JPH089979A

JPH089979A - 耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ及びその遺伝子

Info

Publication number: JPH089979A
Application number: JP6174930A
Authority: JP
Inventors: Yukiko Izu; 由記子伊豆; Satomi Nakura; 里美那倉; Kenichi Mitsunaga; 研一光永; Susumu Tsunasawa; 進綱澤; Ikunoshin Katou; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 1996-01-16
Anticipated expiration: 2019-03-29
Also published as: JP3512237B2

Abstract

(57)【要約】【目的】新規な耐熱性メチオニンアミノペプチダー
ゼ、及び該酵素をコードする遺伝子、並びに該酵素遺伝
子を用いる耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼの遺伝
子工学的製造方法を提供する。【構成】７５℃で６０分間処理したとき約９５％以上
の残存活性を保持している耐熱性メチオニンアミノペプ
チダーゼ。該酵素をコードする、単離された遺伝子。該
遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入した形質転
換体を培養し、該培養物から耐熱性メチオニンアミノペ
プチダーゼを採取する耐熱性メチオニンアミノペプチダ
ーゼの製造方法。該遺伝子の例には配列表の配列番号１
又は２で表されるもの、あるいはそれにハイブリダイズ
可能なもの等がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛋白質工学の分野にお
いて有用で新規な耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
及び該酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の遺伝子工
学的製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞内での蛋白質生合成において、その
アミノ末端は、開始コドンに対応するメチオニン（原核
生物ではホルミルメチオニン）から始まっていることが
知られている。しかしながら、このメチオニンは、その
後のプロセシングにより除去されてしまう場合があり、
多くの分泌型の成熟型蛋白質には、メチオニンが存在し
ないのが通例である。一方、遺伝子組換技術を用いて、
蛋白質を生体内で生産させた場合には、上記メチオニン
が残存している例が見出されている。このアミノ末端に
メチオニンが付加した前駆体蛋白質は、例えば、組換え
ヒト成長ホルモン等に見られるように成熟型に比べ、抗
原性の増加が指摘されている。したがって、遺伝子組換
技術を利用して産生した前駆体蛋白質を医薬品などに利
用するためには、このアミノ末端のメチオニンを選択的
に除去し成熟型蛋白質を得る必要がある。この方法とし
て、メチオニンアミノペプチダーゼを作用させる方法が
最も望ましい。この方法に利用できるメチオニンアミノ
ペプチダーゼとして、大腸菌（Escherichia coli) 〔特
開昭６２−１１５２８１号公報、及びジャーナルオブ
バクテリオロジー（Journal of Bacteriology)、第１
６９（２）巻、第７５１〜７５７頁（１９８７）〕、サ
ルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m) 〔特表平３−５０２４００号公報、及びヨーロピア
ンジャーナルオブバイオケミストリー（European
Journal of Biochemistry) 、第１８０巻、第２３〜３
２頁（１９８９）〕、酵母（特表平４−５００１５５号
公報）、及び枯草菌（Bacillus subtilis)（特開平３−
２８５６８４号公報）由来のメチオニンアミノペプチダ
ーゼが提案されている。これらのメチオニンアミノペプ
チダーゼは、蛋白質として単離され、その遺伝子も明ら
かにされている。一方、蛋白質工学のプロセスに利用さ
れるメチオニンアミノペプチダーゼは、対象とする蛋白
質を加熱し、立体構造を可逆的にほどき、余分なアミノ
末端メチオニンを露出させるような状態で作用させるた
め、高い熱安定性が要求されている。公知の４種類のメ
チオニンアミノペプチダーゼは、上述のような条件で使
用することは困難であり、また、大腸菌、サルモネラ、
酵母、及び枯草菌由来のメチオニンアミノペプチダーゼ
アミノ酸配列中には、すべてシステイン残基が複数個含
まれているために、遺伝子工学的に高発現させた場合、
誤ってジスルフィド結合が形成される可能性も高く、多
量の不活体が蓄積する危険性が大きいという製造法上の
欠点がある。そこで、対象とする蛋白質を加熱し、立体
構造を可逆的にほどき、余分なアミノ末端メチオニンを
露出させるような状態で、メチオニンアミノペプチダー
ゼを作用させるためには、この条件でアミノ末端のメチ
オニンを除去する活性を失わないような、高い熱安定性
をもち、かつ、より確実な遺伝子工学的な高発現系をも
つメチオニンアミノペプチダーゼの開発が望まれてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこれらの課題
を解決するために、新規な耐熱性メチオニンアミノペプ
チダーゼ、及び該酵素をコードする遺伝子、並びに該酵
素遺伝子を用いる耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
の遺伝子工学的製造方法を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、７５℃で６０分間処理したとき約
９５％以上の残存活性を保持していることを特徴とする
耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼに関する。第２の
発明は、第１の発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダ
ーゼをコードする単離された遺伝子に関し、配列表の配
列番号１で表されるアミノ酸配列、又はその一部であっ
て、かつ、耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ酵素活
性を有する部分をコードする遺伝子、及び配列表の配列
番号２で表される遺伝子であることを特徴とし、またこ
の遺伝子にハイブリダイズ可能である耐熱性メチオニン
アミノペプチダーゼ遺伝子に関する。本発明の第３の発
明は、工業的な製造方法に関し、第２の発明の遺伝子を
含有させた組換えプラスミドを導入させた形質転換体を
培養し、該培養物から耐熱性メチオニンアミノペプチダ
ーゼを採取することを特徴とする。

【０００５】本発明者らは、耐熱性に優れたメチオニン
アミノペプチダーゼとしてピロコッカスフリオサス
（Pyrococcus furiosus)ＤＳＭ３６３８のメチオニンア
ミノペプチダーゼを見出し、更に、該酵素の遺伝子をス
クリーニングしようと試みた。目的とする酵素の遺伝子
をクローニングする方法としては例えば発現クローニン
グ法があり、例えば、ピロコッカスボウゼイ（Pyroco
ccus woesei)由来のプルラナーゼ遺伝子（国際公開９２
／０２６１４号）はこの方法により取得された。一般に
発現クローニング法にはプラスミドベクターが使用され
るが、この場合には目的遺伝子が途中で切断されること
なくプラスミドベクターに挿入可能な程度の比較的小さ
なＤＮＡ断片に切断されるような制限酵素を用いなけれ
ばならず、必ずしもすべての酵素遺伝子のクローニング
に適用可能ではない。更に、数多くのクローンについて
酵素活性の発現を調べなければならず、操作が繁雑であ
る。本発明者らは、プラスミドベクターに代えてより大
きなＤＮＡ断片（３５〜５０ｋｂ）を保持できるコスミ
ドベクターを用いてピロコッカスフリオサスＤＮＡ
ゲノムより作製したコスミドライブラリーを構築し、該
ライブラリー中にメチオニンアミノペプチダーゼ活性を
発現するコスミドクローンを検索することにより、メチ
オニンアミノペプチダーゼ遺伝子を単離することを試み
た。コスミドベクターを用いることにより、酵素遺伝子
内部が切断される恐れが減ると共に、スクリーニングす
る形質転換体の数を減らすことができる。その一方でコ
スミドベクターはプラスミドベクターほど宿主内でのコ
ピー数が高くないため、酵素の発現量が低く、活性を検
出できない可能性がある。本発明者らは、目的とする酵
素が高い耐熱性を有する点に着目し、コスミドライブラ
リー中の形質転換体を個別に培養し、得られた菌体から
耐熱性の蛋白のみを含むライゼートを調製する工程を組
合せた。この一群のライゼートは、コスミドプロテイン
ライブラリーと命名され、該コスミドプロテインライブ
ラリーを酵素活性の検出に用いることにより、形質転換
体のコロニーを用いる方法よりも検出感度が上がると共
に、宿主由来の蛋白等によるバックグラウンドや酵素活
性の阻害といった悪影響を除去することができる。

【０００６】本発明者らは、ピロコッカスフリオサス
由来のコスミドプロテインライブラリーを検索し、メチ
オニンアミノペプチダーゼ活性を示す数個のコスミドク
ローンを取得した。本発明者らは、これらのクローン中
に含まれる耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子
を含有するＤＮＡ断片より、種々の遺伝子工学的手法を
駆使して耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子の
単離に成功し、該酵素遺伝子の塩基配列を決定した。更
に、該酵素遺伝子を用いて耐熱性メチオニンアミノペプ
チダーゼを遺伝子工学的に生産することに成功し、該酵
素の種々の酵素学的性質を明らかにした。更に、本発明
者らは、ピロコッカスフリオサスの菌体を培養し、培
養物より耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼを採取で
きることを見出して本発明を完成した。なお、このコス
ミドプロテインライブラリーを利用した発現クローニン
グ法は必ずしもあらゆる耐熱性酵素に応用できるわけで
はなく、目的とする遺伝子によりその成否は左右され
る。例えば、本発明者らは該方法を用いてピロコッカス
フリオサス由来のα−グルコシダーゼ〔ジャーナルオ
ブバクテリオロジー、第１７２巻、第３６５４〜３６
６０頁（１９９０）〕についても該α−グルコシダーゼ
をコードする遺伝子の単離を試みたが、該遺伝子の単離
には至っていない。

【０００７】以下、本発明をより詳細に説明する。本発
明に用いられる微生物は、耐熱性メチオニンアミノペプ
チダーゼ遺伝子を産生する微生物であれば特に限定され
ないが、例えば超好熱菌であるピロコッカス属に属する
菌株を用いることができる。例えばピロコッカスフリ
オサス、ピロコッカスボウゼイ等のゲノムのコスミド
ライブラリーより目的の遺伝子をスクリーニングし、得
ることができる。ピロコッカスフリオサスとしてはピ
ロコッカスフリオサスＤＳＭ３６３８が、ピロコ
ッカスボウゼイとしてはピロコッカスボウゼイＤ
ＳＭ３７７３が使用でき、該両菌株はドイッチェザム
ルンクフォンミクロオルガニスメンウントツェ
ルクルチュウレンＧｍｂＨ（Deutsche Sammlung von Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH)より入手可能な
菌株である。例えば、ピロコッカスフリオサスのゲノ
ムのコスミドライブラリーは、ピロコッカスフリオサ
スＤＳＭ３６３８のゲノムＤＮＡを適当な制限酵
素、例えばＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）を用いて部分分
解し、３５〜５０ｋｂにサイズ分画して得られた各ＤＮ
Ａ断片と適当なコスミドベクター、例えばトリプルヘリ
ックスコスミドベクター（ストラタジーン社製）をライ
ゲーションした後、インビトロパッケージング法で一旦
ラムダファージ粒子中にピロコッカスフリオサスのゲ
ノムＤＮＡ断片をパッケージし、得られるファージ溶液
を用いて適当な大腸菌、例えば大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ
（ＢＲＬ社製）を形質転換し調製することができる。次
に形質転換体のコロニー数個よりコスミドＤＮＡを調製
し、３５〜５０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片の挿入を確認す
る。培養するコロニー数としては、通常３００〜７００
個で良い。各コロニーの培養終了後、培養菌体を集菌
し、熱処理（１００℃、１０分間）、超音波処理、再熱
処理（１００℃、１０分間）して、コスミドプロテイン
ライブラリーとして、得られたライゼート中のメチオニ
ンアミノペプチダーゼ活性の有無を合成ペプチドＭｅｔ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列表の配列番号
３）を基質としてスクリーニングすることができる。こ
れにより、上記の熱処理にも安定な、耐熱性メチオニン
アミノペプチダーゼを発現する、耐熱性メチオニンアミ
ノペプチダーゼ遺伝子を含むコスミドクローンをいくつ
か得ることができる。更に、このようにして得られたコ
スミドクローンより調製したコスミドを適当な制限酵素
で断片化し、各断片を導入した組換えプラスミドを作製
することができる。次に、該プラスミドを適当な微生物
に導入して得られる形質転換体の生産する耐熱性メチオ
ニンアミノペプチダーゼの活性を調べることにより、目
的とする耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を
含む組換えプラスミドを得ることができる。すなわち、
上記のコスミドクローンの１つから調製したコスミドＤ
ＮＡをＸｈｏＩ（宝酒造社製）消化し、得られたＤＮＡ
断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造社製）
のＳａｌＩサイトに導入した組換えプラスミドを得るこ
とができる。次に、この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ
１０９（宝酒造社製）に導入し、得られたコロニーにつ
いてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニング
に用いた方法で耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ活
性を測定することにより、活性の認められたコロニーよ
りプラスミドを調製する。

【０００８】実施例に示すように、該組換えプラスミド
の１つはｐＭＡＰ１と命名されている。更にこの組換え
プラスミドについて数種類の制限酵素を用いて切断し、
生じる種々の長さのＤＮＡ断片を適当なベクターに挿入
する。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に
導入して得られる形質転換体について、耐熱性メチオニ
ンアミノペプチダーゼ活性を測定することにより、前記
のプラスミドｐＭＡＰ１より耐熱性メチオニンアミノペ
プチダーゼを含まないＤＮＡ断片を除くことができる。
すなわち、前記のプラスミドｐＭＡＰ１をＢｌｎＩ（宝
酒造社製）消化して得られるＤＮＡ断片を、プラスミド
ベクターｐＵＣ１１８のＸｂａＩサイトへ導入した組換
えプラスミドを作製する。得られた組換えプラスミドを
大腸菌ＪＭ１０９に導入して得られる形質転換体につい
て耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ活性を測定する
ことにより、活性の認められたコロニーよりプラスミド
を調製する。該組換えプラスミドはｐＭＡＰ２Ｔと命名
されている。

【０００９】更に、前記のプラスミドｐＭＡＰ２Ｔより
耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含まない
ＤＮＡ断片を次のように除くことができる。すなわち、
前記プラスミドｐＭＡＰ２ＴをＮｏｔＩ（宝酒造社
製）、ＢｌｎＩ消化して得られる約３．５ｋｂのＮｏｔ
Ｉ−ＢｌｎＩ断片をプラスミドベクターｐＵＣＮ１９
〔ｐＵＣ１９（宝酒造社製）をＨｉｎｃII消化し、Ｎｏ
ｔＩリンカー（宝酒造社製）を導入したもの〕のＮｏｔ
Ｉ−ＸｂａＩサイトに導入した後、大腸菌ＪＭ１０９に
導入する。得られたコロニーの耐熱性メチオニンアミノ
ペプチダーゼ活性を測定し、活性を示したコロニーより
プラスミドを調製する。該プラスミドはｐＭＡＰ２Ｐと
命名されている。図１にプラスミドｐＭＡＰ２Ｐの制限
酵素地図を示す。図中、太実線はプラスミドベクターｐ
ＵＣＮ１９への挿入ＤＮＡ断片を示す。

【００１０】更に、前記のプラスミドｐＭＡＰ２Ｐより
耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を含まない
ＤＮＡ断片を次のように除くことができる。すなわち、
前記プラスミドｐＭＡＰ２ＰをＥｃｏＲＩ（宝酒造社
製）、ＸｈｏＩ消化して得られる約１．３ｋｂＥｃｏ
ＲＩ−ＸｈｏＩ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８
（宝酒造社製）ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに導入した
後、大腸菌ＪＭ１０９に導入する。得られたコロニーの
耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ活性を測定し、活
性を示したコロニーよりプラスミドを調製する。該プラ
スミドはプラスミドｐＭＡＰ８と命名されている。図２
にプラスミドｐＭＡＰ８の制限酵素地図を示す。図中、
太実線はプラスミドベクターｐＵＣ１８への挿入ＤＮＡ
断片を示す。プラスミドｐＭＡＰ８で形質転換された大
腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coliＪＭ１０９／ｐＭ
ＡＰ８と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭＰ−１４３４４として寄託されてい
る。

【００１１】プラスミドｐＭＡＰ８に挿入されている約
１．３ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列の一部を配列表の配
列番号２に示す。すなわち配列表の配列番号２は本発明
によって得られる耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
遺伝子の１例の塩基配列である。また、配列表の配列番
号１に、配列番号２に示される塩基配列より推定される
遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。すなわち配列表の配
列番号１は本発明によって得られる耐熱性メチオニンア
ミノペプチダーゼ遺伝子を用いて生産される酵素蛋白の
一例のアミノ酸配列である。

【００１２】Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＭＡＰ
８は通常の培養条件、例えば１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リット
ル、酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リ
ットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養することによ
り、培養菌体中に耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
を発現させることができる。培養終了後、培養菌体を集
菌し、得られた菌体の超音波処理後の遠心上清を粗酵素
液とし、該酵素液を１００℃、１０分間の熱処理による
夾雑蛋白質の変性処理、透析処理、イオン交換クロマト
グラフィー等の通常酵素の精製に用いられる方法を組合
せて用いることによって耐熱性メチオニンアミノペプチ
ダーゼを精製することができる。例えば、 Escherichia
coli ＪＭ１０９／ｐＭＡＰ８を培養終了後、培養菌体
を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の遠心上清を粗
酵素液とし、該酵素液を１００℃、１０分間の熱処理に
よる夾雑蛋白質の変性処理後に遠心処理を行い、透析処
理後、ＤＥＡＥ−セファロース（Sepharose)ＣＬ−６Ｂ
イオン交換体（ファルマシア社製）にかけ、活性画分を
素通りさせる。得られた活性画分を、更にＣＭ−セファ
ロースＣＬ−６Ｂイオン交換体（ファルマシア社製）に
かけ、活性画分を溶出させる。このような処理によっ
て、耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼの酵素標品
（１）として酵素化学的、及び理化学的性質を測定し
た。

【００１３】本発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダ
ーゼ遺伝子を発現させることにより得られる耐熱性メチ
オニンアミノペプチダーゼは、ピロコッカス属に属する
菌株、例えばピロコッカスフリオサスＤＳＭ３６３
８やピロコッカスボウゼイＤＳＭ３７７３を適当な
増殖培地中で培養し、その菌体及び培養液より精製して
得ることもできる。ピロコッカス属の菌体の培養に当っ
ては、通常、超好熱菌の培養に用いられる方法が利用で
き、培地に加える栄養源は使用する菌株が利用しうるも
のであればよい。炭素源としては、例えばデンプン等が
利用でき、窒素源としては、例えばトリプトン、ペプト
ン等が利用でき、他の栄養源としては、例えば、酵母エ
キス等が利用できる。培養中には、マグネシウム塩、ナ
トリウム塩、鉄塩等の金属塩を微量元素として加えても
よい。また例えば、培地の調製に人工海水を用いること
が有利である。また培地は固形の硫黄を含んでいない透
明な培地が望ましく、該培地を用いれば、菌体の増殖は
光学密度を測定することにより容易に監視することがで
きる。培養に当っては静置培養又はかくはん培養で行う
ことができるが、例えばアプライドアンドエンバイ
ロンメンタルマイクロバイオロジー（Applied and En
vironmental Microbiology) 、第５５巻、第２０８６〜
２０８８頁（１９９２）に記載のように、透析培養法を
用いてもよい。一般に培養温度は、９５℃前後が好まし
く、通常１６時間程度で耐熱性メチオニンアミノペプチ
ダーゼが培養物中に著量蓄積する。培養条件は、使用す
る菌体、培地組成に応じ耐熱性メチオニンアミノペプチ
ダーゼ生産量が最大になるように設定するのは当然であ
る。

【００１４】耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼを採
取するに当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過な
どによって菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、
菌体の破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶
菌酵素処理等があり、これらの方法を利用して菌体中よ
り耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼを抽出すること
ができる。なお、酵素の抽出液は使用する菌体によって
最も抽出効果の高い方法を採用して粗酵素液を調製すれ
ばよい。かくして得られた粗酵素液から耐熱性メチオニ
ンアミノペプチダーゼを単離するに当っては、通常の酵
素の精製に用いられる方法を使用できる。例えば、硫安
塩析処理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を
組合せて使用できる。例えば、ピロコッカスフリオサ
スＤＳＭ３６３８の培養菌体より調製される粗酵素液
をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂイオン交換体にか
け、活性画分を素通りさせる。得られた活性画分をＨＴ
Ｐ−カートリッジカラム（バイオラッド社製）にかけ活
性画分を溶出させる。このような処理によって、耐熱性
メチオニンアミノペプチダーゼ粗酵素液を得ることがで
きる。

【００１５】すなわち、トリプトン１％、酵母エキス
０．５％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッ
ド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリ
ンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５
％、ＭｇＳＯ₄ ０．００３％、ＮａＣｌの０．００１
％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ＣｏＳＯ
₄０．０００１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０００
１％、ＺｎＳＯ₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ
₂Ｏ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ₄）₂ ０．１ｐｐ
ｍ、Ｈ₃ＢＯ₃ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ
₂Ｏ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．２５
ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメディ
ウムボトルに入れ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒
素ガスを吹込み溶存酸素を除去した後、これに上記菌株
を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、遠
心分離によって菌体を集めた。集菌体を超音波処理によ
り菌体を破砕し、遠心分離を行った後、得られた上清を
透析後、その粗酵素液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂイオン交換体にかけ、活性画分を素通りさせる。得
られた活性画分をＨＴＰ−カートリッジカラムにかけ活
性画分を溶出させる。このような処理によって、得られ
た粗酵素液を酵素標品（２）として耐熱性メチオニンア
ミノペプチダーゼ活性の酵素化学的、及び理化学的性質
を測定した。

【００１６】酵素標品（１）及び（２）の酵素化学的及
び理化学的性質を以下に示す。（１）作用本発明の酵素は、蛋白質、ペプチドのアミノ末端にメチ
オニンが存在する場合、該蛋白質、ペプチドのアミノ末
端メチオニンを生成する。

【００１７】（２）酵素活性測定方法酵素活性の測定はペプチドＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）を基質として用い検定され
得る。すなわち、酵素活性を測定しようとする酵素標品
を適度に希釈し、その酵素溶液５μｌに、０．６２５ｍ
ＭＣｏＣｌ₂を含む２０ｍＭピペス（PIPES)ナトリ
ウム緩衝液〔ｐＨ７．２（７５℃におけるｐＨ）〕４０
μｌを加え、更に８ｍＭＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）を５μｌ添加し、７５℃で
５分間反応させた後、氷冷し、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．５）を１０μｌ加えることによって反応を停止さ
せる。その後、遊離したメチオニンは、発色試薬５０μ
ｌ〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社製）１８μ
ｇ、ｏ−ジアニシジン（シグマ社製）９μｇ、ペルオキ
シダーゼ（Peroxidase、シグマ社製）２．５μｇを含む
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）〕を添
加し、３７℃、１０分間反応させ、３０％酢酸を１０μ
ｌ加えることにより反応を停止し、４５０ｎｍにおける
吸光度を測定することにより定量する。あるいは、別方
法として、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
（配列番号３）との反応後、アミノ酸分析を行うことに
より、定量を行う。酵素１単位は７５℃において１分間
に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量とする。酵
素標品（１）及び（２）は、測定されたｐＨ７．２、７
５℃においてＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
（配列番号３）分解活性を有していた。コスミドプロテ
インライブラリーのスクリーニングにおいては、酵素活
性を測定しようとする溶液を適度に希釈し、その試料溶
液２０μｌに２ｍＭＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ（配列番号３）を含み０．２ｍＭＣｏＣｌ₂
を含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）１００μｌを加え、９５℃で３０分間反応させる。
その後、氷冷して反応を停止させた後、１００μｌの発
色試薬〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ３６μｇ、ｏ−ジア
ニシジン１８μｇ、ペルオキシダーゼ５μｇを含む０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）〕を添加
し、３７℃、３０分間反応させた後、４５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定し、遊離したメチオニンを定量する。な
お、アミノペプチダーゼもＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）と反応するため、ブランク
として、合成ペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ（配列番号４）の基質を用い同様に反応させ、
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号
４）では発色せず、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ（配列番号３）でのみ反応したものを選択する。
更に、ＨＰＬＣカラムにより反応生成物を分離し、アミ
ノ酸分析によりメチオニンのみを遊離することを確認す
る。

【００１８】（３）至適温度測定には、２ミリ単位の酵素標品を用い、種々の温度で
反応を行った。酵素標品（１）は、図３に示すように測
定されたｐＨ７．２において２０℃〜１００℃の範囲で
活性があり、その至適温度は７０〜９５℃であった。図
３は、酵素標品（１）及び（２）の至適温度を示す図で
あり、縦軸は相対活性率（％）、横軸は反応温度（℃）
を示す。図中、白丸印は酵素標品（１）を、黒丸印は酵
素標品（２）の結果を示す。

【００１９】（４）至適ｐＨ測定には、２．５ミリ単位の酵素標品を用い、活性測定
に用いる緩衝液をｐＨ４．１〜５．１においては２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８〜７．２において
は２０ｍＭピペスナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０〜９．
５においては２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
９．９〜１０．６においては２０ｍＭリン酸水素二ナト
リウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いて調製し、使用
した（それぞれのｐＨは、７５℃におけるｐＨであり、
すべて０．６２５ｍＭＣｏＣｌ₂を含む）。酵素標品
（１）及び（２）は、図４に示すようにｐＨ７．０〜
８．５付近で最大活性を示した。図４は酵素標品（１）
及び（２）の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は相対活性
率（％）、横軸はｐＨを示す。図中、白丸印は酵素標品
（１）を、黒丸印は酵素標品（２）の結果を示す。

【００２０】（５）温度安定性７５ミリ単位の酵素を含み、０．５ｍＭＣｏＣｌ₂を
含んだ１７．５ｍＭピペスナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）を７５℃で種々の時間処理した後、その一部を用い
て残存する酵素活性を測定した。図５に示すように酵素
標品（１）、及び（２）は７５℃、１時間処理した後で
も９５％以上の活性を保持していた。図５は、酵素標品
（１）、及び（２）の７５℃における温度安定性を示す
図であり、縦軸は残存活性率（％）、横軸に熱処理時間
を示す。図中、白丸印は酵素標品（１）を、黒丸印は酵
素標品（２）の結果を示す。

【００２１】（６）ｐＨ安定性１６ミリ単位の酵素を含み、０．５ｍＭＣｏＣｌ₂を
含んだ各ｐＨの緩衝液を７５℃で１時間処理した後、そ
の一部を用いて残存する酵素活性を測定した。緩衝液と
してｐＨ４．１〜５．１においては２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ５．８〜７．２においては２０ｍＭピ
ペスナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０〜９．５においては
２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．９〜１０．
６においては２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液を用いてそれぞれ測定を行った。図６
に示すようにｐＨ４．１〜１０．６の間では、７５℃、
１時間の処理後も８５％以上の活性を保持していた。図
６は、本発明により得られる酵素標品（１）、及び
（２）のｐＨ安定性を示す図であり、縦軸は残存活性率
（％）、横軸にｐＨを示す。図中、白丸印は酵素標品
（１）を、黒丸印は酵素標品（２）の結果を示す。

【００２２】（７）分子量本発明により得られる酵素標品（１）は、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によ
り、約３７，０００を示す。

【００２３】（８）各種試薬の影響酵素標品（１）及び（２）をそれぞれ２ミリ単位用い、
各種試薬の存在下で酵素活性の測定を行った。終濃度
０．２ｍＭのＥＤＴＡを加えた場合、活性が見られなか
った。また、終濃度０．２ｍＭ〜５ｍＭのＣｏＣｌ₂を
添加した場合には、酵素活性の上昇が見られ、ＭｎＣｌ
₂添加によっても上昇が見られた。

【００２４】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ及び該酵素をコ
ードする遺伝子が提供され、該酵素遺伝子を用いた耐熱
性メチオニンアミノペプチダーゼの遺伝子工学的製造方
法が提供される。該酵素は高度の耐熱性を有する新規酵
素であり、高温下での蛋白質工学的処理において有用で
ある。また、本発明により単離された遺伝子を用いるこ
とにより、該遺伝子にハイブリダイズ可能な耐熱性メチ
オニンアミノペプチダーゼ、及び該酵素に類似の酵素遺
伝子を簡便にクローニングすることができる。

【００２５】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。な
お、実施例中の％は重量％を意味する。

【００２６】実施例１（ピロコッカス・フリオサスのゲノムＤＮＡの調製）ピ
ロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８の培養は以下の
とおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド３．
５％、ジャマリンＳ・リキッド０．５％、ＭｇＳＯ₄
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄０．０００１
％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ＺｎＳＯ
₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．１ｐ
ｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ₄）₂ ０．１ｐｐｍ、Ｈ₃ＢＯ₃
０．１ｐｐｍ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０．１ｐ
ｐｍ、ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．２５ｐｐｍの組成の
培地を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０
℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を
除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時
間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集め
た。次に、集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４ｍｌに懸濁し、この懸
濁液に０．８ｍｌのリゾチーム〔５ｍｇ／ｍｌ、０．２
５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２ｍｌの０．２
ＭＥＤＴＡを加えて、２０℃で１時間保温した後、２
４ｍｌのＳＥＴ溶液〔１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕
を加え、更に５％ＳＤＳ４ｍｌ、プロティナーゼＫ（１
０ｍｇ／ｍｌ）４００μｌを加え、３７℃、１時間反応
させた。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、
続いてエタノール沈殿を行い、約３．２ｍｇのゲノムＤ
ＮＡを調製した。

【００２７】（コスミドプロテインライブラリーの作
製）ピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８のゲノム
ＤＮＡ４００μｇをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、密度勾
配超遠心法により、３５〜５０ｋｂにサイズ分画した。
次に、トリプルヘリックスコスミドベクター１μｇをＢ
ａｍＨＩ消化した後、アルカリホスファターゼ（宝酒造
社製）を用いて脱リン酸化し、上記の分画された３５〜
５０ｋｂのＤＮＡ１４０μｇと混合したライゲーション
を行い、ガイガーパックゴールド（ストラタジーン社
製）を用いたインビトロパッケージング法によって
ピロコッカスフリオサスゲノムＤＮＡのフラグメン
トをラムダファージ粒子中にパッケージングした。得ら
れたファージ溶液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ
を形質転換し、ライブラリーを調製した。得られたコロ
ニーのうち数個を選んでコスミドを調製し、適当な大き
さの挿入断片があることを確認したのち、改めて、上記
のライブラリー中から約５００個のコロニーを選び、そ
れぞれ個別に、形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含む１５０ｍｌのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ
／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌの５
ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中で培養した。該培養物を
遠心し、回収した菌体を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）１ｍｌに懸濁し、１００℃で１０分間熱処理
した。続いて超音波処理を行い、更に、もう一度１００
℃、１０分間熱処理した。遠心後の上清として得られる
ライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。

【００２８】（耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺
伝子を含むコスミドの選択）メチオニンアミノペプチダ
ーゼ活性は、ペプチドＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ（配列番号３）分解活性を、生成するメチオニ
ンを定量することによって測定を行った。すなわち、上
記のコスミドプロテインライブラリーからライゼートを
個別に２０μｌずつをとり、２ｍＭＭｅｔ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）を含む０．２ｍ
ＭＣｏＣｌ₂を含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、９５℃で３０分間
反応させた。その後、氷冷して反応を停止させた後、１
００μｌの発色試薬〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ３６μ
ｇ、ｏ−ジアニシジン１８μｇ、ペルオキシダーゼ５μ
ｇを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）〕を添加し、３７℃、３０分間反応させた後、４５
０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したメチオニンを
定量した。なお、アミノペプチダーゼ等もＭｅｔ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）と反応する
ためブランクとして、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ（配列番号４）の基質を用い同様に反応させ、
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号
４）では発色せず、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ（配列番号３）でのみ反応したものを選択した。
以上の操作により、コスミドプロテインライブラリーか
らメチオニンアミノペプチダーゼ活性を持つ６つのコス
ミドクローンを得た。

【００２９】（耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＭＡＰ１の調製）メチオニンア
ミノペプチダーゼ活性を持つ６つのコスミドクローンの
１つについてコスミドＤＮＡを調製し、ＸｈｏＩ消化し
た後、プラスミドベクターｐＵＣ１１８のＳａｌＩサイ
トにライゲーションした。この組換えプラスミドを大腸
菌ＪＭ１０９に導入した後、１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢプレート上にまき、出現したコロニー
のうち数個について個別に１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む５ｍｌのＬＢ培地中で培養を行った。該培養
物を遠心して回収した菌体を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）５０μｌに懸濁し、１００℃、１０分間
熱処理を行った後、超音波処理によって菌体を破砕し
た。更にもう一度、１００℃、１０分間の熱処理を行
い、遠心してライゼートを得た。このライゼートについ
てメチオニンアミノペプチダーゼ活性を測定した。すな
わち１μｌのライゼートに０．４ｍＭＭｅｔ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ及び０．２ｍＭＣｏＣｌ₂
を含む５０ｍＭピペスナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）５０μｌを加え、９５℃で３０分間反応させた。氷
冷後、発色試薬〔Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１８μｇ、
ｏ−ジアニシジン９μｇ、ペルオキシダーゼ２．５μｇ
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）〕５０μｌを添加し、３７℃、３０分間反応させた
後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したメチ
オニンを定量した。メチオニンアミノペプチダーゼ活性
を有するコロニーよりプラスミドを調製し、これをプラ
スミドｐＭＡＰ１と命名した。

【００３０】（耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＭＡＰ２Ｔの調製）上記プラス
ミドｐＭＡＰ１についてＢｌｎＩ消化して得られるＤＮ
Ａ断片をｐＵＣ１１８のＸｂａＩサイトに挿入した。こ
の組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、出現
したコロニーについて前述の方法で耐熱性メチオニンア
ミノペプチダーゼ活性を調べた。耐熱性メチオニンアミ
ノペプチダーゼ活性が認められたコロニーよりプラスミ
ドを調製し、これをｐＭＡＰ２Ｔと命名した。

【００３１】（耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＭＡＰ２Ｐの調製）上記プラス
ミドｐＭＡＰ２ＴをＮｏｔＩ、ＢｌｎＩ消化して得られ
る約３．５ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｌｎＩＤＮＡ断片をｐ
ＵＣＮ１９（ｐＵＣ１９をＨｉｎｃIIカットし、Ｎｏｔ
Ｉリンカーを導入したもの）ＮｏｔＩ−ＸｂａＩサイト
に導入した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９
に導入し、出現したコロニーについて前述の方法で耐熱
性メチオニンアミノペプチダーゼ活性を調べた。耐熱性
メチオニンアミノペプチダーゼ活性が認められたコロニ
ーよりプラスミドを調製し、これをｐＭＡＰ２Ｐと命名
した。図１にプラスミドｐＭＡＰ２Ｐの制限酵素地図を
示す。

【００３２】（耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＭＡＰ８の調製）上記プラスミ
ドｐＭＡＰ２ＰをＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ消化後、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を
アガロースゲルより回収した。このＤＮＡ断片をプラス
ミドベクターｐＵＣ１８にＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイト
に利用して導入した。この組換えプラスミドを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入し、出現したコロニーについて前述の方
法で耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ活性を調べ
た。耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ活性が認めら
れたコロニーよりプラスミドを調製し、これをｐＭＡＰ
８と命名した。図２にプラスミドｐＭＡＰ８の制限酵素
地図を示す。プラスミドｐＭＡＰ８で形質転換された大
腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＭ
ＡＰ８と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭＰ−１４３４４として寄託されてい
る。

【００３３】（耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺
伝子の塩基配列の決定）上記プラスミドｐＭＡＰ８に挿
入された耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を
含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を種々の制限酵素で適当
なサイズに断片化し、該断片をプラスミドベクターにサ
ブクローニングした後、各断片の塩基配列を決定した。
塩基配列の決定はＢｃａＢＥＳＴジデオキシシークエン
シングキット（宝酒造社製）を用いたジデオキシ法によ
り行った。配列表の配列番号２にプラスミドｐＭＡＰ８
に挿入された耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す。また、配列表の
配列番号２から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列
番号１に示す。

【００３４】Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＭＡＰ
８は通常の培養条件、例えば１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リット
ル、酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リ
ットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養し、培養終了
後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の
遠心上清を粗酵素液とし、該酵素液を１００℃、１０分
間の熱処理による夾雑蛋白質の変性処理後に遠心処理を
行い、透析処理後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ
イオン交換体にかけ、活性画分を素通りさせた。得られ
た活性画分を、更にＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂイオ
ン交換体にかけ、活性画分を溶出させた。その溶出させ
た活性画分を、耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼの
酵素標品（１）として酵素化学的、及び理化学的性質を
測定した。

【００３５】また、ピロコッカスフリオサスＤＳＭ
３６３８をトリプトン１％、酵母エキス０．５％、可
溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド３．５％、
ジャマリンＳ・リキッド０．５％、ＭｇＳＯ₄ ０．０
０３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄０．０００１％、Ｃａ
Ｃｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ＺｎＳＯ₄ ０．
０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．１ｐｐｍ、Ｋ
Ａｌ（ＳＯ₄）₂ ０．１ｐｐｍ、Ｈ₃ＢＯ₃０．１ｐ
ｐｍ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０．１ｐｐｍ、Ｎｉ
Ｃｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リッ
トルを２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０
℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を
除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時
間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集め
た。集菌体を超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離
を行った後、得られた上清を透析後、その粗酵素液をＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂイオン交換体にかけ、
活性画分を素通りさせ、得られた活性画分をＨＴＰ−カ
ートリッジカラムにかけ活性画分を溶出させた。この処
理によって、得られた粗酵素液を酵素標品（２）として
耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ活性の酵素化学
的、及び理化学的性質を測定した。

【００３６】酵素標品（１）及び（２）の酵素化学的及
び理化学的性質を以下に示す。（１）作用本発明の酵素は、蛋白質、ペプチドのアミノ末端にメチ
オニンが存在する場合、該蛋白質、ペプチドのアミノ末
端メチオニンを生成した。

【００３７】（２）酵素活性測定方法酵素活性の測定はペプチドＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）を基質として用い検定し
た。酵素活性を測定しようとする酵素標品を適度に希釈
し、その酵素溶液５μｌに、０．６２５ｍＭＣｏＣｌ
₂を含む２０ｍＭピペスナトリウム緩衝液〔ｐＨ７．
２（７５℃におけるｐＨ）〕４０μｌを加え、更に８ｍ
ＭＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番
号３）を５μｌ添加し、７５℃で５分間反応させた後、
氷冷し、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を１０μｌ
加えることによって反応を停止させた。その後、遊離し
たメチオニンは、発色試薬５０μｌ〔Ｌ−アミノ酸オキ
シダーゼ１８μｇ、ｏ−ジアニシジン９μｇ、ペルオキ
シダーゼ２．５μｇを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）〕を添加し、３７℃、１０分間反応
させ、３０％酢酸を１０μｌ加えることにより反応を停
止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより
定量する。あるいは、別方法として、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）との反応後、ア
ミノ酸分析を行うことにより、定量を行った。酵素１単
位は７５℃において１分間に１μｍｏｌのメチオニンを
生成する酵素量とした。酵素標品（１）及び（２）は、
測定されたｐＨ７．２、７５℃においてＭｅｔ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３）分解活性を有
していた。

【００３８】（３）至適温度測定には、２ミリ単位の酵素標品を用い、種々の温度で
反応を行った。酵素標品（１）は、図３に示すように測
定されたｐＨ７．２において２０℃〜１００℃の範囲で
活性があり、その至適温度は７０〜９５℃であった。図
３は、酵素標品（１）及び（２）の至適温度を示す図で
あり、縦軸は相対活性率（％）、横軸は反応温度（℃）
を示す。図中、白丸印は酵素標品（１）を、黒丸印は酵
素標品（２）の結果を示す。

【００３９】（４）至適ｐＨ測定には、２．５ミリ単位の酵素標品を用い、活性測定
に用いる緩衝液をｐＨ４．１〜５．１においては２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８〜７．２において
は２０ｍＭピペスナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０〜９．
５においては２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
９．９〜１０．６においては２０ｍＭリン酸水素二ナト
リウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いて調製し、使用
した（それぞれのｐＨは、７５℃におけるｐＨであり、
すべて０．６２５ｍＭＣｏＣｌ₂を含む）。酵素標品
（１）及び（２）は、図４に示すようにｐＨ７．０〜
８．５付近で最大活性を示した。図４は酵素標品（１）
及び（２）の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は相対活性
率（％）、横軸はｐＨを示す。図中、白丸印は酵素標品
（１）を、黒丸印は酵素標品（２）の結果を示す。

【００４０】（５）温度安定性７５ミリ単位の酵素を含み、０．５ｍＭＣｏＣｌ₂を
含んだ１７．５ｍＭ各緩衝液を７５℃で種々の時間処理
した後、その一部を用いて残存する酵素活性を測定し
た。図５に示すように酵素標品（１）、及び（２）は７
５℃、１時間処理した後でも９５％以上の活性を保持し
ていた。図５は、酵素標品（１）、及び（２）の７５℃
における温度安定性を示す図であり、縦軸は残存活性率
（％）、横軸に熱処理時間を示す。図中、白丸印は酵素
標品（１）を、黒丸印は酵素標品（２）の結果を示す。

【００４１】（６）ｐＨ安定性１６ミリ単位の酵素を含み、０．５ｍＭＣｏＣｌ₂を
含んだ各ｐＨの緩衝液を７５℃で１時間処理した後、そ
の一部を用いて残存する酵素活性を測定した。緩衝液と
してｐＨ４．１〜５．１においては２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ５．８〜７．２においては２０ｍＭピ
ペスナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０〜９．５においては
２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．９〜１０．
６においては２０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液を用いてそれぞれ測定を行った。図６
に示すようにｐＨ４．１〜１０．６の間では、７５℃、
１時間の処理後も８５％以上の活性を保持していた。図
６は、本発明により得られる酵素標品（１）、及び
（２）のｐＨ安定性を示す図であり、縦軸は残存活性率
（％）、横軸にｐＨを示す。図中、白丸印は酵素標品
（１）を、黒丸印は酵素標品（２）の結果を示す。

【００４２】（７）分子量本発明により得られる酵素標品（１）は、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によ
り、約３７，０００を示す。

【００４３】（８）各種試薬の影響酵素標品（１）及び（２）をそれぞれ２ミリ単位用い、
各種試薬の存在下で酵素活性の測定を行った。終濃度
０．２ｍＭのＥＤＴＡを加えた場合、活性が見られなか
った。また、終濃度０．２ｍＭ〜５ｍＭのＣｏＣｌ₂を
添加した場合には、酵素活性の上昇が見られ、ＭｎＣｌ
₂添加によっても上昇が見られた。

【００４４】

【発明の効果】本発明により極めて高い耐熱性を有する
メチオニンアミノペプチダーゼ、及び該酵素をコードす
る遺伝子が得られた。該遺伝子を用い、耐熱性メチオニ
ンアミノペプチダーゼが高純度で大量に供給できる。

【００４５】

【配列表】

【００４６】配列番号：1 配列の長さ：295 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Met Asp Thr Glu Lys Leu Met Lys Ala Gly Glu Ile Ala Lys Lys 1 5 10 15 Val Arg Glu Lys Ala Ile Lys Leu Ala Arg Pro Gly Met Leu Leu 20 25 30 Leu Glu Leu Ala Glu Ser Ile Glu Lys Met Ile Met Glu Leu Gly 35 40 45 Gly Lys Pro Ala Phe Pro Val Asn Leu Ser Ile Asn Glu Ile Ala 50 55 60 Ala His Tyr Thr Pro Tyr Lys Gly Asp Thr Thr Val Leu Lys Glu 65 70 75 Gly Asp Tyr Leu Lys Ile Asp Val Gly Val His Ile Asp Gly Phe 80 85 90 Ile Ala Asp Thr Ala Val Thr Val Arg Val Gly Met Glu Glu Asp 95 100 105 Glu Leu Met Glu Ala Ala Lys Glu Ala Leu Asn Ala Ala Ile Ser 110 115 120 Val Ala Arg Ala Gly Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Lys Ala Ile 125 130 135 Glu Asn Glu Ile Arg Lys Arg Gly Phe Lys Pro Ile Val Asn Leu 140 145 150 Ser Gly His Lys Ile Glu Arg Tyr Lys Leu His Ala Gly Ile Ser 155 160 165 Ile Pro Asn Ile Tyr Arg Pro His Asp Asn Tyr Val Leu Lys Glu 170 175 180 Gly Asp Val Phe Ala Ile Glu Pro Phe Ala Thr Ile Gly Ala Gly 185 190 195 Gln Val Ile Glu Val Pro Pro Thr Leu Ile Tyr Met Tyr Val Arg 200 205 210 Asp Val Pro Val Arg Val Ala Gln Ala Arg Phe Leu Leu Ala Lys 215 220 225 Ile Lys Arg Glu Tyr Gly Thr Leu Pro Phe Ala Tyr Arg Trp Leu 230 235 240 Gln Asn Asp Met Pro Glu Gly Gln Leu Lys Leu Ala Leu Lys Thr 245 250 255 Leu Glu Lys Ala Gly Ala Ile Tyr Gly Tyr Pro Val Leu Lys Glu 260 265 270 Ile Arg Asn Gly Ile Val Ala Gln Phe Glu His Thr Ile Ile Val 275 280 285 Glu Lys Asp Ser Val Ile Val Thr Thr Glu 290 295

【００４７】配列番号：2 配列の長さ：885 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA アンチセンス：NO 配列： ATGGATACTG AAAAACTTAT GAAAGCCGGA GAAATAGCAA AAAAAGTAAG AGAGAAAGCT 60 ATTAAACTTG CTAGACCTGG GATGTTGTTG TTAGAACTTG CAGAGTCTAT AGAAAAGATG 120 ATAATGGAAC TTGGGGGTAA ACCTGCTTTC CCAGTAAATT TATCAATTAA TGAAATTGCA 180 GCTCACTATA CTCCTTACAA GGGAGATACT ACTGTTCTGA AAGAGGGGGA TTATCTAAAG 240 ATCGACGTGG GGGTTCACAT AGATGGATTT ATAGCAGATA CTGCAGTTAC AGTTAGAGTA 300 GGGATGGAAG AAGATGAGCT TATGGAGGCT GCCAAGGAAG CGTTAAACGC CGCAATTTCT 360 GTAGCTAGGG CGGGAGTGGA GATAAAGGAA CTAGGAAAGG CAATAGAAAA TGAAATTAGG 420 AAGAGAGGAT TCAAACCAAT AGTTAATCTA AGTGGGCACA AGATAGAAAG ATACAAGCTT 480 CATGCAGGGA TTAGCATTCC GAACATTTAT AGACCGCATG ATAACTATGT TTTAAAGGAA 540 GGAGATGTTT TCGCAATTGA GCCTTTCGCT ACTATAGGTG CTGGTCAAGT AATTGAGGTT 600 CCCCCAACCT TAATCTACAT GTACGTTAGA GATGTTCCAG TTAGAGTGGC CCAAGCTAGG 660 TTCCTTTTGG CTAAGATAAA AAGGGAATAT GGAACCCTAC CCTTTGCCTA TAGGTGGCTT 720 CAGAATGACA TGCCAGAAGG ACAGCTTAAG TTGGCCCTAA AAACCCTCGA AAAGGCTGGA 780 GCTATATATG GCTATCCAGT GCTTAAAGAA ATTAGAAATG GCATTGTGGC ACAATTTGAG 840 CACACAATCA TTGTTGAAAA GGATTCTGTG ATAGTGACGA CAGAA 885

【００４８】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００４９】配列番号：4 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＭＡＰ２Ｐの制限酵素地図を示す
図である。

【図２】プラスミドｐＭＡＰ８の制限酵素地図を示す図
である。

【図３】本発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
の酵素標品の至適温度を示す図である。

【図４】本発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
の酵素標品の至適ｐＨを示す図である。

【図５】本発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
の酵素標品の温度安定性を示す図である。

【図４】本発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
の酵素標品のｐＨ安定性を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１０月３１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図６】本発明の耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ
の酵素標品のｐＨ安定性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者綱澤進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】７５℃で６０分間処理したとき約９５％
以上の残存活性を保持していることを特徴とする耐熱性
メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項２】請求項１に記載の耐熱性メチオニンアミ
ノペプチダーゼをコードする、単離された耐熱性メチオ
ニンアミノペプチダーゼ遺伝子。
【請求項３】配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列、又はその一部であって、かつ、耐熱性メチオニン
アミノペプチダーゼ酵素活性を有する部分をコードする
請求項２記載の単離された耐熱性メチオニンアミノペプ
チダーゼ遺伝子。
【請求項４】配列表の配列番号２で表される塩基配
列、又はその一部を有することを特徴とする請求項３記
載の耐熱性メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子。
【請求項５】請求項３記載の遺伝子にハイブリダイズ
可能な、請求項２記載の耐熱性メチオニンアミノペプチ
ダーゼ遺伝子。
【請求項６】請求項２記載の耐熱性メチオニンアミノ
ペプチダーゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導
入した形質転換体を培養し、該培養物から耐熱性メチオ
ニンアミノペプチダーゼを採取することを特徴とする耐
熱性メチオニンアミノペプチダーゼの製造方法。