JPH09100300A - 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列 - Google Patents
抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列Info
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- JPH09100300A JPH09100300A JP7278266A JP27826695A JPH09100300A JP H09100300 A JPH09100300 A JP H09100300A JP 7278266 A JP7278266 A JP 7278266A JP 27826695 A JP27826695 A JP 27826695A JP H09100300 A JPH09100300 A JP H09100300A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトの疾患の予防、治療、診断などの医学お
よび薬学分野や、生化学試薬、生体高分子の精製試薬な
どの薬理学、生化学分野などの広い分野において有用な
抗原特異的ヒト免疫グロブリンの可変領域の構造を解明
する。 【解決手段】 ヒト子宮癌患者のB細胞とヒトリンパ芽
球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株CLN/SUZ H11が産生
する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンCLN-IgGに対
するマウス抗イディオタイプ抗体Idio33と結合性を有
し、ヒト癌細胞の増殖を抑制するヒト免疫グロブリンCL
N''1-IgMの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列なら
びにその遺伝子の塩基配列。
よび薬学分野や、生化学試薬、生体高分子の精製試薬な
どの薬理学、生化学分野などの広い分野において有用な
抗原特異的ヒト免疫グロブリンの可変領域の構造を解明
する。 【解決手段】 ヒト子宮癌患者のB細胞とヒトリンパ芽
球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株CLN/SUZ H11が産生
する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンCLN-IgGに対
するマウス抗イディオタイプ抗体Idio33と結合性を有
し、ヒト癌細胞の増殖を抑制するヒト免疫グロブリンCL
N''1-IgMの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列なら
びにその遺伝子の塩基配列。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、たとえば、ヒトの
疾患の予防、治療、診断などの医学および薬学分野や、
生化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化
学分野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免
疫グロブリンの可変領域の構造に関する。さらに詳しく
は、本発明は、ヒト子宮癌患者のB細胞とヒトリンパ芽
球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株CLN/SUZ H11が産生
する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンCLN-IgGに対
するマウス抗イディオタイプ抗体Idio33と結合性を有
し、ヒト癌細胞の増殖を抑制するヒト免疫グロブリンCL
N''1-IgMの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列なら
びにその遺伝子の塩基配列に関する。
疾患の予防、治療、診断などの医学および薬学分野や、
生化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化
学分野などの広い分野において有用な抗原特異的ヒト免
疫グロブリンの可変領域の構造に関する。さらに詳しく
は、本発明は、ヒト子宮癌患者のB細胞とヒトリンパ芽
球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株CLN/SUZ H11が産生
する癌細胞抗原特異的ヒト免疫グロブリンCLN-IgGに対
するマウス抗イディオタイプ抗体Idio33と結合性を有
し、ヒト癌細胞の増殖を抑制するヒト免疫グロブリンCL
N''1-IgMの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列なら
びにその遺伝子の塩基配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞融合あるいは細胞の不死化によるモ
ノクローナル抗体作成の技術の開発以来、多くの有用な
抗体が主にマウスなどを使って得られてきた。そのなか
でも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫瘍
抗原の解析などの基礎研究への利用のほかに、治療、血
清診断、標識化抗体による腫瘍の画像診断などに利用さ
れ、その利用価値はきわめて高い。しかし、マウスなど
の異種抗体はヒトにとって異物であり、ヒトに頻回投与
することは投与抗体に対する免疫反応を惹起し、その結
果、副作用ならびに抗体の治療または予防効果の低下を
引き起こす。以上のことから、ヒトの癌の予防、治療、
体内診断など、実際に抗体をヒトに投与する臨床分野を
考えると、ヒト型の抗体を用いることが望ましい。しか
し、ヒト型のモノクローナル抗体は、その作製が困難で
あることから、現在のところほとんど実用に供されてい
ない。
ノクローナル抗体作成の技術の開発以来、多くの有用な
抗体が主にマウスなどを使って得られてきた。そのなか
でも悪性腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体は、腫瘍
抗原の解析などの基礎研究への利用のほかに、治療、血
清診断、標識化抗体による腫瘍の画像診断などに利用さ
れ、その利用価値はきわめて高い。しかし、マウスなど
の異種抗体はヒトにとって異物であり、ヒトに頻回投与
することは投与抗体に対する免疫反応を惹起し、その結
果、副作用ならびに抗体の治療または予防効果の低下を
引き起こす。以上のことから、ヒトの癌の予防、治療、
体内診断など、実際に抗体をヒトに投与する臨床分野を
考えると、ヒト型の抗体を用いることが望ましい。しか
し、ヒト型のモノクローナル抗体は、その作製が困難で
あることから、現在のところほとんど実用に供されてい
ない。
【０００３】このような状況の中で本発明者の一人は、
特開昭58-201994号公報（特公平01-59878号公報）、特
開昭59-135898号公報および特開昭59-137497号公報に詳
しく開示されているごとく、ヒト癌細胞に高い反応性を
有するヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株CLN/SU
Z H11 （ATCC No. HB8307）を樹立した。この細胞株が
産生する抗体（CLN-IgGと命名）は、抗体クラスがIgG、
アイソタイプがγ1型およびk型であり、免疫組織学的に
癌細胞の表面に存在する癌抗原に結合し、なおかつ癌細
胞の増殖を抑制する効果をもつという興味ある知見が得
られている。現在、該抗体の全アミノ酸配列およびDNA
塩基配列が明らかになっている（特開平４−３４６７９
２号公報）。
特開昭58-201994号公報（特公平01-59878号公報）、特
開昭59-135898号公報および特開昭59-137497号公報に詳
しく開示されているごとく、ヒト癌細胞に高い反応性を
有するヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株CLN/SU
Z H11 （ATCC No. HB8307）を樹立した。この細胞株が
産生する抗体（CLN-IgGと命名）は、抗体クラスがIgG、
アイソタイプがγ1型およびk型であり、免疫組織学的に
癌細胞の表面に存在する癌抗原に結合し、なおかつ癌細
胞の増殖を抑制する効果をもつという興味ある知見が得
られている。現在、該抗体の全アミノ酸配列およびDNA
塩基配列が明らかになっている（特開平４−３４６７９
２号公報）。
【０００４】一方、イェルネ（Jerne）がいわゆるネッ
トワーク説を提唱して以来、抗体の可変領域の構造に関
して様々な研究が進められてきた。抗体は、その可変領
域（抗原結合部位）で抗原と結合する。したがって認識
する抗原の表面の抗原決定基の構造に応じて抗体の可変
領域も多様な三次元的構造を持つことになる。したがっ
て、抗体自身も抗原と考えることができ、その場合抗体
の可変領域の構造をイディオタイプ、また抗体のイディ
オタイプに対する抗体を抗イディオタイプ抗体と呼ぶ。
また、抗原決定基に当たる構造をイディオトープと呼
ぶ。イディオタイプはイディオトープの集まったもので
あるといえる。抗体（Ab1）に対する抗イディオタイプ
抗体（Ab2）の中には、Ab1と抗原との結合を競合的に阻
害し、また、Ab1が認識する抗原と似たイディオトープ
をもつ抗体、いわゆる抗原の内部イメージ(internal im
age)としての構造を有する抗体が存在することが報告さ
れている。
トワーク説を提唱して以来、抗体の可変領域の構造に関
して様々な研究が進められてきた。抗体は、その可変領
域（抗原結合部位）で抗原と結合する。したがって認識
する抗原の表面の抗原決定基の構造に応じて抗体の可変
領域も多様な三次元的構造を持つことになる。したがっ
て、抗体自身も抗原と考えることができ、その場合抗体
の可変領域の構造をイディオタイプ、また抗体のイディ
オタイプに対する抗体を抗イディオタイプ抗体と呼ぶ。
また、抗原決定基に当たる構造をイディオトープと呼
ぶ。イディオタイプはイディオトープの集まったもので
あるといえる。抗体（Ab1）に対する抗イディオタイプ
抗体（Ab2）の中には、Ab1と抗原との結合を競合的に阻
害し、また、Ab1が認識する抗原と似たイディオトープ
をもつ抗体、いわゆる抗原の内部イメージ(internal im
age)としての構造を有する抗体が存在することが報告さ
れている。
【０００５】本発明者らは、特開平7-101999号公報に詳
しく開示されているごとく、上記のCLN-IgGに対するマ
ウス抗イディオタイプ抗体5種（Idio3, Idio17, Idio2
0, Idio27, Idio33)を創製し、その可変部アミノ酸配列
およびDNA塩基配列を明らかにした。これら抗体は、ク
ラスがIgG、アイソタイプがγ1型およびk型であり、CLN
-IgGが癌細胞と結合するのを阻害することから、抗原の
内部イメージを有する抗体であることが明らかとなっ
た。
しく開示されているごとく、上記のCLN-IgGに対するマ
ウス抗イディオタイプ抗体5種（Idio3, Idio17, Idio2
0, Idio27, Idio33)を創製し、その可変部アミノ酸配列
およびDNA塩基配列を明らかにした。これら抗体は、ク
ラスがIgG、アイソタイプがγ1型およびk型であり、CLN
-IgGが癌細胞と結合するのを阻害することから、抗原の
内部イメージを有する抗体であることが明らかとなっ
た。
【０００６】Ab2は、さらに、自身のイディオタイプに
結合する抗体（Ab3）を誘導することが知られている。
誘導された抗体は元の抗体（Ab1）の抗-抗イディオタイ
プ抗体と呼ばれる。Ab3の中にはAb1と類似した構造を持
つ抗体が含まれており、Ab1が認識するものと同じ抗原
を認識する。したがって、抗原の内部イメージをもつAb
2を抗原として用いれば、元の抗原と結合するAb3を作製
することが可能である。すなわち、理論上、抗癌ヒトモ
ノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製
し、さらにその抗イディオタイプ抗体と結合するヒトモ
ノクローナル抗体を作製することで、新たな抗癌ヒトモ
ノクローナル抗体を作製できることになる。モノクロー
ナル抗体作製には細胞融合法や細胞不死化法を用いるこ
とができる。このようにして得られる新規ヒトモノクロ
ーナル抗体は、癌治療、診断等において利用可能であ
る。
結合する抗体（Ab3）を誘導することが知られている。
誘導された抗体は元の抗体（Ab1）の抗-抗イディオタイ
プ抗体と呼ばれる。Ab3の中にはAb1と類似した構造を持
つ抗体が含まれており、Ab1が認識するものと同じ抗原
を認識する。したがって、抗原の内部イメージをもつAb
2を抗原として用いれば、元の抗原と結合するAb3を作製
することが可能である。すなわち、理論上、抗癌ヒトモ
ノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製
し、さらにその抗イディオタイプ抗体と結合するヒトモ
ノクローナル抗体を作製することで、新たな抗癌ヒトモ
ノクローナル抗体を作製できることになる。モノクロー
ナル抗体作製には細胞融合法や細胞不死化法を用いるこ
とができる。このようにして得られる新規ヒトモノクロ
ーナル抗体は、癌治療、診断等において利用可能であ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】抗癌ヒトモノクローナ
ル抗体を臨床利用するためには、以下に述べる如き解決
すべき課題がある。
ル抗体を臨床利用するためには、以下に述べる如き解決
すべき課題がある。
【０００８】１）モノクローナル抗体産生細胞株は、一
般に継代とともにその抗体産性能が低下することが知ら
れている。また、一般的にいって、ヒトハイブリドーマ
はマウスのそれと比較して抗体の産生量が低い。ヒトモ
ノクローナル抗体を癌治療や診断に用いる場合、大量の
抗体が必要であり、この問題の解決は必須である。
般に継代とともにその抗体産性能が低下することが知ら
れている。また、一般的にいって、ヒトハイブリドーマ
はマウスのそれと比較して抗体の産生量が低い。ヒトモ
ノクローナル抗体を癌治療や診断に用いる場合、大量の
抗体が必要であり、この問題の解決は必須である。
【０００９】２）現在の免疫学の知見によれば、モノク
ローナル抗体がヒト癌細胞に結合し、抗体それ自体の作
用で癌細胞の増殖を抑制し、あるいは癌細胞を死滅させ
る機構が知られている。さらにはまた、補体もしくはK
細胞やマクロファージなどの助けを借りて癌細胞の増殖
を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こすことが知られてい
る。しかし、これらの効果は実際のところ期待されるほ
ど強力ではなく、それ故さらに抗体の抗癌活性を上昇さ
せる試みが必要である。
ローナル抗体がヒト癌細胞に結合し、抗体それ自体の作
用で癌細胞の増殖を抑制し、あるいは癌細胞を死滅させ
る機構が知られている。さらにはまた、補体もしくはK
細胞やマクロファージなどの助けを借りて癌細胞の増殖
を抑制し、癌細胞の死滅を引き起こすことが知られてい
る。しかし、これらの効果は実際のところ期待されるほ
ど強力ではなく、それ故さらに抗体の抗癌活性を上昇さ
せる試みが必要である。
【００１０】以上のような課題の解決手段、すなわち抗
体産生量の改善と抗体の抗癌活性の向上を具体化する一
つの手段として遺伝子操作による方法がある。たとえば
１）の問題の場合、抗体遺伝子をクローニングしたあ
と、動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入
し、抗体遺伝子を発現させ、抗体を多量に得る方法によ
って解決することが考えられ、また、２）の問題の場
合、抗体遺伝子を人為的に変えることにとって、抗体の
種々の機能、たとえば抗原との結合親和性や、免疫担当
細胞を介した抗癌活性あるいは組織浸潤性を上昇させる
ように改変したり、さらには本来抗体が持たない機能、
たとえば細胞毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体
分子やその断片に付加することで、より抗癌活性の高い
分子をデザインすることが考えられる。
体産生量の改善と抗体の抗癌活性の向上を具体化する一
つの手段として遺伝子操作による方法がある。たとえば
１）の問題の場合、抗体遺伝子をクローニングしたあ
と、動物細胞や大腸菌などの宿主細胞に遺伝子を導入
し、抗体遺伝子を発現させ、抗体を多量に得る方法によ
って解決することが考えられ、また、２）の問題の場
合、抗体遺伝子を人為的に変えることにとって、抗体の
種々の機能、たとえば抗原との結合親和性や、免疫担当
細胞を介した抗癌活性あるいは組織浸潤性を上昇させる
ように改変したり、さらには本来抗体が持たない機能、
たとえば細胞毒性、酵素活性、免疫誘導活性などを抗体
分子やその断片に付加することで、より抗癌活性の高い
分子をデザインすることが考えられる。
【００１１】これらの目的を達成するためには、抗体遺
伝子の分離、さらに構造の解明が重要である。しかしな
がら、これまでのところ、抗癌ヒトモノクローナル抗体
のAb3に相当する新規抗癌ヒトモノクローナル抗体に関
する報告はなく、したがってAb3を構成する軽鎖と重鎖
の構造、さらには抗原と特異的に結合する機能を有する
可変領域の遺伝子構造に関しては全く知られていない。
伝子の分離、さらに構造の解明が重要である。しかしな
がら、これまでのところ、抗癌ヒトモノクローナル抗体
のAb3に相当する新規抗癌ヒトモノクローナル抗体に関
する報告はなく、したがってAb3を構成する軽鎖と重鎖
の構造、さらには抗原と特異的に結合する機能を有する
可変領域の遺伝子構造に関しては全く知られていない。
【００１２】本発明の主たる目的は、抗癌ヒトモノクロ
ーナル抗体のAb3に相当する新規抗癌ヒトモノクローナ
ル抗体の創製と該モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖
の遺伝子構造を解明することにある。
ーナル抗体のAb3に相当する新規抗癌ヒトモノクローナ
ル抗体の創製と該モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖
の遺伝子構造を解明することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、CL
N-IgGを投与した脳腫瘍患者末梢血リンパ球とヒトリン
パ芽球HIH/TO1を細胞融合し、得られるヒト-ヒトハイブ
リドーマからCLN-IgGの抗イディオタイプ抗体Idio33に
対して結合する抗体を産生するものを選択し、その結
果、IgMを分泌するハイブリドーマHT2を得た。さらに、
このHT2が分泌するヒトモノクローナル抗体IgM（CLN''1
-IgMと命名）は、ヒトグリオーマ（膠芽腫）細胞の増殖
を抑制する活性を有していた。ハイブリドーマHT2か
ら、該抗体CLN''1-IgMの軽鎖および重鎖をコードするcD
NAを分離し、そのDNA塩基配列を解明し、また、その配
列より該抗体の軽鎖と重鎖可変領域のアミノ酸配列を決
定し、本発明を完成するに至った。
N-IgGを投与した脳腫瘍患者末梢血リンパ球とヒトリン
パ芽球HIH/TO1を細胞融合し、得られるヒト-ヒトハイブ
リドーマからCLN-IgGの抗イディオタイプ抗体Idio33に
対して結合する抗体を産生するものを選択し、その結
果、IgMを分泌するハイブリドーマHT2を得た。さらに、
このHT2が分泌するヒトモノクローナル抗体IgM（CLN''1
-IgMと命名）は、ヒトグリオーマ（膠芽腫）細胞の増殖
を抑制する活性を有していた。ハイブリドーマHT2か
ら、該抗体CLN''1-IgMの軽鎖および重鎖をコードするcD
NAを分離し、そのDNA塩基配列を解明し、また、その配
列より該抗体の軽鎖と重鎖可変領域のアミノ酸配列を決
定し、本発明を完成するに至った。
【００１４】かくして、本発明によれば下記のアミノ酸
配列 Gly Pro Lys Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Phe Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val を有する超可変領域ＣＤＲ３を含み、そして好ましく
は、 （１）下記のアミノ酸配列 Gly Tyr Tyr Met His を有する超可変領域ＣＤＲ１及び／又は （２）下記のアミノ酸配列 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly を有する超可変領域ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴と
する免疫グロブリン重鎖可変領域断片、並びにこれをコ
ードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片が提供される。
配列 Gly Pro Lys Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Phe Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val を有する超可変領域ＣＤＲ３を含み、そして好ましく
は、 （１）下記のアミノ酸配列 Gly Tyr Tyr Met His を有する超可変領域ＣＤＲ１及び／又は （２）下記のアミノ酸配列 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly を有する超可変領域ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴と
する免疫グロブリン重鎖可変領域断片、並びにこれをコ
ードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片が提供される。
【００１５】また、本発明によれば、下記のアミノ酸配
列 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Thr を有する超可変領域ＣＤＲ３を含み、そして好ましくは （１）下記のアミノ酸配列 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn を有する超可変領域ＣＤＲ１及び／又は （２）下記のアミノ酸配列 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser を有する超可変領域ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴と
する免疫グロブリン軽鎖可変領域断片並びにそれをコー
ドするＤＮＡ及びＲＮＡ断片が提供される。
列 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Thr を有する超可変領域ＣＤＲ３を含み、そして好ましくは （１）下記のアミノ酸配列 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn を有する超可変領域ＣＤＲ１及び／又は （２）下記のアミノ酸配列 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser を有する超可変領域ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴と
する免疫グロブリン軽鎖可変領域断片並びにそれをコー
ドするＤＮＡ及びＲＮＡ断片が提供される。
【００１６】本発明においては、ヒト-ヒトハイブリド
ーマHT2からmRNAを調製し、逆転写酵素によりRNAをcDNA
へ変換した後、さらにそのcDNAを鋳型にPCR法を用いて
抗体遺伝子の増幅を行ない、増幅したDNA断片をプラス
ミッドに組み込みクローニング後、単離した大腸菌クロ
ーンより精製したプラスミッドの挿入DNAの塩基配列を
決定し、その塩基配列からアミノ酸配列を決定した。以
下これらの工程についてさらに詳細に説明する。
ーマHT2からmRNAを調製し、逆転写酵素によりRNAをcDNA
へ変換した後、さらにそのcDNAを鋳型にPCR法を用いて
抗体遺伝子の増幅を行ない、増幅したDNA断片をプラス
ミッドに組み込みクローニング後、単離した大腸菌クロ
ーンより精製したプラスミッドの挿入DNAの塩基配列を
決定し、その塩基配列からアミノ酸配列を決定した。以
下これらの工程についてさらに詳細に説明する。
【００１７】［１］mRNAの単離 ヒト-ヒトハイブリドーマを適当な条件下、例えば37℃
炭酸ガス濃度５％の条件下に、10％牛胎児血清を含む培
養液、例えばRDFまたはRPMI1640培地中で培養増殖さ
せ、得られる細胞を遠心分離によって集めた後、細胞か
ら常法、例えばMolecular Cloning (第２版、Sambrook
ら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）7
章に記載されている方法により細胞質RNAまたはmRNAを
抽出する。得られるRNAはさらにcDNA合成の鋳型として
利用できる。本発明においては、具体的にはヒト-ヒト
ハイブリドーマHT2からmRNAを抽出し、cDNAの合成に供
した。
炭酸ガス濃度５％の条件下に、10％牛胎児血清を含む培
養液、例えばRDFまたはRPMI1640培地中で培養増殖さ
せ、得られる細胞を遠心分離によって集めた後、細胞か
ら常法、例えばMolecular Cloning (第２版、Sambrook
ら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）7
章に記載されている方法により細胞質RNAまたはmRNAを
抽出する。得られるRNAはさらにcDNA合成の鋳型として
利用できる。本発明においては、具体的にはヒト-ヒト
ハイブリドーマHT2からmRNAを抽出し、cDNAの合成に供
した。
【００１８】［２］cDNAの合成 上記［１］の工程で得られるmRNAを鋳型とし、ポリAに
対応するオリゴdT、ランダムな配列をもつ合成ヌクレオ
チド、あるいは特定の配列を持つ合成ヌクレオチドをプ
ライマーとして、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPの存在下
で逆転写酵素によりmRNAと相補的な一本鎖DNAを合成す
る。本発明の具体的操作においては、上記［１］の工程
で得られるmRNAを鋳型とし抗体遺伝子をコードするプラ
イマーを用いてcDNAを合成し、抗体遺伝子増幅の工程に
供した。
対応するオリゴdT、ランダムな配列をもつ合成ヌクレオ
チド、あるいは特定の配列を持つ合成ヌクレオチドをプ
ライマーとして、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPの存在下
で逆転写酵素によりmRNAと相補的な一本鎖DNAを合成す
る。本発明の具体的操作においては、上記［１］の工程
で得られるmRNAを鋳型とし抗体遺伝子をコードするプラ
イマーを用いてcDNAを合成し、抗体遺伝子増幅の工程に
供した。
【００１９】［３］PCRによる抗体遺伝子の増幅 上記［２］の工程で得られる一本鎖cDNAを鋳型に、抗体
遺伝子の配列（例えば抗体遺伝子の定常領域、可変領
域、リーダー領域をコードする配列など）をプライマー
としてdATP、 dGTP、dTTP、dCTPおよびTaqポリメラーゼ
の存在下でPCR反応を行ない抗体遺伝子を増幅する。本
発明においては好適には、上記［２］の工程で得られる
一本鎖cDNAを鋳型に、抗体の軽鎖および重鎖のリーダー
領域および可変領域の配列に相当する合成DNAオリゴマ
ーを使い抗体遺伝子を増幅した。
遺伝子の配列（例えば抗体遺伝子の定常領域、可変領
域、リーダー領域をコードする配列など）をプライマー
としてdATP、 dGTP、dTTP、dCTPおよびTaqポリメラーゼ
の存在下でPCR反応を行ない抗体遺伝子を増幅する。本
発明においては好適には、上記［２］の工程で得られる
一本鎖cDNAを鋳型に、抗体の軽鎖および重鎖のリーダー
領域および可変領域の配列に相当する合成DNAオリゴマ
ーを使い抗体遺伝子を増幅した。
【００２０】［４］PCR増幅DNA断片のクローニング 上記［３］の工程で得られるPCR増幅DNA断片を、直接ま
たは制限酵素処理後、各種ベクター、例えばpUC18、pCR
1000、pCRIITMのようなプラスミッドベクター、M13ファ
ージなどのファージベクター、あるいはpUC118, pBlues
cript SK+等のファージミッドベクターに連結し挿入断
片を含むベクターを作成する。さらに、そのベクターで
大腸菌を形質転換し、目的とする抗体遺伝子断片を含む
大腸菌コロニーを得る。本発明の具体的操作において
は、上記［３］の工程で得られるPCR増幅DNA断片をpCRI
ITMプラスミッドベクターに連結した後、大腸菌INVαF'
を形質転換し、抗体遺伝子断片を含む大腸菌コロニーを
得た。
たは制限酵素処理後、各種ベクター、例えばpUC18、pCR
1000、pCRIITMのようなプラスミッドベクター、M13ファ
ージなどのファージベクター、あるいはpUC118, pBlues
cript SK+等のファージミッドベクターに連結し挿入断
片を含むベクターを作成する。さらに、そのベクターで
大腸菌を形質転換し、目的とする抗体遺伝子断片を含む
大腸菌コロニーを得る。本発明の具体的操作において
は、上記［３］の工程で得られるPCR増幅DNA断片をpCRI
ITMプラスミッドベクターに連結した後、大腸菌INVαF'
を形質転換し、抗体遺伝子断片を含む大腸菌コロニーを
得た。
【００２１】［５］DNAの塩基配列及びアミノ酸配列の
決定 上記［４］の工程で得られる抗体遺伝子断片を含む大腸
菌コロニーから、抗体遺伝子断片DNA塩基配列をサイク
ルシーケンシング法などを用いて決定することができ
る。本発明では、抗体遺伝子断片を含む大腸菌INVαF'
コロニーから抗体遺伝子をPCRで増幅し、増幅断片の塩
基配列をサイクルシーケンシング法により決定した。
決定 上記［４］の工程で得られる抗体遺伝子断片を含む大腸
菌コロニーから、抗体遺伝子断片DNA塩基配列をサイク
ルシーケンシング法などを用いて決定することができ
る。本発明では、抗体遺伝子断片を含む大腸菌INVαF'
コロニーから抗体遺伝子をPCRで増幅し、増幅断片の塩
基配列をサイクルシーケンシング法により決定した。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２３】実施例１：ヒト−ヒトハイブリドーマの作
製 膠芽腫の除去手術後、一週間に一度、投与量1 ｍｇのCL
N-IgGを三週間、静脈内に投与された５６歳男性の末梢
血を採取し、Ficoll-Hypaque（ナカライテスク）に重層
したのち、400 g、３０分の遠心分離によりリンパ球を
分離した。リンパ球はリン酸緩衝液で洗浄後、培養液に
けん濁した。
製 膠芽腫の除去手術後、一週間に一度、投与量1 ｍｇのCL
N-IgGを三週間、静脈内に投与された５６歳男性の末梢
血を採取し、Ficoll-Hypaque（ナカライテスク）に重層
したのち、400 g、３０分の遠心分離によりリンパ球を
分離した。リンパ球はリン酸緩衝液で洗浄後、培養液に
けん濁した。
【００２４】ヒトリンパ芽球HIH/TO1（FERM BP-1884）
と単離したリンパ球を１：５の割合で混合し、そこへ５
０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社）を滴
下し細胞を融合する。融合細胞はヒポキサンチン-アメ
ソプテリン-チミジン（HAT）を含有する培地にけん濁
し、９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）にウ
ェルあたり2 x 105の濃度でまく。融合後７日目にHT培
地に交換し、以後一週間ごとに交換した。その後、融合
細胞の増殖を顕微鏡で観察し、増殖が認められたウェル
の培養液を用いてヒト膠芽腫細胞株U251MGとの結合性を
ELISA反応で確認した。U251MGに対して反応性を有する
抗体を分泌しているハイブリドーマをさらにインターロ
イキン６存在下で限界希釈法によりクローニングした。
と単離したリンパ球を１：５の割合で混合し、そこへ５
０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社）を滴
下し細胞を融合する。融合細胞はヒポキサンチン-アメ
ソプテリン-チミジン（HAT）を含有する培地にけん濁
し、９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）にウ
ェルあたり2 x 105の濃度でまく。融合後７日目にHT培
地に交換し、以後一週間ごとに交換した。その後、融合
細胞の増殖を顕微鏡で観察し、増殖が認められたウェル
の培養液を用いてヒト膠芽腫細胞株U251MGとの結合性を
ELISA反応で確認した。U251MGに対して反応性を有する
抗体を分泌しているハイブリドーマをさらにインターロ
イキン６存在下で限界希釈法によりクローニングした。
【００２５】以上の方法で、ヒト−ヒトハイブリドーマ
HT2を作製した。
HT2を作製した。
【００２６】実施例２：ヒトモノクローナル抗体のアイ
ソタイプの決定 実施例１で得られたヒトハイブリドーマより分泌される
抗体のアイソタイプを以下のように決定した。
ソタイプの決定 実施例１で得られたヒトハイブリドーマより分泌される
抗体のアイソタイプを以下のように決定した。
【００２７】重鎖のアイソタイプ決定においては、抗ヒ
トIgG抗体、抗ヒトIgM抗体（ORGANOTEKNIKA社）をPBSに
て２００倍希釈した溶液を１００μlずつ９６ウエルマ
イクロプレート（ヌンク社）に分注し、37℃、30分間イ
ンキュベートし、0.3％をゼラチンを含むPBS（ゼラチン
緩衝液）で3回洗浄する。
トIgG抗体、抗ヒトIgM抗体（ORGANOTEKNIKA社）をPBSに
て２００倍希釈した溶液を１００μlずつ９６ウエルマ
イクロプレート（ヌンク社）に分注し、37℃、30分間イ
ンキュベートし、0.3％をゼラチンを含むPBS（ゼラチン
緩衝液）で3回洗浄する。
【００２８】1％BSAを含むPBSを200μlずつ分注し、37
℃、30分インキュベートした後、ゼラチン緩衝液で3回
洗浄する。さらに、PBSで100倍希釈したHT2の培養液を1
00μlずつ分注し、37℃、30分インキュベートする。ゼ
ラチン緩衝液で3回洗浄した後、パーオキシダーゼ結合
抗ヒトIgG抗体、パーオキシダーゼ結合抗ヒトIgM抗体
（BIOSOURCE INTERNATIONAL社）をそれぞれPBSで3000倍
希釈した溶液を100μlずつ分注する。37℃、1時間反応
後、ゼラチン緩衝液で3回洗浄し、o-フェニレンジアミ
ン-2HCl 20mgをクエン酸緩衝液（pH5.0）30mlに溶解し
使用直前に6μlの30％H2O2を加えた酵素基質溶液（o-PD
溶液）を50μlずつ分注する。１５分後、5NH2SO4を加
え反応を停止し、492 nmの吸光度を測定した。
℃、30分インキュベートした後、ゼラチン緩衝液で3回
洗浄する。さらに、PBSで100倍希釈したHT2の培養液を1
00μlずつ分注し、37℃、30分インキュベートする。ゼ
ラチン緩衝液で3回洗浄した後、パーオキシダーゼ結合
抗ヒトIgG抗体、パーオキシダーゼ結合抗ヒトIgM抗体
（BIOSOURCE INTERNATIONAL社）をそれぞれPBSで3000倍
希釈した溶液を100μlずつ分注する。37℃、1時間反応
後、ゼラチン緩衝液で3回洗浄し、o-フェニレンジアミ
ン-2HCl 20mgをクエン酸緩衝液（pH5.0）30mlに溶解し
使用直前に6μlの30％H2O2を加えた酵素基質溶液（o-PD
溶液）を50μlずつ分注する。１５分後、5NH2SO4を加
え反応を停止し、492 nmの吸光度を測定した。
【００２９】軽鎖のアイソタイプ決定においては、９６
ウエルマイクロプレート（ヌンク社）にHT2の培養液を1
00μlずつ分注し、37℃、30分インキュベートする。0.3
％のゼラチンを含むPBS（ゼラチン緩衝液）で3回洗浄し
た後、１％BSAを含むPBSを200μlずつ分注する。37℃、
30分インキュベートし、さらにゼラチン緩衝液で3回洗
浄した後、PBSで10000倍希釈したパーオキシダーゼ結合
抗ヒトκ軽鎖抗体およびパーオキシダーゼ結合抗ヒトλ
軽鎖抗体（BIOSOURCE INTERNATIONAL社）を100μlずつ
分注し37℃、30分インキュベートする。ゼラチン緩衝液
で3回洗浄後、o-PD 溶液を50μlずつ加え、１５分後、5
N H2SO4を加え反応を停止し、492 nmの吸光度を測定し
た。
ウエルマイクロプレート（ヌンク社）にHT2の培養液を1
00μlずつ分注し、37℃、30分インキュベートする。0.3
％のゼラチンを含むPBS（ゼラチン緩衝液）で3回洗浄し
た後、１％BSAを含むPBSを200μlずつ分注する。37℃、
30分インキュベートし、さらにゼラチン緩衝液で3回洗
浄した後、PBSで10000倍希釈したパーオキシダーゼ結合
抗ヒトκ軽鎖抗体およびパーオキシダーゼ結合抗ヒトλ
軽鎖抗体（BIOSOURCE INTERNATIONAL社）を100μlずつ
分注し37℃、30分インキュベートする。ゼラチン緩衝液
で3回洗浄後、o-PD 溶液を50μlずつ加え、１５分後、5
N H2SO4を加え反応を停止し、492 nmの吸光度を測定し
た。
【００３０】その結果、ヒト−ヒトハイブリドーマHT-2
が分泌する抗体のアイソタイプは下記表１に示すように
μ、κであった。
が分泌する抗体のアイソタイプは下記表１に示すように
μ、κであった。
【００３１】表１ アイソタイプ 吸光度（492 nm） γ 0.007 μ 0.492 κ 1.258λ 0.013 実施例３：ヒトモノクローナル抗体の精製 ヒト−ヒトハイブリドーマHT2の培養上清３リットル
に、７０％の飽和硫安を添加し、8000 rpm、30分間遠心
分離し沈殿を回収する。回収した沈殿を400 mlの10 mM
PBSにけん濁し、10 mM PBSに対して4℃一晩透析する。
透析内液に再度５０％の飽和硫安を添加し、生じた沈殿
を8000 rpm、30分間遠心分離し回収する。回収した沈殿
を40 mlの10 mM PBSにけん濁し10 mM PBSに対して4℃一
晩透析する。このようにして得られた粗IgM分画をさら
にセファクリルS-300を用いたゲル濾過にかけ、最終精
製IgM分画を取得した。精製IgM(CLN''1-IgM）のポリア
クリルアミドゲル電気泳動パターンを図1に示す。
に、７０％の飽和硫安を添加し、8000 rpm、30分間遠心
分離し沈殿を回収する。回収した沈殿を400 mlの10 mM
PBSにけん濁し、10 mM PBSに対して4℃一晩透析する。
透析内液に再度５０％の飽和硫安を添加し、生じた沈殿
を8000 rpm、30分間遠心分離し回収する。回収した沈殿
を40 mlの10 mM PBSにけん濁し10 mM PBSに対して4℃一
晩透析する。このようにして得られた粗IgM分画をさら
にセファクリルS-300を用いたゲル濾過にかけ、最終精
製IgM分画を取得した。精製IgM(CLN''1-IgM）のポリア
クリルアミドゲル電気泳動パターンを図1に示す。
【００３２】実施例４：ウェスタンブロットによるヒト
モノクローナル抗体CLN''-IgMの認識する抗原の同定 ヒト膠芽腫細胞株U251MG/S*を62.5 mM トリス (pH6.
8)、2％ SDS、5％ 2-メルカプトエタノール、4M尿素を
含む溶液中で超音波破砕し、ついで細胞8 x103〜2x105
相当の破砕液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた。電気泳動後、48 mM トリス、39 mMグリシン、
0.037％ SDS、10％メタノール中で、セミドライ型のブ
ロティング装置を用いてHybond ECL ニトロセルロース
膜（アマーシャム社）へブロティングした。ブロットし
たニトロセルロース膜を10％ BSAを含むTTBS溶液（20 m
M トリス (pH7.5)、0.25 M NaCl、0.3％ Tween-20）に
したし、30分間室温で放置する。TTBS溶液で２回洗浄し
た後、一次抗体（CLN''1-IgM 2μg/ml あるいはCLN-Ig
Ｇ 2μg/ml）と室温、一時間反応させる。さらにTTBS
溶液で3回洗浄した後、二次抗体としてビオチン化抗ヒ
トIgMもしくはビオチン化抗ヒトIgＧ（VECTASTAIN ABC
Kit; VECTOR LABORATORIES)を1000倍希釈したものと反
応させ、洗浄後、さらにアビジンービオチン複合体溶液
とインキュベートする。洗浄後、膜をECL Western blot
ting detection reagent (アマーシャム社）と１分間反
応させ、X線フィルムを重層し記録する。結果を図2に示
す。
モノクローナル抗体CLN''-IgMの認識する抗原の同定 ヒト膠芽腫細胞株U251MG/S*を62.5 mM トリス (pH6.
8)、2％ SDS、5％ 2-メルカプトエタノール、4M尿素を
含む溶液中で超音波破砕し、ついで細胞8 x103〜2x105
相当の破砕液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた。電気泳動後、48 mM トリス、39 mMグリシン、
0.037％ SDS、10％メタノール中で、セミドライ型のブ
ロティング装置を用いてHybond ECL ニトロセルロース
膜（アマーシャム社）へブロティングした。ブロットし
たニトロセルロース膜を10％ BSAを含むTTBS溶液（20 m
M トリス (pH7.5)、0.25 M NaCl、0.3％ Tween-20）に
したし、30分間室温で放置する。TTBS溶液で２回洗浄し
た後、一次抗体（CLN''1-IgM 2μg/ml あるいはCLN-Ig
Ｇ 2μg/ml）と室温、一時間反応させる。さらにTTBS
溶液で3回洗浄した後、二次抗体としてビオチン化抗ヒ
トIgMもしくはビオチン化抗ヒトIgＧ（VECTASTAIN ABC
Kit; VECTOR LABORATORIES)を1000倍希釈したものと反
応させ、洗浄後、さらにアビジンービオチン複合体溶液
とインキュベートする。洗浄後、膜をECL Western blot
ting detection reagent (アマーシャム社）と１分間反
応させ、X線フィルムを重層し記録する。結果を図2に示
す。
【００３３】* ヒト膠芽腫細胞株U251MG/Sは、ヒト膠
芽腫細胞株U-251MGをScidマウスに移植し、形成された
腫瘍を、再度、培養系にもどした細胞株である。U-251M
Gの由来は、Ponten,J.らMed.Biol、 56巻、 184-193 ペ
ージ、1978年の論文に記載されている。
芽腫細胞株U-251MGをScidマウスに移植し、形成された
腫瘍を、再度、培養系にもどした細胞株である。U-251M
Gの由来は、Ponten,J.らMed.Biol、 56巻、 184-193 ペ
ージ、1978年の論文に記載されている。
【００３４】実施例５：細胞増殖抑制効果 10％牛胎児血清（FBS）含有DF培地に5 x 104/mlの濃度
でけん濁したヒト膠芽腫細胞株U251MG/Sを、100μlずつ
９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）にまき、そこ
へCLN''1-IgM、ヒトIgM（INTER-CELL TECHNOLOGIES,In
c.）またはCLN-IgＧを最終濃度37.5〜300μg/mlになる
ように添加した。５％の炭酸ガス濃度、37℃の条件で２
日間培養したのち培養上清を除き、そこへ0.02％EDTA含
有0.25％トリプシンを50μl加え37℃、１５分インキュ
ベートした後、0.1％トリパンブルー溶液を50μl加えけ
ん濁したあと、ヘモサイトメーターで生細胞数を数え
た。結果を図3に示す。
でけん濁したヒト膠芽腫細胞株U251MG/Sを、100μlずつ
９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）にまき、そこ
へCLN''1-IgM、ヒトIgM（INTER-CELL TECHNOLOGIES,In
c.）またはCLN-IgＧを最終濃度37.5〜300μg/mlになる
ように添加した。５％の炭酸ガス濃度、37℃の条件で２
日間培養したのち培養上清を除き、そこへ0.02％EDTA含
有0.25％トリプシンを50μl加え37℃、１５分インキュ
ベートした後、0.1％トリパンブルー溶液を50μl加えけ
ん濁したあと、ヘモサイトメーターで生細胞数を数え
た。結果を図3に示す。
【００３５】実施例６：CLN''1重鎖遺伝子のクローニン
グ ヒト−ヒトハイブリドーマＨＴ２細胞からFast Track m
RNA isolation kit (Invitrogen)を使い、mRNAを単離
し、これを使いRT-PCRを行い、ＣＬＮ”１重鎖遺伝子を
単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液0.5μl(150ng)、1
0 x RT-PCR溶液(500mM KCl, 100mM トリス-HCl(pH9.0),
1％ Triton X-100, 15mM MgCl2)5μl、dNTP(2.5mM) 4
μl、プライマー＃1(10mM) 2μl、プライマー＃2(10m
M)2μl、Taqポリメラーゼ(TAKARA) 0.5μl、RNasin(Pro
mega) 0.5μl、逆転写酵素(TAKARA)0.3μl およびDEPC
処理H2O 35.2μlを混合し、42℃ 30分、95℃ 5分で逆
転写反応を行い、94℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 1分のサ
イクルを 40回くりかえし、さらに72℃ 7分間反応させ
た。このようにして得られたDNA断片をTA cloning kit
(Invitrogen)を使いクローニングした。すなわち、PCR
反応産物1μl、10 x ライゲーションバッファ1μl、pCR
IITM ベクター 2μl（50ng相当）、T4 DNAライゲースお
よび滅菌水6μlを混合したライゲーションミックス溶液
を調製し、12℃で一晩インキュベートした。次いで、0.
5 M β-メルカプトエタノール 2μlを添加したコンピテ
ント大腸菌INVαF'株のけん濁液50μlを準備し、そこへ
上記のライゲーションミックス溶液のうち1μlを加え
る。氷上で３０分放置後、1分間42℃でインキュベート
し、さらに氷上で２分間急冷する。かかる大腸菌溶液に
42℃にあらかじめ暖めておいたSOC培地450μlを加え、3
7℃で１時間振盪培養する。
グ ヒト−ヒトハイブリドーマＨＴ２細胞からFast Track m
RNA isolation kit (Invitrogen)を使い、mRNAを単離
し、これを使いRT-PCRを行い、ＣＬＮ”１重鎖遺伝子を
単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液0.5μl(150ng)、1
0 x RT-PCR溶液(500mM KCl, 100mM トリス-HCl(pH9.0),
1％ Triton X-100, 15mM MgCl2)5μl、dNTP(2.5mM) 4
μl、プライマー＃1(10mM) 2μl、プライマー＃2(10m
M)2μl、Taqポリメラーゼ(TAKARA) 0.5μl、RNasin(Pro
mega) 0.5μl、逆転写酵素(TAKARA)0.3μl およびDEPC
処理H2O 35.2μlを混合し、42℃ 30分、95℃ 5分で逆
転写反応を行い、94℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 1分のサ
イクルを 40回くりかえし、さらに72℃ 7分間反応させ
た。このようにして得られたDNA断片をTA cloning kit
(Invitrogen)を使いクローニングした。すなわち、PCR
反応産物1μl、10 x ライゲーションバッファ1μl、pCR
IITM ベクター 2μl（50ng相当）、T4 DNAライゲースお
よび滅菌水6μlを混合したライゲーションミックス溶液
を調製し、12℃で一晩インキュベートした。次いで、0.
5 M β-メルカプトエタノール 2μlを添加したコンピテ
ント大腸菌INVαF'株のけん濁液50μlを準備し、そこへ
上記のライゲーションミックス溶液のうち1μlを加え
る。氷上で３０分放置後、1分間42℃でインキュベート
し、さらに氷上で２分間急冷する。かかる大腸菌溶液に
42℃にあらかじめ暖めておいたSOC培地450μlを加え、3
7℃で１時間振盪培養する。
【００３６】その間、アンピシリン（50μg/ml）を含む
LBアガープレート上に25μlのX-Gal（40 mg/ml）を塗込
み、完全に浸透するまで37℃でインキュベートしてお
く。
LBアガープレート上に25μlのX-Gal（40 mg/ml）を塗込
み、完全に浸透するまで37℃でインキュベートしてお
く。
【００３７】振盪培養完了した大腸菌培養液200μlを乾
燥したプレート上にスプレッドし、37℃で一晩放置し、
翌日アンピシリン耐性の白色コロニーを得た。なおプラ
イマー＃1および＃2の配列は以下の通りである。
燥したプレート上にスプレッドし、37℃で一晩放置し、
翌日アンピシリン耐性の白色コロニーを得た。なおプラ
イマー＃1および＃2の配列は以下の通りである。
【００３８】 ＃1 ATGGACTGGACCTGGAGGRTCYTCTKC ＃2 AGACGAGGGGGAAAAGGGTT 実施例７：ＣＬＮ”１重鎖遺伝子の塩基配列決定 実施例6で得られたコロニーから、Dynabeads Template
Preparation kit(DYNAL)を使い、塩基配列を決定するた
めのDNA断片を調製した。具体的には、得られたコロニ
ーを爪楊枝の先で拾い上げ、lysis緩衝液(20mM トリス-
HCl pH8.3, 50mMKCl, 0.1％ Tween 20)10μlにけん濁し
た後、96℃で5分間インキュベートし、遠心後の上清を
以下のPCRに用いた。10 x PCR 緩衝液(100mM トリス-HC
l pH8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2)5μl、dNTP(2.5mM) 4
μl、Primer SetA 2μl、溶菌液上清 5μl、Taqポリメ
ラーゼ0.25μl、H2O 33.75μlを混合し、96℃ 30秒、65
℃ 1分、72℃ 2分のサイクルを30回くりかえし反応させ
た。
Preparation kit(DYNAL)を使い、塩基配列を決定するた
めのDNA断片を調製した。具体的には、得られたコロニ
ーを爪楊枝の先で拾い上げ、lysis緩衝液(20mM トリス-
HCl pH8.3, 50mMKCl, 0.1％ Tween 20)10μlにけん濁し
た後、96℃で5分間インキュベートし、遠心後の上清を
以下のPCRに用いた。10 x PCR 緩衝液(100mM トリス-HC
l pH8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2)5μl、dNTP(2.5mM) 4
μl、Primer SetA 2μl、溶菌液上清 5μl、Taqポリメ
ラーゼ0.25μl、H2O 33.75μlを混合し、96℃ 30秒、65
℃ 1分、72℃ 2分のサイクルを30回くりかえし反応させ
た。
【００３９】このようにして得られたDNA断片は、使用
したプライマーの一方の5’末端がビオチン化されてい
るため、一方の5’末端にビオチンが結合した形になっ
ている。このDNA断片を含む溶液40μlをストレプトアビ
ジンの結合したDynabeadsをふくむ溶液40μlを混合して
15分間、室温でインキュベートした。DNAが結合したビ
ーズを磁石で集めた後、上清を取り除き、B&W緩衝液(10
mM トリス-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 2.0M NaCl)40μlにけ
ん濁した。再びビーズを磁石で集めた後、ビーズを0.1M
NaOH10μlにけん濁し、10分間室温でインキュベートし
てビオチン化されたDNAをビーズ側に、ビオチン化され
てないDNAを上清側に分離した。このようにして得られ
た1本鎖DNAを塩基配列決定のための鋳型にして、TAKARA
Taq Cycle Sequencing kit(TAKARA)を使い、塩基配列
を決定した。具体的には、DNAを含むビーズあるいは上
清を5μl、FITC標識プライマー（1pmol/μl、フォワー
ドもしくはリバースを使用）１μl、１０xサイクリング
ミックス溶液２μlおよびTAKARATaq溶液1μlを混合し、
さらに滅菌水1μlを加え最終容量10μlのリアクション
ミックスを作成する。2μlのターミネーションミックス
（A, G, C, T）をあらかじめ分注しておいた４本のチュ
ーブを準備する。上記のリアクションミックスから2μl
ずつとり各チューブに入れる。遠心混合後、10μlのミ
ネラルオイルを重層し、以下の条件でサイクリング反応
を行なう。
したプライマーの一方の5’末端がビオチン化されてい
るため、一方の5’末端にビオチンが結合した形になっ
ている。このDNA断片を含む溶液40μlをストレプトアビ
ジンの結合したDynabeadsをふくむ溶液40μlを混合して
15分間、室温でインキュベートした。DNAが結合したビ
ーズを磁石で集めた後、上清を取り除き、B&W緩衝液(10
mM トリス-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 2.0M NaCl)40μlにけ
ん濁した。再びビーズを磁石で集めた後、ビーズを0.1M
NaOH10μlにけん濁し、10分間室温でインキュベートし
てビオチン化されたDNAをビーズ側に、ビオチン化され
てないDNAを上清側に分離した。このようにして得られ
た1本鎖DNAを塩基配列決定のための鋳型にして、TAKARA
Taq Cycle Sequencing kit(TAKARA)を使い、塩基配列
を決定した。具体的には、DNAを含むビーズあるいは上
清を5μl、FITC標識プライマー（1pmol/μl、フォワー
ドもしくはリバースを使用）１μl、１０xサイクリング
ミックス溶液２μlおよびTAKARATaq溶液1μlを混合し、
さらに滅菌水1μlを加え最終容量10μlのリアクション
ミックスを作成する。2μlのターミネーションミックス
（A, G, C, T）をあらかじめ分注しておいた４本のチュ
ーブを準備する。上記のリアクションミックスから2μl
ずつとり各チューブに入れる。遠心混合後、10μlのミ
ネラルオイルを重層し、以下の条件でサイクリング反応
を行なう。
【００４０】プレサイクル 95℃ ３分；ファーストサイ
クル95℃３０秒、60℃３０秒、72℃１分（１５回繰り返
し）；セカンドサイクル95℃３０秒、72℃１分（１５回
繰り返し）；ポストサイクル4℃。
クル95℃３０秒、60℃３０秒、72℃１分（１５回繰り返
し）；セカンドサイクル95℃３０秒、72℃１分（１５回
繰り返し）；ポストサイクル4℃。
【００４１】2 μlの反応停止色素液（95％ ホルムア
ミド、20 mM EDTA、0.05％メチルバイオレット）を添加
し、遠心、混合した後、電気泳動にかけるまで−20℃で
保存する。
ミド、20 mM EDTA、0.05％メチルバイオレット）を添加
し、遠心、混合した後、電気泳動にかけるまで−20℃で
保存する。
【００４２】7％ロングレンジャーゲルは、尿素21g、10
x TBE BUffer（0.89Mトリス塩酸、0.89Mホウ酸、0.025
M EDTA・Na2塩）6mlおよび50％ロングレンジャーゲル溶
液(FMC Bio Products)7mlに純水を加えて50mlとし、0.2
2μmフィルタで濾過した後、過硫酸アンモニウム22mgお
よびTEMED 22μlを添加し、重合開始後３時間以上経過
したものを使用した。
x TBE BUffer（0.89Mトリス塩酸、0.89Mホウ酸、0.025
M EDTA・Na2塩）6mlおよび50％ロングレンジャーゲル溶
液(FMC Bio Products)7mlに純水を加えて50mlとし、0.2
2μmフィルタで濾過した後、過硫酸アンモニウム22mgお
よびTEMED 22μlを添加し、重合開始後３時間以上経過
したものを使用した。
【００４３】ゲルをDNAシーケンサDSQ-1に装着し、定電
圧1000Vで１時間プレランを行なった。電気泳動直前に
サンプルを95℃で３分間熱変性し、氷上で急冷後、チュ
ーブの底側から２〜３μlの反応液をマイクロシリンジ
で吸い上げ、ゲルにロードした。サンプルランは定電圧
1200Vで12時間行なった。
圧1000Vで１時間プレランを行なった。電気泳動直前に
サンプルを95℃で３分間熱変性し、氷上で急冷後、チュ
ーブの底側から２〜３μlの反応液をマイクロシリンジ
で吸い上げ、ゲルにロードした。サンプルランは定電圧
1200Vで12時間行なった。
【００４４】泳動完了後、DSQ-1付属のソフトウエアを
用いて塩基配列を決定した。
用いて塩基配列を決定した。
【００４５】実施例８：ＣＬＮ”１軽鎖遺伝子のクロー
ニング ヒト−ヒトハイブリドーマＨＴ２細胞を凍結融解した
後、RT-PCRを行い、ＣＬＮ”１軽鎖遺伝子を単離した。
具体的には、DEPC処理H2O(RNAsinを含む)10μlに5x104/
mlの細胞けん濁溶液を2μlを加え、凍結融解し、同じチ
ューブに10 x RT-PCR溶液(500mM KCl, 100mM トリス-HC
l(pH9.0), 1％ Triton X-100, 15mM MgCl2)5μl、dNTP
(2.5mM) 4μl、プライマー＃3(10mM) 1μl、プライマー
＃4(10mM)1μl、Taqポリメラーゼ(TAKARA) 0.5μl、RNa
sin(Promega) 0.5μl、逆転写酵素(TAKARA)0.3μl 、DE
PC処理H2O 35.2μlを混合し、42℃ 30分、95℃ 5分で逆
転写反応を行い、94℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 1分のサ
イクルを40回くりかえし、さらに72℃ 7分間反応させ
た。このようにして得られたDNA断片をTA cloning kit
(Invitrogen)を使いクローニングした。具体的には、PC
R反応産物1μl、10 x ライゲーションバッファ1μl、pC
RIITM ベクター 2μl（50ng相当）、T4 DNAライゲース
および滅菌水6μlを混合したライゲーションミックス溶
液を調製し12℃で一晩インキュベートした。次いで、0.
5 M β-メルカプトエタノール 2μlを添加したコンピテ
ント大腸菌INVαF'株のけん濁液50μlを準備し、そこへ
上記のライゲーションミックス溶液のうち1μlを加え
る。氷上で３０分放置後、1分間42℃でインキュベート
し、さらに氷上で２分間急冷する。かかる大腸菌溶液に
42℃にあらかじめ暖めておいたSOC培地450μlを加え、3
7℃で１時間振盪培養する。
ニング ヒト−ヒトハイブリドーマＨＴ２細胞を凍結融解した
後、RT-PCRを行い、ＣＬＮ”１軽鎖遺伝子を単離した。
具体的には、DEPC処理H2O(RNAsinを含む)10μlに5x104/
mlの細胞けん濁溶液を2μlを加え、凍結融解し、同じチ
ューブに10 x RT-PCR溶液(500mM KCl, 100mM トリス-HC
l(pH9.0), 1％ Triton X-100, 15mM MgCl2)5μl、dNTP
(2.5mM) 4μl、プライマー＃3(10mM) 1μl、プライマー
＃4(10mM)1μl、Taqポリメラーゼ(TAKARA) 0.5μl、RNa
sin(Promega) 0.5μl、逆転写酵素(TAKARA)0.3μl 、DE
PC処理H2O 35.2μlを混合し、42℃ 30分、95℃ 5分で逆
転写反応を行い、94℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 1分のサ
イクルを40回くりかえし、さらに72℃ 7分間反応させ
た。このようにして得られたDNA断片をTA cloning kit
(Invitrogen)を使いクローニングした。具体的には、PC
R反応産物1μl、10 x ライゲーションバッファ1μl、pC
RIITM ベクター 2μl（50ng相当）、T4 DNAライゲース
および滅菌水6μlを混合したライゲーションミックス溶
液を調製し12℃で一晩インキュベートした。次いで、0.
5 M β-メルカプトエタノール 2μlを添加したコンピテ
ント大腸菌INVαF'株のけん濁液50μlを準備し、そこへ
上記のライゲーションミックス溶液のうち1μlを加え
る。氷上で３０分放置後、1分間42℃でインキュベート
し、さらに氷上で２分間急冷する。かかる大腸菌溶液に
42℃にあらかじめ暖めておいたSOC培地450μlを加え、3
7℃で１時間振盪培養する。
【００４６】その間、アンピシリン（50μg/ml）を含む
LBアガープレート上に25μlのX-Gal（40 mg/ml）を塗込
み、完全に浸透するまで37℃でインキュベートしてお
く。
LBアガープレート上に25μlのX-Gal（40 mg/ml）を塗込
み、完全に浸透するまで37℃でインキュベートしてお
く。
【００４７】振盪培養完了した大腸菌培養液200μlを乾
燥したプレート上にスプレッドし、37℃で一晩放置し、
翌日アンピシリン耐性の白色コロニーを得た。
燥したプレート上にスプレッドし、37℃で一晩放置し、
翌日アンピシリン耐性の白色コロニーを得た。
【００４８】実施例９：ＣＬＮ”１軽鎖遺伝子の塩基配
列決定 実施例8で得られたコロニーから、Dynabeads Template
Preparation kit(DYNAL)を使い、塩基配列を決定するた
めのDNA断片を調製した。具体的には、得られたコロニ
ーを爪楊枝の先で拾い上げ、lysis緩衝液(20mM トリス-
HCl pH8.3, 50mM KCl, 0.1％ Tween 20)10μlにけん濁
した後、96℃で5分間インキュベートし、遠心後の上清
を以下のPCRに用いた。10 x PCR 緩衝液(100mM トリス-
HCl pH8.3,500mM KCl, 15mM MgCl2)5μl、dNTP(2.5mM)
4μl、Primer SetA 2μl、溶菌液上清 5μl、Taqポリメ
ラーゼ0.25μl、H2O 33.75μlを混合し、96℃ 30秒、65
℃1分、72℃ 2分のサイクルを30回くりかえし反応させ
た。
列決定 実施例8で得られたコロニーから、Dynabeads Template
Preparation kit(DYNAL)を使い、塩基配列を決定するた
めのDNA断片を調製した。具体的には、得られたコロニ
ーを爪楊枝の先で拾い上げ、lysis緩衝液(20mM トリス-
HCl pH8.3, 50mM KCl, 0.1％ Tween 20)10μlにけん濁
した後、96℃で5分間インキュベートし、遠心後の上清
を以下のPCRに用いた。10 x PCR 緩衝液(100mM トリス-
HCl pH8.3,500mM KCl, 15mM MgCl2)5μl、dNTP(2.5mM)
4μl、Primer SetA 2μl、溶菌液上清 5μl、Taqポリメ
ラーゼ0.25μl、H2O 33.75μlを混合し、96℃ 30秒、65
℃1分、72℃ 2分のサイクルを30回くりかえし反応させ
た。
【００４９】このようにして得られたDNA断片は、使用
したプライマーの一方の5’末端がビオチン化されてい
るため、一方の5’末端にビオチンが結合した形になっ
ている。このDNA断片を含む溶液40μlをストレプトアビ
ジンの結合したDynabeadsをふくむ溶液40μlを混合して
15分間、室温でインキュベートした。DNAが結合したビ
ーズを磁石で集めた後、上清を取り除き、B&W緩衝液(10
mM トリス-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 2.0M NaCl)40μlにけ
ん濁した。次にビーズを0.1M NaOH10μlにけん濁し、10
分間室温でインキュベートしてビオチン化されたDNAビ
ーズ側に、ビオチン化されてないDNAを上清側に分離し
た。このようにして得られた1本鎖DNAを塩基配列決定の
ための鋳型にして、TAKARATaq Cycle Sequencing kit(T
AKARA)を使い、塩基配列を決定した。具体的には、DNA
を含むビーズあるいは上清を5μl、FITC標識プライマー
（1 pmol/μl、フォワードもしくはリバースを使用）１
μl、１０x サイクリングミックス溶液２μlおよびTAKA
RATaq溶液1μlを混合し、さらに滅菌水1μlを加え最終
容量10μlのリアクションミックスを作成する。2μlの
ターミネーションミックス（A, G, C, T）をあらかじめ
分注しておいた４本のチューブを準備する。上記のリア
クションミックスから2 μlずつとり各チューブに入れ
る。遠心混合後、10μlのミネラルオイルを重層し、以
下の条件でサイクリング反応を行なう。
したプライマーの一方の5’末端がビオチン化されてい
るため、一方の5’末端にビオチンが結合した形になっ
ている。このDNA断片を含む溶液40μlをストレプトアビ
ジンの結合したDynabeadsをふくむ溶液40μlを混合して
15分間、室温でインキュベートした。DNAが結合したビ
ーズを磁石で集めた後、上清を取り除き、B&W緩衝液(10
mM トリス-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 2.0M NaCl)40μlにけ
ん濁した。次にビーズを0.1M NaOH10μlにけん濁し、10
分間室温でインキュベートしてビオチン化されたDNAビ
ーズ側に、ビオチン化されてないDNAを上清側に分離し
た。このようにして得られた1本鎖DNAを塩基配列決定の
ための鋳型にして、TAKARATaq Cycle Sequencing kit(T
AKARA)を使い、塩基配列を決定した。具体的には、DNA
を含むビーズあるいは上清を5μl、FITC標識プライマー
（1 pmol/μl、フォワードもしくはリバースを使用）１
μl、１０x サイクリングミックス溶液２μlおよびTAKA
RATaq溶液1μlを混合し、さらに滅菌水1μlを加え最終
容量10μlのリアクションミックスを作成する。2μlの
ターミネーションミックス（A, G, C, T）をあらかじめ
分注しておいた４本のチューブを準備する。上記のリア
クションミックスから2 μlずつとり各チューブに入れ
る。遠心混合後、10μlのミネラルオイルを重層し、以
下の条件でサイクリング反応を行なう。
【００５０】プレサイクル 95℃ ３分；ファーストサイ
クル 95℃ ３０秒、60℃ ３０秒、72℃ １分（１５回繰
り返し）；セカンドサイクル 95℃ ３０秒、72℃ １分
（１５回繰り返し）；ポストサイクル 4℃。
クル 95℃ ３０秒、60℃ ３０秒、72℃ １分（１５回繰
り返し）；セカンドサイクル 95℃ ３０秒、72℃ １分
（１５回繰り返し）；ポストサイクル 4℃。
【００５１】2μlの反応停止色素液（95％ホルムアミ
ド、20 mM EDTA、0.05％メチルバイオレット）を添加
し、遠心、混合した後、電気泳動にかけるまで-20℃で
保存する。
ド、20 mM EDTA、0.05％メチルバイオレット）を添加
し、遠心、混合した後、電気泳動にかけるまで-20℃で
保存する。
【００５２】7％ ロングレンジャーゲルは、尿素21g、1
0 x TBE BUffer（0.89Mトリス塩酸、0.89Mホウ酸、0.02
5M EDTA）6mlおよび50％ロングレンジャーゲル溶液(FMC
Bio Products)7mlに純水を加えて50mlとし、0.22μmフ
ィルタで濾過した後、過硫酸アンモニウム22mgおよびTE
MED 22μlを添加し、重合開始後3時間以上経過したもの
を使用した。
0 x TBE BUffer（0.89Mトリス塩酸、0.89Mホウ酸、0.02
5M EDTA）6mlおよび50％ロングレンジャーゲル溶液(FMC
Bio Products)7mlに純水を加えて50mlとし、0.22μmフ
ィルタで濾過した後、過硫酸アンモニウム22mgおよびTE
MED 22μlを添加し、重合開始後3時間以上経過したもの
を使用した。
【００５３】ゲルをDNAシーケンサDSQ-1に装着し、定電
圧1000Vで１時間プレランを行なった。電気泳動直前に
サンプルを95℃で３分間熱変性し、氷上で急冷後、チュ
ーブの底側から２〜３μlの反応液をマイクロシリンジ
で吸い上げ、ゲルにロードした。サンプルランは定電圧
1200Vで12時間行なった。
圧1000Vで１時間プレランを行なった。電気泳動直前に
サンプルを95℃で３分間熱変性し、氷上で急冷後、チュ
ーブの底側から２〜３μlの反応液をマイクロシリンジ
で吸い上げ、ゲルにロードした。サンプルランは定電圧
1200Vで12時間行なった。
【００５４】泳動完了後、DSQ-1付属のソフトウエアを
用いて塩基配列を決定した。なおプライマー＃3および
＃4の配列は以下の通りである。 得られたヒトモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可
変領域の塩基配列およびそれから予想されるアミノ酸配
列を配列表に示す。
用いて塩基配列を決定した。なおプライマー＃3および
＃4の配列は以下の通りである。 得られたヒトモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可
変領域の塩基配列およびそれから予想されるアミノ酸配
列を配列表に示す。
【００５５】 配列番号１：CLN''1-IgM重鎖可変領域 配列番号２：CLN''1-IgM軽鎖可変領域 実施例１０：超可変領域の決定 Kabatらのデータベース（Sequences of proteins of im
munological interest(Fifth edition, U.S.Department
of health and human services. Public health servi
ce, National Institutes of health. NIH Publication
No.91-3242. Kabat et al. 1991)のナンバーリングに
従い、実施例7および実施例9で得られたアミノ酸配列を
並列表記し、超可変領域CDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配
列を特定した（図４A、重鎖；図4B、軽鎖）。特定した
超可変領域CDR1、CDR2、CDR3のそれぞれのアミノ酸配列
の新規性を確認するために、上記のKabatらのデータベ
ースおよび蛋白質データベースNBRF-PDB（ナショナル・
バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション−プロ
テインデータベース）リリース44を用いコンピュータに
よる検索を行なった。
munological interest(Fifth edition, U.S.Department
of health and human services. Public health servi
ce, National Institutes of health. NIH Publication
No.91-3242. Kabat et al. 1991)のナンバーリングに
従い、実施例7および実施例9で得られたアミノ酸配列を
並列表記し、超可変領域CDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配
列を特定した（図４A、重鎖；図4B、軽鎖）。特定した
超可変領域CDR1、CDR2、CDR3のそれぞれのアミノ酸配列
の新規性を確認するために、上記のKabatらのデータベ
ースおよび蛋白質データベースNBRF-PDB（ナショナル・
バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション−プロ
テインデータベース）リリース44を用いコンピュータに
よる検索を行なった。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【図１】CLN''1-IgMの電気泳動パターンである。
【図２】CLN''1-IgMが認識する抗原のウェスタンブロッ
トである。
トである。
【図３】CLN''1-IgMの癌細胞増殖抑制効果を示すグラフ
である。
である。
【図４】CLN''1-IgMの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸
配列をKabatの表記法に従いナンバリングし、超可変領
域CDR1、CDR2およびCDR3の領域を決定した図である。
配列をKabatの表記法に従いナンバリングし、超可変領
域CDR1、CDR2およびCDR3の領域を決定した図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/574 9162−4Ｂ ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ｂ
Claims (13)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列 Gly Pro Lys Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Phe Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val を有する超可変領域ＣＤＲ３を含むことを特徴とする免
疫グロブリン重鎖可変領域断片。 - 【請求項２】 （１）下記のアミノ酸配列 Gly Tyr Tyr Met His を有する超可変領域ＣＤＲ１及び／又は （２）下記のアミノ酸配列 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly を有する超可変領域ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴と
する請求項１に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域断
片。 - 【請求項３】 下記のアミノ酸配列 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Lys Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Phe Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val を有する免疫グロブリン重鎖可変領域断片。
- 【請求項４】 下記のアミノ酸配列 Gly Pro Lys Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Phe Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val を有する超可変領域ＣＤＲ３をコードする塩基配列を含
むことを特徴とする免疫グロブリン重鎖可変領域断片を
コードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片。 - 【請求項５】 （１）下記のアミノ酸配列 Gly Tyr Tyr Met His を有する超可変領域ＣＤＲ１をコードする塩基配列及び
／又は （２）下記のアミノ酸配列 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly を有する超可変領域ＣＤＲ２をコードする塩基配列をさ
らに含むことを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ及び
ＲＮＡ断片。 - 【請求項６】 下記の塩基配列 CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACC GGC TAC TAT ATG CAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC CCT AAC AGT GGT GGC ACA AAC TAT GCA CAG AAG TTT CAG GGC AGG GTC ACC ATG ACC AGG GAC ACG TCC ATC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGG CTG AGA TCT GAC GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GGA CCG AAA GGG TAT TGT AGT AGT ACC AGC TGC TAT TTT GAC TAC TAC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC を有する免疫グロブリン重鎖可変領域断片。
- 【請求項７】 下記のアミノ配列 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Thr を有する超可変領域ＣＤＲ３を含むことを特徴とする免
疫グロブリン軽鎖可変領域断片。 - 【請求項８】 （１）下記のアミノ酸配列 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn を有する超可変領域ＣＤＲ１及び／又は （２）下記のアミノ酸配列 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser を有する超可変領域ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴と
する請求項7に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域断
片。 - 【請求項９】 下記のアミノ酸配列 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域断片。
- 【請求項１０】 下記のアミノ酸配列 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Thr を有する超可変領域ＣＤＲ３をコードする塩基配列を含
むことを特徴とする免疫グロブリン軽鎖可変領域断片を
コードするＤＮＡ及びＲＮＡ断片。 - 【請求項１１】 （１）下記のアミノ酸配列 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn を有する超可変領域ＣＤＲ１をコードする塩基配列及び
／又は （２）下記のアミノ酸配列 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser を有する超可変領域ＣＤＲ２をコードする塩基配列をさ
らに含むことを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡ及
びＲＮＡ断片。 - 【請求項１２】 下記の塩基配列 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CAG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGA ACT GTG を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域断片。
- 【請求項１３】 請求項３に記載の免疫グロブリン重鎖
可変領域断片と請求項９に記載の免疫グロブリン軽鎖可
変領域断片とからなるＦｖ領域断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7278266A JPH09100300A (ja) | 1995-10-03 | 1995-10-03 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7278266A JPH09100300A (ja) | 1995-10-03 | 1995-10-03 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09100300A true JPH09100300A (ja) | 1997-04-15 |
Family
ID=17594952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7278266A Pending JPH09100300A (ja) | 1995-10-03 | 1995-10-03 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09100300A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1768999A4 (en) * | 2004-06-30 | 2008-09-17 | Mayo Foundation | B7-DC BINDING ANTIBODY |
| US7501119B2 (en) | 2004-06-30 | 2009-03-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and molecules for modulating an immune response |
| US8188238B2 (en) | 2004-11-05 | 2012-05-29 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Recombinantly produced antibody |
-
1995
- 1995-10-03 JP JP7278266A patent/JPH09100300A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1768999A4 (en) * | 2004-06-30 | 2008-09-17 | Mayo Foundation | B7-DC BINDING ANTIBODY |
| US7501119B2 (en) | 2004-06-30 | 2009-03-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and molecules for modulating an immune response |
| EP2481750A1 (en) * | 2004-06-30 | 2012-08-01 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | B7-DC binding antibody |
| US8188238B2 (en) | 2004-11-05 | 2012-05-29 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Recombinantly produced antibody |
| US9255147B2 (en) | 2004-11-05 | 2016-02-09 | Mayo Foundation For Medical Education & Research | Recombinantly produced antibody |
| US10253097B2 (en) | 2004-11-05 | 2019-04-09 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Isolated antibody |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051018 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060307 |