JPH09100296A - 蛋白質の相互分離方法 - Google Patents
蛋白質の相互分離方法Info
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が付加
し蛋白質とを相互に分離する方法の提供。 【解決手段】蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が
付加し、該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質の混
合物を等電点の差異に基づく分離手段に付すことによ
り、蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した蛋白
質とを相互に分離できる。
し蛋白質とを相互に分離する方法の提供。 【解決手段】蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が
付加し、該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質の混
合物を等電点の差異に基づく分離手段に付すことによ
り、蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した蛋白
質とを相互に分離できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質および該蛋
白質にメチオニン残基が付加し該蛋白質と同様の生理活
性を有する蛋白質の混合物を相互に分離する方法に関す
る。
白質にメチオニン残基が付加し該蛋白質と同様の生理活
性を有する蛋白質の混合物を相互に分離する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】サイトカインやペプチドホルモンなど種
々の生理活性蛋白質の存在が明らかにされ、また近年の
遺伝子工学技術の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量
生産、臨床への適用の途を開きつつある。このような技
術は、すでにインターフェロン,インターロイキン,Ｂ細
胞増殖因子(ＢＧＦ),Ｂ細胞分化因子(ＢＤＦ),マクロフ
ァージ活性化因子(ＭＡＦ),リンホトキシン(ＬＴ),腫瘍
壊死因子(ＴＮＦ)などのサイトカイン;トランスホーミ
ンググロースファクター(ＴＧＦ−α);エリスロポエチ
ン,上皮細胞増殖因子,インスリン,ヒト成長ホルモンな
どペプチド蛋白質ホルモン; Ｂ型肝炎ウイルス抗原,イ
ンフルエンザ抗原,口蹄疫ウイルス抗原,マラリア原虫抗
原などのワクチンの開発に有用な病原性微生物抗原蛋白
質;ペプチダーゼ(例、ティシュプラスミノーゲン アク
チベーター,ウロキナーゼ,セラチオペプチダーゼなど)
やリゾチームなどの酵素;ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)
などの血中蛋白成分など各種生理活性蛋白質の製造に応
用されている。
々の生理活性蛋白質の存在が明らかにされ、また近年の
遺伝子工学技術の進歩は、これら生理活性蛋白質の大量
生産、臨床への適用の途を開きつつある。このような技
術は、すでにインターフェロン,インターロイキン,Ｂ細
胞増殖因子(ＢＧＦ),Ｂ細胞分化因子(ＢＤＦ),マクロフ
ァージ活性化因子(ＭＡＦ),リンホトキシン(ＬＴ),腫瘍
壊死因子(ＴＮＦ)などのサイトカイン;トランスホーミ
ンググロースファクター(ＴＧＦ−α);エリスロポエチ
ン,上皮細胞増殖因子,インスリン,ヒト成長ホルモンな
どペプチド蛋白質ホルモン; Ｂ型肝炎ウイルス抗原,イ
ンフルエンザ抗原,口蹄疫ウイルス抗原,マラリア原虫抗
原などのワクチンの開発に有用な病原性微生物抗原蛋白
質;ペプチダーゼ(例、ティシュプラスミノーゲン アク
チベーター,ウロキナーゼ,セラチオペプチダーゼなど)
やリゾチームなどの酵素;ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)
などの血中蛋白成分など各種生理活性蛋白質の製造に応
用されている。
【０００３】しかし、これらの蛋白質は遺伝子工学手法
により製造されるため、しばしば混合物中の他の物質か
ら、最終的に必要な生産物を分離せねばならないという
問題が生じている。特に問題になるのは、必要な蛋白質
をコ−ドする遺伝子の発現により産生する遺伝子産物
が、しばしば必要な蛋白質とそのアミノ末端にメチオニ
ンが付加した第二番目の蛋白質との混合物であることで
ある。付加されたメチオニン(Ｍet)は、所望の遺伝子の
発現の開始を指示する翻訳開始コドンＡＴＧの発現と、
発現産物から付加したＭet基を除く宿主細胞の発現系の
不首尾に由来するものである。この問題は、原核性宿主
および真核性宿主の両者で生ずるが、とりわけ原核性宿
主における遺伝子の発現においてしばしば生ずる。発現
用宿主として大腸菌を用いた発現系において特に問題と
なる。真核細胞および原核細胞の両者における蛋白質合
成は、アミノ酸であるメチオニンをコ−ドするmＲＮＡ
のコドンＡＵＧから開始するので、とりわけ発現用宿主
が大腸菌の場合、蛋白質の発現が必要とする蛋白質をさ
らにアミノ末端にメチオニンが付加した類似体(Ｎ−Ｍe
t 類似体)との分子種の混合物であるかどうか予想でき
ない。
により製造されるため、しばしば混合物中の他の物質か
ら、最終的に必要な生産物を分離せねばならないという
問題が生じている。特に問題になるのは、必要な蛋白質
をコ−ドする遺伝子の発現により産生する遺伝子産物
が、しばしば必要な蛋白質とそのアミノ末端にメチオニ
ンが付加した第二番目の蛋白質との混合物であることで
ある。付加されたメチオニン(Ｍet)は、所望の遺伝子の
発現の開始を指示する翻訳開始コドンＡＴＧの発現と、
発現産物から付加したＭet基を除く宿主細胞の発現系の
不首尾に由来するものである。この問題は、原核性宿主
および真核性宿主の両者で生ずるが、とりわけ原核性宿
主における遺伝子の発現においてしばしば生ずる。発現
用宿主として大腸菌を用いた発現系において特に問題と
なる。真核細胞および原核細胞の両者における蛋白質合
成は、アミノ酸であるメチオニンをコ−ドするmＲＮＡ
のコドンＡＵＧから開始するので、とりわけ発現用宿主
が大腸菌の場合、蛋白質の発現が必要とする蛋白質をさ
らにアミノ末端にメチオニンが付加した類似体(Ｎ−Ｍe
t 類似体)との分子種の混合物であるかどうか予想でき
ない。
【０００４】事実、大腸菌のイニシェーション・ファク
ターＩＦー３においてアミノ末端にメチオニン残基を持
つ分子種と持たない分子種の両者が存在すること〔ホッ
ペ・ザイラーズ・ツァイシュリフト・フュア・フィジオリシ
ェ・ヘミー(Ｈoppe Seyler'sZ.Physiol.Chem.),３５４
巻,１４１５頁(１９７３年)〕や、大腸菌においては、
その全蛋白のアミノ末端が主としてメチオニンであるこ
と(コーン・スタンプ，アウトラインズ・オブ・バイオケミ
ストリー(Ｏutlines of Ｂiochemistry)４版,ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ,１９７６年)などが知られてい
る。組換えＤＮＡ技術を用いて製造された蛋白として
は、アミノ末端へのメチオニン残基の付加率がヒト成長
ホルモンにおいて約１００％〔ネイチャー(Ｎature),２
９３巻,４０８頁(１９８１年)〕にも達する例が知られ
ている。遺伝子工学技術によると、必要とする蛋白質に
比べそのＭet類似体が高比率に産生するという問題が知
られている。ネイチャ−(Ｎature),２９３巻, ４０８頁
(１９８１年)においては、ヒト成長ホルモンの製造にお
いて、実際に必要とする蛋白質に比べてそのＭet類似体
が多量に得られるということを示している。必要とする
蛋白質とそのＮ−Ｍet類似体とが混合物として産生する
場合、二つの分子種の物理化学的性状における相違は、
あるとしても非常に小さいものであるため、相互に分離
することは、極めて困難なことである。
ターＩＦー３においてアミノ末端にメチオニン残基を持
つ分子種と持たない分子種の両者が存在すること〔ホッ
ペ・ザイラーズ・ツァイシュリフト・フュア・フィジオリシ
ェ・ヘミー(Ｈoppe Seyler'sZ.Physiol.Chem.),３５４
巻,１４１５頁(１９７３年)〕や、大腸菌においては、
その全蛋白のアミノ末端が主としてメチオニンであるこ
と(コーン・スタンプ，アウトラインズ・オブ・バイオケミ
ストリー(Ｏutlines of Ｂiochemistry)４版,ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ,１９７６年)などが知られてい
る。組換えＤＮＡ技術を用いて製造された蛋白として
は、アミノ末端へのメチオニン残基の付加率がヒト成長
ホルモンにおいて約１００％〔ネイチャー(Ｎature),２
９３巻,４０８頁(１９８１年)〕にも達する例が知られ
ている。遺伝子工学技術によると、必要とする蛋白質に
比べそのＭet類似体が高比率に産生するという問題が知
られている。ネイチャ−(Ｎature),２９３巻, ４０８頁
(１９８１年)においては、ヒト成長ホルモンの製造にお
いて、実際に必要とする蛋白質に比べてそのＭet類似体
が多量に得られるということを示している。必要とする
蛋白質とそのＮ−Ｍet類似体とが混合物として産生する
場合、二つの分子種の物理化学的性状における相違は、
あるとしても非常に小さいものであるため、相互に分離
することは、極めて困難なことである。
【０００５】メチオニン残基は分子量約１３１で、中程
度に疎水性を有し、かつ解離基を持たないため電気的に
中性のアミノ酸残基である。従って蛋白質のようなそれ
自体多数の解離基や疎水性基および親水性基を有する巨
大分子〔例えば１３３個のアミノ酸残基からなるインタ
−ロイキン−２ポリペプチド(I;但しＸは水素原子)の分
子量は約１５,４２０である〕のアミノ末端にメチオニ
ン残基が１残基付加しても蛋白質全体の物理化学的性質
には通常大きな影響を及ぼさないと予想され、アミノ末
端にメチオニン残基が付加した分子種と付加していない
分子種とを相互に分離することはきわめて困難であると
考えられる。この難しい問題は、多くの蛋白質において
存在し、とりわけ発現用の宿主として大腸菌を用いて発
現する蛋白質、特に遺伝子工学技術により製造されるイ
ンタ−ロイキン−２やインタ−フェロンを、これらのＮ
−Ｍet類似体から分離する場合において、厳しいものが
ある。インターロイキンー２は、マイトーゲンや抗原に
よって活性化されたＴ細胞によって産生されるリンホカ
インの１つであり、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラ
ー細胞の増殖および分化に必須の因子であってこれらの
細胞を介した免疫反応系において重要な働きをしてい
る。また、インターフェロン−αは、ウイルスや核酸に
よって活性化された白血球によって産生されるリンホカ
インの１つであり、細胞に作用してその細胞を抗ウイル
ス状態にするという生物活性をもち、感染防禦系や腫瘍
免疫系において重要な働きをしている。インターロイキ
ンー２やインターフェロン−αはその生物活性から各種
免疫不全症,感染症,悪性腫瘍などの治療薬として効果的
に使用し得ることが期待されている。現在までにヒト末
梢血リンパ球やヒトＴ細胞白血病株(ＪＵＲＫＡＴ株)の
培養上清から単離された天然型のインターロイキンー２
は、分子量的に異なる幾つかの分子種から成るが、いず
れもそのポリペプトド鎖に関しては互いにきわめて良く
似ており、アミノ末端は例外なくアラニン残基から始ま
ることが知られている〔特願昭５９ー１４９２４８号
(昭和５９年７月１９日出願)明細書(ＥＰＣ公開第０１
３２３５９号公報に対応する);プロシージング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐro．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ), ８１巻, ２５４３頁(１９８４
年)〕。
度に疎水性を有し、かつ解離基を持たないため電気的に
中性のアミノ酸残基である。従って蛋白質のようなそれ
自体多数の解離基や疎水性基および親水性基を有する巨
大分子〔例えば１３３個のアミノ酸残基からなるインタ
−ロイキン−２ポリペプチド(I;但しＸは水素原子)の分
子量は約１５,４２０である〕のアミノ末端にメチオニ
ン残基が１残基付加しても蛋白質全体の物理化学的性質
には通常大きな影響を及ぼさないと予想され、アミノ末
端にメチオニン残基が付加した分子種と付加していない
分子種とを相互に分離することはきわめて困難であると
考えられる。この難しい問題は、多くの蛋白質において
存在し、とりわけ発現用の宿主として大腸菌を用いて発
現する蛋白質、特に遺伝子工学技術により製造されるイ
ンタ−ロイキン−２やインタ−フェロンを、これらのＮ
−Ｍet類似体から分離する場合において、厳しいものが
ある。インターロイキンー２は、マイトーゲンや抗原に
よって活性化されたＴ細胞によって産生されるリンホカ
インの１つであり、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラ
ー細胞の増殖および分化に必須の因子であってこれらの
細胞を介した免疫反応系において重要な働きをしてい
る。また、インターフェロン−αは、ウイルスや核酸に
よって活性化された白血球によって産生されるリンホカ
インの１つであり、細胞に作用してその細胞を抗ウイル
ス状態にするという生物活性をもち、感染防禦系や腫瘍
免疫系において重要な働きをしている。インターロイキ
ンー２やインターフェロン−αはその生物活性から各種
免疫不全症,感染症,悪性腫瘍などの治療薬として効果的
に使用し得ることが期待されている。現在までにヒト末
梢血リンパ球やヒトＴ細胞白血病株(ＪＵＲＫＡＴ株)の
培養上清から単離された天然型のインターロイキンー２
は、分子量的に異なる幾つかの分子種から成るが、いず
れもそのポリペプトド鎖に関しては互いにきわめて良く
似ており、アミノ末端は例外なくアラニン残基から始ま
ることが知られている〔特願昭５９ー１４９２４８号
(昭和５９年７月１９日出願)明細書(ＥＰＣ公開第０１
３２３５９号公報に対応する);プロシージング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐro．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ), ８１巻, ２５４３頁(１９８４
年)〕。
【０００６】一方、現在までにヒト白血球の培養上清か
ら単離された天然型のインターフェロン−αは、１０数
種のサブタイプからなるが、いずれもそのポリペプチド
鎖に関しては、互いにきわめて良く似ており、アミノ末
端は例外なくシスティン残基から始まることが知られて
いる〔アチーフ・フュア・ビオヘミー・ウンド・ビオフィジ
ッシェ(Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys.),２２１巻,１頁
(１９８３年)〕。本発明者らは、ヒトリンパ球のインタ
ーロイキンー２遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて大腸
菌内で発現させることにより非グリコシル化ヒトインタ
ーロイキンー２を製造することに成功した〔特願昭５８
ー２２５０７９号(昭和５８年１１月２８日出願)明細書
参照;ＥＰＣ公開第０１４５３９０号公報に対応す
る〕。該インターロイキンー２は〔図１〕に示すアミノ
酸配列(該図中、Ｘは水素原子またはメチオニン残基を
示す)からなるポリペプチド(I)を含有するものであり、
アミノ末端アミノ酸としてヒト天然型と同じくアラニン
残基から始まる分子種(すなわち、Ｘは水素原子)ととも
に、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル
−アラニン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘはメチ
オニン残基)を有する。また、すでに報告されているよ
うに〔ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ
(Ｊ．Interferon Ｒes．),第１巻,３８１頁(１９８１
年); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．),第２５６巻,９７５０頁(１９８
１年)〕、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌内
で発現させたインターフェロン−αＡは〔図２〕に示す
アミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する。アミノ
末端アミノ酸としては、ヒト天然型と同じくシスティン
残基から始まる分子種(すなわち、Ｘは水素原子)ととも
に、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル
−システィン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘはメ
チオニン残基)を有する。
ら単離された天然型のインターフェロン−αは、１０数
種のサブタイプからなるが、いずれもそのポリペプチド
鎖に関しては、互いにきわめて良く似ており、アミノ末
端は例外なくシスティン残基から始まることが知られて
いる〔アチーフ・フュア・ビオヘミー・ウンド・ビオフィジ
ッシェ(Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys.),２２１巻,１頁
(１９８３年)〕。本発明者らは、ヒトリンパ球のインタ
ーロイキンー２遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて大腸
菌内で発現させることにより非グリコシル化ヒトインタ
ーロイキンー２を製造することに成功した〔特願昭５８
ー２２５０７９号(昭和５８年１１月２８日出願)明細書
参照;ＥＰＣ公開第０１４５３９０号公報に対応す
る〕。該インターロイキンー２は〔図１〕に示すアミノ
酸配列(該図中、Ｘは水素原子またはメチオニン残基を
示す)からなるポリペプチド(I)を含有するものであり、
アミノ末端アミノ酸としてヒト天然型と同じくアラニン
残基から始まる分子種(すなわち、Ｘは水素原子)ととも
に、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル
−アラニン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘはメチ
オニン残基)を有する。また、すでに報告されているよ
うに〔ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ
(Ｊ．Interferon Ｒes．),第１巻,３８１頁(１９８１
年); ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．),第２５６巻,９７５０頁(１９８
１年)〕、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌内
で発現させたインターフェロン−αＡは〔図２〕に示す
アミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する。アミノ
末端アミノ酸としては、ヒト天然型と同じくシスティン
残基から始まる分子種(すなわち、Ｘは水素原子)ととも
に、アミノ末端にメチオニン残基の付加したメチオニル
−システィン残基から始まる分子種(すなわち、Ｘはメ
チオニン残基)を有する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】同じ蛋白質であっても
アミノ末端にメチオニン残基の付加した分子種とそうで
ない分子種とは蛋白質の高次構造が相互に異なる可能性
があり、両者の間でin vivoおよびin vitroでの生物活
性や生物学的安定性に差のある可能性もある。また、メ
チオニン残基のアミノ末端への付加が抗原性の増加ある
いは減少をもたらす可能性もあり得よう。従って、生理
学上および産業利用上の観点からアミノ末端にメチオニ
ン残基の付加した分子種とそうでない分子種とを分離し
て両者をそれぞれ実質的に純粋な形で取り出すことはき
わめて意義のあることである。アミノ末端へのメチオニ
ン残基の付加率は、培養条件や蛋白質の発現レベルによ
って左右される可能性がある〔ジャーナル・オブ・インタ
ーフェロン・リサーチ(J．Interferon Res.),１巻,３８
１頁(１９８１年)〕が、メチオニン残基の付加率を制御
し得た例は今までのところ報告されていない。さらに蛋
白質の精製過程においてもアミノ末端にメチオニン残基
が付加した分子種と付加していない分子種とを相互に分
離した例は今までのところ全く報告されていない。本発
明者らは(a)インターロイキン−２とさらにそのアミノ
末端にメチオニン残基を有するインターロイキン−２お
よび(b)インターフェロン−αＡとさらにそのアミノ末
端にメチオニン残基を有するインターフェロン−αＡと
の相互分離法として、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の
差を利用する方法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法お
よびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、抗体との特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフイー
などの疎水性の差を利用する方法などを試みたが、それ
らを相互に分離することは全く出来なかった。
アミノ末端にメチオニン残基の付加した分子種とそうで
ない分子種とは蛋白質の高次構造が相互に異なる可能性
があり、両者の間でin vivoおよびin vitroでの生物活
性や生物学的安定性に差のある可能性もある。また、メ
チオニン残基のアミノ末端への付加が抗原性の増加ある
いは減少をもたらす可能性もあり得よう。従って、生理
学上および産業利用上の観点からアミノ末端にメチオニ
ン残基の付加した分子種とそうでない分子種とを分離し
て両者をそれぞれ実質的に純粋な形で取り出すことはき
わめて意義のあることである。アミノ末端へのメチオニ
ン残基の付加率は、培養条件や蛋白質の発現レベルによ
って左右される可能性がある〔ジャーナル・オブ・インタ
ーフェロン・リサーチ(J．Interferon Res.),１巻,３８
１頁(１９８１年)〕が、メチオニン残基の付加率を制御
し得た例は今までのところ報告されていない。さらに蛋
白質の精製過程においてもアミノ末端にメチオニン残基
が付加した分子種と付加していない分子種とを相互に分
離した例は今までのところ全く報告されていない。本発
明者らは(a)インターロイキン−２とさらにそのアミノ
末端にメチオニン残基を有するインターロイキン−２お
よび(b)インターフェロン−αＡとさらにそのアミノ末
端にメチオニン残基を有するインターフェロン−αＡと
の相互分離法として、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の
差を利用する方法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法お
よびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、抗体との特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフイー
などの疎水性の差を利用する方法などを試みたが、それ
らを相互に分離することは全く出来なかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、蛋白質と
そのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋白質
(Ｎ−Ｍet 類似体)とを相互に分離することを目的とし
て鋭意研究を行った結果、 それらが意外にも相互に異な
る等電点を有する事実を発見した。メチオニンは電気的
に中性のアミノ酸であるため蛋白質のアミノ末端に付加
してもその蛋白質全体の電荷には全く影響を及ぼさない
と考えられ、従ってインターロイキンー２のような蛋白
質とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋
白質とが異なる等電点を有することは全く予想外の発見
であった。この発見に基づき、蛋白質および該蛋白質に
メチオニン残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活性を
有する蛋白質（Met−蛋白質）の混合物を等電点の差異
に基づく分離手段に付すことにより蛋白質と該蛋白質に
メチオニンが付加した蛋白質（Met−蛋白質）とを相互
分離できることを見いだした。
そのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋白質
(Ｎ−Ｍet 類似体)とを相互に分離することを目的とし
て鋭意研究を行った結果、 それらが意外にも相互に異な
る等電点を有する事実を発見した。メチオニンは電気的
に中性のアミノ酸であるため蛋白質のアミノ末端に付加
してもその蛋白質全体の電荷には全く影響を及ぼさない
と考えられ、従ってインターロイキンー２のような蛋白
質とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する蛋
白質とが異なる等電点を有することは全く予想外の発見
であった。この発見に基づき、蛋白質および該蛋白質に
メチオニン残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活性を
有する蛋白質（Met−蛋白質）の混合物を等電点の差異
に基づく分離手段に付すことにより蛋白質と該蛋白質に
メチオニンが付加した蛋白質（Met−蛋白質）とを相互
分離できることを見いだした。
【０００９】すなわち、本発明は、蛋白質および該蛋白
質にメチオニン残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活
性を有する蛋白質の混合物を等電点の差異に基づく分離
手段に付すことを特徴とする蛋白質と該蛋白質にメチオ
ニン残基が付加した蛋白質との相互分離方法を提供する
ものである。
質にメチオニン残基が付加し、該蛋白質と同様の生理活
性を有する蛋白質の混合物を等電点の差異に基づく分離
手段に付すことを特徴とする蛋白質と該蛋白質にメチオ
ニン残基が付加した蛋白質との相互分離方法を提供する
ものである。
【００１０】本願明細書において「蛋白質」とは、糖鎖を
有するものもしくは有さないもののいずれをも含み、ま
た、例えば化学反応もしくは酵素反応により、化学的ま
たは構造的に修飾されたポリペプチドを包含する、アミ
ノ酸の１次構造からなる高分子物質を意味する。また
「Ｍet−蛋白質」とは、上記「蛋白質」にさらにメチオニン
基が付加したものを意味する。本発明は、とりわけ、所
望の蛋白質およびそれと同一もしくは同様の生理活性を
有するＭet−蛋白質に係るものである。本発明における
好ましいＭet−蛋白質は、所望の蛋白質の生理活性を奏
するに十分な、該蛋白質とのアミノ酸配列上の類似性を
有するものである。本発明は、所望の蛋白質のそのアミ
ノ末端にさらにメチオニン残基を付加した蛋白質(Ｎ−
Ｍet類似体)を包含するＭet−蛋白質から蛋白質を分離
する方法による生産物に関するものである。とりわけ、
本発明は、そのＮ−Ｍet類似体を実質的に含有しないイ
ンタ−ロイキン−２蛋白質の分離、およびそのＮ−Ｍet
類似体を実質的に含有しないインタ−フェロン−αの分
離に関するものである。
有するものもしくは有さないもののいずれをも含み、ま
た、例えば化学反応もしくは酵素反応により、化学的ま
たは構造的に修飾されたポリペプチドを包含する、アミ
ノ酸の１次構造からなる高分子物質を意味する。また
「Ｍet−蛋白質」とは、上記「蛋白質」にさらにメチオニン
基が付加したものを意味する。本発明は、とりわけ、所
望の蛋白質およびそれと同一もしくは同様の生理活性を
有するＭet−蛋白質に係るものである。本発明における
好ましいＭet−蛋白質は、所望の蛋白質の生理活性を奏
するに十分な、該蛋白質とのアミノ酸配列上の類似性を
有するものである。本発明は、所望の蛋白質のそのアミ
ノ末端にさらにメチオニン残基を付加した蛋白質(Ｎ−
Ｍet類似体)を包含するＭet−蛋白質から蛋白質を分離
する方法による生産物に関するものである。とりわけ、
本発明は、そのＮ−Ｍet類似体を実質的に含有しないイ
ンタ−ロイキン−２蛋白質の分離、およびそのＮ−Ｍet
類似体を実質的に含有しないインタ−フェロン−αの分
離に関するものである。
【００１１】本願明細書において「生理活性」とは、生理
学的および免疫学的活性および効果を含むインビボもし
くはインビトロで生存していてもいなくてもよい細胞,
細胞の一部,細胞もしくは他の生理学的作用に基づく生
産物および生物学的物質を含む生体および(または)生理
物質への活性または効果を意味する。上記蛋白質および
それにメチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)
の混合物は、通常遺伝子組換え技術で製造でき、通常大
腸菌,枯草菌,酵母,動物細胞を用いて発現させることに
より製造できる。上記蛋白質としては、各種生理活性蛋
白質が挙げられ、例えば、インターフェロン(ＩＦＮ;
例、ＩＦＮ−α,ＩＦＮ−β,ＩＦＮ−γなど),インター
ロイキン(例、インターロイキン−１,インターロイキン
−２など),Ｂ細胞増殖因子(ＢＧＦ),Ｂ細胞分化因子(Ｂ
ＤＦ),マクロファージ活性化因子(ＭＡＦ),リンホトキ
シン(ＬＴ),腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)などのサイトカイン;
トランスホーミンググロースファクター(ＴＧＦ−α);
エリスロポエチン,上皮細胞増殖因子,インスリン,ヒト
成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホルモン;Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原,インフルエンザ抗原,口蹄疫ウイルス抗原,
マラリア原虫抗原などの病原性微生物抗原蛋白質;ペプ
チダーゼ(例、ティシュプラスミノーゲン アクチベー
ター,ウロキナーゼ,セラチオペプチダーゼなど)やリゾ
チームなどの酵素;ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの
血中蛋白成分が挙げられる。これら蛋白質の中でも、分
子量約３,０００〜５０,０００、とりわけ約５,０００〜
３０,０００のもの、 またアミノ酸数として約３０〜５
００、 とりわけ約５０〜３００のものに対して、 本発明
の蛋白質の相互分離方法は有利に適用ができる。
学的および免疫学的活性および効果を含むインビボもし
くはインビトロで生存していてもいなくてもよい細胞,
細胞の一部,細胞もしくは他の生理学的作用に基づく生
産物および生物学的物質を含む生体および(または)生理
物質への活性または効果を意味する。上記蛋白質および
それにメチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)
の混合物は、通常遺伝子組換え技術で製造でき、通常大
腸菌,枯草菌,酵母,動物細胞を用いて発現させることに
より製造できる。上記蛋白質としては、各種生理活性蛋
白質が挙げられ、例えば、インターフェロン(ＩＦＮ;
例、ＩＦＮ−α,ＩＦＮ−β,ＩＦＮ−γなど),インター
ロイキン(例、インターロイキン−１,インターロイキン
−２など),Ｂ細胞増殖因子(ＢＧＦ),Ｂ細胞分化因子(Ｂ
ＤＦ),マクロファージ活性化因子(ＭＡＦ),リンホトキ
シン(ＬＴ),腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)などのサイトカイン;
トランスホーミンググロースファクター(ＴＧＦ−α);
エリスロポエチン,上皮細胞増殖因子,インスリン,ヒト
成長ホルモンなどペプチド蛋白質ホルモン;Ｂ型肝炎ウ
イルス抗原,インフルエンザ抗原,口蹄疫ウイルス抗原,
マラリア原虫抗原などの病原性微生物抗原蛋白質;ペプ
チダーゼ(例、ティシュプラスミノーゲン アクチベー
ター,ウロキナーゼ,セラチオペプチダーゼなど)やリゾ
チームなどの酵素;ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの
血中蛋白成分が挙げられる。これら蛋白質の中でも、分
子量約３,０００〜５０,０００、とりわけ約５,０００〜
３０,０００のもの、 またアミノ酸数として約３０〜５
００、 とりわけ約５０〜３００のものに対して、 本発明
の蛋白質の相互分離方法は有利に適用ができる。
【００１２】また蛋白質の等電点が約４〜１１とりわ
け、 約５〜８のものにおいて、有利に相互分離を行う
ことができ、また蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基を
有する蛋白質との等電点の差が、約０.０１以上、好ま
しくは約０.１以上とりわけ０.０１〜０.２程度あるこ
とが好ましい。とりわけ、遺伝子組換え技術で製造され
たインターロイキン−２やインターフェロン−αに対し
て、有利に本発明の相互分離方法が適用できる。ここで
インターロイキン−２とは天然のヒトインターロイキン
−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例えばイン
ターロイキン−２レセプターや抗インターロイキン−２
抗体との結合能、を有するものであればいずれでもよ
く、具体的には〔図１〕で示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド(I;但しＸは水素原子)や、その生物学的
もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列か
らなるフラグメントでもよく、例えばポリペプチド(I)
のアミノ末端から１個のアミノ酸(ＥＰＣ公開９１５３
９号公報)または４個のアミノ酸を欠くフラグメント(特
願昭５８−２３５６３８号,昭和５８年１２月１３日出
願,明細書参照、特開昭６０−１２６０８８号公報に対
応)やカルボキシル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフ
ラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリペプチド
(I)の構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ
酸に置換されたもの、例えば１２５位のシステイン残基
がセリン残基に置換されたもの(特開昭５９−９３０９
３号公報)でもよい。これらのポリペプチドは、非グリ
コシル化ポリペプチドであることが好ましく、とりわけ
〔図１〕に示すアミノ酸配列を有するＩＬ−２が好まし
い。以下の本願明細書においては、これらのインターロ
イキン−２をＩＬ−２と略記し、それらのアミノ末端に
さらにメチオニン残基を有するインターロイキン−２を
Ｍet−ＩＬ−２と略記することがある。
け、 約５〜８のものにおいて、有利に相互分離を行う
ことができ、また蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基を
有する蛋白質との等電点の差が、約０.０１以上、好ま
しくは約０.１以上とりわけ０.０１〜０.２程度あるこ
とが好ましい。とりわけ、遺伝子組換え技術で製造され
たインターロイキン−２やインターフェロン−αに対し
て、有利に本発明の相互分離方法が適用できる。ここで
インターロイキン−２とは天然のヒトインターロイキン
−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例えばイン
ターロイキン−２レセプターや抗インターロイキン−２
抗体との結合能、を有するものであればいずれでもよ
く、具体的には〔図１〕で示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド(I;但しＸは水素原子)や、その生物学的
もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列か
らなるフラグメントでもよく、例えばポリペプチド(I)
のアミノ末端から１個のアミノ酸(ＥＰＣ公開９１５３
９号公報)または４個のアミノ酸を欠くフラグメント(特
願昭５８−２３５６３８号,昭和５８年１２月１３日出
願,明細書参照、特開昭６０−１２６０８８号公報に対
応)やカルボキシル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフ
ラグメントなどが挙げられ、さらに上記ポリペプチド
(I)の構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ
酸に置換されたもの、例えば１２５位のシステイン残基
がセリン残基に置換されたもの(特開昭５９−９３０９
３号公報)でもよい。これらのポリペプチドは、非グリ
コシル化ポリペプチドであることが好ましく、とりわけ
〔図１〕に示すアミノ酸配列を有するＩＬ−２が好まし
い。以下の本願明細書においては、これらのインターロ
イキン−２をＩＬ−２と略記し、それらのアミノ末端に
さらにメチオニン残基を有するインターロイキン−２を
Ｍet−ＩＬ−２と略記することがある。
【００１３】ここでインターフェロン−αとは天然のヒ
トインターフェロン−αと同様の生物学的もしくは免疫
学的活性例えばインターフェロンαレセプターや抗イン
ターフェロンα抗体との結合能を有するものであればい
ずれでもよく、例えば〔図２〕で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド(II;但しＸは水素原子)が挙げら
れる。さらにインターフェロン−αの生物学的もしくは
免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフ
ラグメントでもよく、たとえばポリペプチド(II)のアミ
ノ末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントやカル
ボキシル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメント
などが挙げられ、さらに上記ポリペプチド(II)の構成ア
ミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換され
たものでもよい。とりわけインターフェロン−αＡが好
ましい。これらのポリペプチドは非グリコシル化ポリペ
プチドであることが好ましい。以下の本願明細書におい
ては、これらのインターフェロン−αＡをＩＦＮ−αＡ
と略記し、ＩＦＮ−αＡのアミノ末端にメチオニン残基
を有するＩＦＮ−αＡをＭet−ＩＦＮ−αＡと略記する
ことがある。上記蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチ
オニン残基を有する蛋白質の混合物としては、混合蛋白
質として５０％以上、好ましくは８０％以上、とりわけ
９９％以上の純度を有するものが用いられる。
トインターフェロン−αと同様の生物学的もしくは免疫
学的活性例えばインターフェロンαレセプターや抗イン
ターフェロンα抗体との結合能を有するものであればい
ずれでもよく、例えば〔図２〕で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド(II;但しＸは水素原子)が挙げら
れる。さらにインターフェロン−αの生物学的もしくは
免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフ
ラグメントでもよく、たとえばポリペプチド(II)のアミ
ノ末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントやカル
ボキシル末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメント
などが挙げられ、さらに上記ポリペプチド(II)の構成ア
ミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置換され
たものでもよい。とりわけインターフェロン−αＡが好
ましい。これらのポリペプチドは非グリコシル化ポリペ
プチドであることが好ましい。以下の本願明細書におい
ては、これらのインターフェロン−αＡをＩＦＮ−αＡ
と略記し、ＩＦＮ−αＡのアミノ末端にメチオニン残基
を有するＩＦＮ−αＡをＭet−ＩＦＮ−αＡと略記する
ことがある。上記蛋白質とそのアミノ末端にさらにメチ
オニン残基を有する蛋白質の混合物としては、混合蛋白
質として５０％以上、好ましくは８０％以上、とりわけ
９９％以上の純度を有するものが用いられる。
【００１４】本発明においては、上記混合物を等電点の
差異に基づく分離手段に付すことによりこれらを相互分
離することができる。なお、実施例１記載の方法によれ
ば、ＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の等電点はそれぞれ
７.７および７.５と算出された。また、実施例６記載の
方法によれば、ＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡ
の等電点は、それぞれ６.２および６.３と算出された。
本発明における等電点の差異に基づく分離手段として
は、等電点の差が０.０１〜０.２程度である蛋白質を相
互に分離する方法であればどんなものでも適用でき、た
とえばアンホラインを利用する密度勾配等電点電気泳動
法,ゲル等電点電気泳動法,等速度電気泳動法などの電場
の中で蛋白質を泳動させる方法やクロマトホーカシング
法,ＦＰＬＣ法(Ｆast Protein Liquid Chromatograph
y),ＤＥＡＥ(diethylaminoethyl)−,ＣＭ(carboxymethy
l)−またはＳＰ(スルホプロピル)−イオン交換カラムク
ロマトグラフ法などの、溶出カラム等の荷電担体に付加
した蛋白質を、pＨ勾配または塩濃度勾配を作成して等
電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担体から蛋白
質を順に脱離して溶出させる方法など自体公知の方法や
これらを組合せた方法などが挙げられる。これらの分離
法に用いられる試薬および器具類はいずれも市販されて
いるものであり容易に入手可能である。たとえばアンホ
ラインはＬＫＢ社(スエ−デン)から、ゲル等電点分離法
に用いるゲルはセファデックスＩＥＦとしてファルマシ
ア社から、またＰＡＧ(ポリアクリルアミドゲル)プレー
トとしてＬＫＢ社から、クロマトホーカシング法の担体
および溶出緩衝液はポリバッファー交換体ＰＢＥ９４,
同ＰＢＥ １１８やポリバッファー７４,ポリバッファー
９６としてファルマシア社(スエ−デン)から、ＦＰＬＣ
法に用いるたとえばモノＰカラムやモノＱカラムおよび
溶出用緩衝液はファルマシア社から、ＤＥＡＥ−イオン
交換体はＤＥＡＥ−トヨパールとして東洋曹達工業(株)
から、ＣＭ−イオン交換体はＣＭ−トヨパールとして東
洋曹達工業(株)から、ＳＰイオン交換体はＳＰ−５ＰＷ
として東洋曹達工業(株)からあるいはＳＰ−セファデッ
クスとしてファルマシア社から入手できる。〔メソッズ
・イン・エンザイモロジ−(Methods in Enzymology, 第５
巻,３−２７頁(１９６２年)〕。
差異に基づく分離手段に付すことによりこれらを相互分
離することができる。なお、実施例１記載の方法によれ
ば、ＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の等電点はそれぞれ
７.７および７.５と算出された。また、実施例６記載の
方法によれば、ＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡ
の等電点は、それぞれ６.２および６.３と算出された。
本発明における等電点の差異に基づく分離手段として
は、等電点の差が０.０１〜０.２程度である蛋白質を相
互に分離する方法であればどんなものでも適用でき、た
とえばアンホラインを利用する密度勾配等電点電気泳動
法,ゲル等電点電気泳動法,等速度電気泳動法などの電場
の中で蛋白質を泳動させる方法やクロマトホーカシング
法,ＦＰＬＣ法(Ｆast Protein Liquid Chromatograph
y),ＤＥＡＥ(diethylaminoethyl)−,ＣＭ(carboxymethy
l)−またはＳＰ(スルホプロピル)−イオン交換カラムク
ロマトグラフ法などの、溶出カラム等の荷電担体に付加
した蛋白質を、pＨ勾配または塩濃度勾配を作成して等
電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担体から蛋白
質を順に脱離して溶出させる方法など自体公知の方法や
これらを組合せた方法などが挙げられる。これらの分離
法に用いられる試薬および器具類はいずれも市販されて
いるものであり容易に入手可能である。たとえばアンホ
ラインはＬＫＢ社(スエ−デン)から、ゲル等電点分離法
に用いるゲルはセファデックスＩＥＦとしてファルマシ
ア社から、またＰＡＧ(ポリアクリルアミドゲル)プレー
トとしてＬＫＢ社から、クロマトホーカシング法の担体
および溶出緩衝液はポリバッファー交換体ＰＢＥ９４,
同ＰＢＥ １１８やポリバッファー７４,ポリバッファー
９６としてファルマシア社(スエ−デン)から、ＦＰＬＣ
法に用いるたとえばモノＰカラムやモノＱカラムおよび
溶出用緩衝液はファルマシア社から、ＤＥＡＥ−イオン
交換体はＤＥＡＥ−トヨパールとして東洋曹達工業(株)
から、ＣＭ−イオン交換体はＣＭ−トヨパールとして東
洋曹達工業(株)から、ＳＰイオン交換体はＳＰ−５ＰＷ
として東洋曹達工業(株)からあるいはＳＰ−セファデッ
クスとしてファルマシア社から入手できる。〔メソッズ
・イン・エンザイモロジ−(Methods in Enzymology, 第５
巻,３−２７頁(１９６２年)〕。
【００１５】市販のたとえばＰＡＧプレート(245×110
×1mm,ＬＫＢ社製)を用いるゲル等電点電気泳動分離法
ではＰＡＧプレートとしてpＨ3.5.−9.5用プレート,pＨ
5.5−8.5用プレートなどを、陽極液として１Ｍリン酸,
0.4Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液などを、陰極液として１Ｍ水酸
化ナトリウム,0.1Ｍ水酸化ナトリウムなどを使用する。
通常プレート１枚あたり１０〜１０００μgの蛋白質を
のせて、電力は１〜２００Ｗ,好ましくは１０〜５０Ｗ
で、温度は０〜２０℃,好ましくは２〜５℃で泳動を行
う。泳動時間は０.５〜５０時間,通常は１.５〜５時間
である。また市販のたとえばモノＰカラム(0.5×２０c
m,ファルマシア社製)を用いるＦＰＬＣ法では平衡化緩
衝液として、たとえば0.025Ｍジエタノールアミン−塩
酸緩衝液(pＨ9.5),0.075Ｍトリスー酢酸緩衝液(pＨ9.3)
などを用い、溶出緩衝液として１％(v／v)ファルマライ
ト(８−10．5)−5.2％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸
緩衝液(pＨ7.0〜 8.0),１０％(v／v)ポリバッファー９
６−塩酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)および１０％(v／v)ポリ
バッファー９６−酢酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)などを用い
る。通常、０.１〜 １０mgの蛋白質をのせて、１〜５０
ml／hの、好ましくは１０〜３０ml／hの流速でＦＰＬＣ
を行う。
×1mm,ＬＫＢ社製)を用いるゲル等電点電気泳動分離法
ではＰＡＧプレートとしてpＨ3.5.−9.5用プレート,pＨ
5.5−8.5用プレートなどを、陽極液として１Ｍリン酸,
0.4Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液などを、陰極液として１Ｍ水酸
化ナトリウム,0.1Ｍ水酸化ナトリウムなどを使用する。
通常プレート１枚あたり１０〜１０００μgの蛋白質を
のせて、電力は１〜２００Ｗ,好ましくは１０〜５０Ｗ
で、温度は０〜２０℃,好ましくは２〜５℃で泳動を行
う。泳動時間は０.５〜５０時間,通常は１.５〜５時間
である。また市販のたとえばモノＰカラム(0.5×２０c
m,ファルマシア社製)を用いるＦＰＬＣ法では平衡化緩
衝液として、たとえば0.025Ｍジエタノールアミン−塩
酸緩衝液(pＨ9.5),0.075Ｍトリスー酢酸緩衝液(pＨ9.3)
などを用い、溶出緩衝液として１％(v／v)ファルマライ
ト(８−10．5)−5.2％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸
緩衝液(pＨ7.0〜 8.0),１０％(v／v)ポリバッファー９
６−塩酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)および１０％(v／v)ポリ
バッファー９６−酢酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)などを用い
る。通常、０.１〜 １０mgの蛋白質をのせて、１〜５０
ml／hの、好ましくは１０〜３０ml／hの流速でＦＰＬＣ
を行う。
【００１６】クロマトホーカシング法ではゲルとして市
販のＰＢＥ１１８およびＰＢＥ９４(ファルマシア社製)
などを用い、平衡化緩衝液として0.025Ｍトリエチルア
ミン−塩酸緩衝液(pＨ11.0),0.025Ｍジエタノールアミ
ン−塩酸緩衝液(pＨ9.4)および0.025Ｍジエタノールア
ミン−酢酸緩衝液(pＨ9.4)などを、溶出緩衝液として2.
2％(v／v)ファルマライト(８−10.5)−塩酸緩衝液(pＨ
7.0〜8.0), １０％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩
衝液(pＨ7.0〜8.0)および１０％(v／v)ポリバッファー
９６−酢酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)などを用いる。カラム
のベッド容積としては蛋白質１gあたり0.01〜0.1,好ま
しくは１００〜１０００mlのものを用い、流速はＳＶ＝
0.01〜１０,好ましくはＳＶ＝0.1〜1.0でクロマトフォ
ーカシングを行う。カラム温度は０〜３０℃,好ましく
は２〜５℃に保つのがよい。本発明の分離法によれば、
蛋白質とそれにメチオニン残基を付加した蛋白質(Ｍet
−蛋白質)はその等電点の差異に従って、電場中で泳動
するかもしくはpＨ勾配をつけたカラム中の担体から順
に脱離して溶出されるかして互いに分離される。特にp
Ｈ勾配や塩濃度勾配をつけずに、イオン交換体を用いる
イソクラチック溶出法を適用しても分離しうる。所望に
より上記の方法に従って分離した蛋白質のみを含む画分
およびそれにさらにメチオニン残基が付加した蛋白質を
含む画分から実質的に純粋な蛋白質およびそれにさらに
メチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)をそれ
ぞれ採取することができる。この目的のためには、自体
公知の塩折法,疎水クロマトグラフ法,ゲルろ過法,イオ
ン交換クロマトグラフ法や高速液体クロマトグラフ法な
どの蛋白質の精製に一般的に用いられる方法を適宜組み
合わせて用いればよい。
販のＰＢＥ１１８およびＰＢＥ９４(ファルマシア社製)
などを用い、平衡化緩衝液として0.025Ｍトリエチルア
ミン−塩酸緩衝液(pＨ11.0),0.025Ｍジエタノールアミ
ン−塩酸緩衝液(pＨ9.4)および0.025Ｍジエタノールア
ミン−酢酸緩衝液(pＨ9.4)などを、溶出緩衝液として2.
2％(v／v)ファルマライト(８−10.5)−塩酸緩衝液(pＨ
7.0〜8.0), １０％(v／v)ポリバッファー９６−塩酸緩
衝液(pＨ7.0〜8.0)および１０％(v／v)ポリバッファー
９６−酢酸緩衝液(pＨ6.0〜7.0)などを用いる。カラム
のベッド容積としては蛋白質１gあたり0.01〜0.1,好ま
しくは１００〜１０００mlのものを用い、流速はＳＶ＝
0.01〜１０,好ましくはＳＶ＝0.1〜1.0でクロマトフォ
ーカシングを行う。カラム温度は０〜３０℃,好ましく
は２〜５℃に保つのがよい。本発明の分離法によれば、
蛋白質とそれにメチオニン残基を付加した蛋白質(Ｍet
−蛋白質)はその等電点の差異に従って、電場中で泳動
するかもしくはpＨ勾配をつけたカラム中の担体から順
に脱離して溶出されるかして互いに分離される。特にp
Ｈ勾配や塩濃度勾配をつけずに、イオン交換体を用いる
イソクラチック溶出法を適用しても分離しうる。所望に
より上記の方法に従って分離した蛋白質のみを含む画分
およびそれにさらにメチオニン残基が付加した蛋白質を
含む画分から実質的に純粋な蛋白質およびそれにさらに
メチオニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)をそれ
ぞれ採取することができる。この目的のためには、自体
公知の塩折法,疎水クロマトグラフ法,ゲルろ過法,イオ
ン交換クロマトグラフ法や高速液体クロマトグラフ法な
どの蛋白質の精製に一般的に用いられる方法を適宜組み
合わせて用いればよい。
【００１７】本発明は、遺伝子工学技術で製造した蛋白
質を、そのＮ−Ｍet類似体など対応するＭet−蛋白質を
実質的に含まないよう分離することを初めて可能ならし
めたものである。本発明により製造される蛋白質は、対
応するＭet−蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２
％以下、とりわけ１以下しか含まないのである。同様
に、本発明は遺伝子工学技術で製造した Ｍet−蛋白質
を、その対応する蛋白質を実質的に含まないよう分離す
ることを初めて可能ならしめたものである。本発明によ
り製造される Ｍet−蛋白質は、対応する蛋白質を重量
比で３％以下、好ましくは２％以下、とりわけ１％以下
しか含まないものである。
質を、そのＮ−Ｍet類似体など対応するＭet−蛋白質を
実質的に含まないよう分離することを初めて可能ならし
めたものである。本発明により製造される蛋白質は、対
応するＭet−蛋白質を重量比で３％以下、好ましくは２
％以下、とりわけ１以下しか含まないのである。同様
に、本発明は遺伝子工学技術で製造した Ｍet−蛋白質
を、その対応する蛋白質を実質的に含まないよう分離す
ることを初めて可能ならしめたものである。本発明によ
り製造される Ｍet−蛋白質は、対応する蛋白質を重量
比で３％以下、好ましくは２％以下、とりわけ１％以下
しか含まないものである。
【００１８】これまでＭet−ＩＬ−２およびＭet−ＩＦ
Ｎ−αＡを蛋白質として分離したとの報告はなく、本発
明ははじめて高度に精製されたＭet−ＩＬ−２蛋白質お
よびＭet−ＩＦＮ−αＡ蛋白質をも提供するものであ
る。本発明により製造される蛋白質およびそれにメチオ
ニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)は、いずれも
天然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学
的活性を有し、高純度に精製されており夾雑蛋白質、発
熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として安全に
使用される。本発明により得られるＩＬ−２およびＭet
−ＩＬ−２はいずれも正常なＴ細胞やナチュラルキラー
細胞をその機能を保持させたまま増殖させる活性を有す
る。したがって、本発明により得られるＩＬ−２および
Ｍet−ＩＬ−２は、それぞれＴ細胞やナチュラルキラー
細胞をインビトロで長期にわたり増殖,継代したりクロ
ーン化するのに使用できる。なお、この性質を利用して
ヒトＩＬ−２の活性を測定することができる。
Ｎ−αＡを蛋白質として分離したとの報告はなく、本発
明ははじめて高度に精製されたＭet−ＩＬ−２蛋白質お
よびＭet−ＩＦＮ−αＡ蛋白質をも提供するものであ
る。本発明により製造される蛋白質およびそれにメチオ
ニン残基が付加した蛋白質(Ｍet−蛋白質)は、いずれも
天然の対応する蛋白質と同様の生物学的もしくは免疫学
的活性を有し、高純度に精製されており夾雑蛋白質、発
熱物質がきわめて少ないので注射剤原体等として安全に
使用される。本発明により得られるＩＬ−２およびＭet
−ＩＬ−２はいずれも正常なＴ細胞やナチュラルキラー
細胞をその機能を保持させたまま増殖させる活性を有す
る。したがって、本発明により得られるＩＬ−２および
Ｍet−ＩＬ−２は、それぞれＴ細胞やナチュラルキラー
細胞をインビトロで長期にわたり増殖,継代したりクロ
ーン化するのに使用できる。なお、この性質を利用して
ヒトＩＬ−２の活性を測定することができる。
【００１９】さらに、本発明により得られるＩＬ−２お
よびＭet−ＩＬ−２は、たとえば腫瘍抗原を認識し、破
壊する抗原特異的なキラーＴ細胞や抗原感作の経験の有
無と無関係に腫瘍を殺す能力をもつところのナチュラル
キラー細胞をインビトロで選択的に増殖させることがで
き、またこのキラーＴ細胞を生体へ移入する際に、本発
明により得られるＩＬー２またはＭet−ＩＬ−２を同時
に接種することにより、その抗腫瘍効果を増大させるこ
とから、温血動物(例、マウス,ラット,ウサギ,犬,ネコ,
ブタ,ウマ,ヒツジ,ウシ,人など)の腫瘍の予防,治療や免
疫機能低下疾患の治療のために用いることができる。本
発明により得られるＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２はそ
れぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。本
発明により得られるＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を腫
瘍の予防,治療剤として用いるには、当該物質を自体公
知の担体と混合希釈して、たとえば注射剤,カプセル剤
などとして非経口的にまたは経口的に投与することがで
きる。さらに、前述したようにインビトロで増殖させた
キラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共にまたは単独
で使用することができる。本発明のＩＬ−２およびＭet
−ＩＬ−２は、公知の天然から分離されたヒトＩＬ−２
と実質的に同じ生物活性を有するのでこれと同様に使用
することができ、細胞のＩＬ−２受容体との解離定数が
きわめて小さいことから、極く小量の投与で良い。Ｔ細
胞をインビトロで増殖させる目的に使用するためには、
本発明のＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を約０.０１〜
１ユニット／ml、好ましくは約０.１〜０.５ユニット／
mlの濃度で培地に添加して用いることができる。インタ
−ロイキン−２の生物活性の測定は、インタ−ロイキン
−２依存性細胞を用いる方法〔バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサ−チ・コミュニケ−ションズ(Bio
chem. Biophys. Res. Commun.)，１０９巻，３６３頁
(１９８２年)〕により行なうことができる。
よびＭet−ＩＬ−２は、たとえば腫瘍抗原を認識し、破
壊する抗原特異的なキラーＴ細胞や抗原感作の経験の有
無と無関係に腫瘍を殺す能力をもつところのナチュラル
キラー細胞をインビトロで選択的に増殖させることがで
き、またこのキラーＴ細胞を生体へ移入する際に、本発
明により得られるＩＬー２またはＭet−ＩＬ−２を同時
に接種することにより、その抗腫瘍効果を増大させるこ
とから、温血動物(例、マウス,ラット,ウサギ,犬,ネコ,
ブタ,ウマ,ヒツジ,ウシ,人など)の腫瘍の予防,治療や免
疫機能低下疾患の治療のために用いることができる。本
発明により得られるＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２はそ
れぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。本
発明により得られるＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を腫
瘍の予防,治療剤として用いるには、当該物質を自体公
知の担体と混合希釈して、たとえば注射剤,カプセル剤
などとして非経口的にまたは経口的に投与することがで
きる。さらに、前述したようにインビトロで増殖させた
キラーＴ細胞やナチュラルキラー細胞と共にまたは単独
で使用することができる。本発明のＩＬ−２およびＭet
−ＩＬ−２は、公知の天然から分離されたヒトＩＬ−２
と実質的に同じ生物活性を有するのでこれと同様に使用
することができ、細胞のＩＬ−２受容体との解離定数が
きわめて小さいことから、極く小量の投与で良い。Ｔ細
胞をインビトロで増殖させる目的に使用するためには、
本発明のＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−２を約０.０１〜
１ユニット／ml、好ましくは約０.１〜０.５ユニット／
mlの濃度で培地に添加して用いることができる。インタ
−ロイキン−２の生物活性の測定は、インタ−ロイキン
−２依存性細胞を用いる方法〔バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサ−チ・コミュニケ−ションズ(Bio
chem. Biophys. Res. Commun.)，１０９巻，３６３頁
(１９８２年)〕により行なうことができる。
【００２０】Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使
用する具体例としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地にヒト末梢血より分離し
たＴ細胞(１×１０6個／ml)およびＸ線 (１５００ラッ
ド)照射したＢ細胞トランスフォーマント(１×１０6個
／ml)を加えて３７℃，５％ ＣＯ2存在下で３日間リン
パ球混合培養を行なって得られるアロ抗原感作Ｔ細胞を
含む細胞浮遊液に本発明のＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−
２を０.１〜０.５ユニット／mlの濃度で加え約一週間ご
とに培地交換しながら約１か月間培養を続ける方法など
が挙げられる。本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよ
びＭet−ＩＦＮ−αＡはいずれも細胞に作用してその細
胞を抗ウイルス状態にする活性を有する。なお、この性
質を利用してヒトＩＦＮ−αＡの活性を測定することが
できる。さらに、本発明により得られるＩＦＮ−αＡお
よびＭet−ＩＦＮ−αＡは、抗ウイルス作用だけでな
く、細胞増殖抑制作用，抗体産生抑制作用，ナチュラル
キラー活性の増強作用などを併せもっている。本発明に
より得られるＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡは
それぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。
本発明により得られるＩＦＮ−αＡまたはＭet−ＩＦＮ
−αＡを治療剤として用いるには、当該物質を自体公知
の担体と混合希釈して、たとえば、注射剤，カプセル剤
などとして非経口的にまたは経口的に投与することがで
きる。投与量は１日当たり１×１０6〜１×１０8ユニッ
ト，好ましくは５×１０7〜６×１０7ユニットである。
用する具体例としては、たとえば、２０％ウシ胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地にヒト末梢血より分離し
たＴ細胞(１×１０6個／ml)およびＸ線 (１５００ラッ
ド)照射したＢ細胞トランスフォーマント(１×１０6個
／ml)を加えて３７℃，５％ ＣＯ2存在下で３日間リン
パ球混合培養を行なって得られるアロ抗原感作Ｔ細胞を
含む細胞浮遊液に本発明のＩＬ−２またはＭet−ＩＬ−
２を０.１〜０.５ユニット／mlの濃度で加え約一週間ご
とに培地交換しながら約１か月間培養を続ける方法など
が挙げられる。本発明により得られるＩＦＮ−αＡおよ
びＭet−ＩＦＮ−αＡはいずれも細胞に作用してその細
胞を抗ウイルス状態にする活性を有する。なお、この性
質を利用してヒトＩＦＮ−αＡの活性を測定することが
できる。さらに、本発明により得られるＩＦＮ−αＡお
よびＭet−ＩＦＮ−αＡは、抗ウイルス作用だけでな
く、細胞増殖抑制作用，抗体産生抑制作用，ナチュラル
キラー活性の増強作用などを併せもっている。本発明に
より得られるＩＦＮ−αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡは
それぞれ夾雑蛋白質による抗原性がなく低毒性である。
本発明により得られるＩＦＮ−αＡまたはＭet−ＩＦＮ
−αＡを治療剤として用いるには、当該物質を自体公知
の担体と混合希釈して、たとえば、注射剤，カプセル剤
などとして非経口的にまたは経口的に投与することがで
きる。投与量は１日当たり１×１０6〜１×１０8ユニッ
ト，好ましくは５×１０7〜６×１０7ユニットである。
【００２１】本願明細書，請求の範囲および図面におい
て、アミノ酸を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃommission on Ｂiochemical Ｎomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸に関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体
を示すものとする。 Ｇly : グリシン Ａla : アラニン Ｖal : バリン Ｌeu : ロイシン Ｉle : イソロイシン Ｓer : セリン Ｔhr : スレオニン Ｃys : システイン 1/2Ｃys : ハーフシスチン mＣys : カルボキシメチルシスティン Ｍet : メチオニン Ｇly : グルタミン酸 Ａsp : アスパラギン酸 Ｌys : リジン Ａrg : アルギニン Ｈis : ヒスチジン Ｐhe : フェニールアラニン Ｔyr : チロシン Ｔrp : トリプトファン Ｐro : プロリン Ａsn : アスパラギン Ｇln : グルタミン Ａsp／Ａsn : アスパラギン酸／アスパラギン Ｇlu／Ｇln : グルタミン酸／グルタミン
て、アミノ酸を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃommission on Ｂiochemical Ｎomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸に関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体
を示すものとする。 Ｇly : グリシン Ａla : アラニン Ｖal : バリン Ｌeu : ロイシン Ｉle : イソロイシン Ｓer : セリン Ｔhr : スレオニン Ｃys : システイン 1/2Ｃys : ハーフシスチン mＣys : カルボキシメチルシスティン Ｍet : メチオニン Ｇly : グルタミン酸 Ａsp : アスパラギン酸 Ｌys : リジン Ａrg : アルギニン Ｈis : ヒスチジン Ｐhe : フェニールアラニン Ｔyr : チロシン Ｔrp : トリプトファン Ｐro : プロリン Ａsn : アスパラギン Ｇln : グルタミン Ａsp／Ａsn : アスパラギン酸／アスパラギン Ｇlu／Ｇln : グルタミン酸／グルタミン
【００２２】
【実施例】以下の実施例および参考例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお参考例に開示した形質転換体、エシェ
リヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＤＨ１／pＴＦ４は財
団法人発酵研究所(ＩＦＯ)にＩＦＯ−１４２９９とし
て、また昭和５９年４月６日から通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)にＦＥＲＭ Ｐ−７５７
８として寄託され、 該寄託がブタペスト条約に基づく寄
託に切換えられて、 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８と
して同研究所に保管されている。また、形質転換体エシ
ェリヒア・コリＮ４８３０／ｐＴＢ２８５はＩＦＯにＩ
ＦＯ−１４４３７として、また昭和６０年４月３０日か
らＦＲＩに ＦＥＲＭＰ−８１９９として寄託され、該
寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられて受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８５２として同研究所に保管され
ている。
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお参考例に開示した形質転換体、エシェ
リヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＤＨ１／pＴＦ４は財
団法人発酵研究所(ＩＦＯ)にＩＦＯ−１４２９９とし
て、また昭和５９年４月６日から通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)にＦＥＲＭ Ｐ−７５７
８として寄託され、 該寄託がブタペスト条約に基づく寄
託に切換えられて、 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８と
して同研究所に保管されている。また、形質転換体エシ
ェリヒア・コリＮ４８３０／ｐＴＢ２８５はＩＦＯにＩ
ＦＯ−１４４３７として、また昭和６０年４月３０日か
らＦＲＩに ＦＥＲＭＰ−８１９９として寄託され、該
寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切換えられて受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８５２として同研究所に保管され
ている。
【００２３】実施例１ ＦＰＬＣによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参
考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の
混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキシン−
２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.
０)(蛋白質濃度，１.１８mg／ml)５ml(５.９mg)を０.０
２５Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pＨ９.４)で平
衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０．５×２０ｃｍ，
ファルマシア社製)にのせ、ついで１％(v／v)ファルマ
ライト(８−１０.５)−５.２％(v／v)ポリバッファー９
６−塩酸緩衝液(pＨ８.０)を用いてモノＰカラムに吸着
したタンパク質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温下、流
速３０ml／hで行った。その結果、〔図２〕に示すよう
にｐＨ８.０で溶出されるピーク１とｐＨ７.９で溶出さ
れるピーク２とに分離された。そこで、これらを分取
後、ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するため、
トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする
高速液体クロマトグラフイーを行った。カラム，ウルト
ラポアＲＰＳＣ(１.０×２５cm，アルテックス社，アメ
リカ)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリ
フルオロ酢酸−９９.９％水;溶出溶媒Ｂ，０.１％トリ
フルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログ
ラム，０分(５５％Ａ＋４５％Ｂ)−４分(５５％Ａ＋４
５％Ｂ)−２８分(４２％Ａ＋５８％Ｂ)−３８分(３４％
Ａ＋６６％Ｂ)−４３分(２０％Ａ＋８０％Ｂ)−４４分
(５５％Ａ＋４５％Ｂ)；溶出速度３.０ml／min。このク
ロマトグラフイーによって得られた溶液をそれぞれ凍結
乾燥に付し、白色粉末を得た。ＦＰＬＣにおけるピーク
１およびピーク２から得られたものを、それぞれＰ１お
よびＰ２となずけた。Ｐ１の収量は１.１２mg(１９.０
％), Ｐ２の収量は３.０１mg(５１.０％)であった。次
に得られたＰ１およびＰ２について蛋白化学的分析を行
った。Ｐ１およびＰ２それぞれ ４５μg(３nmol)を用
い、気相プロテインシークエンサー(アプライド・バイオ
システムズ社製４７０Ａ型)を用いる自動エンドマン分
解法によりＰ１およびＰ２のアミノ末端アミノ酸配列を
決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸(ＰＴＨ
−アミノ酸)はミクロパックＳＰ−Ｃ１８カラム(バリア
ン社製)を用いる高速液体クロマトグラフイーにより同
定した。各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を
〔表１〕に示す。
考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の
混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキシン−
２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.
０)(蛋白質濃度，１.１８mg／ml)５ml(５.９mg)を０.０
２５Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pＨ９.４)で平
衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０．５×２０ｃｍ，
ファルマシア社製)にのせ、ついで１％(v／v)ファルマ
ライト(８−１０.５)−５.２％(v／v)ポリバッファー９
６−塩酸緩衝液(pＨ８.０)を用いてモノＰカラムに吸着
したタンパク質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温下、流
速３０ml／hで行った。その結果、〔図２〕に示すよう
にｐＨ８.０で溶出されるピーク１とｐＨ７.９で溶出さ
れるピーク２とに分離された。そこで、これらを分取
後、ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するため、
トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする
高速液体クロマトグラフイーを行った。カラム，ウルト
ラポアＲＰＳＣ(１.０×２５cm，アルテックス社，アメ
リカ)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリ
フルオロ酢酸−９９.９％水;溶出溶媒Ｂ，０.１％トリ
フルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログ
ラム，０分(５５％Ａ＋４５％Ｂ)−４分(５５％Ａ＋４
５％Ｂ)−２８分(４２％Ａ＋５８％Ｂ)−３８分(３４％
Ａ＋６６％Ｂ)−４３分(２０％Ａ＋８０％Ｂ)−４４分
(５５％Ａ＋４５％Ｂ)；溶出速度３.０ml／min。このク
ロマトグラフイーによって得られた溶液をそれぞれ凍結
乾燥に付し、白色粉末を得た。ＦＰＬＣにおけるピーク
１およびピーク２から得られたものを、それぞれＰ１お
よびＰ２となずけた。Ｐ１の収量は１.１２mg(１９.０
％), Ｐ２の収量は３.０１mg(５１.０％)であった。次
に得られたＰ１およびＰ２について蛋白化学的分析を行
った。Ｐ１およびＰ２それぞれ ４５μg(３nmol)を用
い、気相プロテインシークエンサー(アプライド・バイオ
システムズ社製４７０Ａ型)を用いる自動エンドマン分
解法によりＰ１およびＰ２のアミノ末端アミノ酸配列を
決定した。フェニルチオヒダントインアミノ酸(ＰＴＨ
−アミノ酸)はミクロパックＳＰ−Ｃ１８カラム(バリア
ン社製)を用いる高速液体クロマトグラフイーにより同
定した。各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を
〔表１〕に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】カルボキシル末端アミノ酸の分析は次のよ
うにして行った。すなわちＰ１およびＰ２をヒドラジン
分解用ガラス管にとり、無水ヒドラジンを加えて減圧下
に封管したのち１００℃で６時間加熱した。得られたヒ
ドラジン分解物をベンズアルデヒド処理したのち、遊離
アミノ酸を日立製８３５型アミノ酸分析計により測定し
た。その結果、Ｐ１およびＰ２ともにスレオニンのみが
検出され、回収率はそれぞれ３４.８％および３４.０％
であった。このことからＰ１およびＰ２のカルボキシル
末端アミノ酸はスレオニンと同定された。アミノ酸組成
分析は４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて
減圧下に封管後、１１０℃で２４，４８，７２時間、加
水分解し、日立製８３５型アミノ酸分析計により実施し
た。シスチンおよびシステインは過ギ酸酸化したのち、
減圧下定沸点塩酸中で２４時間加水分解してアミノ酸分
析計によりシステイン酸として定量した。アミノ酸分析
値は２４，４８および７２時間の加水分解で得られた値
を平均して求めた。ただし、セリンおよびスレオニンの
値は加水分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果
を〔表２〕に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析および
アミノ酸組成分析の結果から、Ｐ１は〔図１〕中Ｘ＝水
素原子で示される分子種(ＩＬ−２)を、Ｐ２は〔図１〕
中Ｘ＝メチオニン残基で示される分子種(Ｍet−ＩＬ−
２)をそれぞれ９８％および９９％以上の純度で含んで
いることが確認された。
うにして行った。すなわちＰ１およびＰ２をヒドラジン
分解用ガラス管にとり、無水ヒドラジンを加えて減圧下
に封管したのち１００℃で６時間加熱した。得られたヒ
ドラジン分解物をベンズアルデヒド処理したのち、遊離
アミノ酸を日立製８３５型アミノ酸分析計により測定し
た。その結果、Ｐ１およびＰ２ともにスレオニンのみが
検出され、回収率はそれぞれ３４.８％および３４.０％
であった。このことからＰ１およびＰ２のカルボキシル
末端アミノ酸はスレオニンと同定された。アミノ酸組成
分析は４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて
減圧下に封管後、１１０℃で２４，４８，７２時間、加
水分解し、日立製８３５型アミノ酸分析計により実施し
た。シスチンおよびシステインは過ギ酸酸化したのち、
減圧下定沸点塩酸中で２４時間加水分解してアミノ酸分
析計によりシステイン酸として定量した。アミノ酸分析
値は２４，４８および７２時間の加水分解で得られた値
を平均して求めた。ただし、セリンおよびスレオニンの
値は加水分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果
を〔表２〕に示す。アミノ末端アミノ酸配列分析および
アミノ酸組成分析の結果から、Ｐ１は〔図１〕中Ｘ＝水
素原子で示される分子種(ＩＬ−２)を、Ｐ２は〔図１〕
中Ｘ＝メチオニン残基で示される分子種(Ｍet−ＩＬ−
２)をそれぞれ９８％および９９％以上の純度で含んで
いることが確認された。
【００２６】
【表２】
【００２７】次にアンフォラインＰＡＧプレート(ＬＫ
Ｂ社製)を用いてＰ１およびＰ２の等電点を測定した結
果を〔図３〕に示す。原料として用いたＩＬ−２および
ＭetＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインタ
ーロイキン−２は等電点電気泳動では２本のバンドを示
すのに対し、本実施例で得られたＰ１およびＰ２は、そ
れぞれ互いに泳動距離の異なる１本のバンドとして泳動
された。また、泳動後のＰＡＧプレート断片のpＨを測
定することにより、Ｐ１(ＩＬ−２)の等電点は７.７、
Ｐ２(ＭetＩＬ−２)の等電点は７.５と算出された。さ
らに、得られたＰ２に関して以下のようにしてトリプシ
ン消化を行いペプチドマップを得た。すなわち、５０μ
gのＰ２を含む０.０２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液(pＨ
８.０)１００μlに、１.２５μgのＴＰＣＫ−トリプシ
ン(ワシントン社製，アメリカ)を加えて３７℃で２８時
間反応させた。反応液に１％(v／v)トリフルオロ酢酸４
００μlを加えて反応を停止させた。得られた消化液に
ついて下記の条件下で高速液体クロマトグラフイーを行
い〔図４〕に示すマップを得た。 高速液体クロマトグラフ：バリアン社(アメリカ)５０４
０型 カラム：ヌクレオシル５Ｃ１８(マヘレーナーゲル社
製，西ドイツ) カラム温度：３０℃ 溶出溶媒： Ａ液,０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水(v／v) Ｂ液,０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニト
リル(v／v) 溶出プログラム：０分(８５％Ａ＋１５％Ｂ)−１５分
(７２％Ａ＋２８％Ｂ)-１６分(６４％Ａ＋３６％Ｂ)−
８０分(４０％Ａ＋６０％Ｂ)−８５分(１５％Ａ＋８５
％Ｂ) 〔直線勾配〕 溶出速度：３.０ml／分 検出法：オルトフタールアルデヒド法〔Anal.,Chem.，
第43巻，880頁(1971年)〕によるポストラベル法
Ｂ社製)を用いてＰ１およびＰ２の等電点を測定した結
果を〔図３〕に示す。原料として用いたＩＬ−２および
ＭetＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインタ
ーロイキン−２は等電点電気泳動では２本のバンドを示
すのに対し、本実施例で得られたＰ１およびＰ２は、そ
れぞれ互いに泳動距離の異なる１本のバンドとして泳動
された。また、泳動後のＰＡＧプレート断片のpＨを測
定することにより、Ｐ１(ＩＬ−２)の等電点は７.７、
Ｐ２(ＭetＩＬ−２)の等電点は７.５と算出された。さ
らに、得られたＰ２に関して以下のようにしてトリプシ
ン消化を行いペプチドマップを得た。すなわち、５０μ
gのＰ２を含む０.０２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液(pＨ
８.０)１００μlに、１.２５μgのＴＰＣＫ−トリプシ
ン(ワシントン社製，アメリカ)を加えて３７℃で２８時
間反応させた。反応液に１％(v／v)トリフルオロ酢酸４
００μlを加えて反応を停止させた。得られた消化液に
ついて下記の条件下で高速液体クロマトグラフイーを行
い〔図４〕に示すマップを得た。 高速液体クロマトグラフ：バリアン社(アメリカ)５０４
０型 カラム：ヌクレオシル５Ｃ１８(マヘレーナーゲル社
製，西ドイツ) カラム温度：３０℃ 溶出溶媒： Ａ液,０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％水(v／v) Ｂ液,０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニト
リル(v／v) 溶出プログラム：０分(８５％Ａ＋１５％Ｂ)−１５分
(７２％Ａ＋２８％Ｂ)-１６分(６４％Ａ＋３６％Ｂ)−
８０分(４０％Ａ＋６０％Ｂ)−８５分(１５％Ａ＋８５
％Ｂ) 〔直線勾配〕 溶出速度：３.０ml／分 検出法：オルトフタールアルデヒド法〔Anal.,Chem.，
第43巻，880頁(1971年)〕によるポストラベル法
【００２８】実施例２ クロマトホーカシングによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２
との分離：参考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet
−ＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインター
ロイキンー２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液(ｐＨ５.０)(蛋白質濃度,１.０９mg／ml)５００ml(５
４５mg)を０.０２５Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液
(ｐＨ９.４)で平衡化したＰＢＥ９４(ファルマシア社
製)カラム(２.７×８７cm)にのせ、ついで溶出液として
１％(v／v)ファルマライト(８−１０.５)−５.２％(v／
v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用い
てクロマトホーカシングを行った。なお、この操作は４
℃,流速２００ml／hで行った。その結果、〔図５〕に示
すように、ｐＨ８.５で溶出されるピーク１とｐＨ８.３
で溶出されるピーク２とに分離された。実施例１で示し
た同様の方法でポリバッアーを除去した後のタンパクの
収量はピーク１で９４.８mg(１７.４％)，ピーク２で３
３６mg (６１.６％)であった。また、アミノ末端アミノ
酸分析をダンシル化反応後、塩酸加水分解し、生じたダ
ンシルアミノ酸をミクロパックＳＰカラムを用いる高速
液体クロマトグラフイーで検出する方法で行った結果、
ピーク１はＩＬ−２を９９.６％以上の純度でピーク２
はＭet−ＩＬ−２を９９.５％以上の純度で含んでいる
ことが確認された。
との分離：参考例１(iv)で得られたＩＬ−２およびＭet
−ＩＬ−２の混合物である非グリコシル化ヒトインター
ロイキンー２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液(ｐＨ５.０)(蛋白質濃度,１.０９mg／ml)５００ml(５
４５mg)を０.０２５Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液
(ｐＨ９.４)で平衡化したＰＢＥ９４(ファルマシア社
製)カラム(２.７×８７cm)にのせ、ついで溶出液として
１％(v／v)ファルマライト(８−１０.５)−５.２％(v／
v)ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用い
てクロマトホーカシングを行った。なお、この操作は４
℃,流速２００ml／hで行った。その結果、〔図５〕に示
すように、ｐＨ８.５で溶出されるピーク１とｐＨ８.３
で溶出されるピーク２とに分離された。実施例１で示し
た同様の方法でポリバッアーを除去した後のタンパクの
収量はピーク１で９４.８mg(１７.４％)，ピーク２で３
３６mg (６１.６％)であった。また、アミノ末端アミノ
酸分析をダンシル化反応後、塩酸加水分解し、生じたダ
ンシルアミノ酸をミクロパックＳＰカラムを用いる高速
液体クロマトグラフイーで検出する方法で行った結果、
ピーク１はＩＬ−２を９９.６％以上の純度でピーク２
はＭet−ＩＬ−２を９９.５％以上の純度で含んでいる
ことが確認された。
【００２９】実施例３ ＤＥＡＥ−トヨパールイオン交換クロマトグラフイーに
よるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参考例１(iv)
で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の混合物であ
る非グリコシル化ヒトインターロイキン−２を含む０.
００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.０)(蛋白質濃
度：１.０３mg／ml)１０ml(１０.３mg)に等容の１０mＭ
トリス−塩酸緩衝液(pＨ９.０)を加えてｐＨを８.５に
調整したのち、１０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ８.５)
で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ(東洋曹達
工業(株)製)カラム(１.０×６４cm)にのせ、１０mＭト
リス−塩酸緩衝液(ｐＨ８.５)１Ｌと１０mＭトリス−塩
酸緩衝液(pＨ７.０)１Ｌを用いるｐＨ勾配法で溶出を行
った。なお、この操作は４℃，流速１００ml／hで行っ
た。その結果、分離能はＦＰＬＣやクロマトフォーカシ
ングに比べて劣っていたが、２つのピーク(ピーク１と
ピーク２)が検出された。それぞれのピークが重なり合
わないように、ピーク１は前半分をピーク２は後半分を
分取した。収量はピーク１で０.８２mg(８.０％),ピー
ク２で１.９８mg (１９.２％)であった。また、ダンシ
ル法によるアミノ末端アミノ酸分析の結果、ピーク１は
ＩＬ−２を９０％以上，ピーク２はＭet−ＩＬ−２を９
５％以上含んでいることが確認された。
よるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離：参考例１(iv)
で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２の混合物であ
る非グリコシル化ヒトインターロイキン−２を含む０.
００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(pＨ５.０)(蛋白質濃
度：１.０３mg／ml)１０ml(１０.３mg)に等容の１０mＭ
トリス−塩酸緩衝液(pＨ９.０)を加えてｐＨを８.５に
調整したのち、１０mＭトリス−塩酸緩衝液(pＨ８.５)
で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ(東洋曹達
工業(株)製)カラム(１.０×６４cm)にのせ、１０mＭト
リス−塩酸緩衝液(ｐＨ８.５)１Ｌと１０mＭトリス−塩
酸緩衝液(pＨ７.０)１Ｌを用いるｐＨ勾配法で溶出を行
った。なお、この操作は４℃，流速１００ml／hで行っ
た。その結果、分離能はＦＰＬＣやクロマトフォーカシ
ングに比べて劣っていたが、２つのピーク(ピーク１と
ピーク２)が検出された。それぞれのピークが重なり合
わないように、ピーク１は前半分をピーク２は後半分を
分取した。収量はピーク１で０.８２mg(８.０％),ピー
ク２で１.９８mg (１９.２％)であった。また、ダンシ
ル法によるアミノ末端アミノ酸分析の結果、ピーク１は
ＩＬ−２を９０％以上，ピーク２はＭet−ＩＬ−２を９
５％以上含んでいることが確認された。
【００３０】実施例４ ＦＰＬＣによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２との分離:参
考例１(iii)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２
を含む非グリコシル化ヒトインターロイキンー２部分精
製標品５mlを、０.０２５Ｍジエタノールアミンー塩酸
緩衝液(pＨ９.４)で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム
(０.５×２０cm，ファルマシア社製)にのせ、ついで１
％(v／v)ファルマライト(８〜１０.５)−５.２％(v／v)
ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いて
モノＰカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出速度：
２５ml／h，カラム温度：室温。その結果、ＩＬ−２を
含む画分(ピーク１)とＭet−ＩＬ−２を含む画分(ピー
ク２)とに分離された。ピーク１の活性回収率は２５
％，ピーク２の活性回収率は５４％であった。
考例１(iii)で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ−２
を含む非グリコシル化ヒトインターロイキンー２部分精
製標品５mlを、０.０２５Ｍジエタノールアミンー塩酸
緩衝液(pＨ９.４)で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム
(０.５×２０cm，ファルマシア社製)にのせ、ついで１
％(v／v)ファルマライト(８〜１０.５)−５.２％(v／v)
ポリバッファー９６−塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いて
モノＰカラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出速度：
２５ml／h，カラム温度：室温。その結果、ＩＬ−２を
含む画分(ピーク１)とＭet−ＩＬ−２を含む画分(ピー
ク２)とに分離された。ピーク１の活性回収率は２５
％，ピーク２の活性回収率は５４％であった。
【００３１】実施例５ ＳＰ−５ＰＷカラムによるＩＬ−２とＭet−ＩＬ−２と
の分離：参考例２で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ
−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキ
ン−２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ
５.０，蛋白質濃度１.０３mg/ml)０.５mlを０.０２５Ｍ
リン酸緩衝液(ｐＨ７.４)で平衡化した高速液体クロマ
トグラフィー用ＳＰ−５ ＰＷカラム(０.７５×７.５c
m；東洋曹達社製)にのせ０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ
７.４)を用いて蛋白質を溶出した。 カラム温度は３５℃
に、緩衝液の流速は０.５ml／minに設定した。クロマト
グラフシステムはバリアン社製５５００型液体クロマト
グラフを用いた。 その結果〔図７〕に示すように、非
グリコシル化インターロイキン−２は２つのピーク(ピ
ークＡおよびピークＢ)として溶出された。それぞれの
ピークを分取し(図中太実線で示す)アミノ末端アミノ酸
の分析を行った結果、ピークＡはＭet−ＩＬ−２を、ピ
ークＢはＩＬ−２をそれぞれ９９.５％以上の純度で含
んでいることが確認された。
の分離：参考例２で得られたＩＬ−２およびＭet−ＩＬ
−２の混合物である非グリコシル化ヒトインターロイキ
ン−２を含む０.００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ
５.０，蛋白質濃度１.０３mg/ml)０.５mlを０.０２５Ｍ
リン酸緩衝液(ｐＨ７.４)で平衡化した高速液体クロマ
トグラフィー用ＳＰ−５ ＰＷカラム(０.７５×７.５c
m；東洋曹達社製)にのせ０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ
７.４)を用いて蛋白質を溶出した。 カラム温度は３５℃
に、緩衝液の流速は０.５ml／minに設定した。クロマト
グラフシステムはバリアン社製５５００型液体クロマト
グラフを用いた。 その結果〔図７〕に示すように、非
グリコシル化インターロイキン−２は２つのピーク(ピ
ークＡおよびピークＢ)として溶出された。それぞれの
ピークを分取し(図中太実線で示す)アミノ末端アミノ酸
の分析を行った結果、ピークＡはＭet−ＩＬ−２を、ピ
ークＢはＩＬ−２をそれぞれ９９.５％以上の純度で含
んでいることが確認された。
【００３２】実施例６ ＦＰＬＣによるＩＦＮ−αＡとＭet−ＩＦＮ−αＡとの
分離：参考例３に記載の方法によって得られたＩＦＮ−
αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡの混合物である非グリコ
シル化ヒトインターフェロンαＡを含む０.１２Ｍ塩化
ナトリウム−０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ
５.０)(蛋白質濃度，２.９６mg/ ml)１.０ml(２.９６m
g)を０.０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液(ｐＨ６.７)
で平衡化したＰＤ−１０カラム(１.５×５cm，ファルマ
シア社製)にのせ脱塩を行った。 このようにして得られ
た非グリコシル化ヒトインターフェロンαＡを含む溶出
液(蛋白質濃度，１.５８mg/ml)１.５ml(２.３７mg)を
０.０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液 (ｐＨ６.７)で
平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０.５×２０cm，フ
ァルマシア社製)にのせ、 ついで１０％(V/V)ポリバッフ
ァー７４−塩酸緩衝液(ｐＨ５.５)を用いてモノＰカラ
ムに吸着した蛋白質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温
下、流速３０ml/hで行った。 その結果、〔図８〕に示す
ようにｐＨ５.６で溶出されるピークＩとｐＨ５.４で溶
出されるピークIIとして分離された。そこで、 これらを
分取後、 ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するた
め、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒と
する高速液体クロマトグラフィーを行った。カラム，ウ
ルトラポアＲＰＳＣ(１.０×２５cm，アルテックス社
製)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラ
ム，０分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)−４５分(４５％Ａ＋５
５％Ｂ)−４６分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)；溶出速度３.０
ml/min。このクロマトグラフィーによって得られた溶液
をそれぞれ凍結乾燥に付し、 白色粉末を得た。 ＦＰＬＣ
におけるピークＩおよびピークIIから得られたものを、
それぞれＰＩおよびＰIIとなずけた。ＰＩの収量は０.
７２３mg(２４.４％)，ＰIIの収量は０.９４５mg(３１.
９％)であった。
分離：参考例３に記載の方法によって得られたＩＦＮ−
αＡおよびＭet−ＩＦＮ−αＡの混合物である非グリコ
シル化ヒトインターフェロンαＡを含む０.１２Ｍ塩化
ナトリウム−０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ
５.０)(蛋白質濃度，２.９６mg/ ml)１.０ml(２.９６m
g)を０.０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液(ｐＨ６.７)
で平衡化したＰＤ−１０カラム(１.５×５cm，ファルマ
シア社製)にのせ脱塩を行った。 このようにして得られ
た非グリコシル化ヒトインターフェロンαＡを含む溶出
液(蛋白質濃度，１.５８mg/ml)１.５ml(２.３７mg)を
０.０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液 (ｐＨ６.７)で
平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム(０.５×２０cm，フ
ァルマシア社製)にのせ、 ついで１０％(V/V)ポリバッフ
ァー７４−塩酸緩衝液(ｐＨ５.５)を用いてモノＰカラ
ムに吸着した蛋白質を溶出した。なおＦＰＬＣは室温
下、流速３０ml/hで行った。 その結果、〔図８〕に示す
ようにｐＨ５.６で溶出されるピークＩとｐＨ５.４で溶
出されるピークIIとして分離された。そこで、 これらを
分取後、 ＦＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するた
め、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒と
する高速液体クロマトグラフィーを行った。カラム，ウ
ルトラポアＲＰＳＣ(１.０×２５cm，アルテックス社
製)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラ
ム，０分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)−４５分(４５％Ａ＋５
５％Ｂ)−４６分(６０％Ａ＋４０％Ｂ)；溶出速度３.０
ml/min。このクロマトグラフィーによって得られた溶液
をそれぞれ凍結乾燥に付し、 白色粉末を得た。 ＦＰＬＣ
におけるピークＩおよびピークIIから得られたものを、
それぞれＰＩおよびＰIIとなずけた。ＰＩの収量は０.
７２３mg(２４.４％)，ＰIIの収量は０.９４５mg(３１.
９％)であった。
【００３３】次に得られたＰＩおよびＰIIについて蛋白
化学的分析を行った。ＰＩおよびＰIIを還元カルボキシ
メチル化したのち、それぞれ４０μg(２.１nmol)を用
い、 気相プロティンシークエンサー(アプライド・バイオ
システムズ社製４７０Ａ型)を用いる自動エドマン分解
法によりＰＩおよびＰIIのアミノ末端アミノ酸配列を決
定した。 フェニルチオヒダントインアミノ酸(ＰＴＨ−
アミノ酸)はミクロ パックＳＰ−Ｃ１８カラム(バリア
ン社製)を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同
定した。 各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を
〔表３〕に示す。
化学的分析を行った。ＰＩおよびＰIIを還元カルボキシ
メチル化したのち、それぞれ４０μg(２.１nmol)を用
い、 気相プロティンシークエンサー(アプライド・バイオ
システムズ社製４７０Ａ型)を用いる自動エドマン分解
法によりＰＩおよびＰIIのアミノ末端アミノ酸配列を決
定した。 フェニルチオヒダントインアミノ酸(ＰＴＨ−
アミノ酸)はミクロ パックＳＰ−Ｃ１８カラム(バリア
ン社製)を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同
定した。 各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を
〔表３〕に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】カルボキシル末端アミノ酸の分析を実施例
１と同様にして行った結果、ＰＩおよびＰIIともにグル
タミン酸のみが検出され回収率はそれぞれ１２.５％お
よび１４.３％であった。アミノ酸組成分析を実施例１と
同様にして行った結果を〔表４〕に示す。アミノ末端ア
ミノ酸配列分析およびアミノ酸組成分析の結果から、Ｐ
Ｉは〔図２〕中Ｘ＝メチオニン残基で示される分子種
(Ｍet−ＩＦＮ−αＡ)を、ＰIIは〔図２〕中Ｘ＝水素原
子で示される分子種(ＩＦＮ−αＡ)をそれぞれ９８％以
上の純度で含んでいることが確認された。
１と同様にして行った結果、ＰＩおよびＰIIともにグル
タミン酸のみが検出され回収率はそれぞれ１２.５％お
よび１４.３％であった。アミノ酸組成分析を実施例１と
同様にして行った結果を〔表４〕に示す。アミノ末端ア
ミノ酸配列分析およびアミノ酸組成分析の結果から、Ｐ
Ｉは〔図２〕中Ｘ＝メチオニン残基で示される分子種
(Ｍet−ＩＦＮ−αＡ)を、ＰIIは〔図２〕中Ｘ＝水素原
子で示される分子種(ＩＦＮ−αＡ)をそれぞれ９８％以
上の純度で含んでいることが確認された。
【００３６】
【表４】
【００３７】また、アンフォラインＰＡＧプレート(Ｌ
ＫＢ社製)を用いてＰＩおよびＰIIの等電点を測定した
結果、ＰＩ(Ｍet−ＩＦＮ−αＡ)の等電点は６.３，ＰI
I(ＩＦＮ−αＡ)の等電点は６.２と算出された。
ＫＢ社製)を用いてＰＩおよびＰIIの等電点を測定した
結果、ＰＩ(Ｍet−ＩＦＮ−αＡ)の等電点は６.３，ＰI
I(ＩＦＮ−αＡ)の等電点は６.２と算出された。
【００３８】実施例７ ＩＬ−２注射用製剤：実施例１で得られたＩＬ−２含有
溶液を、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.
０)で平衡化したＣＭトヨパール(東洋曹達工業(株))カ
ラムに無菌条件下で吸着させ、０.１５ＭのＮaＣlを含
む上記緩衝液で溶出させる。溶出液に０.１５ＭＮaＣl
を適宜加えて希釈し、ＨＳＡを０.５％になるように添
加してメンブランフイルター(孔径０.２２μm)を用いて
ろ過後、得られたろ液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に
分注して凍結乾燥し、注射用ＩＬ−２を調製する。本注
射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解する。
溶液を、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ５.
０)で平衡化したＣＭトヨパール(東洋曹達工業(株))カ
ラムに無菌条件下で吸着させ、０.１５ＭのＮaＣlを含
む上記緩衝液で溶出させる。溶出液に０.１５ＭＮaＣl
を適宜加えて希釈し、ＨＳＡを０.５％になるように添
加してメンブランフイルター(孔径０.２２μm)を用いて
ろ過後、得られたろ液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に
分注して凍結乾燥し、注射用ＩＬ−２を調製する。本注
射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解する。
【００３９】実施例８ ＩＦＮ−αＡ注射用製剤：実施例６で得られたＩＦＮ−
αＡ含有溶液を、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液
(ｐＨ５.０)で平衡化したＣＭトヨパール(東洋曹達工業
(株))カラムに無菌条件下で吸着させ、０.１５ＭのＮa
Ｃlを含む上記緩衝液で溶出させる。溶出液に０.１５Ｍ
ＮaＣlを適宜加えて希釈し、ＨＳＡを０.５％になるよ
うに添加してメンブランフィルター(孔径０.２２μm)を
用いてろ過後、得られたろ液を無菌的に１mlずつバイア
ル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用ＩＦＮ−αＡを調製
する。本注射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解す
る。上記注射用製剤は、それぞれ上記精製ＩＬ−２およ
びＩＦＮ−αＡを、精製Ｍet−ＩＬ−２およびＭet−Ｉ
ＦＮ−αＡに置き換えることにより、Ｍet−ＩＬ−２お
よびＭet−ＩＦＮ−αＡの注射用製剤とすることができ
る。
αＡ含有溶液を、０.０２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液
(ｐＨ５.０)で平衡化したＣＭトヨパール(東洋曹達工業
(株))カラムに無菌条件下で吸着させ、０.１５ＭのＮa
Ｃlを含む上記緩衝液で溶出させる。溶出液に０.１５Ｍ
ＮaＣlを適宜加えて希釈し、ＨＳＡを０.５％になるよ
うに添加してメンブランフィルター(孔径０.２２μm)を
用いてろ過後、得られたろ液を無菌的に１mlずつバイア
ル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用ＩＦＮ−αＡを調製
する。本注射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解す
る。上記注射用製剤は、それぞれ上記精製ＩＬ−２およ
びＩＦＮ−αＡを、精製Ｍet−ＩＬ−２およびＭet−Ｉ
ＦＮ−αＡに置き換えることにより、Ｍet−ＩＬ−２お
よびＭet−ＩＦＮ−αＡの注射用製剤とすることができ
る。
【００４０】参考例１ 非グリコシル化ヒトインターロイキン−２の製造I： (i)形質転換体の培養：形質転換体Ｅ．coli ＤＨ１／p
ＴＦ４〔特願昭５８−２２５０７９号(昭和５８年１１
月２８日出願)明細書参照；該出願は特開昭６０−１１
５５２８号公報に対応する〕を２５０ml容三角フラスコ
内のバクト・トリプトン(デイフコ・ラボラトリーズ，ア
メリカ)１％，バクト・イーストエキス(デイフコ・ラボラ
トリーズ，アメリカ)０.５％，食塩０.５％およびテト
ラサイクリン７μg／mlを含む液体培地(ｐＨ７.０)５０
mlに接種して３７℃で１晩回転振盪培養した。この培養
液をカザミノ酸０.５％，グルコース０.５％およびテト
ラサイクリン７μg／mlを含むＭ９培地２.５Lの入った
５L容ジャーファーメンターに移し３７℃で４時間、つ
いで３−βインドリルアクリル酸(２５μg／ml)を添加
して、さらに４時間通気撹拌培養して培養液２.５Lを得
た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃で
凍結して保存した。 (ii)抽出：上記で得た凍結保存菌体１２.１gを７Ｍ塩酸
グアニジン，０.１ＭＴris・ＨＣlを含む抽出液(ｐＨ７.
０)１００mlに均一に懸濁し、４℃で１時間撹拌した。
この溶菌液を２８,０００×gで２０分間遠心分離して上
清９３mlを得た。
ＴＦ４〔特願昭５８−２２５０７９号(昭和５８年１１
月２８日出願)明細書参照；該出願は特開昭６０−１１
５５２８号公報に対応する〕を２５０ml容三角フラスコ
内のバクト・トリプトン(デイフコ・ラボラトリーズ，ア
メリカ)１％，バクト・イーストエキス(デイフコ・ラボラ
トリーズ，アメリカ)０.５％，食塩０.５％およびテト
ラサイクリン７μg／mlを含む液体培地(ｐＨ７.０)５０
mlに接種して３７℃で１晩回転振盪培養した。この培養
液をカザミノ酸０.５％，グルコース０.５％およびテト
ラサイクリン７μg／mlを含むＭ９培地２.５Lの入った
５L容ジャーファーメンターに移し３７℃で４時間、つ
いで３−βインドリルアクリル酸(２５μg／ml)を添加
して、さらに４時間通気撹拌培養して培養液２.５Lを得
た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃で
凍結して保存した。 (ii)抽出：上記で得た凍結保存菌体１２.１gを７Ｍ塩酸
グアニジン，０.１ＭＴris・ＨＣlを含む抽出液(ｐＨ７.
０)１００mlに均一に懸濁し、４℃で１時間撹拌した。
この溶菌液を２８,０００×gで２０分間遠心分離して上
清９３mlを得た。
【００４１】(iii)インターロイキン−２蛋白質の部分
精製：上記で得た上清を０.０１ＭＴris・ＨＣl緩衝液
(ｐＨ８.５)に対して透析後１９,０００×gで１０分間
遠心分離して透析上清９４mlを得た。この透析上清を
０．０１ＭＴris−ＨＣl緩衝液(pＨ８.５)で平衡化した
ＤＥ５２(ＤＥＡＥ−セルロース，ワットマン社製，イ
ギリス)カラム(５０ml容)に通して蛋白を吸着後、ＮaＣ
l濃度直線勾配(０〜０.１５ＭＮaＣl，１Ｌ)を作成して
ＩＬ−２を溶出させ、活性画分５３mlを得た。 (iv)インターロイキン−２蛋白質の精製：上記の活性画
分５３mlをＹＭ−５メンブラン(アミコン社製，アメリ
カ)を用いて４.８mlに濃縮し、０.１ＭＴris・ＨＣl(pＨ
８.０)−１ＭＮaＣl緩衝液で平衡化したセファクリルＳ
−２００(ファルマシア社製，スエーデン)カラム(５０
０ml容)を用いてゲルろ過を行った。活性画分２８mlを
ＹＭ−５メンブランで２.５mlに濃縮した。得られた濃
縮液をウルトラポアＲＰＳＣ(アルテックス社製，アメ
リカ)カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニ
トリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフイー
を行った。カラム，ウルトラポアＲＰＳＣ(４.６×７５
mm)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラ
ム，０分(６８％Ａ＋３２％Ｂ)−２５分(５５％Ａ＋４
５％Ｂ)−３５分(４５％Ａ＋５５％Ｂ)−４５分(３０％
Ａ＋７０％Ｂ)−４８分(１００％Ｂ)；溶出速度，０.８
ml／min；検出波長，２３０nm。本条件下で保持時間約
３９分の活性画分を集め、非グリコシル化ヒトインター
ロイキン−２蛋白質０.５３mg〔比活性,３０,０００Ｕ
／mg，出発材料からの活性回収率，３０.６％；蛋白質
の純度，９９％(デンシトメトリーによる)〕を含む溶液
１０mlを得た。なお上記溶液の凍結乾燥品(白色粉末)の
比活性は２６,０００Ｕ／mgであった。
精製：上記で得た上清を０.０１ＭＴris・ＨＣl緩衝液
(ｐＨ８.５)に対して透析後１９,０００×gで１０分間
遠心分離して透析上清９４mlを得た。この透析上清を
０．０１ＭＴris−ＨＣl緩衝液(pＨ８.５)で平衡化した
ＤＥ５２(ＤＥＡＥ−セルロース，ワットマン社製，イ
ギリス)カラム(５０ml容)に通して蛋白を吸着後、ＮaＣ
l濃度直線勾配(０〜０.１５ＭＮaＣl，１Ｌ)を作成して
ＩＬ−２を溶出させ、活性画分５３mlを得た。 (iv)インターロイキン−２蛋白質の精製：上記の活性画
分５３mlをＹＭ−５メンブラン(アミコン社製，アメリ
カ)を用いて４.８mlに濃縮し、０.１ＭＴris・ＨＣl(pＨ
８.０)−１ＭＮaＣl緩衝液で平衡化したセファクリルＳ
−２００(ファルマシア社製，スエーデン)カラム(５０
０ml容)を用いてゲルろ過を行った。活性画分２８mlを
ＹＭ−５メンブランで２.５mlに濃縮した。得られた濃
縮液をウルトラポアＲＰＳＣ(アルテックス社製，アメ
リカ)カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニ
トリル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフイー
を行った。カラム，ウルトラポアＲＰＳＣ(４.６×７５
mm)；カラム温度，３０℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフ
ルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラ
ム，０分(６８％Ａ＋３２％Ｂ)−２５分(５５％Ａ＋４
５％Ｂ)−３５分(４５％Ａ＋５５％Ｂ)−４５分(３０％
Ａ＋７０％Ｂ)−４８分(１００％Ｂ)；溶出速度，０.８
ml／min；検出波長，２３０nm。本条件下で保持時間約
３９分の活性画分を集め、非グリコシル化ヒトインター
ロイキン−２蛋白質０.５３mg〔比活性,３０,０００Ｕ
／mg，出発材料からの活性回収率，３０.６％；蛋白質
の純度，９９％(デンシトメトリーによる)〕を含む溶液
１０mlを得た。なお上記溶液の凍結乾燥品(白色粉末)の
比活性は２６,０００Ｕ／mgであった。
【００４２】参考例２ 非グリコシル化ヒトインターロイキン−２の製造II： (i)発現用プラスミドの構築：ヒトＩＬ−２遺伝子を有
するプラスミドｐＩＬＯＴ １３５−８〔特願昭５８−
２２５０７９号(昭和58年11月28日出願)明細書(特開昭
６０−１１５５２８号公報に対応)実施例１(vii)参照〕
を制限酵素HgiAIで切断した。 得られた１２９４bpＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて、EcoRIリンカー dTGCCATGAATT
CATGGCA を結合させた。 得られたＤＮＡをEcoRIで消化
し、翻訳開示コドンATG およびヒトＩＬ−２遺伝子を有
するＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、あらかじめ
EcoRI-PstI 部位を消化したptrp781〔ヌクレイック・ア
シズ・リサーチ,第11巻,3077頁(1983)〕にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて挿入した。かくして得られた発現用プラ
スミドｐＴＦ１はtrpプロモーターの下流に翻訳開示コ
ドンとヒトＩＬ−２遺伝子を有する〔図９〕。プラスミ
ドｐＴＦ１を制限酵素StuIで切断し、 Bam HIリンカーと
結合させた。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Bam HIお
よびEcoRIで処理し、 ついでEcoRI−Bam HI部位にλPLプ
ロモーターを有するプラスミドpTB281に挿入した。 かく
して得た発現用プラスミドをpTB285と命名した〔図１
０〕。 (ii)形質転換体の製造：上記で得たプラスミドｐＴＢ２
８５でエシェリヒア・コリＮ４８３０をコーエンらの方
法〔プロシージングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci.USA), 第69
巻, 2110頁(1972)〕に従い形質転換し、上記プラスミド
を含有する形質転換体エシェリヒア・コリＮ４８３０／
ｐＴＢ２８５を得た。
するプラスミドｐＩＬＯＴ １３５−８〔特願昭５８−
２２５０７９号(昭和58年11月28日出願)明細書(特開昭
６０−１１５５２８号公報に対応)実施例１(vii)参照〕
を制限酵素HgiAIで切断した。 得られた１２９４bpＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて、EcoRIリンカー dTGCCATGAATT
CATGGCA を結合させた。 得られたＤＮＡをEcoRIで消化
し、翻訳開示コドンATG およびヒトＩＬ−２遺伝子を有
するＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、あらかじめ
EcoRI-PstI 部位を消化したptrp781〔ヌクレイック・ア
シズ・リサーチ,第11巻,3077頁(1983)〕にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて挿入した。かくして得られた発現用プラ
スミドｐＴＦ１はtrpプロモーターの下流に翻訳開示コ
ドンとヒトＩＬ−２遺伝子を有する〔図９〕。プラスミ
ドｐＴＦ１を制限酵素StuIで切断し、 Bam HIリンカーと
結合させた。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Bam HIお
よびEcoRIで処理し、 ついでEcoRI−Bam HI部位にλPLプ
ロモーターを有するプラスミドpTB281に挿入した。 かく
して得た発現用プラスミドをpTB285と命名した〔図１
０〕。 (ii)形質転換体の製造：上記で得たプラスミドｐＴＢ２
８５でエシェリヒア・コリＮ４８３０をコーエンらの方
法〔プロシージングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci.USA), 第69
巻, 2110頁(1972)〕に従い形質転換し、上記プラスミド
を含有する形質転換体エシェリヒア・コリＮ４８３０／
ｐＴＢ２８５を得た。
【００４３】(iii)形質転換体の培養：形質転換体Ｅ. c
oli Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５を２５０ml容フラスコ内
のバクト・トリプトン(ディフコ・ラボラトリーズ,アメリ
カ)１％,バクト・イーストエキス(ディフコ・ラボラトリ
ーズ,アメリカ)０.５％,食塩０.５％およびアンピシリ
ン５０μg/mlを含む液体培地(pH 7.0)５０mlに接種して
３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液をカザミノ
酸０.５％,グルコース０.５％およびアンピシリン５０
μg/mlを含むＭ９培地２.５Lの入った５L容ジャーファ
ーメンターに移し３５℃で６時間、ついで42℃でさらに
３時間通気撹拌培養して培養液２.５Lを得た。 この培養
液を遠心分離し、 菌体を集め、−８０℃で凍結して保存
した。 (iv)抽出：凍結菌体2０ｇを７Ｍ塩酸グアニジン０.１Ｍ
Tris-HClを含む抽出(pH 7.0)１００mlに均一に懸濁し、
４℃で１時間撹拌した後、２８,０００×ｇで２０分間
遠心分離し上清を得た。
oli Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５を２５０ml容フラスコ内
のバクト・トリプトン(ディフコ・ラボラトリーズ,アメリ
カ)１％,バクト・イーストエキス(ディフコ・ラボラトリ
ーズ,アメリカ)０.５％,食塩０.５％およびアンピシリ
ン５０μg/mlを含む液体培地(pH 7.0)５０mlに接種して
３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液をカザミノ
酸０.５％,グルコース０.５％およびアンピシリン５０
μg/mlを含むＭ９培地２.５Lの入った５L容ジャーファ
ーメンターに移し３５℃で６時間、ついで42℃でさらに
３時間通気撹拌培養して培養液２.５Lを得た。 この培養
液を遠心分離し、 菌体を集め、−８０℃で凍結して保存
した。 (iv)抽出：凍結菌体2０ｇを７Ｍ塩酸グアニジン０.１Ｍ
Tris-HClを含む抽出(pH 7.0)１００mlに均一に懸濁し、
４℃で１時間撹拌した後、２８,０００×ｇで２０分間
遠心分離し上清を得た。
【００４４】(v)インターロイキン−２蛋白質の部分精
製：得られた上清を０.０１Ｍ Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)
に対して透析後１９,０００×ｇで１０分間遠心分離し
て得た上清を０.０１Ｍ Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)で平衡
化したＤＥ５２(ＤＥＡＥ−セルロース,ワットマン社
製,イギリス)カラム(５０ml容)に通して蛋白を吸着後、
NaCl濃度直線勾配(0〜0.15Ｍ NaCl,１L)を作成して、
ＩＬ−２を溶出させ、活性画分を得た。 (vi)インターロイキン−２蛋白質の精製：上記で得られ
た活性画分をYM−５メンブラン(アミコン社製,アメリ
カ)を用いて、５mlに濃縮し、0.1Ｍ Tris-HCl(pH 8.0)
−１Ｍ NaCl緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−200
(ファルマシア製,スウエーデン)カラム(500ml容)を用い
てゲルろ過を行った。 活性画分４０mlをＹＭ−５メンブ
ランで３mlに濃縮した。得られた濃縮液を、ウルトラポ
ア ＲＰＳＣ(アルテックス社製,アメリカ)カラムに吸着
させ、 トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒
とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラム,
ウルトラポアＲＰＳＣ(4.6×75mm);カラム温度,３０℃:
溶出溶媒Ａ, 0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水; 溶出
溶媒Ｂ, 0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリ
ル; 溶出プログラム, ０分(68％A＋32％B)−２５分(55
％A＋45％B)−３５分(45％A＋55％B)−４５分(30％A＋7
0％B)−４８分(100％B); 溶出速度, ０.８ml/min; 検出
波長, ２３０nm。 本条件下で保持時間約３９分の活性画分,Ala−ＩＬ−２
およびＭet−Ａla−ＩＬ−２の混合物１０mlを集めた。
製：得られた上清を０.０１Ｍ Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)
に対して透析後１９,０００×ｇで１０分間遠心分離し
て得た上清を０.０１Ｍ Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)で平衡
化したＤＥ５２(ＤＥＡＥ−セルロース,ワットマン社
製,イギリス)カラム(５０ml容)に通して蛋白を吸着後、
NaCl濃度直線勾配(0〜0.15Ｍ NaCl,１L)を作成して、
ＩＬ−２を溶出させ、活性画分を得た。 (vi)インターロイキン−２蛋白質の精製：上記で得られ
た活性画分をYM−５メンブラン(アミコン社製,アメリ
カ)を用いて、５mlに濃縮し、0.1Ｍ Tris-HCl(pH 8.0)
−１Ｍ NaCl緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−200
(ファルマシア製,スウエーデン)カラム(500ml容)を用い
てゲルろ過を行った。 活性画分４０mlをＹＭ−５メンブ
ランで３mlに濃縮した。得られた濃縮液を、ウルトラポ
ア ＲＰＳＣ(アルテックス社製,アメリカ)カラムに吸着
させ、 トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒
とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カラム,
ウルトラポアＲＰＳＣ(4.6×75mm);カラム温度,３０℃:
溶出溶媒Ａ, 0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水; 溶出
溶媒Ｂ, 0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％アセトニトリ
ル; 溶出プログラム, ０分(68％A＋32％B)−２５分(55
％A＋45％B)−３５分(45％A＋55％B)−４５分(30％A＋7
0％B)−４８分(100％B); 溶出速度, ０.８ml/min; 検出
波長, ２３０nm。 本条件下で保持時間約３９分の活性画分,Ala−ＩＬ−２
およびＭet−Ａla−ＩＬ−２の混合物１０mlを集めた。
【００４５】参考例３ 非グリコシル化ヒトＩＦＮ−αＡの製造： (i)形質転換体の培養：〔図２〕に示すアミノ酸配列を
コードするヒトＩＦＮ−αＡ遺伝子を組入れた発現プラ
スミドを持つエシェリヒア・コリ２９４(ＡＴＣＣ ３１
４４６)/ｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５〔ＥＰＣ公開第４３９
８０号公報実施例Ｉ参照〕を、Ｍ−９培地にグルコース
２５g/L, Ｌ−グルタミン酸ナトリウム４g/L, FeCl3・6H
2O ２７mg/L, CuSO4・5H2O ８mg/L, ZnSO4・7H2O ８mg/L,
ビタミンB1塩酸塩７０mg/L, 塩酸テトラサイクリン５m
g/L, Ｌ−プロリン５０mg/LおよびＬ−ロイシン５０mg/
Lを添加した培地(合成培地)夫々２.５Lを仕込んだ５L容
ジャーファーメンターへ接種し、 通気２.５L/分,撹拌１
０００r.p.m.,３７℃で培養を開始し、 途中ＯＤ３００
０ＫＵ で３３℃, ５０００ＫＵで２９℃,７０００ＫＵ
で２５℃に温度を下げて４８時間培養を続けた。 培養中
溶存酵素濃度は５％以上に保たれた。途中培養液中のグ
ルコース濃度が１％以下に低下した時、２５g/Lの割合
でグルコースを添加した。 (ii)抽出：(i)で得られた培養液２Lを遠心分離して菌体
を集め、 これを１００mlの１０％シュクロース，０.２
Ｍ NaCl, 10mMエチレンジアミンテトラアセテート(ＥＤ
ＴＡ), １０mMスペルミジン，２mM フェニルメチルスル
ホニルフルオライド(ＰＭＳＦ), ０.２mg/mlリゾチーム
を含む５０mM Tris−HCl(pH 7.6)に懸濁し、 ４℃で１時
間撹拌したのち、３７℃で５分間保温し、これをさらに
超音波破砕器(アルテック社製,米国)で、０℃40秒処理
した。 この溶菌液を１１,３００×ｇで１時間遠心分離
して上清９５mlを集めた。
コードするヒトＩＦＮ−αＡ遺伝子を組入れた発現プラ
スミドを持つエシェリヒア・コリ２９４(ＡＴＣＣ ３１
４４６)/ｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５〔ＥＰＣ公開第４３９
８０号公報実施例Ｉ参照〕を、Ｍ−９培地にグルコース
２５g/L, Ｌ−グルタミン酸ナトリウム４g/L, FeCl3・6H
2O ２７mg/L, CuSO4・5H2O ８mg/L, ZnSO4・7H2O ８mg/L,
ビタミンB1塩酸塩７０mg/L, 塩酸テトラサイクリン５m
g/L, Ｌ−プロリン５０mg/LおよびＬ−ロイシン５０mg/
Lを添加した培地(合成培地)夫々２.５Lを仕込んだ５L容
ジャーファーメンターへ接種し、 通気２.５L/分,撹拌１
０００r.p.m.,３７℃で培養を開始し、 途中ＯＤ３００
０ＫＵ で３３℃, ５０００ＫＵで２９℃,７０００ＫＵ
で２５℃に温度を下げて４８時間培養を続けた。 培養中
溶存酵素濃度は５％以上に保たれた。途中培養液中のグ
ルコース濃度が１％以下に低下した時、２５g/Lの割合
でグルコースを添加した。 (ii)抽出：(i)で得られた培養液２Lを遠心分離して菌体
を集め、 これを１００mlの１０％シュクロース，０.２
Ｍ NaCl, 10mMエチレンジアミンテトラアセテート(ＥＤ
ＴＡ), １０mMスペルミジン，２mM フェニルメチルスル
ホニルフルオライド(ＰＭＳＦ), ０.２mg/mlリゾチーム
を含む５０mM Tris−HCl(pH 7.6)に懸濁し、 ４℃で１時
間撹拌したのち、３７℃で５分間保温し、これをさらに
超音波破砕器(アルテック社製,米国)で、０℃40秒処理
した。 この溶菌液を１１,３００×ｇで１時間遠心分離
して上清９５mlを集めた。
【００４６】(iii)ＩＦＮ−αＡ蛋白質の精製：この上
清９５mlを１mM ＥＤＴＡ, ０.１５M NaClを含む２０mM
Tris−HCl(pH7.6)(ＴＥＮ)で３００mlに希釈したのち、
抗ＩＦ−αＡ抗体カラム(20ml)にかけた。ＴＥＮで十
分洗浄したのち、さらに０.１％トゥイーン２０(和光純
薬工業株式会社製)を含む０.２Ｍ酢酸でＩＦ−αＡを溶
出し活性画分を集め、pH４.５に調整したのちＣＭセル
ロースカラムに吸着させ、十分洗浄後、０.１５M NaCl
を含む０.０２５M酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.0)にて
溶出した。 再び活性画分を集めて凍結乾燥に付し３２０
mgのヒト白血球ＩＦ−αＡ粉末を得た。このもののＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量
は、１９０００±１０００であった。 また、 ここで得ら
れた最終のヒト白血球ＩＦ蛋白質の比活性は２×１０8U
/mg であった。 また、 その他の理化学的性状, アミノ酸
組成,ペプチドマッピングにおいて、 従来の培地で生産
される遺伝子組換えヒト白血球ＩＦと全く同一の挙動を
示した。
清９５mlを１mM ＥＤＴＡ, ０.１５M NaClを含む２０mM
Tris−HCl(pH7.6)(ＴＥＮ)で３００mlに希釈したのち、
抗ＩＦ−αＡ抗体カラム(20ml)にかけた。ＴＥＮで十
分洗浄したのち、さらに０.１％トゥイーン２０(和光純
薬工業株式会社製)を含む０.２Ｍ酢酸でＩＦ−αＡを溶
出し活性画分を集め、pH４.５に調整したのちＣＭセル
ロースカラムに吸着させ、十分洗浄後、０.１５M NaCl
を含む０.０２５M酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.0)にて
溶出した。 再び活性画分を集めて凍結乾燥に付し３２０
mgのヒト白血球ＩＦ−αＡ粉末を得た。このもののＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量
は、１９０００±１０００であった。 また、 ここで得ら
れた最終のヒト白血球ＩＦ蛋白質の比活性は２×１０8U
/mg であった。 また、 その他の理化学的性状, アミノ酸
組成,ペプチドマッピングにおいて、 従来の培地で生産
される遺伝子組換えヒト白血球ＩＦと全く同一の挙動を
示した。
【００４７】
【発明の効果】本発明により蛋白質と該蛋白質にさらに
メチオニン残基が付加した蛋白質との相互分離が可能で
ある。該分離方法により得られる蛋白質は、それぞれ医
薬品等として有用である。
メチオニン残基が付加した蛋白質との相互分離が可能で
ある。該分離方法により得られる蛋白質は、それぞれ医
薬品等として有用である。
【００４８】
【配列番号：１】 配列の長さ：１３３−１３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列の特徴：Ｘは水素原子またはメチオニン残基を示
す。 配列 X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 5 １０
１５ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ ３５ ４０
４５ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ５０ ５５
６０ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ８５
９０ ９５ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ １００ １０５
１１０ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ １１５ １２０
１２５ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ １３０
す。 配列 X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 5 １０
１５ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ ２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ ３５ ４０
４５ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ５０ ５５
６０ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ８５
９０ ９５ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ １００ １０５
１１０ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ １１５ １２０
１２５ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ １３０
【００４９】
【配列番号：２】 配列の長さ：１６５−１６６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列の特徴：Ｘは水素原子またはメチオニン残基を示す 配列 Ｘ−Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ５ １０
１５ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ２０ ２５
３０ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｐｈｅ ３５ ４０
４５ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ ５０ ５５
６０ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ ８５
９０ ９５ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｍｅｔ １００ １０５
１１０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ １１５ １２０
１２５ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ １３０ １３５
１４０ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ １６５
ｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ５ １０
１５ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ２０ ２５
３０ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｐｈｅ ３５ ４０
４５ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ ５０ ５５
６０ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ ８５
９０ ９５ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｍｅｔ １００ １０５
１１０ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ １１５ １２０
１２５ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ １３０ １３５
１４０ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ １６５
【図１】参考例１で得られた非グルコシル化ヒトインタ
ーロイキシン−２蛋白質のアミノ酸配列(図中Ｘは、水
素原子またはメチオニン残基を表わす)を示す。
ーロイキシン−２蛋白質のアミノ酸配列(図中Ｘは、水
素原子またはメチオニン残基を表わす)を示す。
【図２】参考例３で得られた非グリコシル化ヒトインタ
ーフェロン−αＡ蛋白質のアミノ酸配列(図中Ｘは、水
素原子またはメチオニン残基を表わす)を示す。
ーフェロン−αＡ蛋白質のアミノ酸配列(図中Ｘは、水
素原子またはメチオニン残基を表わす)を示す。
【図３】実施例１におけるＦＰＬＣの結果を示す。
【図４】実施例１における等電点電気泳動の結果を示
す。
す。
【図５】実施例１におけるトリプシン消化ペプチドマッ
ピングの結果を示す。
ピングの結果を示す。
【図６】実施例２におけるクロマトホーカシングの結果
を示す。
を示す。
【図７】実施例５におけるＳＰ−５ＰＷイオン交換クロ
マトグラフィーの結果を示す。
マトグラフィーの結果を示す。
【図８】実施例６におけるＦＰＬＣの結果を示す。
【図９】参考例３におけるプラスミドｐＴＦ１の構築図
を示す。
を示す。
【図１０】参考例３におけるｐＴＢ２８５の構築図を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/52 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/52 ＺＮＡ 14/575 14/575 14/745 14/745 14/76 14/76
Claims (26)
- 【請求項１】蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が
付加し、該蛋白質と同様の生理活性を有する蛋白質の混
合物を等電点の差異に基づく分離手段に付すことを特徴
とする蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付加した蛋
白質との相互分離方法。 - 【請求項２】分離工程が(i)電場の中で蛋白質の混合物
を泳動させる方法、または(ii)荷電担体に付加した蛋白
質の混合物を、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を作成して等
電点の差異をもたらす荷電の相異に従って担体から順に
脱離して溶出させる方法である請求項１記載の分離方
法。 - 【請求項３】電場の中で蛋白質の混合物を泳動させる方
法が、密度勾配等電点電気泳動法,ゲル等電点電気泳動
法または等速度電気泳動法である請求項２記載の分離方
法。 - 【請求項４】荷電担体に付加した蛋白質の混合物を荷電
の相異に従って担体から順に脱離して溶出させる方法
が、クロマトホ−カシング法,ファ−スト・プロテイン
・リキッド・クロマトグラフ法,ジエチルアミノエチル
−イオン交換カラムクロマトグラフ法,カルボキシメチ
ル−イオン交換カラムクロマトグラフ法またはスルホプ
ロピル−イオン交換カラムクロマトグラフ法である請求
項２記載の分離方法。 - 【請求項５】メチオニン残基が付加した蛋白質が、アミ
ノ末端に付加したメチオニン残基を有する蛋白質である
請求項１記載の分離方法。 - 【請求項６】付加したメチオニン残基が、蛋白質のアミ
ノ末端のみである請求項５記載の分離方法。 - 【請求項７】蛋白質および該蛋白質にメチオニン残基が
付加した蛋白質が、遺伝子工学技術で製造された蛋白質
である請求項１記載の分離方法。 - 【請求項８】蛋白質が、サイトカイン,ペプチドホルモ
ン,病原性微生物抗原蛋白質, 酵素または血中蛋白成分
である請求項１記載の分離方法。 - 【請求項９】蛋白質の分子量が約３,０００〜５０,００
０である請求項１記載の分離方法。 - 【請求項１０】分子量が５,０００〜３０,０００である
請求項９記載の分離方法。 - 【請求項１１】蛋白質が３０〜５００のアミノ酸からな
る蛋白質である請求項１記載の分離方法。 - 【請求項１２】５０〜３００のアミノ酸からなる蛋白質
である請求項１１記載の分離方法。 - 【請求項１３】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質の等電点が約４〜１１である請求項１記載
の分離方法。 - 【請求項１４】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質の等電点が約５〜８である請求項１記載の
分離方法。 - 【請求項１５】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質との等電点の差が約０.０１以上である請
求項１記載の分離方法。 - 【請求項１６】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質との等電点の差が約０.１以上である請求
項１記載の分離方法。 - 【請求項１７】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質との等電点の差が約０.０１〜０.２である
請求項１記載の分離方法。 - 【請求項１８】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基を有
する蛋白質が非グリコシル化蛋白質である請求項１記載
の分離方法。 - 【請求項１９】蛋白質がサイトカインである請求項１記
載の分離方法。 - 【請求項２０】サイトカインがインタ−フェロンである
請求項１９記載の分離方法。 - 【請求項２１】インタ−フェロンがインタ−フェロン−
αである請求項２０記載の分離方法。 - 【請求項２２】インタ−フェロン−αが図２(但しＸは
水素原子を示す)で表わされるアミノ酸配列からなる非
グリコシル化蛋白質である請求項２１記載の分離方法。 - 【請求項２３】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質の混合物の純度が約５０％以上である請求
項１記載の分離方法。 - 【請求項２４】蛋白質と該蛋白質にメチオニン残基が付
加した蛋白質の混合物の純度が約９９％以上である請求
項１記載の分離方法。 - 【請求項２５】非グリコシル化インタ−フェロン−αＡ
とそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を有する非グ
リコシル化インタ−フェロン−αＡとの混合物を、ファ
−スト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフ法に付
し、非グリコシル化インタ−フェロン−αＡとそのアミ
ノ末端にさらにメチオニン残基を有する非グリコシル化
インタ−フェロン−αＡとを相互に分離する請求項１記
載の分離方法。 - 【請求項２６】非グリコシル化インタ−フェロン−αＡ
が図２(但しＸは水素原子を示す)で表わされる非グリコ
シル化インタ−フェロン−αＡである請求項２５記載の
分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8186491A JPH09100296A (ja) | 1984-09-26 | 1996-07-17 | 蛋白質の相互分離方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1984/000460 WO1986002068A1 (fr) | 1984-09-26 | 1984-09-26 | Separation mutuelle de proteines |
| MC84/00460 | 1985-05-21 | ||
| MC85/00274 | 1985-05-21 | ||
| PCT/JP1985/000274 WO1986007063A1 (fr) | 1985-05-21 | 1985-05-21 | Separation de deux proteines |
| JP8186491A JPH09100296A (ja) | 1984-09-26 | 1996-07-17 | 蛋白質の相互分離方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205873A Division JPH0694476B2 (ja) | 1984-09-26 | 1985-09-17 | 蛋白質の相互分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09100296A true JPH09100296A (ja) | 1997-04-15 |
Family
ID=27304404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8186491A Pending JPH09100296A (ja) | 1984-09-26 | 1996-07-17 | 蛋白質の相互分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09100296A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021004261A (ja) * | 2009-06-26 | 2021-01-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 天然の免疫グロブリン形式を有する容易に単離される二重特異性抗体 |
-
1996
- 1996-07-17 JP JP8186491A patent/JPH09100296A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1981 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021004261A (ja) * | 2009-06-26 | 2021-01-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 天然の免疫グロブリン形式を有する容易に単離される二重特異性抗体 |
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