JPH089985A - チアミン二リン酸の製造法 - Google Patents
チアミン二リン酸の製造法Info
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- JPH089985A JPH089985A JP6150847A JP15084794A JPH089985A JP H089985 A JPH089985 A JP H089985A JP 6150847 A JP6150847 A JP 6150847A JP 15084794 A JP15084794 A JP 15084794A JP H089985 A JPH089985 A JP H089985A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 チアミン二リン酸の製造法
【構成】 チアミンピロホスホキナーゼ活性を有する微
生物の菌体、培養液またはそれらの処理物の存在下、該
培養物中もしくは水性媒体中でチアミンとＡＴＰとを反
応させ、該培養物中もしくは水性媒体中より生成したチ
アミン二リン酸を採取することを特徴とするチアミン二
リン酸の製造法。
生物の菌体、培養液またはそれらの処理物の存在下、該
培養物中もしくは水性媒体中でチアミンとＡＴＰとを反
応させ、該培養物中もしくは水性媒体中より生成したチ
アミン二リン酸を採取することを特徴とするチアミン二
リン酸の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はチアミン二リン酸（以
下、ＴＰＰと略す）の製造法に関する。ＴＰＰはチアミ
ン（ビタミンＢ1）の補酵素型であり、栄養剤原料、各
種医薬品原料としての用途がある。また、生化学試薬と
しても重要な物質である。
下、ＴＰＰと略す）の製造法に関する。ＴＰＰはチアミ
ン（ビタミンＢ1）の補酵素型であり、栄養剤原料、各
種医薬品原料としての用途がある。また、生化学試薬と
しても重要な物質である。
【０００２】
【従来の技術】ＴＰＰの製造方法としては、チアミンを
化学的にリン酸化する方法が多数知られている［英国特
許687673号、Journal of the American Chemical Socie
ty 60,2263 (1938)、同誌 63, 1160 (1941)、特公昭49-
14751号公報など］。また、チアミンキナーゼ、チアミ
ン一リン酸キナーゼの２種類の酵素を利用して、酵素反
応によりチアミンをリン酸化する方法も報告されている
［特開平3-210190号公報］。
化学的にリン酸化する方法が多数知られている［英国特
許687673号、Journal of the American Chemical Socie
ty 60,2263 (1938)、同誌 63, 1160 (1941)、特公昭49-
14751号公報など］。また、チアミンキナーゼ、チアミ
ン一リン酸キナーゼの２種類の酵素を利用して、酵素反
応によりチアミンをリン酸化する方法も報告されている
［特開平3-210190号公報］。
【０００３】しかしながら、化学的な合成法を用いた場
合には、目的物以外の各種リン酸エステルの混合物が生
成するため、複雑な精製工程を必要とし、収率が極めて
低くなり、チアミンキナーゼ、チアミン一リン酸キナー
ゼの２種類の酵素を利用した場合には、両酵素の反応至
適条件の違いから、チアミン一リン酸が副生し、収率も
低くなり、いずれも工業化が困難である。
合には、目的物以外の各種リン酸エステルの混合物が生
成するため、複雑な精製工程を必要とし、収率が極めて
低くなり、チアミンキナーゼ、チアミン一リン酸キナー
ゼの２種類の酵素を利用した場合には、両酵素の反応至
適条件の違いから、チアミン一リン酸が副生し、収率も
低くなり、いずれも工業化が困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、一段
階の酵素反応によりチアミンからＴＰＰを工業的に効率
良く製造する方法を提供することにある。
階の酵素反応によりチアミンからＴＰＰを工業的に効率
良く製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、パラコ
ッカス(Paracoccus)属に属する微生物、またはパラコッ
カス(Paracoccus)属に属する微生物に由来しチアミン二
リン酸の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含
む組換え体ＤＮＡを保有する微生物であり、かつチアミ
ンとアデノシン−５’−三リン酸とからチアミン二リン
酸を生成する反応を触媒する活性を有する微生物の菌
体、培養液またはそれらの処理物の存在下、該培養物中
もしくは水性媒体中でチアミンとアデノシン−５’−三
リン酸（以下、ＡＴＰと略す）とを反応させ、該培養物
中もしくは水性媒体中より生成したＴＰＰを採取するこ
とを特徴とするＴＰＰの製造法を提供することができ
る。
ッカス(Paracoccus)属に属する微生物、またはパラコッ
カス(Paracoccus)属に属する微生物に由来しチアミン二
リン酸の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含
む組換え体ＤＮＡを保有する微生物であり、かつチアミ
ンとアデノシン−５’−三リン酸とからチアミン二リン
酸を生成する反応を触媒する活性を有する微生物の菌
体、培養液またはそれらの処理物の存在下、該培養物中
もしくは水性媒体中でチアミンとアデノシン−５’−三
リン酸（以下、ＡＴＰと略す）とを反応させ、該培養物
中もしくは水性媒体中より生成したＴＰＰを採取するこ
とを特徴とするＴＰＰの製造法を提供することができ
る。
【０００６】パラコッカス(Paracoccus)属に属する微生
物としては、チアミンとＡＴＰとからＴＰＰを生成する
反応を触媒することができる微生物であればいずれの微
生物でも使用できる。具体的な例としてはパラコッカス
・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans) Ａ
ＴＣＣ１９３６７株をあげることができる。組換え体Ｄ
ＮＡを保有する微生物としては、パラコッカス(Paracoc
cus)属に属する微生物由来のチアミン二リン酸の合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をベクターに組み込
んで得られる組換え体ＤＮＡで宿主微生物を形質転換す
ることによって得られる微生物があげられる。
物としては、チアミンとＡＴＰとからＴＰＰを生成する
反応を触媒することができる微生物であればいずれの微
生物でも使用できる。具体的な例としてはパラコッカス
・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans) Ａ
ＴＣＣ１９３６７株をあげることができる。組換え体Ｄ
ＮＡを保有する微生物としては、パラコッカス(Paracoc
cus)属に属する微生物由来のチアミン二リン酸の合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をベクターに組み込
んで得られる組換え体ＤＮＡで宿主微生物を形質転換す
ることによって得られる微生物があげられる。
【０００７】ＤＮＡ断片としては、配列番号１で表され
るアミノ酸をコードするＤＮＡ、配列番号２または配列
番号３で表されるＤＮＡおよびこれらにハイブリダイズ
するＤＮＡをあげることができる。本発明で用いられる
宿主微生物としては、組換え体ＤＮＡ取り込み能を有
し、tpk遺伝子を発現できる微生物であればいずれでも
よく、エッシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバク
ター(Enterobacter)属、シュードモナス(Pseudomonas)
属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属あるいは
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属などに属する微
生物があげられる。好適にはエッシェリヒア・コリ(Esc
herichia coli)Ｋ−１２株系統のＬＥ３９２株をあげる
ことができる。本発明で用いられるベクターとしては、
エッシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(En
terobacter)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリ
ネバクテリウム(Corynebacterium)属あるいはブレビバ
クテリウム(Brevibacterium)属などに属する微生物中で
自立複製できるものであれば、ファージ・ベクター、プ
ラスミド・ベクターなどいずれでも用いることができ
る。好適にはｐＢＲ３２２［F.Bolivarら; Gene, 2, 95
(1977)］、ｐＵＣ１９［C.Yanisch-Perronら; Gene, 3
3, 103 (1985)］などをあげることができる。
るアミノ酸をコードするＤＮＡ、配列番号２または配列
番号３で表されるＤＮＡおよびこれらにハイブリダイズ
するＤＮＡをあげることができる。本発明で用いられる
宿主微生物としては、組換え体ＤＮＡ取り込み能を有
し、tpk遺伝子を発現できる微生物であればいずれでも
よく、エッシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバク
ター(Enterobacter)属、シュードモナス(Pseudomonas)
属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属あるいは
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属などに属する微
生物があげられる。好適にはエッシェリヒア・コリ(Esc
herichia coli)Ｋ−１２株系統のＬＥ３９２株をあげる
ことができる。本発明で用いられるベクターとしては、
エッシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(En
terobacter)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリ
ネバクテリウム(Corynebacterium)属あるいはブレビバ
クテリウム(Brevibacterium)属などに属する微生物中で
自立複製できるものであれば、ファージ・ベクター、プ
ラスミド・ベクターなどいずれでも用いることができ
る。好適にはｐＢＲ３２２［F.Bolivarら; Gene, 2, 95
(1977)］、ｐＵＣ１９［C.Yanisch-Perronら; Gene, 3
3, 103 (1985)］などをあげることができる。
【０００８】tpk遺伝子ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡは試験管内で両ＤＮＡを同一切断末端
を与える制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで連結
反応を行うことによって種々の組換え体混成物と共に得
ることができる。得られた組換え体混成物を用いて、宿
主微生物を形質転換し、tpk遺伝子ＤＮＡ断片を含む組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換株を選択し、その株よ
り組換え体ＤＮＡを取得することができる。
の組換え体ＤＮＡは試験管内で両ＤＮＡを同一切断末端
を与える制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで連結
反応を行うことによって種々の組換え体混成物と共に得
ることができる。得られた組換え体混成物を用いて、宿
主微生物を形質転換し、tpk遺伝子ＤＮＡ断片を含む組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換株を選択し、その株よ
り組換え体ＤＮＡを取得することができる。
【０００９】形質転換法としては公知の方法、〔T.Mani
atis et al.; モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning), コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー(1982)、S.Cohen et al.; プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミィ・サイエンス(Proc. Natl.
Acad. Sci.) USA,69, 2110 (1972)〕などに従って行う
ことができる。
atis et al.; モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning), コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー(1982)、S.Cohen et al.; プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミィ・サイエンス(Proc. Natl.
Acad. Sci.) USA,69, 2110 (1972)〕などに従って行う
ことができる。
【００１０】tpk遺伝子ＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮ
Ａを保有する形質転換株の選択法としては、直接形質転
換株の該酵素活性を測定する方法もあるが、より効率的
方法としてＴＰＰの合成に関与する遺伝子に変異を生じ
た突然変異株を利用し、ＴＰＰ要求性を相補する形質転
換株を取得することにより得ることができる。得られた
形質転換株を含め微生物の有するチアミンピロホスホキ
ナーゼ活性は以下の方法により測定する。
Ａを保有する形質転換株の選択法としては、直接形質転
換株の該酵素活性を測定する方法もあるが、より効率的
方法としてＴＰＰの合成に関与する遺伝子に変異を生じ
た突然変異株を利用し、ＴＰＰ要求性を相補する形質転
換株を取得することにより得ることができる。得られた
形質転換株を含め微生物の有するチアミンピロホスホキ
ナーゼ活性は以下の方法により測定する。
【００１１】測定に供する微生物として形質転換株を用
いる場合には、ＬＢ液体培地〔バクトトリプトン（ディ
フコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、
ＮａＣｌ ５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７．２に調
整した培地〕にアンピシリン７５μｇ／ｍｌ添加した培
地（以後、ＬＢＡｐ液体培地と略す）３ｍｌに、それ以
外の微生物ではＬＢ液体培地３ｍｌに、１白金耳接種
し、３０℃で一晩振盪培養する。この培養液０．８ｍｌ
を同組成の液体培地４０ｍｌに接種し、パラコッカス(P
aracoccus)属に属する微生物の場合には３０℃で、それ
以外の微生物では３７℃で２０時間振盪培養したのち遠
心分離により菌体を分離する。この菌体に、５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２００ｍｇ／ｍｌの菌体
濃度となるように添加し、懸濁後、超音波処理により菌
体を破砕する。破砕菌体を遠心分離により除去した後の
上清画分を粗酵素液として活性測定に用いる。粗酵素液
５〜６００μｌに反応用緩衝液〔１００ｍＭ トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、トリスと略
す）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ チアミンを含み、塩酸でｐＨ９．０に調
整した緩衝液〕を添加し１ｍｌとした後、４０℃にて静
置し、チアミンからのＴＰＰ生成反応を行う。経時的
（３０、６０、９０および１２０分）に反応液より１０
０μｌ採取し、０．２Ｎ ＨＣｌを１００μｌ添加後、
１００℃、２分間煮沸し遠心分離後上清画分を適宜希釈
し、生成されたＴＰＰを、高速液体クロマトグラフィー
（以後、ＨＰＬＣと略す）を用い定量する。
いる場合には、ＬＢ液体培地〔バクトトリプトン（ディ
フコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、
ＮａＣｌ ５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７．２に調
整した培地〕にアンピシリン７５μｇ／ｍｌ添加した培
地（以後、ＬＢＡｐ液体培地と略す）３ｍｌに、それ以
外の微生物ではＬＢ液体培地３ｍｌに、１白金耳接種
し、３０℃で一晩振盪培養する。この培養液０．８ｍｌ
を同組成の液体培地４０ｍｌに接種し、パラコッカス(P
aracoccus)属に属する微生物の場合には３０℃で、それ
以外の微生物では３７℃で２０時間振盪培養したのち遠
心分離により菌体を分離する。この菌体に、５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２００ｍｇ／ｍｌの菌体
濃度となるように添加し、懸濁後、超音波処理により菌
体を破砕する。破砕菌体を遠心分離により除去した後の
上清画分を粗酵素液として活性測定に用いる。粗酵素液
５〜６００μｌに反応用緩衝液〔１００ｍＭ トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、トリスと略
す）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０、１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ チアミンを含み、塩酸でｐＨ９．０に調
整した緩衝液〕を添加し１ｍｌとした後、４０℃にて静
置し、チアミンからのＴＰＰ生成反応を行う。経時的
（３０、６０、９０および１２０分）に反応液より１０
０μｌ採取し、０．２Ｎ ＨＣｌを１００μｌ添加後、
１００℃、２分間煮沸し遠心分離後上清画分を適宜希釈
し、生成されたＴＰＰを、高速液体クロマトグラフィー
（以後、ＨＰＬＣと略す）を用い定量する。
【００１２】ＨＰＬＣでの分析条件は以下のとおりであ
る。 ＨＰＬＣ分析条件： １）カラム ：Inertosil ODS-2 （ＧＬサイエンス社
製） ２）移動相 ：５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 (10N KOHでpH
6.0に調整） ３）カラム温度：３５℃ ４）流速 ：１ｍｌ／ｍｉｎ ５）サンプル量：２０μｌ ６）検出 ：２５４ｎｍ 紫外部吸収 なお、１分間に１μmolのＴＰＰを精製する酵素活性を
１単位とする。
る。 ＨＰＬＣ分析条件： １）カラム ：Inertosil ODS-2 （ＧＬサイエンス社
製） ２）移動相 ：５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 (10N KOHでpH
6.0に調整） ３）カラム温度：３５℃ ４）流速 ：１ｍｌ／ｍｉｎ ５）サンプル量：２０μｌ ６）検出 ：２５４ｎｍ 紫外部吸収 なお、１分間に１μmolのＴＰＰを精製する酵素活性を
１単位とする。
【００１３】得られた形質転換株の培養は、炭素源、窒
素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常
の合成培地または天然培地を用い、好気的条件下で温
度、ｐＨなどを調節しつつ行われる。培地に用いる炭素
源としては、例えばグルコース、フラクトース、シュク
ロース、マルトース、糖蜜、廃糖蜜、白糠、キャッサ
バ、バガス、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノー
ル、グリセリン、ソルビトールなどのアルコール類、ピ
ルビン酸、乳酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、グルタ
ミン酸、メチオニン、リジンなどのアミノ酸など、該微
生物が資化可能なものであればいずれでも使用できる。
これらの使用濃度は０．５〜３０％が望ましい。
素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常
の合成培地または天然培地を用い、好気的条件下で温
度、ｐＨなどを調節しつつ行われる。培地に用いる炭素
源としては、例えばグルコース、フラクトース、シュク
ロース、マルトース、糖蜜、廃糖蜜、白糠、キャッサ
バ、バガス、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノー
ル、グリセリン、ソルビトールなどのアルコール類、ピ
ルビン酸、乳酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、グルタ
ミン酸、メチオニン、リジンなどのアミノ酸など、該微
生物が資化可能なものであればいずれでも使用できる。
これらの使用濃度は０．５〜３０％が望ましい。
【００１４】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩、
グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミノ
酸、あるいはペプトン、ＮＺアミン、コーン・スティー
プ・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、フィッシュミールあるいはその消化物などの含窒素
有機物などの種々の物が使用できる。これらの使用濃度
は０．５〜１０％が好適である。
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩、
グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミノ
酸、あるいはペプトン、ＮＺアミン、コーン・スティー
プ・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、フィッシュミールあるいはその消化物などの含窒素
有機物などの種々の物が使用できる。これらの使用濃度
は０．５〜１０％が好適である。
【００１５】無機物としては、リン酸二水素カリウム、
リン酸一水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモニウム、硫酸亜鉛などを用いる
ことができる。用いる微生物がビタミン、アミノ酸、ミ
ネラル、核酸など特定の栄養物質を生育に要求する場合
は培地にこれらの物質を適当量添加する。
リン酸一水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモニウム、硫酸亜鉛などを用いる
ことができる。用いる微生物がビタミン、アミノ酸、ミ
ネラル、核酸など特定の栄養物質を生育に要求する場合
は培地にこれらの物質を適当量添加する。
【００１６】培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行う。培養温度は２０〜５０℃が良
く、２８〜４０℃がより好ましい。培養時間は通常１〜
４８時間で終了する。培養中の培地のｐＨはアンモニ
ア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などでほぼ中性に保つ
ことが望ましい。このようにして得られる微生物の培養
物は、そのままでも反応に使用できるし、さらに該培養
物を処理して得られる処理物を反応に用いてもよい。処
理物としては、培養液の濃縮物および乾燥物、界面活性
剤処理物もしくは溶菌酵素処理物さらに培養物を遠心分
離して得られる菌体、凍結菌体、菌体の乾燥物、凍結乾
燥物、界面活性剤処理物、溶媒処理物、酵素処理物、超
音波処理物、機械的磨砕処理物、機械的圧力処理物、菌
体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。
どの好気的条件下で行う。培養温度は２０〜５０℃が良
く、２８〜４０℃がより好ましい。培養時間は通常１〜
４８時間で終了する。培養中の培地のｐＨはアンモニ
ア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などでほぼ中性に保つ
ことが望ましい。このようにして得られる微生物の培養
物は、そのままでも反応に使用できるし、さらに該培養
物を処理して得られる処理物を反応に用いてもよい。処
理物としては、培養液の濃縮物および乾燥物、界面活性
剤処理物もしくは溶菌酵素処理物さらに培養物を遠心分
離して得られる菌体、凍結菌体、菌体の乾燥物、凍結乾
燥物、界面活性剤処理物、溶媒処理物、酵素処理物、超
音波処理物、機械的磨砕処理物、機械的圧力処理物、菌
体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。
【００１７】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝
液、およびメタノール、エタノール等のアルコール類、
酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ア
セトアミド等のアミド類などの有機溶媒を含有した水溶
液があげられる。反応は、微生物の菌体、培養液または
それらの処理物の存在下、培養物中または水性媒体中で
行う。
塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝
液、およびメタノール、エタノール等のアルコール類、
酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ア
セトアミド等のアミド類などの有機溶媒を含有した水溶
液があげられる。反応は、微生物の菌体、培養液または
それらの処理物の存在下、培養物中または水性媒体中で
行う。
【００１８】tpk遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡを保
有する微生物の菌体および該微生物の培養物の処理物を
用いる場合、その濃度は通常湿菌体として５〜２００ｇ
／ｌであることが望ましい。反応に用いられるチアミン
およびＡＴＰの濃度は、それぞれ０．１〜３０ｇ／ｌ、
０．１〜１００ｇ／ｌである。
有する微生物の菌体および該微生物の培養物の処理物を
用いる場合、その濃度は通常湿菌体として５〜２００ｇ
／ｌであることが望ましい。反応に用いられるチアミン
およびＡＴＰの濃度は、それぞれ０．１〜３０ｇ／ｌ、
０．１〜１００ｇ／ｌである。
【００１９】ＡＴＰ源としては、高度精製品のほか、ア
デニンをエネルギー供与体存在下に微生物菌体と接触さ
せることにより得られるＡＴＰ含有液（特開昭59-5179
9）、またはその菌体除去液、さらにはそれらの濃縮液
などを用いることもできる。さらに、ＡＴＰ再生活性を
有する微生物（特開昭61-74595）を反応系に加えグルコ
ースと無機リン酸からＡＴＰを合成供給することもでき
る。この場合には、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ前駆体、Ａ
ＴＰ再生エネルギー供与体、リン酸基供与体およびＡＴ
Ｐ生合成活性を有する微生物を反応液中に存在させる。
ここで用いるＡＴＰ再生活性を有する菌株としてはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス（旧名ブレビバクテ
リウム・アンモニアゲネス：International Journal of
Systematic Bacteriology, 34,442(1987))に記載）ATC
C21170 株があげられる。ＡＴＰ再生活性を有する微生
物の培養は特開昭61-74595に記載された方法で行うこと
ができる。
デニンをエネルギー供与体存在下に微生物菌体と接触さ
せることにより得られるＡＴＰ含有液（特開昭59-5179
9）、またはその菌体除去液、さらにはそれらの濃縮液
などを用いることもできる。さらに、ＡＴＰ再生活性を
有する微生物（特開昭61-74595）を反応系に加えグルコ
ースと無機リン酸からＡＴＰを合成供給することもでき
る。この場合には、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ前駆体、Ａ
ＴＰ再生エネルギー供与体、リン酸基供与体およびＡＴ
Ｐ生合成活性を有する微生物を反応液中に存在させる。
ここで用いるＡＴＰ再生活性を有する菌株としてはコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス（旧名ブレビバクテ
リウム・アンモニアゲネス：International Journal of
Systematic Bacteriology, 34,442(1987))に記載）ATC
C21170 株があげられる。ＡＴＰ再生活性を有する微生
物の培養は特開昭61-74595に記載された方法で行うこと
ができる。
【００２０】反応は、温度２０〜５０℃、ｐＨ６〜１０
で１〜７２時間行う。必要に応じて、菌体処理あるいは
反応時に界面活性剤や有機溶剤を添加する。界面活性剤
としては、ポリオキシエチレン・ステアリルアミン（例
えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）、セチルト
リメチルアンモニウムブロマイド、セチルピリジウムク
ロライド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２─４０Ｅなどの
カチオン性界面活性剤、ナトリウムラウリル硫酸、ナト
リウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラ
ピゾール８０などのアニオン系界面活性剤、ポリオキシ
エチレンソルビタン・モノステアレート（例えばノニオ
ンＳＴ２２１、日本油脂社製）などの非イオン性界面活
性剤、ラウリルベタイン（例えばアノンＢＦ、日本油脂
社製）などの両性界面活性剤などが用いられ、これらは
通常０．１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは１〜２０ｇ／ｌの
濃度で用いられる。
で１〜７２時間行う。必要に応じて、菌体処理あるいは
反応時に界面活性剤や有機溶剤を添加する。界面活性剤
としては、ポリオキシエチレン・ステアリルアミン（例
えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）、セチルト
リメチルアンモニウムブロマイド、セチルピリジウムク
ロライド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２─４０Ｅなどの
カチオン性界面活性剤、ナトリウムラウリル硫酸、ナト
リウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラ
ピゾール８０などのアニオン系界面活性剤、ポリオキシ
エチレンソルビタン・モノステアレート（例えばノニオ
ンＳＴ２２１、日本油脂社製）などの非イオン性界面活
性剤、ラウリルベタイン（例えばアノンＢＦ、日本油脂
社製）などの両性界面活性剤などが用いられ、これらは
通常０．１〜５０ｇ／ｌ、好ましくは１〜２０ｇ／ｌの
濃度で用いられる。
【００２１】有機溶剤としては、トルエン、キシレン、
アセトン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルな
どが用いられる。通常０．１〜５０μl／ｍｌ、好まし
くは１〜２０μl／ｍｌの濃度で用いられる。培養物中
または水性媒体中からＴＰＰを回収する方法としては、
公知のイオン交換樹脂法、活性炭吸着法、溶媒抽出沈澱
法などを用いることができる。
アセトン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルな
どが用いられる。通常０．１〜５０μl／ｍｌ、好まし
くは１〜２０μl／ｍｌの濃度で用いられる。培養物中
または水性媒体中からＴＰＰを回収する方法としては、
公知のイオン交換樹脂法、活性炭吸着法、溶媒抽出沈澱
法などを用いることができる。
【００２２】以下に本発明の実施例を示す。
【００２３】
実施例１ tpk遺伝子のクローニング （１）tpk遺伝子のクローン化のための宿主微生物の作
製 宿主微生物として、ＴＰＰの生合成系に関与する遺伝子
ホスホメチルピリミジンキナーゼ遺伝子(thiD)およびチ
アミンモノリン酸キナーゼ遺伝子(thiL)、チアミンの資
化に関与するチアミンキナーゼ遺伝子(thiK)の３つの遺
伝子に変異を持つ、エッシェリヒア・コリ(Escherichia
coli)のＴＰＰ栄養要求性変異株を利用した。
製 宿主微生物として、ＴＰＰの生合成系に関与する遺伝子
ホスホメチルピリミジンキナーゼ遺伝子(thiD)およびチ
アミンモノリン酸キナーゼ遺伝子(thiL)、チアミンの資
化に関与するチアミンキナーゼ遺伝子(thiK)の３つの遺
伝子に変異を持つ、エッシェリヒア・コリ(Escherichia
coli)のＴＰＰ栄養要求性変異株を利用した。
【００２４】ＴＰＰ栄養要求性変異株は培地中にチアミ
ンが存在していてもＴＰＰが存在しなければ生育できな
いが、チアミンピロホスホキナーゼ活性を有するように
なった該微生物は、チアミンのみ培地中に存在すればチ
アミンピロホスホキナーゼによりチアミンからＴＰＰが
生成されるため生育できるようになる。本実施例におい
ては、中山らにより作製されたＴＰＰ要求性を有するエ
ッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＮＩ５１２株
（H.Nakayamaら；J.Bacteriol.,151,708(1982)）（遺伝
子型：F-, argG6, metB1, his-1, leu-6, trp-31, gal-
6,lacY1, rpsL104, thiD1, thiK1,thiL3）に、Ｐ１ファ
ージを用いた形質導入法（J.H.Miller, Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(197
2)）を用いて、hsdR変異を付与することにより、宿主制
限系を解除した株ＡＩ１１０２を得、これを宿主微生物
として用いた。
ンが存在していてもＴＰＰが存在しなければ生育できな
いが、チアミンピロホスホキナーゼ活性を有するように
なった該微生物は、チアミンのみ培地中に存在すればチ
アミンピロホスホキナーゼによりチアミンからＴＰＰが
生成されるため生育できるようになる。本実施例におい
ては、中山らにより作製されたＴＰＰ要求性を有するエ
ッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＮＩ５１２株
（H.Nakayamaら；J.Bacteriol.,151,708(1982)）（遺伝
子型：F-, argG6, metB1, his-1, leu-6, trp-31, gal-
6,lacY1, rpsL104, thiD1, thiK1,thiL3）に、Ｐ１ファ
ージを用いた形質導入法（J.H.Miller, Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(197
2)）を用いて、hsdR変異を付与することにより、宿主制
限系を解除した株ＡＩ１１０２を得、これを宿主微生物
として用いた。
【００２５】宿主制限系の解除された株は、ＬＢ液体培
地で３０℃、２０時間培養後、該培養菌体液をエッシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli)Ｃ６００ｒ-ｍ-株( AT
CC33525)より公知の方法（J.H.Miller, Experiments in
Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab. (197
2)）で調製したλファージと同一ＬＢ平板培地（ＬＢ液
体培地にディフコ社製寒天１．５％添加）上に塗布し培
養すると、溶菌することにより検出できる。 （２）ショットガン法によるtpk遺伝子のクローニング パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitr
ificans) ＡＴＣＣ１９３６７を１白金耳、１０ｍｌの
ＬＢ培地に植菌し、３０℃で２０時間培養した。得られ
た培養菌体から公知の方法（H.Sato & K.I.Miura: Bioc
him. Biophys.Acta., 72, 619 (1963)）に従い染色体Ｄ
ＮＡを分離精製した。
地で３０℃、２０時間培養後、該培養菌体液をエッシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli)Ｃ６００ｒ-ｍ-株( AT
CC33525)より公知の方法（J.H.Miller, Experiments in
Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab. (197
2)）で調製したλファージと同一ＬＢ平板培地（ＬＢ液
体培地にディフコ社製寒天１．５％添加）上に塗布し培
養すると、溶菌することにより検出できる。 （２）ショットガン法によるtpk遺伝子のクローニング パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitr
ificans) ＡＴＣＣ１９３６７を１白金耳、１０ｍｌの
ＬＢ培地に植菌し、３０℃で２０時間培養した。得られ
た培養菌体から公知の方法（H.Sato & K.I.Miura: Bioc
him. Biophys.Acta., 72, 619 (1963)）に従い染色体Ｄ
ＮＡを分離精製した。
【００２６】精製したパラコッカス・デニトリフィカン
ス(Paracoccus denitrificans) の染色体ＤＮＡ ５μg
をEcoRＩ用緩衝液（１００ｍＭ トリス、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、１００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミンを含み、塩酸
を用いｐＨ７．５に調整した緩衝液）４０μｌに溶か
し、２０単位の制限酵素EcoRＩ（宝酒造社製）を加え、
３７℃で２時間消化反応を行った後、６５℃で１０分間
加熱処理することにより反応を停止させた。 この消化
物に蒸留水 １４０μｌ、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．６）２０μｌを添加後、２倍量の水冷したエタノー
ルを加え、−８０℃にて２０分間静置した。静置後、こ
のエタノール混合物中に形成された沈殿を遠心分離によ
り取得した（以下、この方法をエタノール沈澱法と略
す）。この沈澱に２０μｌの蒸留水を加えて沈澱を溶解
した。
ス(Paracoccus denitrificans) の染色体ＤＮＡ ５μg
をEcoRＩ用緩衝液（１００ｍＭ トリス、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、１００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミンを含み、塩酸
を用いｐＨ７．５に調整した緩衝液）４０μｌに溶か
し、２０単位の制限酵素EcoRＩ（宝酒造社製）を加え、
３７℃で２時間消化反応を行った後、６５℃で１０分間
加熱処理することにより反応を停止させた。 この消化
物に蒸留水 １４０μｌ、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．６）２０μｌを添加後、２倍量の水冷したエタノー
ルを加え、−８０℃にて２０分間静置した。静置後、こ
のエタノール混合物中に形成された沈殿を遠心分離によ
り取得した（以下、この方法をエタノール沈澱法と略
す）。この沈澱に２０μｌの蒸留水を加えて沈澱を溶解
した。
【００２７】また、ベクターｐＵＣ１９ ２μｇをEcoR
Ｉ用緩衝液４０μｌ中に溶かし、１０単位のEcoRＩを加
え、３７℃で２時間消化反応を行った後、６５℃で１０
分間加熱処理することにより反応を停止させ、エタノー
ル沈澱法によりプラスミド断片の沈殿を取得した。この
沈殿に１５μｌの蒸留水を加え沈澱を溶解した。この様
にして得たパラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoc
cus denitrificans) の染色体ＤＮＡのEcoRＩ消化断片
とｐＵＣ１９ EcoRＩ消化断片を混合し、Ｔ４リガーゼ
緩衝液〔６６ｍＭ トリス・塩酸緩衝液 (ｐＨ７．６)、
６．６ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ジチオスレイトール
および１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液〕５０μｌおよび２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え、１２
℃で１８時間ＤＮＡの連結反応を行い、組換え体ＤＮＡ
を得た。この組換え体ＤＮＡを用い、エッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)ＡＩ１１０２株をコーエンらの
方法［S.Cohenら; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2
110 (1972) ］により形質転換し、アンピシリン（７５
μｇ／ｍｌ）に耐性で、かつ宿主微生物が示すＴＰＰ要
求性を失った形質転換株を得た。
Ｉ用緩衝液４０μｌ中に溶かし、１０単位のEcoRＩを加
え、３７℃で２時間消化反応を行った後、６５℃で１０
分間加熱処理することにより反応を停止させ、エタノー
ル沈澱法によりプラスミド断片の沈殿を取得した。この
沈殿に１５μｌの蒸留水を加え沈澱を溶解した。この様
にして得たパラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoc
cus denitrificans) の染色体ＤＮＡのEcoRＩ消化断片
とｐＵＣ１９ EcoRＩ消化断片を混合し、Ｔ４リガーゼ
緩衝液〔６６ｍＭ トリス・塩酸緩衝液 (ｐＨ７．６)、
６．６ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ジチオスレイトール
および１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液〕５０μｌおよび２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え、１２
℃で１８時間ＤＮＡの連結反応を行い、組換え体ＤＮＡ
を得た。この組換え体ＤＮＡを用い、エッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)ＡＩ１１０２株をコーエンらの
方法［S.Cohenら; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2
110 (1972) ］により形質転換し、アンピシリン（７５
μｇ／ｍｌ）に耐性で、かつ宿主微生物が示すＴＰＰ要
求性を失った形質転換株を得た。
【００２８】この形質転換株から公知の方法〔モレキュ
ラー・クローニング(Molecular Cloning),T.Maniatis e
t al.コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
(1982)〕でプラスミドを単離し、制限酵素消化とアガロ
ースゲル電気泳動で解析した。得られたプラスミドの大
きさは、４．４キロベースペア（ｋｂｐ）であり、ｐＵ
Ｃ１９のEcoRＩ切断部位に、パラコッカス・デニトリフ
ィカンス(Paracoccus denitrificans) 由来の１．７ｋｂ
ｐのEcoRＩ挿入断片を有していた。このプラスミドをｐ
ＡＩ２１３と命名した。このプラスミドｐＡＩ２１３の
制限酵素切断地図を図１に示す。
ラー・クローニング(Molecular Cloning),T.Maniatis e
t al.コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
(1982)〕でプラスミドを単離し、制限酵素消化とアガロ
ースゲル電気泳動で解析した。得られたプラスミドの大
きさは、４．４キロベースペア（ｋｂｐ）であり、ｐＵ
Ｃ１９のEcoRＩ切断部位に、パラコッカス・デニトリフ
ィカンス(Paracoccus denitrificans) 由来の１．７ｋｂ
ｐのEcoRＩ挿入断片を有していた。このプラスミドをｐ
ＡＩ２１３と命名した。このプラスミドｐＡＩ２１３の
制限酵素切断地図を図１に示す。
【００２９】ｐＡＩ２１３を導入した形質転換株はＭ９
ＣＡＡｐ平板培地（ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１
２Ｈ2Ｏ １４．７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ
2Ｏ １５ｍｇ、グルコース ２ｇ、ビタミンＢ1 １ｍ
ｇ、カザミノ酸 ２ｇ、チアミン １０ｍｇ、アンピシリ
ン７５ｍｇを水１リットルに溶解し、寒天１．５％を加
えたもの）上で生育可能で、ＴＰＰ要求性は認められな
かった。またチアミンピロホスホキナーゼ活性を調べた
ところ、宿主微生物ＡＩ１１０２株では認められないチ
アミンピロホスホキナーゼ活性が、形質転換株には認め
られた。 （３）チアミンピロホスホキナーゼをコードする遺伝子
の塩基配列の決定 ｐＡＩ２１３に含まれるtpk遺伝子のＤＮＡ配列をジデ
オキシ法（F.Sangerら;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
4, 5463 (1977)）により決定した。ＤＮＡ配列より推定
されるチアミンピロホスホキナーゼのアミノ酸配列を配
列番号１に、tpk遺伝子の構造遺伝子領域を配列番号２
に示した。 実施例２ チアミンピロホスホキナーゼ活性高発現微生
物の取得 ｐＡＩ２１３保有株のチアミンピロホスホキナーゼ活性
の発現を強化させるため、ｐＡＩ２１３のtpk遺伝子上
流にエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)のトリプ
トファン生合成酵素遺伝子由来プロモーター（以下、tr
pプロモーターと略す）を接続し、プラスミドｐＴＰＫ
１を作製した。
ＣＡＡｐ平板培地（ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１
２Ｈ2Ｏ １４．７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ
2Ｏ １５ｍｇ、グルコース ２ｇ、ビタミンＢ1 １ｍ
ｇ、カザミノ酸 ２ｇ、チアミン １０ｍｇ、アンピシリ
ン７５ｍｇを水１リットルに溶解し、寒天１．５％を加
えたもの）上で生育可能で、ＴＰＰ要求性は認められな
かった。またチアミンピロホスホキナーゼ活性を調べた
ところ、宿主微生物ＡＩ１１０２株では認められないチ
アミンピロホスホキナーゼ活性が、形質転換株には認め
られた。 （３）チアミンピロホスホキナーゼをコードする遺伝子
の塩基配列の決定 ｐＡＩ２１３に含まれるtpk遺伝子のＤＮＡ配列をジデ
オキシ法（F.Sangerら;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
4, 5463 (1977)）により決定した。ＤＮＡ配列より推定
されるチアミンピロホスホキナーゼのアミノ酸配列を配
列番号１に、tpk遺伝子の構造遺伝子領域を配列番号２
に示した。 実施例２ チアミンピロホスホキナーゼ活性高発現微生
物の取得 ｐＡＩ２１３保有株のチアミンピロホスホキナーゼ活性
の発現を強化させるため、ｐＡＩ２１３のtpk遺伝子上
流にエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)のトリプ
トファン生合成酵素遺伝子由来プロモーター（以下、tr
pプロモーターと略す）を接続し、プラスミドｐＴＰＫ
１を作製した。
【００３０】ｐＡＩ２１３約２μｇを１０ｍＭ トリス
・塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジ
チオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブ
ミンおよび、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液 ２０μ
ｌに溶解し、５単位のＢａｍＨＩを加え、３０℃で１時
間消化反応を行った後、さらに５単位のMaeＩ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）を加え、４５℃で１時間消化
反応を行った。これを０．７％アガロースゲル電気泳動
で分離し、tpk遺伝子を含む０．７５ｋｂｐの位置のゲ
ル断片を切り出し、ＤＮＡ Prep （ダイヤトロン社）を
用いて、この断片より０．７５ｋｂｐ ＤＮＡを回収お
よび精製後、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス
・塩酸および１ｍＭ ＥＤＴＡ・Ｎａ2 、ｐＨ８．０）
に溶解した。MaeＩ切断部位はtpk遺伝子内に存在するた
め、０．７５ｋｂｐ ＤＮＡ断片中のtpk遺伝子は、Ｎ末
アミノ酸９残基が欠失したチアミンピロホスホキナーゼ
をコードしている。
・塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジ
チオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブ
ミンおよび、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液 ２０μ
ｌに溶解し、５単位のＢａｍＨＩを加え、３０℃で１時
間消化反応を行った後、さらに５単位のMaeＩ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）を加え、４５℃で１時間消化
反応を行った。これを０．７％アガロースゲル電気泳動
で分離し、tpk遺伝子を含む０．７５ｋｂｐの位置のゲ
ル断片を切り出し、ＤＮＡ Prep （ダイヤトロン社）を
用いて、この断片より０．７５ｋｂｐ ＤＮＡを回収お
よび精製後、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス
・塩酸および１ｍＭ ＥＤＴＡ・Ｎａ2 、ｐＨ８．０）
に溶解した。MaeＩ切断部位はtpk遺伝子内に存在するた
め、０．７５ｋｂｐ ＤＮＡ断片中のtpk遺伝子は、Ｎ末
アミノ酸９残基が欠失したチアミンピロホスホキナーゼ
をコードしている。
【００３１】ベクターとして、trpプロモーターをもつ
ｐＴｒＳ３１（特開平3-210190）を用いた。プラスミド
ｐＴｒＳ３１にはtrpプロモーターの下流にHindIIIおよ
びBamHIの切断部位が１カ所ずつ存在する。ｐＴｒＳ３
１プラスミドＤＮＡ２μｇを、２０ｍＭ トリス・塩酸
（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ Ｋ
Ｃｌを含む緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素 HindII
I、BamHIをそれぞれ５単位ずつ加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。これを０．７％アガロースゲル電気泳
動で分離し、４．５ｋｂｐの位置のゲル断片を切り出
し、ＤＮＡ Prep （ダイヤトロン社）を用いて４．５ｋ
ｂｐ ＤＮＡを精製し、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し
た。
ｐＴｒＳ３１（特開平3-210190）を用いた。プラスミド
ｐＴｒＳ３１にはtrpプロモーターの下流にHindIIIおよ
びBamHIの切断部位が１カ所ずつ存在する。ｐＴｒＳ３
１プラスミドＤＮＡ２μｇを、２０ｍＭ トリス・塩酸
（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ Ｋ
Ｃｌを含む緩衝液２０μｌに溶かし、制限酵素 HindII
I、BamHIをそれぞれ５単位ずつ加え、３７℃で２時間消
化反応を行った。これを０．７％アガロースゲル電気泳
動で分離し、４．５ｋｂｐの位置のゲル断片を切り出
し、ＤＮＡ Prep （ダイヤトロン社）を用いて４．５ｋ
ｂｐ ＤＮＡを精製し、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し
た。
【００３２】Ｎ末アミノ酸７残基の欠失したチアミンピ
ロホスホキナーゼの欠失部分を補い、ｐＴｒＳ３１プラ
スミドのHindIII切断部位と０．７５ｋｂｐ ＤＮＡのMa
eＩ切断部位とを接続するために、図２に示したリンカ
ーを用いた。リンカー中のチアミンピロホスホキナーゼ
の欠失９アミノ酸残基部分を補う領域の塩基配列は、パ
ラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrif
icans) の染色体由来の配列から、大腸菌の至適コドン
（池村; 細胞工学、５巻３号,212-221頁,(1986)）に相
応する配列へと改変したものを用いた。即ち、パラコッ
カス・デニトリフィカンスのチアミンピロホスホキナー
ゼのＮ末端より２番目のセリン残基、３番目と４番目の
グルタミン残基、５番目のグリシン残基、６番目のスレ
オニン残基、７番目のリジン残基に相当するコドンの３
文字目、および８番目のロイシン残基に相当するコドン
の一文字目を配列番号２に示される塩基から図２に示さ
れる塩基に置換したリンカーを用いた。
ロホスホキナーゼの欠失部分を補い、ｐＴｒＳ３１プラ
スミドのHindIII切断部位と０．７５ｋｂｐ ＤＮＡのMa
eＩ切断部位とを接続するために、図２に示したリンカ
ーを用いた。リンカー中のチアミンピロホスホキナーゼ
の欠失９アミノ酸残基部分を補う領域の塩基配列は、パ
ラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrif
icans) の染色体由来の配列から、大腸菌の至適コドン
（池村; 細胞工学、５巻３号,212-221頁,(1986)）に相
応する配列へと改変したものを用いた。即ち、パラコッ
カス・デニトリフィカンスのチアミンピロホスホキナー
ゼのＮ末端より２番目のセリン残基、３番目と４番目の
グルタミン残基、５番目のグリシン残基、６番目のスレ
オニン残基、７番目のリジン残基に相当するコドンの３
文字目、および８番目のロイシン残基に相当するコドン
の一文字目を配列番号２に示される塩基から図２に示さ
れる塩基に置換したリンカーを用いた。
【００３３】該リンカーの合成にはトリエステル法（R.
Creaら：Proc. Natl. Acad. Sci.,75, 5765(1978)）を
用い、配列番号４で示した一本鎖ＤＮＡ３３塩基と配列
番号５で示した一本鎖ＤＮＡ３１塩基を合成した後、２
μｇずつ水５０μｌ中で混合し、６５℃で１０分間加熱
後、室温に放置してアニーリングを行うことによりリン
カーを取得した。
Creaら：Proc. Natl. Acad. Sci.,75, 5765(1978)）を
用い、配列番号４で示した一本鎖ＤＮＡ３３塩基と配列
番号５で示した一本鎖ＤＮＡ３１塩基を合成した後、２
μｇずつ水５０μｌ中で混合し、６５℃で１０分間加熱
後、室温に放置してアニーリングを行うことによりリン
カーを取得した。
【００３４】パラコッカス・デニトリフィカンス(Parac
occus denitrificans) 由来のtpk遺伝子を含むMaeI、Ba
mHI消化ＤＮＡ断片５μｌにｐＴｒＳ３１の HindIII、B
amHI消化ＤＮＡ断片３μｌ、上記ＤＮＡリンカー２μｌ
および４０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液を加えた後、２単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６
℃、１８時間処理した。この処理液を用いてエッシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)ＡＩ１１０２株をコーエ
ンらの方法［S.Cohenら; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
69, 2110 (1972) ］により形質転換し、Ｍ９ＣＡＡｐ
平板培地に塗布した。３７℃で２４時間培養後、生育し
てきたＴＰＰ非要求性の形質転換株を、ＬＢＡｐ液体培
地 １０ｍｌを含む試験管に植菌した。３７℃で１６時
間振盪培養し、遠心分離して集めた菌体より公知の方法
〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),T.
Maniatis et al.コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー(1982)〕でプラスミドを単離した。この様に
して作製したパラコッカス・デニトリフィカンス(Parac
occus denitrificans) 由来のtpk遺伝子を含むプラスミ
ドをｐＴＰＫ１と命名した。このプラスミドｐＴＰＫ１
の制限酵素切断地図を図３に示す。
occus denitrificans) 由来のtpk遺伝子を含むMaeI、Ba
mHI消化ＤＮＡ断片５μｌにｐＴｒＳ３１の HindIII、B
amHI消化ＤＮＡ断片３μｌ、上記ＤＮＡリンカー２μｌ
および４０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液を加えた後、２単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６
℃、１８時間処理した。この処理液を用いてエッシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)ＡＩ１１０２株をコーエ
ンらの方法［S.Cohenら; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
69, 2110 (1972) ］により形質転換し、Ｍ９ＣＡＡｐ
平板培地に塗布した。３７℃で２４時間培養後、生育し
てきたＴＰＰ非要求性の形質転換株を、ＬＢＡｐ液体培
地 １０ｍｌを含む試験管に植菌した。３７℃で１６時
間振盪培養し、遠心分離して集めた菌体より公知の方法
〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),T.
Maniatis et al.コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー(1982)〕でプラスミドを単離した。この様に
して作製したパラコッカス・デニトリフィカンス(Parac
occus denitrificans) 由来のtpk遺伝子を含むプラスミ
ドをｐＴＰＫ１と命名した。このプラスミドｐＴＰＫ１
の制限酵素切断地図を図３に示す。
【００３５】ｐＴＰＫ１は、trpプロモーターの下流域
に開始コドンを有するチアミンピロホスホキナーゼ構造
遺伝子がリンカーを介して接続された高発現タイプのプ
ラスミドである。ｐＴＰＫ１に含まれるtpk遺伝子のＤ
ＮＡ配列をジデオキシ法（F.Sangerら; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)）により決定した。該t
pk遺伝子の改変構造遺伝子領域を配列番号３に示す。
に開始コドンを有するチアミンピロホスホキナーゼ構造
遺伝子がリンカーを介して接続された高発現タイプのプ
ラスミドである。ｐＴＰＫ１に含まれるtpk遺伝子のＤ
ＮＡ配列をジデオキシ法（F.Sangerら; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)）により決定した。該t
pk遺伝子の改変構造遺伝子領域を配列番号３に示す。
【００３６】パラコッカス・デニトリフィカンス(Parac
occus denitrificans) ＡＴＣＣ１９３６７株、ＡＩ１
１０２／ｐＡＩ２１３株およびＬＥ３９２／ｐＴＰＫ１
株をＬＢＡｐ液体培地で３７℃、１６時間培養後、チア
ミンピロホスホキナーゼ活性を調べた。ＬＥ３９２／ｐ
ＴＰＫ１株は、ＡＩ１１０２／ｐＡＩ２１３株の約１４
０倍の活性を有していた（表１）。
occus denitrificans) ＡＴＣＣ１９３６７株、ＡＩ１
１０２／ｐＡＩ２１３株およびＬＥ３９２／ｐＴＰＫ１
株をＬＢＡｐ液体培地で３７℃、１６時間培養後、チア
ミンピロホスホキナーゼ活性を調べた。ＬＥ３９２／ｐ
ＴＰＫ１株は、ＡＩ１１０２／ｐＡＩ２１３株の約１４
０倍の活性を有していた（表１）。
【００３７】
【表１】
【００３８】該菌株は、平成６年６月８日付でFERM BP-
４６９２として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。 実施例３ パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoc
cus denitrificans) ＡＴＣＣ１９３６７株の菌体を用
いたチアミンとＡＴＰからのＴＰＰの生産 ポリペプトン（大五栄養化学社製） １０ｇ／ｌ、肉エ
キス ７ｇ／ｌ、イーストエキス（大五栄養化学社製）
５ｇ／ｌおよびＮａＣｌ ３ｇ／ｌ（苛性ソーダでｐＨ
７．２に調整）の組成からなる液体培地を大型試験管に
１０ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌後、
該液体培地にパラコッカス・デニトリフィカンス(Parac
occus denitrificans)ＡＴＣＣ１９３６７株を一白金耳
接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２０時間振盪培養し
た。培養後、培養液を遠心分離することにより菌体を取
得し、４００ｇ／ｌ湿重量となるように１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）を加え懸濁した。
４６９２として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。 実施例３ パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoc
cus denitrificans) ＡＴＣＣ１９３６７株の菌体を用
いたチアミンとＡＴＰからのＴＰＰの生産 ポリペプトン（大五栄養化学社製） １０ｇ／ｌ、肉エ
キス ７ｇ／ｌ、イーストエキス（大五栄養化学社製）
５ｇ／ｌおよびＮａＣｌ ３ｇ／ｌ（苛性ソーダでｐＨ
７．２に調整）の組成からなる液体培地を大型試験管に
１０ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌後、
該液体培地にパラコッカス・デニトリフィカンス(Parac
occus denitrificans)ＡＴＣＣ１９３６７株を一白金耳
接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２０時間振盪培養し
た。培養後、培養液を遠心分離することにより菌体を取
得し、４００ｇ／ｌ湿重量となるように１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）を加え懸濁した。
【００３９】この懸濁液１．２５ｍｌを大型試験管に入
れ、チアミン塩酸塩 ２５ｍｇ、ＡＴＰ ０．１ｇ、硫酸
マグネシウム ２５ｍｇ、０．３Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）０．５ｍｌ、ナイミーン Ｓ−２１５（日本油
脂社製）２０ｍｇおよびキシレン ０．０５ｍｌを添加
し、蒸留水を加え全量を５ｍｌとした。この混合液を１
００ｒｐｍで振盪撹拌しながら３０℃で反応を行った。
その結果、反応４６時間目にＴＰＰが７７μＭ生成され
た。 実施例４ エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｌ
Ｅ３９２／ｐＴＰＫ１株の菌体を用いたチアミンとＡＴ
ＰからのＴＰＰの生産 実施例２で得たエッシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)ＬＥ３９２／ｐＴＰＫ１株を、ＬＢＡｐ液体培地に接
種し、３７℃にて２０時間振盪培養した後、培養液を遠
心分離し、菌体を取得した。
れ、チアミン塩酸塩 ２５ｍｇ、ＡＴＰ ０．１ｇ、硫酸
マグネシウム ２５ｍｇ、０．３Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）０．５ｍｌ、ナイミーン Ｓ−２１５（日本油
脂社製）２０ｍｇおよびキシレン ０．０５ｍｌを添加
し、蒸留水を加え全量を５ｍｌとした。この混合液を１
００ｒｐｍで振盪撹拌しながら３０℃で反応を行った。
その結果、反応４６時間目にＴＰＰが７７μＭ生成され
た。 実施例４ エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｌ
Ｅ３９２／ｐＴＰＫ１株の菌体を用いたチアミンとＡＴ
ＰからのＴＰＰの生産 実施例２で得たエッシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)ＬＥ３９２／ｐＴＰＫ１株を、ＬＢＡｐ液体培地に接
種し、３７℃にて２０時間振盪培養した後、培養液を遠
心分離し、菌体を取得した。
【００４０】この菌体０．８ｇ（湿菌体重量）を２００
ｍｌ容ビーカーに入れ、チアミン２７２ｍｇ、ＡＴＰ
９３６ｍｇ（０、１、５、８時間目に２３４ｍｇずつ添
加）、塩化マグネシュウム ０．１ｇ、１Ｍ トリス・塩
酸（ｐＨ９．０）２ｍｌおよびキシレン ０．２ｍｌを
添加し、蒸留水を加え全量を２０ｍｌとした。この混合
液を３００ｒｐｍで撹拌しながら４０℃で反応を行っ
た。その結果、反応２４時間目にＴＰＰが３０ｍＭ生成
した。 実施例５ チアミンピロホスホキナーゼ活性を有するエ
ッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＬＥ３９２／ｐ
ＴＰＫ１株とＡＴＰ再生活性を有するコリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株との共役系
におけるチアミンからのＴＰＰ生産 （１）チアミンピロホスホキナーゼ活性を有するエッシ
ェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＬＥ３９２／ｐＴＰ
Ｋ１株の菌体調製 実施例２で得たエッシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)ＬＥ３９２／ｐＴＰＫ１株を、ＬＢＡｐ液体培地に接
種し、３７℃で２０時間振盪培養した後、培養液を遠心
分離することにより、菌体を調製した。
ｍｌ容ビーカーに入れ、チアミン２７２ｍｇ、ＡＴＰ
９３６ｍｇ（０、１、５、８時間目に２３４ｍｇずつ添
加）、塩化マグネシュウム ０．１ｇ、１Ｍ トリス・塩
酸（ｐＨ９．０）２ｍｌおよびキシレン ０．２ｍｌを
添加し、蒸留水を加え全量を２０ｍｌとした。この混合
液を３００ｒｐｍで撹拌しながら４０℃で反応を行っ
た。その結果、反応２４時間目にＴＰＰが３０ｍＭ生成
した。 実施例５ チアミンピロホスホキナーゼ活性を有するエ
ッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＬＥ３９２／ｐ
ＴＰＫ１株とＡＴＰ再生活性を有するコリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株との共役系
におけるチアミンからのＴＰＰ生産 （１）チアミンピロホスホキナーゼ活性を有するエッシ
ェリヒア・コリ(Escherichia coli)ＬＥ３９２／ｐＴＰ
Ｋ１株の菌体調製 実施例２で得たエッシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)ＬＥ３９２／ｐＴＰＫ１株を、ＬＢＡｐ液体培地に接
種し、３７℃で２０時間振盪培養した後、培養液を遠心
分離することにより、菌体を調製した。
【００４１】（２）ＡＴＰ再生活性を有するコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株の菌
体の調製 種培養用液体培地１〔グルコース ５０ｇ／ｌ、ポリペ
プトン（大五栄養化学社製） １０ｇ／ｌ、イーストエ
キス（大五栄養化学社製） １０ｇ／ｌ、尿素５ｇ／
ｌ、（ＮＨ4）ＳＯ4 ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイ
ン塩酸塩 ２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム
１０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸
５ｍｇ／ｌおよびビオチン ３０μｇ／ｌ（苛性ソーダ
でｐＨ７．２に調製）の組成からなる液体培地〕を大型
試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間蒸気
殺菌後、該液体培地にコリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスＡＴＣＣ２１１７０株を接種し、２８℃で２４時
間振盪培養した。
テリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株の菌
体の調製 種培養用液体培地１〔グルコース ５０ｇ／ｌ、ポリペ
プトン（大五栄養化学社製） １０ｇ／ｌ、イーストエ
キス（大五栄養化学社製） １０ｇ／ｌ、尿素５ｇ／
ｌ、（ＮＨ4）ＳＯ4 ５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイ
ン塩酸塩 ２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム
１０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸
５ｍｇ／ｌおよびビオチン ３０μｇ／ｌ（苛性ソーダ
でｐＨ７．２に調製）の組成からなる液体培地〕を大型
試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間蒸気
殺菌後、該液体培地にコリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスＡＴＣＣ２１１７０株を接種し、２８℃で２４時
間振盪培養した。
【００４２】この培養液２０ｍｌを上記種培養用培地１
を２３０ｍｌ含む２リットル容バッフル付き三角フラス
コに接種し、２８℃で２４時間振盪培養し種培養液１を
取得した。種培養用液体培地２〔グルコース １００ｇ
／ｌ、肉エキス １０ｇ／ｌ、ポリペプトン １０ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１
ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ２
０ｍｇ／ｌ、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システ
イン塩酸塩 ２０ｍｇ／ｌおよび、ビオチン １００μｇ
／ｌの組成の培地を１２０℃で２０分間蒸気殺菌後、別
途１２０℃で２０分間蒸気殺菌しておいた尿素 ２ｇ／
ｌおよびビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌを添加し、苛性ソーダ
でｐＨ７．２に調製した液体培地〕を２．５リットル含
む５リットル容培養槽に、上記種培養液１を２５０ｍｌ
接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５リットル
／分の培養条件下、濃アンモニア水でｐＨを６．８に調
整しつつ、培養液中のグルコースが消費されるまで培養
を行い、種培養液２を取得した。
を２３０ｍｌ含む２リットル容バッフル付き三角フラス
コに接種し、２８℃で２４時間振盪培養し種培養液１を
取得した。種培養用液体培地２〔グルコース １００ｇ
／ｌ、肉エキス １０ｇ／ｌ、ポリペプトン １０ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．１
ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ２
０ｍｇ／ｌ、β−アラニン １５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システ
イン塩酸塩 ２０ｍｇ／ｌおよび、ビオチン １００μｇ
／ｌの組成の培地を１２０℃で２０分間蒸気殺菌後、別
途１２０℃で２０分間蒸気殺菌しておいた尿素 ２ｇ／
ｌおよびビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌを添加し、苛性ソーダ
でｐＨ７．２に調製した液体培地〕を２．５リットル含
む５リットル容培養槽に、上記種培養液１を２５０ｍｌ
接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５リットル
／分の培養条件下、濃アンモニア水でｐＨを６．８に調
整しつつ、培養液中のグルコースが消費されるまで培養
を行い、種培養液２を取得した。
【００４３】本培養用液体培地〔グルコース １８０ｇ
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．
１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン塩酸塩 ２０ｍｇ／ｌ、
グルタミン酸ナトリウム １ｇ／ｌおよびビオチン１０
０μｇ／ｌの組成の培地を１２０℃で２０分間蒸気殺菌
後、別途１２０℃で２０分間蒸気殺菌しておいた尿素
２ｇ／ｌおよびビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌを添加し、苛性
ソーダでｐＨ７．２に調製した液体培地〕を２．５リッ
トル含む５リットル容培養槽に上記種培養液２を３５０
ｍｌ接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５リッ
トル／分の培養条件下、濃アンモニア水でｐＨを６．８
に調整しつつ、培養液中のグルコースが消費されるまで
培養を行い、本培養液を取得した。この本培養液を遠心
分離することにより菌体を調製した。
／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．
１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン塩酸塩 ２０ｍｇ／ｌ、
グルタミン酸ナトリウム １ｇ／ｌおよびビオチン１０
０μｇ／ｌの組成の培地を１２０℃で２０分間蒸気殺菌
後、別途１２０℃で２０分間蒸気殺菌しておいた尿素
２ｇ／ｌおよびビタミンＢ1 ５ｍｇ／ｌを添加し、苛性
ソーダでｐＨ７．２に調製した液体培地〕を２．５リッ
トル含む５リットル容培養槽に上記種培養液２を３５０
ｍｌ接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５リッ
トル／分の培養条件下、濃アンモニア水でｐＨを６．８
に調整しつつ、培養液中のグルコースが消費されるまで
培養を行い、本培養液を取得した。この本培養液を遠心
分離することにより菌体を調製した。
【００４４】（３）チアミンからのＴＰＰ生産 上記（１）および（２）で調製したＬＥ３９２／ｐＴＰ
Ｋ１株の菌体０．４ｇとコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスＡＴＣＣ２１１７０株の菌体３ｇを２００ｍｌ
容ビーカーに入れ、グルコース ０．６ｇ、チアミン ２
０２ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
２７２ｍｇおよびキシレン ０．２ｍｌを添加し、蒸留
水を加え全量を２０ｍｌとした。この混合液を４００ｒ
ｐｍで撹拌し、１０規定水酸化カリウムでｐＨ７．８に
調製しつつ３７℃で反応を行った。反応中、リン酸は、
ＫＨ2ＰＯ4として１〜５ｇ／ｌに保たれるように、ま
た、グルコースおよびチアミンは消費に伴い適宜添加し
た。その結果、反応２４時間目にＴＰＰが６７ｍＭ生成
された。
Ｋ１株の菌体０．４ｇとコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスＡＴＣＣ２１１７０株の菌体３ｇを２００ｍｌ
容ビーカーに入れ、グルコース ０．６ｇ、チアミン ２
０２ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
２７２ｍｇおよびキシレン ０．２ｍｌを添加し、蒸留
水を加え全量を２０ｍｌとした。この混合液を４００ｒ
ｐｍで撹拌し、１０規定水酸化カリウムでｐＨ７．８に
調製しつつ３７℃で反応を行った。反応中、リン酸は、
ＫＨ2ＰＯ4として１〜５ｇ／ｌに保たれるように、ま
た、グルコースおよびチアミンは消費に伴い適宜添加し
た。その結果、反応２４時間目にＴＰＰが６７ｍＭ生成
された。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、チアミンとＡＴＰとか
らＴＰＰを、工業的に効率よく製造することができる。
らＴＰＰを、工業的に効率よく製造することができる。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：２１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Gln Gln Gly Thr Lys Leu Ala Ser Ala Arg Pro Val Thr 1 5 10 15 Leu Ile Gly Gly Ala Pro Val Gly Arg Ala Asp Leu Glu Gln Ala 20 25 30 Leu Ala Leu Ala Pro Val Val Ala Ala Ala Asp Ser Gly Ala Asp 35 40 45 Thr Ala Leu Ser His Gly Leu Met Pro Ala Ala Val Trp Gly Asp 50 55 60 Phe Asp Ser Ile Ser Ala Arg Ala Arg Ala Glu Ile Pro Leu Ala 65 70 75 Asn Gln His Pro Ile Ala Glu Gln Asn Ser Thr Asp Phe Glu Lys 80 85 90 Cys Leu Ser Asn Leu Asp Ala Pro Phe Val Val Ala Leu Gly Phe 95 100 105 Ser Gly Ala Arg His Asp His Phe Leu Ser Val Leu Asn Val Leu 110 115 120 Ala Arg Arg Ile Gly Pro Pro Cys Ile Leu Ile Ala Gly Glu Asp 125 130 135 Val Ile Thr Leu Ala Pro Pro Arg Leu Ala Leu Asp Leu Ala Pro 140 145 150 Gly Thr Arg Val Ser Leu Phe Pro Met Gly Pro Ala Thr Gly Arg 155 160 165 Ser Gln Gly Leu Lys Trp Pro Ile Asp Gly Leu Ala Phe Ala Pro 170 175 180 Gly Gly Arg Ser Gly Thr Ser Asn Gln Ala Thr Gly Pro Val Thr 185 190 195 Leu Glu Cys Asp Gly Pro Met Leu Leu Ile Leu Pro Arg Ser Glu 200 205 210 Leu Ala Thr Leu Ala Arg Ala Leu 215 配列番号：２ 配列の長さ：６５４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：パラコッカス デニトリフィカンス (Paracoc
cus denitrificans) 株名：ＡＴＣＣ１９３６７ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：１..６５４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AGC CAG CAA GGG ACC AAG TTG GCT AGT GCC CGC CCG GTC ACG CTG 48 ATC GGC GGT GCG CCG GTC GGC CGC GCC GAT CTG GAG CAG GCG CTG GCC 96 CTG GCG CCG GTG GTG GCC GCC GCC GAT AGC GGC GCC GAT ACC GCG CTG 144 AGC CAC GGG TTG ATG CCG GCG GCG GTC TGG GGC GAT TTC GAC AGC ATT 192 TCC GCC CGC GCC CGG GCC GAG ATC CCG CTG GCG AAC CAG CAC CCC ATC 240 GCC GAG CAG AAC AGC ACC GAT TTC GAG AAA TGC TTG TCC AAT CTC GAT 288 GCT CCC TTC GTC GTC GCC CTG GGC TTT TCG GGC GCG CGC CAT GAC CAT 336 TTC CTG TCG GTG CTC AAT GTG CTC GCC CGC CGT ATC GGC CCG CCC TGC 384 ATC CTG ATC GCG GGC GAG GAC GTG ATC ACG CTT GCC CCG CCG CGC CTC 432 GCG CTG GAT CTC GCG CCC GGC ACG CGG GTC TCG CTT TTC CCG ATG GGC 480 CCG GCC ACC GGC CGC TCG CAG GGC CTG AAA TGG CCC ATC GAC GGC CTG 528 GCC TTC GCG CCG GGC GGC CGC AGC GGC ACC TCG AAC CAG GCC ACG GGT 576 CCG GTC ACG CTG GAA TGC GAC GGC CCG ATG TTG CTG ATC CTG CCG CGC 624 TCG GAA CTG GCG ACG CTC GCC CGC GCC CTC 654 配列番号：３ 配列の長さ：６５４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：パラコッカス デニトリフィカンス(Paracoccu
s denitrificans) 株名：ＡＴＣＣ１９３６７ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：１..６５４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AGT CAA CAG GGC ACT AAA CTG GCT AGT GCC CGC CCG GTC ACG CTG 48 ATC GGC GGT GCG CCG GTC GGC CGC GCC GAT CTG GAG CAG GCG CTG GCC 96 CTG GCG CCG GTG GTG GCC GCC GCC GAT AGC GGC GCC GAT ACC GCG CTG 144 AGC CAC GGG TTG ATG CCG GCG GCG GTC TGG GGC GAT TTC GAC AGC ATT 192 TCC GCC CGC GCC CGG GCC GAG ATC CCG CTG GCG AAC CAG CAC CCC ATC 240 GCC GAG CAG AAC AGC ACC GAT TTC GAG AAA TGC TTG TCC AAT CTC GAT 288 GCT CCC TTC GTC GTC GCC CTG GGC TTT TCG GGC GCG CGC CAT GAC CAT 336 TTC CTG TCG GTG CTC AAT GTG CTC GCC CGC CGT ATC GGC CCG CCC TGC 384 ATC CTG ATC GCG GGC GAG GAC GTG ATC ACG CTT GCC CCG CCG CGC CTC 432 GCG CTG GAT CTC GCG CCC GGC ACG CGG GTC TCG CTT TTC CCG ATG GGC 480 CCG GCC ACC GGC CGC TCG CAG GGC CTG AAA TGG CCC ATC GAC GGC CTG 528 GCC TTC GCG CCG GGC GGC CGC AGC GGC ACC TCG AAC CAG GCC ACG GGT 576 CCG GTC ACG CTG GAA TGC GAC GGC CCG ATG TTG CTG ATC CTG CCG CGC 624 TCG GAA CTG GCG ACG CTC GCC CGC GCC CTC 654 配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：１..３３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGCTTAAATG AGTCAACAGG GCACTAAACT GGC 33 配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：１..３１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TAGCCAGTTT AGTGCCCTGT TGACTCATTT A 31
cus denitrificans) 株名：ＡＴＣＣ１９３６７ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：１..６５４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AGC CAG CAA GGG ACC AAG TTG GCT AGT GCC CGC CCG GTC ACG CTG 48 ATC GGC GGT GCG CCG GTC GGC CGC GCC GAT CTG GAG CAG GCG CTG GCC 96 CTG GCG CCG GTG GTG GCC GCC GCC GAT AGC GGC GCC GAT ACC GCG CTG 144 AGC CAC GGG TTG ATG CCG GCG GCG GTC TGG GGC GAT TTC GAC AGC ATT 192 TCC GCC CGC GCC CGG GCC GAG ATC CCG CTG GCG AAC CAG CAC CCC ATC 240 GCC GAG CAG AAC AGC ACC GAT TTC GAG AAA TGC TTG TCC AAT CTC GAT 288 GCT CCC TTC GTC GTC GCC CTG GGC TTT TCG GGC GCG CGC CAT GAC CAT 336 TTC CTG TCG GTG CTC AAT GTG CTC GCC CGC CGT ATC GGC CCG CCC TGC 384 ATC CTG ATC GCG GGC GAG GAC GTG ATC ACG CTT GCC CCG CCG CGC CTC 432 GCG CTG GAT CTC GCG CCC GGC ACG CGG GTC TCG CTT TTC CCG ATG GGC 480 CCG GCC ACC GGC CGC TCG CAG GGC CTG AAA TGG CCC ATC GAC GGC CTG 528 GCC TTC GCG CCG GGC GGC CGC AGC GGC ACC TCG AAC CAG GCC ACG GGT 576 CCG GTC ACG CTG GAA TGC GAC GGC CCG ATG TTG CTG ATC CTG CCG CGC 624 TCG GAA CTG GCG ACG CTC GCC CGC GCC CTC 654 配列番号：３ 配列の長さ：６５４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：パラコッカス デニトリフィカンス(Paracoccu
s denitrificans) 株名：ＡＴＣＣ１９３６７ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：１..６５４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AGT CAA CAG GGC ACT AAA CTG GCT AGT GCC CGC CCG GTC ACG CTG 48 ATC GGC GGT GCG CCG GTC GGC CGC GCC GAT CTG GAG CAG GCG CTG GCC 96 CTG GCG CCG GTG GTG GCC GCC GCC GAT AGC GGC GCC GAT ACC GCG CTG 144 AGC CAC GGG TTG ATG CCG GCG GCG GTC TGG GGC GAT TTC GAC AGC ATT 192 TCC GCC CGC GCC CGG GCC GAG ATC CCG CTG GCG AAC CAG CAC CCC ATC 240 GCC GAG CAG AAC AGC ACC GAT TTC GAG AAA TGC TTG TCC AAT CTC GAT 288 GCT CCC TTC GTC GTC GCC CTG GGC TTT TCG GGC GCG CGC CAT GAC CAT 336 TTC CTG TCG GTG CTC AAT GTG CTC GCC CGC CGT ATC GGC CCG CCC TGC 384 ATC CTG ATC GCG GGC GAG GAC GTG ATC ACG CTT GCC CCG CCG CGC CTC 432 GCG CTG GAT CTC GCG CCC GGC ACG CGG GTC TCG CTT TTC CCG ATG GGC 480 CCG GCC ACC GGC CGC TCG CAG GGC CTG AAA TGG CCC ATC GAC GGC CTG 528 GCC TTC GCG CCG GGC GGC CGC AGC GGC ACC TCG AAC CAG GCC ACG GGT 576 CCG GTC ACG CTG GAA TGC GAC GGC CCG ATG TTG CTG ATC CTG CCG CGC 624 TCG GAA CTG GCG ACG CTC GCC CGC GCC CTC 654 配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：１..３３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGCTTAAATG AGTCAACAGG GCACTAAACT GGC 33 配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 存在位置：１..３１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TAGCCAGTTT AGTGCCCTGT TGACTCATTT A 31
【図１】 パラコッカス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ
１９３６７由来のチアミンピロホスホキナーゼをコード
する遺伝子を含むプラスミドｐＡＩ２１３の制限酵素地
図を示す。
１９３６７由来のチアミンピロホスホキナーゼをコード
する遺伝子を含むプラスミドｐＡＩ２１３の制限酵素地
図を示す。
【図２】 プラスミドｐＴｒＳ３１にパラコッカス・デ
ニトリフィカンスＡＴＣＣ１９３６７由来のチアミンピ
ロホスホキナーゼをコードする遺伝子を含む０．７５ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を挿入するさいに用いたリンカーを示
す。
ニトリフィカンスＡＴＣＣ１９３６７由来のチアミンピ
ロホスホキナーゼをコードする遺伝子を含む０．７５ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を挿入するさいに用いたリンカーを示
す。
【図３】 パラコッカス・デニトリフィカンスＡＴＣＣ
１９３６７由来のチアミンピロホスホキナーゼをコード
する遺伝子の一部を改変させた遺伝子を含むプラスミド
ｐＡＩ２１３の制限酵素地図を示す。
１９３６７由来のチアミンピロホスホキナーゼをコード
する遺伝子の一部を改変させた遺伝子を含むプラスミド
ｐＡＩ２１３の制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 9/12 (Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (16)
- 【請求項１】 パラコッカス(Paracoccus)属に属する微
生物、またはパラコッカス(Paracoccus)属に属する微生
物に由来しチアミン二リン酸の合成に関与する遺伝情報
を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを保有する微生
物であり、かつチアミンとアデノシン−５’−三リン酸
とからチアミン二リン酸を生成する反応を触媒する活性
を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物の
存在下、水性媒体中でチアミンとアデノシン−５’−三
リン酸とを反応させ、該反応液から生成したチアミン二
リン酸を採取することを特徴とするチアミン二リン酸の
製造法。 - 【請求項２】 パラコッカス(Paracoccus)属に属する微
生物が、配列番号１で表されるアミノ酸をコードするtp
k遺伝子を保有する微生物である請求項１記載の製造
法。 - 【請求項３】 組換え体ＤＮＡを保有する微生物が、エ
ッシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Ente
robacter)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリネ
バクテリウム(Corynebacterium)属あるいはブレビバク
テリウム(Brevibacterium)属に属する微生物である請求
項１記載の製造法。 - 【請求項４】 ＤＮＡ断片が、チアミンピロホスホキナ
ーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片である請求項１または請求項３記載の製造法。 - 【請求項５】 アデノシン−５’−三リン酸が、アデノ
シン−５’−三リン酸の前駆体、リン酸供与体およびエ
ネルギー供与体とからアデノシン−５’−三リン酸を生
成する活性を有する微生物により供給されるアデノシン
−５’−三リン酸である請求項１、請求項２、請求項３
または請求項４記載の製造法。 - 【請求項６】 パラコッカス(Paracoccus)属に属する微
生物由来で、かつチアミンピロホスホキナーゼ活性を有
する蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベク
ターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項７】 遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ
酸配列をコードする遺伝子またはこれにハイブリダイズ
する遺伝子である請求項６記載の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項８】 遺伝子が、配列番号２の塩基配列で表さ
れる遺伝子またはこれにハイブリダイズする遺伝子であ
る請求項６記載の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項９】 遺伝子が、配列番号３の塩基配列で表さ
れる遺伝子またはこれにハイブリダイズする遺伝子であ
る請求項６記載の組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項１０】 パラコッカス(Paracoccus)属に属する
微生物由来で、かつチアミンピロホスホキナーゼ活性を
有する蛋白質をコードする遺伝子またはこれにハイブリ
ダイズする遺伝子。 - 【請求項１１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を
コードする遺伝子またはこれにハイブリダイズする遺伝
子。 - 【請求項１２】 配列番号２の塩基配列で表される遺伝
子またはこれにハイブリダイズする遺伝子。 - 【請求項１３】 配列番号３の塩基配列で表される遺伝
子またはこれにハイブリダイズする遺伝子。 - 【請求項１４】 パラコッカス(Paracoccus)属に属する
微生物由来で、かつチアミンピロホスホキナーゼ活性を
有する蛋白質をコードする遺伝子またはこれにハイブリ
ダイズする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡを保有する微生物。 - 【請求項１５】 遺伝子が、配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子またはこれにハイブリダイ
ズする遺伝子である請求項１４記載の微生物。 - 【請求項１６】 遺伝子が、配列番号３の塩基配列で表
される遺伝子またはこれにハイブリダイズする遺伝子で
ある請求項１４記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6150847A JPH089985A (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | チアミン二リン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6150847A JPH089985A (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | チアミン二リン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH089985A true JPH089985A (ja) | 1996-01-16 |
Family
ID=15505685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6150847A Withdrawn JPH089985A (ja) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | チアミン二リン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH089985A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007026871A1 (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Kagoshima University | 魚醤油の製造方法 |
-
1994
- 1994-07-01 JP JP6150847A patent/JPH089985A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007026871A1 (ja) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Kagoshima University | 魚醤油の製造方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20010904 |