及びKm値を示すライン・ウィーバー・パークプ
ロットを示す。
レーンａ及びレーンｇ マーカー（ホスホリラーゼ
ｂ 97.4KDa、ウシ血漿アルブミン 66.2KDa、卵白アルブ
ミン 45KDa、炭酸脱水素酵素 31KDa、大豆トリプシンイ
ンヒビター 21.5KDa、卵白リゾチーム 14.4KDa） レーンｂ 菌体抽出物 レーンｃ ＱセファロースHP処理後 レーンｄ フェニルスーパーロース処理後 レーンｅ セファクリルＳ─100 HR処理後 レーンｆ モノＱカラムクロマトグラフィー処理後
ｂ 97.4KDa、ウシ血漿アルブミン 66.2KDa、卵白アルブ
ミン 45KDa、炭酸脱水素酵素 31KDa、大豆トリプシンイ
ンヒビター 21.5KDa、卵白リゾチーム 14.4KDa） レーンｂ 菌体抽出物 レーンｃ ＱセファロースHP処理後 レーンｄ フェニルスーパーロース処理後 レーンｅ セファクリルＳ─100 HR処理後 レーンｆ モノＱカラムクロマトグラフィー処理後
フロントページの続き (72)発明者 高藤 愼一 埼玉県川越市小堤62−32 (72)発明者 岩崎 泰介 オランダ ハーレン エヌエー 9752 ヘ ムスターハウスラーン 17
Claims (3)
- 【請求項１】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) が産生し、以下の性質を有する
アミノペプチダーゼ。 （１）分子量：約 95kDa（ＳＤＳ電気泳動による）、約
93kDa（アミノ酸分析による） （２）等電点：約 4.9 （３）至適温度：約 50 ℃ （４）至適pH：６〜８ （５）基質特異性：アミノ末端にプロリン(Pro) がある
ペプチド及びアミノペプチダーゼ試験用基質を特異的に
分解する。 （６）酵素阻害剤の影響：エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、ベスタチン（Bestatin）、p-chloromercurib
enzenesulfonic acid （ＰＣＭＢＳ）により活性が阻害
される。 （７）金属イオンの影響：Ｚｎ2+、Ｆｅ2+及びＣｕ2+に
より活性が阻害され、Ｃｏ2+により活性が増加される。 - 【請求項２】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) が、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus)SBT 2171 (FERM P-
14381)である請求項１記載のアミノペプチダーゼ。 - 【請求項３】Km値及びVmax値が、基質Pro-pNA の分解に
おいてKm値約0.6mM 、Vmax値約 2.5μmol/min/mgであ
り、基質Lys-pNA の分解においてKm値約0.003mM 、Vmax
値約37.5μmol/min/mgである請求項１記載のアミノペプ
チダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17356994A JP3518773B2 (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | 新規アミノペプチダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17356994A JP3518773B2 (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | 新規アミノペプチダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH089973A true JPH089973A (ja) | 1996-01-16 |
| JP3518773B2 JP3518773B2 (ja) | 2004-04-12 |
Family
ID=15962998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17356994A Expired - Lifetime JP3518773B2 (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | 新規アミノペプチダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3518773B2 (ja) |
-
1994
- 1994-07-01 JP JP17356994A patent/JP3518773B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3518773B2 (ja) | 2004-04-12 |
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