JPH09100416A - 固定化モノメチンシアニン染料 - Google Patents

固定化モノメチンシアニン染料

Info

Publication number
JPH09100416A
JPH09100416A JP8146335A JP14633596A JPH09100416A JP H09100416 A JPH09100416 A JP H09100416A JP 8146335 A JP8146335 A JP 8146335A JP 14633596 A JP14633596 A JP 14633596A JP H09100416 A JPH09100416 A JP H09100416A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
groups
amino
group
compound
hydroxyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8146335A
Other languages
English (en)
Inventor
Ratnakar B Mujumdar
ラトナカル・ビー・ムジュムダル
Alan S Waggoner
アラン・エス・ワゴーナー
Bhalchandra M Karandikar
バルチャンドラ・エム・カランディカル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carnegie Mellon University
Original Assignee
Carnegie Mellon University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/474,057 external-priority patent/US5986093A/en
Priority claimed from US08/474,056 external-priority patent/US5852191A/en
Application filed by Carnegie Mellon University filed Critical Carnegie Mellon University
Publication of JPH09100416A publication Critical patent/JPH09100416A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/0075—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of an heterocyclic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/04—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups one >CH- group, e.g. cyanines, isocyanines, pseudocyanines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Thermal Transfer Or Thermal Recording In General (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 複素環の間にブリッジ基を含めることによっ
て固定化した、蛍光マーカーとして用いうる化学染料を
提供すること。 【解決手段】 基Ｒ2〜Ｒ7で任意に置換されている下
式： 【化１】 （式中、基Ｒ2〜Ｒ7は、所望の溶解度、反応性およびス
ペクトル特性を化合物にもたらすように選択され；Ｔは 【化２】 が６または７員環であるような結合基であり；基Ｚ1お
よびＺ2は、各環が５または６個の原子を有する１、２
または３個の縮合芳香族環を完成するのに必要な原子を
表し、炭素原子、並びに任意に２個以下の酸素、窒素お
よび硫黄原子から選択される）の化合物、およびこれを
用いて標的物質に蛍光性を与える方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光マーカーとし
て用いることができる化学染料に関する。特に、本発明
は、化合物の複素環の間にブリッジ基を含めることによ
って固定化（ｒｉｇｉｄｉｚｅ）したシアニン染料型化
合物、およびそれらの製造方法に関する。本発明の染料
は、これが物質と共有または非共有結合してその物質に
蛍光性を与えるように、反応基または他の基を含むよう
製造または化学変性しうる。
【０００２】
【従来の技術】蛍光染料は一般に公知であり、蛍光顕微
鏡、蛍光免疫検定および流動細胞計測法のような方法に
よって各種生物学的および非生物学的物質の蛍光標識お
よび検出に用いられている。そのような物質を蛍光染料
で標識する一般的な方法は、染料分子上の適当な基と標
識する物質上の適した基との間を結合させることによっ
て蛍光複合体をつくるものである。この方法では、細
胞、組織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモ
ン、ヌクレオチド、核酸、脂質および多糖類等のような
物質を化学的に標識、検出または定量したり、あるいは
標的物質に特異的に結合し、そして蛍光検出法により検
出することができる蛍光プローブとして用いうる。
【０００３】一般に用いられる４種類の蛍光染料はフル
オレセイン（緑色蛍光）およびローダミン（オレンジ色
蛍光）、クマリンおよびピレン（青色蛍光）発色団に基
づくものである。フルオレセインに基づく染料は、強力
励起源によって照射されたとき光による漂白が生じる傾
向を含めた多くの欠点を有する。この結果、時間がたつ
につれて像が急速に消失するため、これらの染料での検
出および定量は困難である。またフルオレセイン誘導体
の吸収スペクトルはｐＨに敏感であり、得られる蛍光量
はｐＨ８より下では著しく減少する。ローダミン誘導体
は使用が難しい標識試薬であり、特に、タンパク質に結
合したとき蛍光を発しない。クマリンおよびピレントリ
スルホネートは吸収および発光スペクトルが広く、吸収
係数が比較的低い。
【０００４】それぞれ異なる発光スペクトルを有する多
数の発蛍光団は、流動細胞計測、顕微鏡、電気泳動等の
ような方法における蛍光標識物質の多重検出に一般に用
いられる。蛍光信号のオーバーラップを減じるために
は、吸収および発光バンドが狭い蛍光染料を用いるのが
望ましい。例えばクマリン発色団に基づく染料は吸収お
よび発光ピークが広く（かつ、吸収係数が比較的低
い）、従って、そのような用途に適していない。
【０００５】米国特許第５２６８４８６号は、式
（１）：
【化７】 （式中、点線は各環に５〜６個の原子を有する１〜３個
の環を表す）のシアニン化合物が蛍光染料として有用で
あると記載している。Ｒ3、Ｒ4、Ｒ8およびＲ9基は環に
結合している。Ｒ8およびＲ9基の少なくとも１つはスル
ホン酸またはスルホネート基であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、
Ｒ4およびＲ7基の少なくとも１つは、アミノ、ヒドロキ
シ、ホスホリルまたはスルフィドリル基と反応する部分
である。これらの化合物はスペクトルの緑、オレンジ、
赤および近赤外領域で蛍光するものとして記されてい
る。
【０００６】複素環の間にメチン基を有する、ビス−ピ
ロメテンボロンジフルオリド構造に基づく”固定化”シ
アニン染料は、米国特許第４７７４３３９号、第５１２
８２８８号、第５２４８７８２号、第５２７４１１３号
および第５４５１６６３号に記載されている。基本構造
は式（２）：
【化８】 （式中、ピロール環は置換されていてもよい）で示され
る。この構造の具体的な誘導体の例は３，３′，５，
５′−テトラメチル−２，２′−ビスピロメテン−１，
１′−ボロンジフルオリドであり、オレゴン州ユージー
ンのモレキュラー プローブ社から商品名ＢＯＤＩＰＹ
で販売されている。ＢＯＤＩＰＹ類似物については上記
米国特許第４７７４３３９号に記載されている。ＢＯＤ
ＩＰＹ分子は５００ｎｍ以上の波長で一般に蛍光を発す
る。例えば、米国特許第４７７４３３９号には、フルオ
レセインと類似の波長で吸収および発光する（すなわ
ち、それぞれほぼ４９０および５００ｎｍ）ピロール型
染料が記載されている。
【０００７】式（３）のピリジン型モノメチンボロンジ
フルオリド構造およびキノリン型モノメチンボロン複合
体（式（４）Ｒ＝Ｈ；Ｓｃｈｅｉｂｅ等、Ｚ．Ｐｈｙ
ｓ．Ｃｈｅｍ．、第６４、９７−１１４（１９６９））
も記載されている。キノリン型化合物はレーザー染料と
しての用途が評価されているが、これらが蛍光マーカー
として有用であるかどうかは未知である。その構造に基
づくと、キノリン誘導体は発光極大が５００ｎｍ以上で
あると考えられる。
【０００８】
【化９】 一般式（５）のアルキレン固定化シアニン染料も記載さ
れている。例えば次の文献を参照：Ｒａｍｏｓ等、Ｊ．
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄＳｐｅｃｔ
ｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２１巻、第２
号、１７９−１８２（１９９１）；Ｓｔｕｒｍｅｒおよ
びＧａｕｇｈ、Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１９巻、第
５号、２７３（１９７５）；英国特許第６１００６４
号、第６１８８８９号（コダック社）；米国特許第４４
９０４６３号（コダック社）、第２５４１４００号（Ｂ
ｒｏｏｋｅｒ等）および第３１４８１８７号（Ｈｅｓｅ
ｌｔｉｎｅ）。
【０００９】
【化１０】 上記のような染料は増感剤として写真乳剤に有用であ
る。しかしながら、これらは蛍光標識染料として使用す
ることができず、そしてそれとしての記載はない。
【００１０】前記文献のいずれにも、染料を共有結合標
識、特に生物学的分子および他の標的物質の共有結合標
識に適したものにする官能基および／または可溶化基を
含む蛍光染料化合物についての記載はない。従って、ス
ペクトルの短い波長（３００〜５００ｎｍ）領域で蛍光
を発し、所望のスペクトル特性を有し、そして各種物質
の標識に使用することができる明るい可溶性の蛍光染料
化合物についてはなにも記載されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】我々はこのたび、スペ
クトルの近ＵＶおよび青色（３００〜５００ｎｍ）領域
で発光し、そして各種生物学的および非生物学的用途に
用いうる、明るい、高度に蛍光性の強力に光を吸収する
染料および蛍光マーカーである、新規な種類のモノメチ
ン固定化シアニンを見いだした。
【００１２】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は１〜６
個の基Ｒ2〜Ｒ7で任意に置換されている下式（６）の固
定化モノメチンシアニン蛍光化合物に関する：
【化１１】 （式中、基Ｒ1〜Ｒ7は、所望の溶解性、反応性およびス
ペクトル特性を蛍光化合物にもたらすように選択され；
Ｔは
【化１２】 が６または７員環であるような結合基であり；Ｘおよび
Ｙは同じまたは異なるものであり、ビス置換炭素、酸
素、硫黄、セレニウム、ＣＨ＝ＣＨおよび−Ｎ−Ｗから
選択され、ここで、Ｎは窒素であり、Ｗは水素、基−
（ＣＨ2）nＲ8から選択され、ここで、ｎは１〜２６の
整数であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセタ
ール、ケタール、ハロゲン、シアノ、アリール、ヘテロ
アリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェー
ト、カルボキシレート、置換アミノ、第４アミノ、ニト
ロ、第１アミド、置換アミド、並びにアミノ、ヒドロキ
シル、カルボニル、ホスホリルおよびスルフィドリル基
と反応性の基から選択され；基Ｚ1およびＺ2は、各環が
５または６個の原子を有する１、２または３個の縮合芳
香族環を完成するのに必要な原子を表し、炭素原子、並
びに任意に２個以下の酸素、窒素および硫黄原子から選
択され；Ｒ2およびＲ3は、Ｔが炭素原子を含んでいると
き、Ｔの炭素原子に結合し；Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は
ＸおよびＹを含む環に結合するか、あるいは任意にＺ1
およびＺ2環構造の原子に結合し；但し、ＸおよびＹが
同じである場合、Ｒ1〜Ｒ7の少なくとも１つは水素また
はＣ1−Ｃ4アルキル以外である）。
【００１３】好ましくは、同じまたは異なるものである
基Ｒ2〜Ｒ7は、−Ｒ9および−Ｌ−Ｒ9を含み、ここで、
Ｒ9は ＊ 水溶性を低下させる中性基、例えば、水素およびハ
ロゲン原子； ＊ 水溶性を高める極性基、例えば、アミド、スルホネ
ート、スルフェート、ホスフェート、第４アンモニウ
ム、グアニジニウム、ヒドロキシルおよびホスホネー
ト； ＊ 標識反応に用いうる官能基、例えば、任意に置換さ
れたアミノ、アジド、ヒドロキシル、スルフィドリル、
イミダゾール、カルボキシルおよびカルボニル基、例え
ばアルデヒドまたはケトン、並びにアミノ、ヒドロキシ
ル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフィドリル基と
反応性の基； ＊ 反応基、例えば、スクシンイミジルエステル、イソ
チオシアネート、イソシアネート、無水物、ハロアセト
アミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホアミ
ダイト、酸ハライド、アシルアジド、アルキルイミデー
ト、ヒドラジド、アリールイミデート、ヒドロキシルア
ミン、カルボジイミド； ＊ 蛍光分子の吸収および発光波長をシフトする電子供
与および吸引基、例えばアミド、シアノ、ニトロ、Ｃ1
−Ｃ6アルコキシ、スチリル、アリールおよびヘテロア
リール基； ＊ 脂質および炭化水素可溶化基、例えばアルキル、ア
リールおよびアラルキル基；から選択され；並びにＬは
直鎖または分枝鎖Ｃ1-26アルキル、Ｃ2-20モノエーテル
もしくはポリエーテル、および４個以下の第２アミド結
合を含むＣ2-20原子鎖よりなる群から選択される。
【００１４】好ましいＲ9基は次のものから選択され
る：水素、ハロゲン、アミド、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、シ
アノ、アリール、ヘテロアリール、スルホネート、第４
アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスホ
ネート、任意に置換されたアミノ、アジド、ヒドロキシ
ル、スルフィドリル、カルボニル、反応基、例えばスク
シンイミジルエステル、イソチオシアネート、無水物、
ハロアセトアミド、マレイミド、スルホニルハライド、
ホスホアミダイト、酸ハライド、アルキルイミデート、
ヒドラジドおよびカルボジイミド；並びにアミノ、ヒド
ロキシル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフィドリ
ル基と反応性の基。
【００１５】適しているのは、Ｒ1が水素、アリール、
ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロゲ
ン、ヒドロキシ、炭素原子数２６以下のアルキル基、ア
ミノ、第４アミノ、アセタール、ケタール、ホスホリ
ル、スルフィドリル、水への可溶化基、および−（ＣＨ
2）nＱから選択されるものであり、ここで、１＜ｎ＜２
６であり、Ｑはアミノ、置換アミノ、第４アミノ、アル
デヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリー
ル、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、ス
ルフェート、カルボキシレート、アミド、ニトロ、並び
にアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルおよ
びスルフィドリル基と反応性の基から選択される。
【００１６】好ましいＲ1は水素、アリール、ヘテロア
リール、シアノ、ハロゲン、炭素原子数２６以下のアル
キル基、および−（ＣＨ2）nＱから選択され、ここで、
１＜ｎ＜２６であり、Ｑはアミノ、アルデヒド、ヒドロ
キシル、並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホ
スホリルおよびスルフィドリル基と反応性の基から選択
される。
【００１７】ビス置換炭素はビスＣ1−Ｃ4アルキル基お
よびＣ4−Ｃ5スピロアルキル基を含む。
【００１８】適しているのは、Ｔが＞ＣＲ2Ｒ3、−ＣＨ
Ｒ2−ＣＨＲ3−およびＢＭ2から選択され、ここで、Ｂ
が硼素、Ｍがフルオロまたはクロロであるものである。
【００１９】適しているのは、ＸおよびＹがＣ4−Ｃ5ス
ピロアルキル誘導体を含めたビス−アルキル置換炭素、
酸素、硫黄、セレニウム、−ＣＨ＝ＣＨ−および窒素か
ら選択されるものである。
【００２０】適しているのは、Ｗが基−（ＣＨ2）nＲ8
であり、ここで、ｎは１〜６の整数であり、Ｒ8は水
素、アミノ、スルホネート、カルボキシレート、アリー
ル、ヒドロキシル、並びにアミノ、ヒドロキシル、カル
ボニル、ホスホリルおよびスルフィドリル基と反応性の
基から選択されるものである。
【００２１】基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ
7並びにこれらのＲ基が反応する基の具体例を表１に示
す。あるいは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ
7は、標的分子の反応基と反応する表１の官能基であっ
てもよい。
【００２２】
【表１】 表１： 可能な反応性置換基およびこれらと反応性の部位 反応基 相当する官能基 スクシンイミジルエステル 第１アミノ、第２アミノ、 ヒドロキシル 無水物 第１アミノ、第２アミノ、 ヒドロキシル アシルアジド 第１アミノ、第２アミノ、 イソチオシアネート、イソシアネート アミノ、チオール、ヒドロキシル スルホニルクロリド、スルホニルフルオリド アミノ、ヒドロキシル 置換ヒドラジン アルデヒド、ケトン 置換ヒドロキシルアミン 酸ハライド アミノ、ヒドロキシル ハロアセトアミド、マレイミド チオール、イミダゾール、 ヒドロキシル、アミン カルボジイミド カルボキシル基 ホスホアミダイト ヒドロキシル
【００２３】表１に挙げた基以外に、多数の他の基が本
発明の化合物のＲ1−Ｒ7位置における反応置換基として
可能である。例えば、利用できるアミノおよびヒドロキ
シ官能基を有する標的化合物の標識に特に有用な反応基
は次のものである：
【化１３】 （式中、ｎ＝０または１〜１０の整数であり、Ｒ10また
はＲ11の少なくとも１つはＩ、ＢｒまたはＣｌのような
脱離基である）。
【００２４】利用できるスルフィドリル官能基を有する
標的化合物の標識に特に有用な可能なＲ1、Ｒ2、Ｒ3、
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7基の具体例は次のものである：
【化１４】 （式中、ｎ＝０または整数であり、Ｒ12はＩまたはＢｒ
のような脱離基である）。
【００２５】光活性化架橋結合による標的化合物の標識
に特に有用な可能なＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およ
びＲ7官能基の具体例は次のものである：
【化１５】 本発明の１つの好ましい態様において、式（６）の化合
物は、基Ｒ4−Ｒ7（Ｒ4−Ｒ7、Ｘ、Ｙ、Ｚ1、Ｚ2および
Ｍは上記定義通りである）によって任意に置換されてい
る式（７）：
【化１６】 を有する。
【００２６】本発明の第２の好ましい態様において、式
（６）の化合物は、基Ｒ2−Ｒ7（Ｒ2−Ｒ7、Ｘ、Ｙ、Ｚ
1およびＺ2は上記定義通りである）によって任意に置換
されている式（８）：
【化１７】 を有する。
【００２７】アルキルは、炭素原子数１〜２６の直鎖ま
たは分枝鎖アルキルである。
【００２８】アリールは、任意に互いに縮合したまたは
互いに炭素−炭素単結合によって結合しかつ単結合によ
って結合し、そして任意にかつ独立して直鎖もしくは分
枝鎖アルキルまたは水溶性を高める極性基で置換されて
いる、６個の共役炭素原子を有しかつ複素原子は含まな
い１〜４個の芳香族環を含む芳香族または多芳香族置換
基である。
【００２９】ヘテロアリールは、別の６員環に任意に縮
合した、またはもう１つの５または６員複素芳香族環に
縮合した５または６員芳香族複素環であり、上記複素芳
香族環は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１
つおよび３以下の複素原子を含み、ヘテロアリールは単
結合によって結合し、そして任意にかつ独立して、直鎖
もしくは分枝鎖アルキルまたは水溶性を高める極性基に
よって置換されている。
【００３０】アラルキルは、アリールまたはヘテロアリ
ールによって置換されているＣ1−Ｃ6アルキル基であ
る。
【００３１】ハロゲンおよびハロ基は、塩素、臭素およ
びヨウ素から選択されるものである。
【００３２】レーザー染料への用途およびプラスチック
への添加の１つの態様において、式（６）の化合物は非
置換、すなわちＲ1〜Ｒ7はそれぞれ水素であるのが好ま
しい。
【００３３】水溶性を高めたり、または試料中での蛍光
標識成分の不適当な成分への不所望な非特異的結合を減
じたり、または蛍光の消光の原因となる標識成分上の２
つ以上の反応性発色団間の相互作用を減じるために、Ｒ
1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7官能基は周知の
極性および荷電化学基から選択してもよい。そのような
基の例は−Ｅ−Ｆ−であり、ここで、Ｆはヒドロキシ、
スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換
アミノまたは第４アミノであり、Ｅは−（ＣＨ2）n−の
ようなスペーサー基であり、ここで、ｎは０〜６であ
る。−Ｅ−Ｆ基の有用な例はＣ1-6アルキルスルホネー
ト、例えば−（ＣＨ2）3−ＳＯ3 -および−（ＣＨ2）4−
ＳＯ3 -である。
【００３４】蛍光色、水溶性、および反応基または官能
基の位置を調整しうる本発明の化合物の例は次の通りで
ある： ｉ） ６，６′−ジスルホ−メソ−カルボキシメチル
ビス−（ベンゾチアゾリル）メチンボロンジフルオリド ｉｉ） α−カルボキシメチル−５，５′−ジスルホ−
３，３′−エチレン−オキサシアニン ｉｉｉ） ３，３′−エチレン−６−スルファチア−
５′−カルボキシメチル−６′−スルファオキサモノメ
チンシアニン ｉｖ） ５−カルボキシメチル−ビスー（ベンズオキサ
ゾリル）メチンボロンジフルオリド ｖ） α−カルボキシメチル−３，３′−エチレンチア
シアニン ｖｉ） メソ−カルボキシメチル−ベンズオキサゾリル
−ベンゾチアゾリルモノメチンボロンジフルオリド。
【００３５】ここに示した基は、本発明の化合物のＲ部
位に組み込むことができる基の全てではない。本発明の
化合物によって標識される物質上の基と反応する基は他
に各種あることが理解されるであろう。そのような他の
基をＲ1〜Ｒ7位置に組み込むことによって得られる化合
物は、本発明に包含されるものである。
【００３６】本発明の化合物は多くの生物学的および非
生物学的用途に用いうる。非生物学的用途において、Ｒ
1〜Ｒ7位置に１つ以上の非荷電基、例えばＣ1-26アルキ
ルおよびアリール部分を有する本発明の化合物は、非極
性物質に溶解して、これらの物質に蛍光性をもたらす。
そのような非極性物質の例はペイント、ポリマー、ワッ
クス、油、インクおよび炭化水素溶媒である。本発明の
別の非生物学的用途は、Ｒ1〜Ｒ7位置に１つ以上の荷電
基および／または極性基を有する本発明の化合物を、極
性溶媒または他の物質、例えば水、エチレングリコー
ル、メチルアルコール、または水とメチルアルコールと
の混合物に溶解することである。そのような荷電Ｒ基の
例は−ＮＲ3 +、−ＳＯ3 -、−ＰＯ3 -、およびＣＯＯ-で
あり、そのような極性Ｒ基は例えばヒドロキシル基であ
る。生物学的用途において、生物学的分子は本発明の複
合体を用いて非共有結合的に標識される。例えば、Ｒ1
〜Ｒ7の少なくとも１つが第４アミンのように電荷を有
する本発明の複合体は、ＤＮＡおよびＲＮＡのような荷
電生物学的分子への非共有結合に用いうる。さらに、Ｒ
1〜Ｒ7の少なくとも１つが長鎖アルキルのような非荷電
基である本発明の化合物は、生物学的脂質のような非荷
電生物学的分子の結合に用いうる。
【００３７】本発明の染料はまた、ＢｏｙｅｒおよびＭ
ｏｒｇａｎｎの米国特許第４９１６７１１号に示される
方法によるレーザー染料としても用いることができる。
レーザー染料は蛍光性でなければならず、量子収量が
０．５６もしくは０．５７より大きくなければならず、
そしてかなり光安定性でなければならない。本発明の化
合物はこれらの各要件を満たしている。さらに本発明の
染料は布の染料、写真染料および有機導体として使用す
ることができる。
【００３８】本発明の複合体はまた、標的物質の共有結
合標識に用いて、標的物質に蛍光性を与えうる。本発明
の化合物を用いる共有結合標識は、生物学的または非生
物学的用途のいずれにも利用しうる。非生物学的用途に
おいて標識しうる標的物質の例は、セルロース性材料
（例えば、紙が含まれる）、布、石油系生成物、写真フ
ィルム、ガラス、ポリマーおよびゲル濾過、並びにクロ
マトグラフィー媒質である。
【００３９】本発明の化合物を用いる共有結合標識は、
上記のような少なくとも１つの官能基または反応基を有
する標的に対して行いうる。標的は、標的物質の官能基
または反応基と共有結合することができる上で定義され
た反応または官能基を含むＲ1〜Ｒ7の少なくとも１つを
有する本発明の化合物のある量と共にインキュベートし
うる。標的物質および本発明の化合物は、標的物質を本
発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下および
時間、インキュベートする。
【００４０】Ｒ1〜Ｒ7は、本発明の化合物が異なる標的
化合物と反応するように、および／または異なるスペク
トル特性を有するように選択することができ、これによ
って単一試料中の各種化合物の存在および量を多数の検
出蛍光発光の波長および強度に基づいて区別しなければ
ならない多重分析に用いることができる多数の関連化合
物を提供する。本発明の化合物は、Ｒ基の適切な選択に
より、標識される物質を含む水性、他の極性、または非
極性媒質に可溶性なものにしうる。
【００４１】本発明の複合体はまた、吸収および発光極
大はシャープではっきりしており、ストークスシフトは
小さく、そして比較的光安定性であって、検出システム
内で照射されたときそれらの発光信号は退色しない。
【００４２】本発明はまた、Ｒ1〜Ｒ7位置に少なくとも
１つの官能基を含む本発明の複合体を、タンパク質また
は他の物質のアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホス
ホリル、カルボキシル、スルフィドリルまたは他の反応
基と共有結合反応させる標識方法に関する。本発明の化
合物によって標識することができるそのような物質は他
に、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血液、細胞、微生物、並び
にペプチド、タンパク質、薬剤、炭水化物、毒物、粒
子、プラスチックもしくはガラス表面、ポリマー、並び
にアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルもし
くはスルフィドリル反応基を含む他の物質があるが、こ
れらに限定されない。蛍光による標識物質検出装置の例
は、広く入手しうる自動ＤＮＡ配列決定装置、毛管電気
泳動装置および蛍光ゲルリーダーである。
【００４３】上記の１工程標識法に加えて、本発明はま
た、第１工程では、本発明の化合物を共有結合反応させ
て、抗体のような第１成分を標識する、２工程標識法に
関する。２工程法の第２工程すなわち染色工程では、蛍
光標識第１成分を、抗体が特異的である抗原のような第
２成分のプローブとして用いる。そのように標識された
抗体の標的が細胞であるとき、その方法の第２工程を用
いると、細胞の蛍光強度を測定することによって、その
種の細胞に結合した標識抗体量を測定しうる。この２工
程法によって、第１工程において本発明の蛍光化合物で
共有結合標識されたモノクローナル抗体および他の成分
は、抗原プローブとして用いることができる。
【００４４】本発明の化合物はまた、系内の特定のタン
パク質または他の成分の濃度の測定に用いることができ
る。プローブと反応しうるタンパク質上の反応基の数が
分かれば、分子当たりの蛍光を知ることができ、系内の
これらの分子の濃度は系の総蛍光強度によって決定する
ことができる。この特定の方法を用いると、マイクロタ
イタープレートリーダーまたは他の公知の免疫蛍光検出
装置を使用して、各種標識分析物の濃度を測定すること
ができる。蛍光標識物質の濃度は、例えば蛍光偏光検出
装置を使用して測定することもできる。
【００４５】本発明の蛍光化合物はまた、第２成分混合
物中の複数の第２成分の各々を識別するために、複数の
蛍光化合物が複数の異なる抗体のような一次成分に共有
結合し、各一次成分が抗原のような異なる第２成分に対
して特異的である、検出方法に用いることもできる。こ
の使用方法では、各一次成分は、他の一次成分の標識に
用いる染料分子と較べて吸収および発光波長特性が異な
る蛍光化合物で別々に標識される。次に、いわゆる一次
成分は、抗原のような第２成分を含有する配合物に加え
られ、そして一次成分は選択的に各第２成分に結合する
ことができる。
【００４６】未反応プローブ物質を、例えば洗浄によっ
て配合物から除去すると、分析の邪魔になるのを防ぐこ
とができる。次に、配合物に、特定の蛍光化合物の吸収
波長を含む範囲の励起波長を照射する。次に、励起波長
光線および蛍光波長を選ぶフィルターまたはモノクロメ
ーターを有する蛍光顕微鏡または他の蛍光検出装置、例
えば流動細胞計測器または蛍光分光光度計を用いて、使
用蛍光化合物に相当する発光波長の強度を測定する。蛍
光強度は、特定の標識一次成分と結合した第２成分の量
を示している。多変数蛍光試験を行う公知の方法は、例
えば多変数流動細胞計測法である。
【００４７】ある場合には、単一の励起波長を用いて、
混合物中の２種以上の物質から蛍光を励起することがで
き、異なる波長でのそれぞれの蛍光および各標識成分の
量は、各発光波長でのその個々の蛍光強度を検出するこ
とによって測定することができる。必要ならば、光吸収
法を用いることもできる。
【００４８】本発明の検出方法は、蛍光一次成分の形成
が可能などのような系にも適用することができる。例え
ば、適切な反応性の蛍光化合物はＤＮＡまたはＲＮＡフ
ラグメントとコンジュゲートさせることができ、次い
で、得られるコンジュゲートをＤＮＡまたはＲＮＡの相
補的標的鎖に結合させる。次に、適当な蛍光検出装置を
用いると、結合蛍光コンジュゲートの存在を検出するこ
とができる。
【００４９】本発明はまた、本発明の化合物と、例えば
タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、誘導核酸、脂
質、特定の他の生物学的分子、生物学的細胞、可溶性ポ
リマー、ポリマー粒子、ポリマー表面、ポリマー膜、ガ
ラス表面、および他の粒子および表面等の物質上のアミ
ン、ヒドロキシ、アルデヒド、スルフィドリル、ホスホ
リルまたは他の公知の官能基との間の共有結合反応に関
する。蛍光の検出には非常に敏感な光学方法がかかわる
ので、存在する標識が非常に少ない量であるときでも、
これらの染料”標識”の存在は検出および定量すること
ができる。従って、染料標識試薬は、標識された物質量
の測定に用いることができる。
【００５０】例えば、フルオレセインと比較すると、本
発明の固定化モノメチンシアニンは著しく光安定性であ
り、ｐＨ２〜１０のｐＨ変化に感受性ではない。本発明
の化合物は３００〜５００ｎｍまたはそれ以下の波長で
光の吸収および発光が極大であり、従って、クマリンお
よびピレンの代替物である。また、本発明の化合物のほ
ぼ３００〜５００ｎｍでの発光極大は可視スペクトル
の”青色”領域に相当し、従って、吸収および発光極大
が５００ｎｍ以上である上記のＢＯＤＩＰＹ化合物、キ
ノリン型モノメチンシアニン複合体、およびピリジン型
モノメチンシアニン複合体よりも一般に低い。
【００５１】本発明はまた、基Ｒ4〜Ｒ7によって任意に
置換されている式（Ａ）の化合物またはそのプロトン化
形：
【化１８】 （式中、Ｒ4〜Ｒ7、Ｘ、Ｙ、Ｚ1およびＺ2は上記定義通
りである）と、結合Ｔの形成に適した化合物との反応を
含む式（６）の複合体の製造方法を提供するものであ
る。
【００５２】好ましい態様において、本発明は、硼素化
合物ＢＭ3（Ｍはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨー
ドである）と化合物（Ａ）の４級化誘導体との反応を含
む、式（６）の化合物の製造方法を提供するものである
（反応経路１ｂおよび１ｃ参照）。反応は不活性非極性
溶媒、例えばトルエンのような炭化水素中で行うのが適
している。反応は塩基、例えばジイソプロピルエチルア
ミンのような有機塩基中、５０〜１５０℃、好ましくは
１００〜１２５℃のような高温で行うのが適している。
ＢＭ3は三弗化硼素エーテル錯化合物が適している。
【００５３】第２の好ましい態様において、本発明は、
式： Ｒ2−ＣＨＫ−ＣＨＫ−Ｒ3 （式中、Ｒ2およびＲ3は上記定義通りであり、Ｋはブロ
モおよびパラ−トルエンスルホネートから選択される脱
離基である）の化合物と、式（Ａ）の化合物との反応を
含む、式（７）の化合物の製造方法を提供する。
【００５４】Ｒ4〜Ｒ7が酸の存在を必要とせずに第４ア
ンモニウムイオンを形成するほど十分に電子吸引性でな
いならば、式（Ａ）の化合物の四級化は、酸ＨＲ（Ｒは
酸残基、例えばハライド、ＣｌＯ4 -、ＣＦ3ＣＯ2 -また
はパラ−トルエンスルホニルである）の存在下で行うの
が好ましい。Ｒは、ハライド、例えば臭素が好ましい。
四級化反応は室温以上、２５０℃以下で行うのが適して
いる。
【００５５】ＸおよびＹが同じであり、構造Ｚ1および
Ｚ2が同じである式（Ａ）の対称化合物は、基Ｒ4および
Ｒ5によって任意に置換されている式（Ｂ）：
【化１９】 （式中、Ｒ4、Ｒ5、ＸおよびＺ1は上記定義通りであ
る）の化合物を適切な理論量で、ＣＨ2（ＣＮ）2、ＣＨ
2（ＣＯＯＨ）2およびＣＨ2（ＣＯＯＥｔ）2から選択さ
れる少なくとも１種の化合物と反応させる環縮合反応に
よって製造することができる。反応はポリリン酸および
熱の存在下で行うのが適している。あるいは、化合物
（Ｂ）を式：
【化２０】 （式中、Ｒ′はメチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブ
チルから選択される）の化合物で環縮合してもよい。反
応はトリエチルアミンのような塩基の存在下、メタノー
ルのようなアルコール中での還流下で行うのが好ましい
（反応経路１ａ参照）。
【００５６】ＸおよびＹが異なる式（Ａ）の非対称化合
物は、基Ｒ4およびＲ5によって任意に置換されている式
（Ｄ）：
【化２１】 （式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、ＸおよびＺ1は上記定義通りで
あり、Ｒ′はメチル、エチル、ｎ−ブチルおよびプロピ
ルから選択される）の化合物を、基Ｒ6およびＲ7によっ
て任意に置換されている式（Ｅ）：
【化２２】 （式中、Ｒ6、Ｒ7、ＹおよびＺ2は上記定義通りであ
る）の化合物と、メタノールのようなアルコール溶液中
の還流下で加熱することによって製造しうる（反応経路
１ａ参照）。
【００５７】反応経路１ａに示される合成方法は、式
（Ｄ）の化合物と、基Ｒ4およびＲ5によって任意に置換
されている式（Ｂ）の化合物（式中、Ｒ4、Ｒ5、Ｘおよ
びＺ1は上記定義通りである）との反応による、式
（Ａ）の対称化合物の製造にも適している。
【００５８】化学式（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）および
（Ｅ）の先駆体化合物は、当業者に周知の方法によって
製造しうる。例えば、Ｌｏｅｗ等の米国特許第４，０６
４，１３６号参照（この全ての記載は参照することによ
ってここに記載されたものとする）。
【００５９】Ｒ1が水素以外のものである式（５）の化
合物を製造するためには、Ｒ1が水素である式（Ａ）の
化合物を適切な理論量で、化合物ＧＲ1（Ｇは塩素、臭
素およびヨウ素から選択され、Ｒ1は水素以外のもので
ある）と、ＮａＨ、ＮａＯＭｅまたはＮａＯＥｔのよう
な塩基の存在下で反応させる。
【００６０】式（５）の特定の化合物が、当業者に周知
の方法による式（５）の他の化合物への転化のための中
間体として有用であることは容易に理解されるであろ
う。同様に、特定の中間体は式（５）の誘導体の合成に
有用である。本発明の化合物はここに記載の方法によっ
て合成しうる。特定の有用性を有する化合物の誘導体
は、適切な先駆体を選択することによって、または得ら
れる化合物を官能基を様々な位置へ含める公知の方法に
より修飾することによって製造される。例として、本発
明の複合体を修飾して、蛍光標識試薬を製造するために
特定の反応基を含めてもよく、あるいは荷電または極性
基を加えて、化合物の極性もしくは非極性溶媒または物
質への溶解性を高めてもよい。転化の例としては、エス
テルをカルボン酸に転化しても、あるいはアミド誘導体
へ転化してもよい。
【００６１】以下は、本発明の化合物の合成具体例およ
びこれらの化合物に観察されたスペクトルデータであ
る。
【００６２】
【実施例】実施例１ ビス−（ベンゾチアゾリル）メチンボロンジ
フルオリド
【化２３】 ｉ） 冷却器および撹拌棒を備えた二口１００ｍｌ丸底
フラスコ中で、マロンニトリル（２．６４ｇ、４０ミリ
モル）を無水エタノール（４０ｍｌ）に溶解した。２−
アミノチオフェノール（１０ｇ，８０ミリモル）をこの
溶液に撹拌しながらゆっくり加えた。窒素ブランケット
下で、反応混合物を６時間、加熱還流した。冷却後、フ
ラスコを一晩、冷蔵した。形成されたビス−（２−ベン
ゾチアゾリル）メタンの淡緑色結晶を回収し、次に、真
空濾過、ヘキサンでの洗浄および乾燥を行った（収率：
８２％）。
【００６３】ｉｉ） エルレンマイヤーフラスコ中で、
ビス−（２−ベンゾチアゾリル）メタン（２．８２ｇ、
１０ミリモル）をクロロホルム（５０ｍｌ）に溶解し
た。臭化水素酸（１０ｍｌ）を含む氷酢酸を、そっと撹
拌しながら滴加した。カナリヤイエローの沈殿が形成し
て、反応混合物が粘稠となった。撹拌を１時間室温で続
けた。濾過およびエーテルでの洗浄を行った後、黄色の
微粉を回収した。収量は定量的であり、ビス−（２−ベ
ンゾチアゾリル）メテンモノハイドロブロマイド生成物
は次の段階のためには十分に純粋であった。
【００６４】ｉｉｉ） 撹拌棒を備えた丸底フラスコ中
で、ビス−（２−ベンゾチアゾリル）メテンモノハイド
ロブロマイド（１．１ｇ、３ミリモル）を乾燥トルエン
（５０ｍｌ）に懸濁させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエ
チルアミン（１．６ｍｌ、９ミリモル）を撹拌下、懸濁
液にゆっくり加えた。懸濁液は無職透明になった。注射
器を用いて、三弗化硼素エーテル錯化合物（１．１ｍ
ｌ、９ミリモル）を透明溶液へ注意深く加えた。反応混
合物はただちに黄色になり、いくらかの固体が析出し
た。窒素雰囲気下、フラスコを蒸気浴で１時間加熱し、
冷却し、そして内容物を水（５０ｍｌ）で急冷した。ト
ルエン層を分離し、冷蔵庫に貯蔵したところ、少量の黄
色固体が分離した。次に、トルエン層を濾過して、固体
粒状物を除去し、濾液を回転蒸発器で蒸発させたとこ
ろ、黄色固体が得られ、これをアセトン（２０ｍｌ）に
再溶解した。アセトンに不溶性の固体物質を濾去し、所
望のビス−（２−ベンゾチアゾリル）メチンボロンジフ
ルオリド複合体を濾液から結晶化させた（収率：８０
％）。
【００６５】実施例２ ビス−（ベンズオキサゾリル）
メチンボロンジフルオリド
【化２４】 米国特許第３２５０７８０号の方法によってオルト−ア
ミノフェノールをポリリン酸媒質中のマロン酸と縮合さ
せて、ビス−（ベンズオキサゾリル）メタンを３２％の
収率で生成した。縮合反応においてマロン酸に代わるも
のはマロン酸ジエチルである。
【００６６】縮合物を臭化水素酸で四級化し、その後、
実施例１におけるように三弗化硼素と反応させて硼素固
定化複合体を形成した。
【００６７】実施例１および２の硼素固定化複合体につ
いて観察された吸収極大、モル吸光係数、発光スペクト
ルおよび定性溶解度データは表２に示す。
【００６８】表２から、吸収および発光極大が溶媒極性
の広い範囲にわたって実際に敏感でないことが明らかで
ある。両化合物ともストークスシフトは比較的小さく、
オキサゾール型化合物は２８ｎｍシフトであり、チアゾ
ール型化合物はわずか５〜７ｎｍシフトである。
【００６９】図２（実施例１のチアゾール化合物）およ
び図３（実施例２のオキサゾール化合物）に示すよう
に、化合物の吸収スペクトル（実線）および発光スペク
トル（点線）は、吸収ピークがシャープで狭く、発光ピ
ークがいくらかブロードである特徴を有する。
【００７０】各種溶媒中の実施例１および２の化合物の
相対蛍光強度は表３に示す。表３は、染料の蛍光強度が
溶媒極性に敏感でないことを示している。極めて高い蛍
光量子効率も両染料化合物に見られた。
【００７１】メタノールおよびジクロロメタン中の実施
例１および２の化合物の耐光崩壊性も調べ、クマリン−
３０の光による退色率と比較した。石英キュベット中の
各染料のガス抜き溶液を、４インチの距離から５００ワ
ット水銀灯で照射した。極大波長での溶液光学濃度を時
間の関数で調べた。メタノール中では、オキサゾール型
化合物およびクマリン−３０は同じような速度で退色
し、一方、チアゾール型化合物はいくらか速く退色し
た。ジクロロメタンに溶解した実施例１および２の化合
物は、クマリン−３０よりも光退色に対する抵抗性は高
かった。
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】 表３ 実施例１および２の化合物の相対蛍光強度データ 溶媒 ビス−（ベンゾチアゾリル） ビス−（ベンズオキサゾリル） メチンボロンジフルオリド メチンボロンジフルオリド メタノール ０．８９ １．３５ エタノール − １．３３ アセトニトリル ０．８９ １．３９ 酢酸エチル ０．９７ １．２ クロロホルム ０．９１ １．２７ トルエン ０．８１ １．４２
【００７４】実施例３ ビス−（カルボキシメチルベン
ズオキサゾリル）メチンボロンジフルオリド
【化２５】 ｉ） ４５℃に維持した４−ヒドロキシフェニル酢酸
（１００ｇ、０．６５ミリモル）を含む氷酢酸（２５０
ｍｌ）の磁気撹拌溶液に、４０ｍｌの硝酸（比重１．
４）および６０ｍｌの氷酢酸の混合物を滴加した。硝酸
／酢酸混合物を加えた後、得られた混合物を２５℃で１
時間、撹拌し続け、次に、フラスコを氷水中で１時間冷
却した。得られた結晶を冷水で洗浄し、室温で空気乾燥
して、純粋な３−ニトロ−４−ヒドロキシフェニル酢酸
（収率：６５％）を得た。
【００７５】ｉｉ） ３−ニトロ−４−ヒドロキシフェ
ニル酢酸（１９．７ｇ、９０．１ミリモル）を１６０ｍ
ｌの水性０．６２５Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解し
た。パラジウム担持炭（１７５ｍｇ、触媒の１０重量
％）を得られた溶液に加え、次に２．５当量のヒドラジ
ン水和物を注射器を用いて０．５時間かけて注意深く滴
加した。混合物の温度を観察すると、反応のために６０
℃に上がった。反応混合物を８０℃にさらに加熱し、そ
の温度で０．５時間一定に保ち、次にさらに１時間還流
した。還流の間、溶液のオレンジ色が徐々に消えるのが
観察された。還流後、反応容器を２５℃に冷却し、混合
物をセライトで濾過して触媒を除去した。過剰の溶媒を
濾液から除き、２０〜３０ｍｌの濃縮物を得、そのｐＨ
を４〜５に氷酢酸で調節した。酸性にした濃縮物を冷却
すると、３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル酢酸の結
晶が析出し始め、これを濾過によって集めた。酸性にし
た濃縮物を一晩冷蔵庫で冷却すると、２回目の結晶が回
収された。３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル酢酸は
９２％の収率で回収された。
【００７６】ｉｉｉ） マロンニトリル（０．６６ｇ、
１０ミリモル）を５ｍｌの乾燥ジオキサンに溶解した。
この溶液に０．９２ｇ（２０ミリモル）のエタノールを
加え、次に、４Ｍ塩酸を含むジオキサンの溶液５ｍｌを
１回の注入で加えた。反応体を３６時間室温で撹拌し
た。得られた粘稠な白色スラリーを濾過し、少なくとも
３回乾燥エーテルで洗浄し、真空下、室温で１〜２時間
乾燥して、収率９３％でエチルビスイミデートヒドロク
ロリドを得た。
【００７７】ｉｖ） ３−アミノ−４−ヒドロキシフェ
ニル酢酸（１．６７ｇ、１０ミリモル）を３０ｍｌの乾
燥メタノールに丸底フラスコ中で懸濁させた。１．１５
ｇ（５ミリモル）の新しく製造したエチルビスイミデー
トヒドロクロリドを、懸濁液に素早く加えた。２回目の
乾燥メタノール３０ｍｌを加えたら、得られた混合物の
温度を還流温度に上げた。数分内で溶液が透明になった
のが観察された。還流するにつれて、生成物であるビス
−（カルボキシメチルベンズオキサゾリル）メタンが溶
液から析出し、混合物の濁りが増した。還流は４時間維
持し、その後、フラスコを室温に冷却し、そして冷蔵庫
で１２時間冷却した。濾過、メタノールでの洗浄および
乾燥を行った後、ビス−（カルボキシメチルベンズオキ
サゾリル）メタンを白色粉末の形で７５％の収率にて回
収した。
【００７８】ｖ） 前工程からの生成物（１．６５ｇ、
４ミリモル）をメタノール（２５ｍｌ）に懸濁させた。
塩化アセチル（１ｍｌ）を１回で加えたところ、懸濁液
はただちに透明になった。反応混合物を３時間還流加熱
したところ、０．５時間後に白色固体が形成した。反応
容器を２５℃に冷却し、次に、メタノールを真空下で除
去した。酢酸エチル（２５ｍｌ）を湿った白色固体に加
え、次いで、２０ｍｌの０．５Ｍ水性水酸化ナトリウム
を加えた。混合物の水性層および有機層を激しく混合し
た後、有機層を集め、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
真空下で濃縮して、ビス−（カルボキシメチルベンズオ
キサゾリル）メタンのジメチルエステルを含む無色で粘
性の油状物を得た。この油状物を次の工程に用いた。
【００７９】ｖｉ） ビス−（カルボキシメチルベンズ
オキサゾリル）メタンのジメチルエステルの臭化水素第
四塩を臭化水素酸の作用によって製造した。第４塩を次
に、実施例１の化合物の場合と同一の方法を用いて三弗
化硼素と縮合した。
【００８０】ｖｉｉ） 工程ｖｉ）の生成物を、３５ｍ
ｌのメタノールおよび５ｍｌの水酸化ナトリウム（８０
ｍｇ／ｍｌ）の混合物に懸濁させた。懸濁液を０．７５
時間加熱還流し、そして冷却後、溶媒を真空下で一部除
去して、３ｍｌの濃縮物を得た。濃縮物を氷酢酸でｐＨ
４〜５に調節して生成物を沈殿させた。濾液を濃縮し、
冷水で洗浄し、真空中２５℃で乾燥した後、ビス−（カ
ルボキシメチルベンズオキサゾリル）メチンボロンジフ
ルオリドを白色粉末の形で回収した（収率：８８％）。
1Ｈ ＮＭＲ ＣＤＣｌ3中：δ ７．６（ｍ，４Ｈ，４
−Ｈ，６−Ｈ，４′−Ｈ，６′−Ｈ）；７．３（ｄ，２
Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ，７−Ｈ，７′−Ｈ）；６．２（ｓ，１
Ｈ，メチンＨ）；３．８（ｓ，４Ｈ，２ＣＨ2−ＣＯＯ
Ｈ）。
【００８１】観察された化合物の極大吸収波長は３６２
ｎｍであり、極大発光波長は３８６ｎｍであり、いずれ
もメタノール中で測定した。化合物は高度に蛍光性であ
った。
【００８２】実施例４ ベンズオキサゾリル−ベンゾチ
アゾリル−メチンボロンジフルオリド
【化２６】 ｉ） ２−アミノ−ベンゼンチオール（１０ミリモル）
およびマロンニトリル（１０ミリモル）を、少量の氷酢
酸（１０ミリモル）を加えた１０ｍｌのエタノールに溶
解した。一晩撹拌した後、濾過および乾燥後に黄色結晶
物質を回収して、理論収量の８２％の２−シアノメチル
−ベンゾチアゾール（融点：１０５〜１０６℃）を得
た。
【００８３】ｉｉ） １：１モル比の２−シアノメチル
−ベンゾチアゾールおよび２−アミノフェノール（１０
ミリモル）を均一に混合し、粉砕し、丸底フラスコに移
した。ポリリン酸（約８０％、２０ｍｌ）を、流動性に
なるまで温め、そしてフラスコに注いだ。次に、フラス
コを１８５℃の油浴中に置き、窒素環境中で加熱した。
１時間後、フラスコを取り出し、内容物を砕いた氷の上
に注ぎ、１時間撹拌した。形成された塊を壊して、褐色
の懸濁液を得た。これを濾過し、得られた固形分を、洗
液が中性になるまで、冷水で洗浄した。次に、生成物２
−（２′−ベンズオキサゾリル）−メチル−ベンゾチア
ゾールを空気乾燥した。
【００８４】ｉｉｉ） 最終固定化硼素複合体は２−
（２′−ベンズオキサゾリル）−メチル−ベンゾチアゾ
ールから、まず臭化水素第４塩を製造し、次に、先の実
施例１および３におけるように、この塩を三弗化硼素と
縮合させることによって合成した。化合物の極大吸収波
長は３８８ｎｍ、極大発光波長は４１４ｎｍであり、い
ずれもメタノール中で測定した。化合物はメタノール中
で高度に蛍光性であった。
【００８５】実施例５ メソ−アセチル−ビス−（ベン
ゾチアゾリル）−メチンボロンジフルオリド
【化２７】 ｉ） 鉱油中の水素化ナトリウムスラリー（８０％、３
０ｍｇ）を、撹拌棒を備えた火炎乾燥した丸底フラスコ
に素早く移した。乾燥した新しく蒸留したテトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）（４ｍｌ）を次に加えた。別のフラス
コで、計量したビス−ベンゾチアゾリルメタン（実施例
１参照）（０．２８ｇ、１ミリモル）を１．５ｍｌのＴ
ＨＦに溶解した。この溶液を撹拌水素化ナトリウムスラ
リーへ滴加した。反応の間に発生した水素ガスを注意深
くガス抜きした。沸騰が止んだ後、反応混合物を０．５
時間撹拌した。
【００８６】ｉｉ） 塩化アセチル（０．０７８ｇ、１
ミリモル）を反応混合物へ滴加した。添加して数分内
に、反応混合物は塩化ナトリウムの沈殿のために濁っ
た。撹拌を２時間続け、その後、固形分を濾過により分
離した。濾液を蒸発させて油状物を得、次にこれをメタ
ノール（２ｍｌ）で希釈し、０．５時間そのままに放置
したところ、固体が析出した。その後冷却すると、さら
に固体が生じた。濾過および乾燥の後、生成物はほぼ３
０％の収率で得られた。
【００８７】ｉｉｉ） 上記のメソ−アセチル誘導体の
臭化水素第４塩を、臭化水素酸を加えることによって製
造した。この後に、実施例１と同様な方法で塩を二弗化
硼素と縮合して、メソ−アセチル−ビス−（ベンゾチア
ゾリル）メチンボロンジフルオリド（２７％）を得た。
発光団の極大吸収波長はメタノール中で測定して４１６
ｎｍであった。発色団は塩基性ベンゾチアゾール発色団
よりも蛍光性が少なかった。
【００８８】実施例６ ベンゾチアゾリル−ピリジルモ
ノメチンボロンジフルオリド
【化２８】 ｉ） ２−ピリジルメチル−ベンゾチアゾールを、エタ
ノール中の１：１モル比の２−シアノメチルピリジンお
よび２−アミノチオフェノールを８時間還流することに
よって製造した。約２５ｍｌのエタノールを、１０ミリ
モルスケール反応に用いた。溶媒を除去した後、黄色油
状物が残った。油状物をエーテルに溶解し、０．５Ｍ水
性水酸化カリウム溶液で洗浄して、未反応チオールを除
去した。次に、有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄
し、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて、再び黄色
油状物を得た。
【００８９】ｉｉ） その後の４級化および三弗化硼素
との縮合の工程は、実施例１の化合物の製造の場合と同
様であった。ベンゾチアゾリルピリジルモノメチンボロ
ンジフルオリドの収率は理論量の４０〜５０％であっ
た。発色団の極大吸収波長は４３０ｎｍ、極大発光波長
は４７６ｎｍであり、共にメタノール中で測定した。発
色団はメタノール中で高度な蛍光性を示した。
【００９０】実施例７ ２−（２′−ベンゾチアゾリ
ル）−キノリンメチンボロンジフルオリド
【化２９】 ２−（２′−ベンゾチアゾリルメチル）−キノリンを２
−メチルベンゾチアゾールおよび２−クロロキノリンか
ら、米国特許第２５４１４００号に記載の方法によって
製造した。得られた粗２−（２′−ベンゾチアゾリルメ
チル）−キノリンを実施例１におけるように４級化およ
び縮合した。２−（２′−ベンゾチアゾリル）−キノリ
ンメチンボロンジフルオリドの極大吸収波長は４８０ｎ
ｍ、極大発光波長は４９２ｎｍであり、共にメタノール
中で測定した。発色団は緑色の蛍光を示した。
【００９１】実施例８ タンパク質の標識 約２０ｍｇのビス−（カルボキシメチル−ベンズオキサ
ゾリル）メチンボロンジフルオリド複合体（実施例３の
ビス−カルボキシメチル染料）および約２５ｍｇのジス
クシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を２５０ｍｌの
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させた。懸
濁液を５５℃に加熱してビス−カルボキシメチル染料お
よびＤＳＣを溶解し、溶液をその温度に１時間維持し
た。ビス−カルボキシメチル染料およびＤＳＣを反応さ
せてジスクシンイミジルベンズオキサゾリルメチンボロ
ンジフルオリド複合体（Ｂｌｕｅ１−ＯＳｕ）、Ｂｌｕ
ｅ１のジスクシンイミジルエステルを形成した。セファ
デックスＧ５０カラムをリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）を
用いて製造した。１ｍｇのヒツジＩｇＧタンパク質を含
む４００マイクロリットルのＣＯ3 -／ＨＣＯ3 -緩衝溶液
（ｐＨ９．６）に、１０〜１５マイクロリットルのＢｌ
ｕｅ １−ＯＳｕ含有ＤＭＦ反応混合物を加えた。タン
パク質／染料溶液を１０分間ボルテックスし、次に、溶
液をセファデックスカラムに入れ、ＰＢＳで溶離した。
溶離した第１フラクションはタンパク質／染料コンジュ
ゲートであり、これは３６５ｎｍＵＶ灯下で青色領域の
蛍光を発した。
【００９２】次に、ヒツジＩｇＧタンパク質をより高い
染料対タンパク質比（染料分子／タンパク質分子）で標
識する実験を行った。１〜２ｍｇの乾燥ビス−カルボキ
シメチル−ＯＳｕ粉末を、１ｍｇのタンパク質を懸濁さ
せた４００マイクロリットルのｐＨ９．６緩衝溶液に直
接加えた。得られた染料／ＩｇＧコンジュゲートを次に
セファデックスＧ５０カラムで精製した。染料／タンパ
ク質コンジュゲートの染料対タンパク質比は２．７：１
であると推定された。ＰＢＳ中のタンパク質／染料コン
ジュゲートをその発光スペクトルについても試験し、測
定したところ、励起極大波長は３８０ｎｍ、発光極大波
長は４２５ｎｍであった。タンパク質／染料コンジュゲ
ートの量子収量を計算したところ０．５であった。
【００９３】実施例９ ６，６′−ジスルホ−メソ−カ
ルボキシメチル ビス−（ベンゾチアゾリル）−メチン
ボロンジフルオリド
【化３０】 ｉ） 鉱油中の水素化ナトリウムスラリー（８０％、３
０ｍｇ）を、撹拌棒を備えた火炎乾燥した２５ｍｌ丸底
フラスコに素早く移した。乾燥した新しく蒸留したＴＨ
Ｆ（４ｍｌ）を次に加えた。別のフラスコで、計量した
ビス−ベンゾチアゾリルメタン（０．２８ｇ、１ミリモ
ル）を１．５ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した。この溶液を
撹拌水素化ナトリウムスラリーへ滴加した。反応の間に
発生した水素ガスを注意深くガス抜きした。沸騰が止ん
だ後、反応混合物を０．５時間撹拌した。
【００９４】ブロム酢酸メチル（０．１５３ｇ、１ミリ
モル）を反応混合物へ滴加した。添加して数分内に、反
応混合物は臭化ナトリウムの沈殿のために濁った。撹拌
を２時間続け、その後、固形分を濾過により分離した。
濾液を蒸発させて緑色の油状物を得た。油状物をメタノ
ール（２ｍｌ）で希釈し、０．５時間そのままに放置し
たところ、黄緑色の固体が析出した。その後冷却する
と、さらに固体が生じた。濾過および乾燥の後、０．１
ｇの固形分が回収された（収率２８％）。
【００９５】ｉｉ） ３，３−ビス−（ベンゾチアゾー
ル−２−イル）プロピオン酸メチル（０．１７６ｇ、
０．５ミリモル）を８ｍｌのクロロホルムに２５ｍｌ丸
底フラスコ中で溶解した。臭化水素酸を含む酢酸（３０
％、５０マイクロリットル）を撹拌溶液へ滴加した。数
分内に黄色沈殿が形成した。撹拌をさらに０．５時間続
けた。濾過および乾燥の後、臭化水素酸塩を鮮黄色粉末
（０．１２ｇ、５５％）として回収した。
【００９６】ｉｉｉ） 工程ｉｉ）からの臭化水素酸塩
（１．０ｇ、２．３ミリモル）を乾燥トルエン（１５ｍ
ｌ）に、撹拌棒を備えた１００ｍｌ丸底フラスコ中で懸
濁させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３ｍ
ｌ）を撹拌懸濁液へ窒素雰囲気下で滴加したところ、反
応混合物は透明になった。次に、フラスコを氷／水浴中
に維持しながら、三弗化硼素トリエーテル錯化合物（５
ｍｌ）を反応混合物へ注意深く加えた。４時間後、撹拌
を停止し、反応混合物をヒュームフード内で濾過した。
水（１００ｍｌ）およびイソプロパノール（１００ｍ
ｌ）で洗浄しそして乾燥した後、黄色固体を回収した。
イソプロパノール／クロロホルムからの再結晶で黄色結
晶（０．２５ｇ、２７％）のメソ−カルボキシメチル−
ビス−（ベンゾチアゾリル）メチンボロンジフルオリド
（カルボキシメチル−Ｂｌｕｅ２染料）を得た。
【００９７】ｉｖ） カルボキシメチル−Ｂｌｕｅ２染
料（０．２ｇ）を５ｍｌの塩化メチレンに懸濁させた。
クロロスルホン酸（０．５ｍｌ）を懸濁液へ滴状で注入
すると、透明になった。クロロスルホン化は１８時間室
温で行った。次に、１０ｍｌの水を加えることによって
反応を急冷した。オレンジ色の層を注意深く分離した。
水性層に含まれる生成物を水酸化ナトリウム（０．２５
ｇ）を加えることによって塩基性加水分解し、溶液を室
温で２０時間撹拌した。加水分解の完了は生成物染料が
溶解することで示され、透明な青色蛍光の溶液が得られ
た。
【００９８】反応生成物には、１０％メタノール／水で
溶離する逆層Ｃ−１８ＴＬＣで、２種の化合物（Ｒｆ＝
０．８およびＲｆ＝０．３）が存在することが示され
た。混合物は、１０％メタノール／水を溶離剤として用
いる逆層Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーによって分
離した。鮮青色蛍光を示す２つのフラクションが得られ
た。モノ−およびビス−スルホン化カルボキシメチルＢ
ｌｕｅ２染料がそれぞれ５０ｍｇ、１０％および１２０
ｍｇ、２０％の収量で得られた。
【００９９】ｖ） ビス−スルホン化誘導体を次のよう
に、スクシンイミジルエステルおよびタンパク質コンジ
ュゲートの製造にさらに用いた。上で製造された約５〜
１０ｍｇのビス−スルホン化誘導体を、約１０ｍｇのＤ
ＳＣを含む０．２５ｍｌのヘキサメチルホスホアミド
（ＨＭＰＡ）および５０マイクロリットルのピリジンと
共にインキュベートした。撹拌しながら、混合物を１０
０℃に加熱し、そして０．２５時間反応させて、ジスク
シンイミジル誘導体を得た。生成物を室温に冷却した
後、約５〜１０マイクロリットルのこの誘導体を毛管を
用いて取り出し、ヒツジＩｇＧを含む新しく製造したＰ
ＢＳ緩衝溶液（４００マイクロリットル中に１ｍｇ）に
加えた。１５分後、染料／タンパク質コンジュゲートを
セファデックスＧ５０カラムを用いて未反応染料から分
離した。
【０１００】実施例１０ α−カルボキシメチル−５，
５′−ジスルホ−３．３′−エチレン−オキサシアニン
【化３１】 ｉ） エチルビスイミデートを、ＭｃＥｌｖａｎ等の方
法（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７１、４０
（１９７１））の変形によって製造した。マロンニトリ
ル（０．６６ｇ、１０ミリモル）を乾燥ジオキサン（５
ｍｌ）に溶解した。この溶液に、エタノール（０．９２
ｇ、２０ミリモル）を加えた。４ＭＨＣｌを含むジオキ
サン（５ｍｌ）の溶液を１回でマロンニトリル溶液へ注
入した。得られた混合物を３６時間室温で撹拌した。得
られた粘稠で白色のスラリーを濾過し、５０ｍｌの乾燥
エーテルで３回洗浄し、真空下、室温で１〜２時間乾燥
した。エチルビスイミデートヒドロクロリドの収率は９
３％であった。
【０１０１】ｉｉ） ３−アミノ−４−ヒドロキシベン
ゼンスルホン酸（１８．９ｇ、０．１モル）をメタノー
ル（１００ｍｌ）に懸濁させた懸濁液に、トリエチルア
ミン（１１．２ｇ、０．１１モル）を加えた。溶液を５
０ｍｌに濃縮し、冷却した。トリエチルアミン塩の褐色
結晶質生成物が得られた。これは分解を伴って２００℃
で溶融した。収率は理論量の８５〜９０％であった。
【０１０２】トリエチルアミン塩（２９ｇ、０．１モ
ル）を乾燥メタノール（２００ｍｌ）に懸濁させた。新
しく製造したエチルビスイミデート（１１．５ｇ、０．
０５モル）を懸濁液に加え、混合物を還流加熱した。５
分以内で溶液が透明になった。２時間加熱を続けると、
その後、溶液は濁ってきた。次に、反応混合物を冷却
し、５，５′−ジスルホ−３．３′−オキサシアニント
リエチルアミン塩の褐色結晶を濾過した（収量１２
ｇ）。結晶は１７０〜１７５℃で溶融した。
【０１０３】ｉｉｉ） 上で得られた生成物（１００ｍ
ｇ、０．２ミリモル）および３．４−ジ−パラ−トシル
酪酸メチル（８８ｍｇ、０．２ミリモル）を十分に混合
し、１８５℃（油浴温度）で２０分間ゆっくり加熱し
た。得られた暗褐色物質を、さらさらした粉末が得られ
る（１００ｍｇ）まで、０．２ミリモルのトリエチルア
ミンおよびイソプロパノール（２０ｍｌ）と共に粉砕し
た。粗生成物は、１０％メタノール／水中のＣ１８ＴＬ
Ｃに３つの鮮やかなスポットを示した。混合物を水／メ
タノール混合物を溶離剤として用いるＣ１８カラムでク
ロマトグラフィーした。Ｒｆ＝０．７５の遊離酸を溶媒
から回収したところ、銀色の粉末が得られた（収量１０
ｍｇ）。
【０１０４】図５に示すように、３６０ｎｍで励起した
ときの化合物のＵＶスペクトルの吸収極大は３６４ｎｍ
であり、発光極大は４０６ｎｍであった。キニンスルフ
ェートを標準とした量子収量は０．８であった。さらに
精製することなく、この遊離酸染料をスクシンイミジル
エステルの製造に用いた。
【０１０５】ｉｖ） 上で得られた酸を、１０マイクロ
リットルのピリジンを含有する１００マイクロリットル
の乾燥ＤＭＦに溶解した。過剰（１０ｍｇ）のＤＳＣを
加え、混合物を６５〜７０℃で２時間、窒素雰囲気下で
加熱した。反応完了後、乾燥ジエチルエーテル（５０ｍ
ｌ）を加えた。沈殿した活性エステルを濾過し、真空中
で１時間乾燥した。
【０１０６】乾燥した活性エステル（約１ｍｇ）をＤＭ
Ｆ（５０マイクロリットル）に溶解し、１０マイクロリ
ットルのこのストック溶液を、２５０ｍｌの炭酸塩−炭
酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解した１ｍｇのヒツ
ジＩｇＧタンパク質と３０分間反応させた。ＰＢＳ溶液
（ｐＨ７）を溶離剤として用いるサイズ排除カラム（セ
ファデックスＧ５０）で染料抗体コンジュゲートを未反
応染料から分離した。染料抗体コンジュゲートの吸収お
よび発光スペクトルを図６に示す。タンパク質は２８０
ｎｍで吸収し（０．１３８７吸光単位）、染料は３７２
ｎｍで吸収した（０．０４２５７吸光単位）。
【０１０７】実施例１１ メソ−５−カルボキシペンチ
ル−３，３′−エチレンチアシアニン
【化３２】 ｉ） 鉱油中の水素化ナトリウムスラリー（８０％、３
０ｍｇ）を、撹拌棒を備えた火炎乾燥した２５ｍｌ丸底
フラスコに素早く移した。乾燥した新しく蒸留したＴＨ
Ｆ（４ｍｌ）を次に加えた。別のフラスコで、計量した
ビス−ベンゾチアゾリルメタン（０．２８ｇ、１ミリモ
ル）を１．５ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した。この溶液を
撹拌水素化ナトリウムスラリーへ室温で滴加した。反応
の間に発生した水素ガスを注意深くガス抜きした。沸騰
が止んだ後、反応混合物を０．５時間撹拌した。
【０１０８】ヨードヘキサン酸メチル（０．２５６ｇ、
１ミリモル）を反応混合物へ滴加した。添加して数分内
に、反応混合物はヨウ化ナトリウムの沈殿のために濁っ
た。撹拌を２時間続け、その後、固形分を濾過により分
離した。濾液を蒸発させて緑色の油状物を得た。油状物
をメタノール（２ｍｌ）で希釈し、０．５時間そのまま
に放置したところ、黄緑色の固体が析出した。その後冷
却すると、さらに固体が生じた。濾過および乾燥の後、
０．１ｇの生成物、メソ−ビス−（ベンゾチアゾリル）
メタンヘキサン酸メチルエステルが回収された（収率２
８％）。
【０１０９】ｉｉ） 工程ｉ）からの生成物（１００ｍ
ｇ、０．２４ミリモル）およびエチレングリコールジ−
ｐ−トシレート（１００ｍｇ、０．２７ミリモル）を十
分に混合し、１８５℃（油浴温度）で２０分間加熱し
た。得られた暗褐色物質を、さらさらした粉末が得られ
る（５０ｍｇ）まで、０．２ミリモルのトリエチルアミ
ンと共に粉砕した。メチルエステルを水酸化ナトリウム
で加水分解した後、粗生成物を水／メタノールを溶離剤
として用いてＣ１８逆相カラムでクロマトグラフィーを
行って、所望の遊離酸を得た。水、０．１Ｎ ＨＣｌお
よび０．１Ｎ ＮａＯＨ中でのこの化合物のＵＶスペク
トルから、４１８ｎｍで励起したとき、吸収極大は４５
４ｎｍ、発光極大は４７２ｎｍであることが分かった。
キニンスルフェートを標準とした量子収量は０．８であ
った。ＰＢＳを溶媒として用いる別の試験では、化合物
の吸収極大は４５４ｎｍ、発光極大は４７２ｎｍであっ
た。エタノール中のクマリン３０を対照標準として用い
た量子収量は０．２８であった。
【０１１０】メソ−５−カルボキシペンチル−３，３′
−エチレンチアシアニンをそのスクシンイミジルエステ
ルに転化し、ヒツジＩｇＧタンパク質にコンジュゲート
した。ＰＢＳでは、コンジュゲートの吸収極大は４５６
ｎｍ、発光極大は４７２ｎｍ、そしてエタノール中のク
マリン３０を対照として用いた量子収量は０．１５であ
った。
【０１１１】ｉｉｉ） メソ−５−カルボキシペンチル
−３，３′−エチレンチアシアニンを次の方法でスルホ
ン化した。染料（１００ｍｇ）を、濃硫酸（１ｍｌ）お
よび無水酢酸（１ｍｌ）の混合物へ溶解し、１４０℃に
１時間加熱した。混合物を冷却し、暗褐色物質をアセト
ン（５０ｍｌ）と共に粉砕した。得られた固体を濾過
し、５％メタノール／水を溶離剤として用いる逆相Ｃ１
８カラムでのクロマトグラフィーを行った。Ｒｆ＝０．
３。
【０１１２】実施例１２ ３，３′−エチレン−６−ス
ルホチア−５′−カルボキシメチル−６′−スルホ−オ
キサモノメチンシアニン
【化３３】 ｉ） 氷浴中で冷却した４−ヒドロキシフェニル酢酸
（１００ｇ、０．６５モル）を含む氷酢酸（２５０ｍ
ｌ）の磁気撹拌溶液に、濃硝酸（４０ｍｌ）および氷酢
酸（８０ｍｌ）の混合物を２０分間かけて滴加した。撹
拌を５℃で１時間、次に室温で１時間続けた。溶液は添
加の間に黄色がかった褐色に変わった。粘性物質を濾過
し、冷水で洗浄し、室温で乾燥した。生成物をメタノー
ルから結晶化して、鮮黄色結晶（７２ｇ、５６％）を得
た。融点１４６〜７℃：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，
δ）：８．０（１Ｈ，ｓ，２−Ｈ）；７．５（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ）；７．１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈ
ｚ，５−Ｈ）；３．６（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2）。
【０１１３】ｉｉ） 丸底フラスコ中の水酸化ナトリウ
ム（１ｇ）を含む４０ｍｌの水の撹拌溶液に、工程ｉ）
からの３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル酢酸（４．
９３ｇ、０．０２５モル）を加えた。固体はすぐに溶解
してオレンジ色の溶液となった。１０％Ｐｄ／炭（５ｍ
ｇ）を加え、次にヒドラジン１水和物（３．２５ｍｌ）
を滴加した。添加完了（５分）後、混合物を６０℃で
１．５時間加熱した。温度を還流温度に上げ、さらに
０．５時間加熱を続けた。混合物はこれにＰｄ／Ｃを懸
濁させると透明になった。溶液を熱濾過し、半分の体積
に濃縮し、次いで冷却した。次に、溶液を酢酸でｐＨ４
〜５の酸性にした。冷却後分離した白色沈殿、３−アミ
ノ−４−ヒドロキシフェニル酢酸を濾過し、エタノール
で洗浄した。融点２２５〜７℃（収量３．４ｇ、３０
％）；1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，δ）：７．９（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝７Ｈｚ，６−Ｈ）；７．８（ｓ，１Ｈ，２−Ｈ）；
７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，５−Ｈ）；３．４
（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2ＣＯＯＨ）。
【０１１４】ｉｉｉ） ２−シアノメチルベンゾチアゾ
ールを、実施例４、工程ｉ）におけるように、サトー等
の方法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２１０−１１（１９８
３））により製造した。
【０１１５】ｉｖ） ２−シアノメチルベンゾチアゾー
ル（１．７４ｇ、０．０１モル）およびナトリウムメト
キシド（０．５ｇ、０．０１モル）を含む無水メタノー
ル（５０ｍｌ）の混合物を室温で１５時間撹拌した。得
られたオレンジ色の粉末を、分離することなく、次の工
程に用いた。酢酸を混合物に加えてナトリウムメトキシ
ドを中性にした。３−アミノ−４−ヒドロキシフェニル
酢酸（１．６７ｇ、０．０１モル）を加え、混合物を還
流加熱した。４時間後、メタノールを留去し、残留物
（３．４ｇ）を、クロロホルム／メタノールを溶離剤と
して用いるシリカゲルカラム（５０ｇ）上でのフラッシ
ュクロマトグラフィーにより精製した。黄色がかった緑
色の結晶がエタノールから得られた。融点１８２〜４℃
（収量０．７５ｇ、２３％）：1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ
−ｄ6，δ） ８．１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．
９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．６２（１Ｈ，Ｄ，Ｊ
＝７Ｈｚ）；７．６（１Ｈ，ｓ），７．４−７．５５
（２Ｈ，ｍ），７．３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），５．
０（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2−ブリッジ），３．７（２Ｈ，
ｓ，ＣＨ2ＣＯＯＨ）。
【０１１６】ｖ） ３２４ｍｇ（１ミリモル）の工程ｉ
ｖ）から得た酸および３７０ｍｇ（１ミリモル）のエチ
レングリコールジ−ｐ−トルエンスルホネートを共に４
時間１７０℃で加熱した。得られた黄色固体生成物を冷
却し、そしてアセトン（１００ｍｌ）、次にトリエチル
アミン（２ｍｌ）を加えた。溶液を蒸発させて乾燥し、
残留物をエーテルで洗浄して、過剰のトリエチルアミン
を除去した。固体暗褐色物質を次にメタノールに溶解し
た。１０ｍｌの熱メタノールに溶解したヨウ化ナトリウ
ムを加えて、３，３′−エチレン−シアニンｐ−スルホ
ネートをヨウ化物に転化した。溶媒を除去し、物質を全
部、１０％のメタノールを含むクロロホルム溶液に溶解
し、次に、クロロホルム／メタノールを溶離剤として用
いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーを
行った。２種の黄色生成物はＵＶ光の中で非常に明るか
った。これらを単離した。フラクションＡからの生成物
（２０ｍｇ、Ｒｆ＝０．３、１０％メタノール／クロロ
ホルムを用いるシリカゲル）は特徴づけをしなかった。
フラクションＢからの残留物は、蒸発させた後、所望の
染料、３，３′−エチレン−チア−（５′−カルボキシ
メチルオキサ）モノメチンシアニン（化合物１２Ａ）
（収量１５０ｍｇ、Ｒｆ＝０．１、５０％メタノール／
クロロホルムを用いるシリカゲル）として特徴づけられ
た。水／メタノール混合物を溶離剤として用いる逆相Ｃ
１８カラムで精製した：1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，
δ） ８．２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．９（１
Ｈ，Ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．４５−７．６（３Ｈ，
ｍ），７．４（１Ｈ，ｔ），７．３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７
Ｈｚ），６．５（１Ｈ，ｓ，ＣＨ−ブリッジ），４．９
−４．７（４Ｈ，ブロード ｍ，ＣＨ2 −ＣＨ2），３．
４（２Ｈ，ｓ，ＣＨ2ＣＯＯＨ）。ＵＶ（メタノール）
λmax４１０ｎｍ、ε６１０００、Ｅｍmax４２０ｎｍ、
φ水中で０．２４およびメタノール中で０．８２、標準
としてのクマリン３０に基づく。
【０１１７】ｖｉ） ３，３′−エチレン−チア−
（５′−カルボキシメチルオキサ）モノメチンシアニン
（化合物１２Ａ）（１００ｍｇ）を、濃硫酸（１ｍｌ）
および無水酢酸（１ｍｌ）の混合物に溶解し、１４０℃
に１時間加熱した。混合物を冷却し、暗褐色物質をアセ
トン（５０ｍｌ）と共に粉砕した。溶液を濾過し、得ら
れた固体を、水を溶媒として用い，逆相Ｃ１８カラムで
クロマトグラフィーを行って、３，３′−エチレン−６
−スルホチア−５′−カルボキシメチル−６′−スルホ
−オキサモノメチンシアニン（化合物１２Ｂ）を得た。
（Ｒｆ＝０．８、Ｃ１８、水）：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，
δ） ８．２（１Ｈ，ｓ，７−Ｈ），８．１（１Ｈ，
ｓ，７′−Ｈ），７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，５
−Ｈ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，４−Ｈ），
７．４５（１Ｈ，ｓ，４′−Ｈ），６．３（１Ｈ，ｓ，
ＣＨ−ブリッジ），４．９−４．７（４Ｈ，ブロード
ｍ，ＣＨ2−ＣＨ2，水の信号に合併），４．０（２Ｈ，
ｓ，ＣＨ2ＣＯＯＨ）。ＵＶ（メタノール）λmax４１４
ｎｍ、ε７００００、Ｅｍmax４２０ｎｍ、φ０．６０
（水）、標準としてのクマリン３０に基づく。
【０１１８】ｖｉｉ） 染料／タンパク質コンジュゲー
ト実験は非スルホン化染料（化合物１２Ａ）およびスル
ホン化染料（化合物１２Ｂ）で行った。Ｍｕｊｕｍｄａ
ｒ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４，１
０５（１９９３）に記載の方法により、両化合物ともそ
れらのスクシンイミジルエステルにそれぞれ転化した。
染料（１ｍｇ）を、１０マイクロリットルのピリジンを
含有する１００マイクロリットルの乾燥ＤＭＦに溶解し
た。ＤＳＣ（７ｍｇ）をこの混合物に加え、窒素雰囲気
下、２時間、６５〜７０℃で加熱した。反応完了後、溶
媒を減圧下、５０℃で除去した。乾燥スクシンイミジル
エステルを１００マイクロリットルの乾燥ＤＭＦに溶解
し、１０マイクロリットルのこのストック溶液を、２５
０マイクロリットルの炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ
９．４）に溶解した１ｍｇのヒツジＩｇＧと３０分間反
応させた。ＰＢＳ（ｐＨ７）を溶離剤として用いるサイ
ズ排除クロマトグラフィー（セファデックスＧ５０）に
より、染料抗体コンジュゲートを未反応染料から分離し
た。次のスペクトルデータが、各種溶媒中のコンジュゲ
ートおよび非コンジュゲート化合物（１２Ａ）および
（１２Ｂ）からそれぞれ得られた（表４参照）。
【０１１９】
【表４】表４ 化合物 溶媒 吸光 励起 発光 ＱＹ ストークス （極大） 波長 波長 シフト （ｎｍ） （ｎｍ） １２Ａ ＭｅＯＨ ４１０ ３８４ ４４４ ０．８２ ３４ １２Ａ 水 ４０８ ３８４ ４４０ ０．２４ ３２ １２Ａ ＰＢＳ ４１２ ３８４ ４１８ ０．０８ ６ １２Ｂ 水 ４１４ ３８４ ４２２ ０．６ ８ １２Ｂ ＰＢＳ ４１４ ３８４ ４２４ ０．３４＊ １０ ＊ 染料−ＩｇＧは３日間、室温に置いた。
【０１２０】
【０１２１】染料（１２Ａ）は、ＤＮＡに付ける実験に
も用いた。標準ニックトランスレーション反応によっ
て、５−アミノプロパルギル−２′−デオキシシチジン
−５′−トリホスフェートをＤＮＡの配列に組み込ん
だ。得られた脂肪族アミノ基含有ＤＮＡをエタノール沈
殿によって精製し、硼酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、
−２０℃で貯蔵した。このアミノ−ＤＮＡ（約１マイク
ログラム）を１２ＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
エステルと反応させることによって、蛍光ＤＮＡを形成
した。１マイクログラムのアミノ−プロパルギルＤＮＡ
を含む２５マイクロリットルの緩衝液を、２５マイクロ
リットルのホルムアミドで希釈し、７７℃に５分間加熱
して、ＤＮＡを一重鎖形に変性し、ただちに氷で冷却し
て、二重鎖ＤＮＡの再形成を防いだ。この冷溶液を同体
積の炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．２）で希釈し
た。１２Ａの活性エステル（１マイクロリットルのＤＭ
Ｆ中約１０ミリモル）をＤＮＡに加え、混合物を室温で
１時間インキュベートした。次に、ＤＮＡを酢酸アンモ
ニウム／エタノールで沈殿させ、氷冷７０％エタノール
で２回洗浄し、次にＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ緩衝液に再溶解
した。蛍光ＤＮＡ生成物をアガロースゲル電気泳動によ
って分析し、標準ＵＶトランス−イルミネーションを用
いて可視化した。
【０１２２】実施例１３および１４ 本発明の合成経路を用いて、次の化合物１３および１４
を製造した：
【化３４】 化合物は表示溶媒中で次のスペクトル特性を示した（表
５参照）。化合物１４はまたヒツジＩｇＧタンパク質に
コンジュゲートし、記載のスペクトル特性を示した。量
子収量は、対照標準としてエタノール中のクマリン３０
を用いて測定した。
【０１２３】
【表５】表５ 化合物 溶媒 吸光 励起 発光 ＱＹ＊ ストークス （極大） 波長 波長 シフト （ｎｍ） （ｎｍ） １３ メタノール ４３８ ４１８ ４５０ ０．８１ １２ １３ ＰＢＳ − ４１８ ４５０ ０．６１ １４ メタノール ４４０ ４１８ ４５０ １．２１６ １０ １４ 水 ４５０ ４１８ ４７２ ０．７ ２２ ＊ 相対量子収量はクマリン３０（０．６７）に基づく。
【０１２４】
【０１２５】実施例１５ ガラス表面の共有結合標識 アルコキシシランはガラス表面と反応することが知られ
ている。そのような試薬の１つである３−アミノプロピ
ルトリメトキシシランは、多孔質ガラスビーズに塗布す
ると、アフィニティクロマトグラフィー用の吸着体とし
て使用されるガラスのアミノプロピル誘導体を形成する
ことが知られている。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔ．、２１２、１（１９７０）；Ｊ．Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、９７、３９（１９７４）参照。
この方法を、本発明の蛍光染料化合物によるガラススラ
イドの染色に適用した。
【０１２６】ゴールドシールマイクロスライド（ベクト
ン−ディッキンソン社）を蒸留水およびアセトンで洗浄
した。次に、スライドを３−アミノプロピルトリメトキ
シシラン（シグマ ケミカル社）を含むキシレンの１０
％（ｖ／ｖ）溶液で３０分間処理した。そしてスライド
を無水エタノール中ですすいでキシレンを除去し、水中
ですすぎ、空気乾燥した。炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液
（ｐＨ９．４）の溶液（約２００マイクロリットル）を
各スライドの中心に、ＤＭＦに溶解した本発明の染料の
溶液（約２ｍｇ染料／１００マイクロリットルＤＭＦ）
２０マイクロリットルと共に置いた。使用染料化合物は
次のスクシンイミジルエステルモノメチンシアニン化合
物であった：
【化３５】 スクシンイミジルエステル誘導体は、米国特許第５２６
８４８６号に概略記載の方法によって製造した。スライ
ドを２０分間インキュベートした後、蒸留水ですすい
だ。このようにして、スクシンイミジルエステル染料化
合物をガラススライドの表面に共有結合付着させた。共
有結合付着した染料がガラス表面上にあることは、蛍光
分光光度計によって検出された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のビス−ベンズオキサゾリルメ
チンボロンジフルオリド複合体およびビス−ベンズオキ
サゾリルメチンヒドロクロリドの、相対蛍光強度対波長
のプロットである。
【図２】図２は、本発明のビス−ベンゾチアゾリルメチ
ンボロンジフルオリド化合物の吸収および発光スペクト
ルのプロットである。
【図３】図３は、本発明のビス−ベンズオキサゾリルメ
チンボロンジフルオリド化合物の吸収および発光スペク
トルのプロットである。本発明の化合物の複素環の固定
化で得られる蛍光の増加は、ビス−ベンズオキサゾリル
メテンボロンジフルオリド複合体（曲線ａ）およびビス
−ベンズオキサゾリルメテンボロンジフルオリドヒドロ
クロリド（曲線ｂ）のメタノール中での相対蛍光スペク
トル（いずれも３４８ｎｍで励起した）を示す図１で証
明される。硼素固定化複合体の量子収量は、非固定化染
料の数倍以上である。
【図４】図４は、本発明のエチレン固定化ベンズオキサ
ゾリルメチン複合体（曲線ａ）、５，５′−ジスルホ−
３，３′−エチレンオキサシアニン、非固定化Ｎ，Ｎ′
−ジメチル−ジ−２−ベンズオキサゾリルメタンのグリ
セロール中（曲線ｂ）のおよび水中（曲線ｃ）の相対蛍
光スペクトル（いずれも３６４ｎｍで励起した）のプロ
ットである。
【図５】図５は、実施例１０の化合物のＵＶ吸収スペク
トルおよび発光スペクトルのプロットである。
【図６】図６は、ＩｇＧヒツジ抗体にコンジュゲートし
た実施例１０の化合物のＵＶ吸収スペクトルのプロット
である。
【図７】図７は、本発明の化合物を合成する反応経路１
ａである。
【図８】図８は、本発明の化合物を合成する反応経路１
ｂである。
【図９】図９は、本発明の化合物を合成する反応経路１
ｃである。
【手続補正書】
【提出日】平成８年６月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のビス−ベンズオキサゾリルメ
チンボロンジフルオリド複合体およびビス−ベンズオキ
サゾリルメチンヒドロクロリドの、相対蛍光強度対波長
のプロットである。
【図２】図２は、本発明のビス−ベンゾチアゾリルメチ
ンボロンジフルオリド化合物の吸収および発光スペクト
ルのプロットである。
【図３】図３は、本発明のビス−ベンズオキサゾリルメ
チンボロンジフルオリド化合物の吸収および発光スペク
トルのプロットである。本発明の化合物の複素環の固定
化で得られる蛍光の増加は、ビス−ベンズオキサゾリル
メテンボロンジフルオリド複合体（曲線ａ）およびビス
−ベンズオキサゾリルメテンヒドロクロリド（曲線ｂ）
のメタノール中での相対蛍光スペクトル（いずれも３４
８ｎｍで励起した）を示す図１で証明される。硼素固定
化複合体の量子収量は、非固定化染料の数倍以上であ
る。
【図４】図４は、本発明のエチレン固定化ベンズオキサ
ゾリルメチン複合体（曲線ａ）、５，５′−ジスルホ−
３，３′−エチレンオキサシアニン、非固定化Ｎ，Ｎ′
−ジメチル−ジ−２−ベンズオキサゾリルメタンのグリ
セロール中（曲線ｂ）のおよび水中（曲線ｃ）の相対蛍
光スペクトル（いずれも３６４ｎｍで励起した）のプロ
ットである。
【図５】図５は、実施例１０の化合物のＵＶ吸収スペク
トルおよび発光スペクトルのプロットである。
【図６】図６は、ＩｇＧヒツジ抗体にコンジュゲートし
た実施例１０の化合物のＵＶ吸収スペクトルのプロット
である。
【図７】図７は、本発明の化合物を合成する反応経路１
ａである。
【図８】図８は、本発明の化合物を合成する反応経路１
ｂである。
【図９】図９は、本発明の化合物を合成する反応経路１
ｃである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アラン・エス・ワゴーナー アメリカ合衆国ぺンシルバニア州15208, ピッツバーグ，サウス・レキシントン・ア ベニュー 121 (72)発明者 バルチャンドラ・エム・カランディカル アメリカ合衆国オレゴン州97223，タイガ ード，モーニング・ヒル・ドライブ 11844

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基Ｒ2〜Ｒ7で任意に置換されている下式
    の化合物： 【化１】 （式中、 基Ｒ1〜Ｒ7は、所望の溶解性、反応性およびスペクトル
    特性を化合物にもたらすように選択され；Ｔは 【化２】 が６または７員環であるような結合基であり；Ｘおよび
    Ｙは同じまたは異なるものであり、ビス置換炭素、酸
    素、硫黄、セレニウム、ＣＨ＝ＣＨおよびＮ−Ｗから選
    択され、ここで、Ｎは窒素であり、Ｗは水素、基−（Ｃ
    Ｈ2）nＲ8から選択され、ここで、ｎは１〜２６の整数
    であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセター
    ル、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリー
    ル、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カル
    ボキシレート、置換アミノ、第４アミノ、ニトロ、第１
    アミド、置換アミド、並びにアミノ、ヒドロキシル、ア
    ルデヒド、ホスホリルおよびスルフィドリル基と反応性
    の基から選択され；基Ｚ1およびＺ2は、各環が５または
    ６個の原子を有する１、２または３個の縮合芳香族環を
    完成するのに必要な原子を表し、炭素原子、並びに任意
    に２個以下の酸素、窒素および硫黄原子から選択され；
    但し、ＸおよびＹが同じである場合、Ｒ1〜Ｒ7の少なく
    とも１つは水素またはＣ1−Ｃ4アルキル以外である）。
  2. 【請求項２】 基Ｒ4〜Ｒ7で任意に置換されている下式
    の化合物： 【化３】 （式中、 ＭはＦおよびＣｌから選択され；基Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6
    およびＲ7は、所望の溶解性、反応性およびスペクトル
    特性を化合物にもたらすように選択され；ＸおよびＹは
    同じまたは異なるものであり、ビス置換炭素、酸素、硫
    黄、セレニウム、ＣＨ＝ＣＨおよびＮ−Ｗから選択さ
    れ、ここで、Ｎは窒素であり、Ｗは水素、基−（Ｃ
    Ｈ2）nＲ8から選択され、ここで、ｎは１〜２６の整数
    であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセター
    ル、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリー
    ル、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カル
    ボキシレート、置換アミノ、第４アミノ、ニトロ、第１
    アミド、置換アミド、並びにアミノ、ヒドロキシル、ア
    ルデヒド、ホスホリルおよびスルフィドリル基と反応性
    の基から選択され；基Ｚ1およびＺ2は、各環が５または
    ６個の原子を有する１、２または３個の縮合芳香族環を
    完成するのに必要な原子を表し、炭素原子、並びに任意
    に２個以下の酸素、窒素および硫黄原子から選択され；
    但し、ＸおよびＹが同じである場合、Ｒ1〜Ｒ7の少なく
    とも１つは水素またはＣ1−Ｃ4アルキル以外である）。
  3. 【請求項３】 基Ｒ2〜Ｒ7で任意に置換されている下式
    の化合物： 【化４】 （式中、 基Ｒ1〜Ｒ7は、所望の溶解性、反応性およびスペクトル
    特性を化合物にもたらすように選択され；ＸおよびＹは
    同じまたは異なるものであり、ビス置換炭素、酸素、硫
    黄、セレニウム、ＣＨ＝ＣＨおよびＮ−Ｗから選択さ
    れ、ここで、Ｎは窒素であり、Ｗは水素、基−（Ｃ
    Ｈ2）nＲ8から選択され、ここで、ｎは１〜２６の整数
    であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデヒド、アセター
    ル、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリー
    ル、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カル
    ボキシレート、置換アミノ、第４アミノ、ニトロ、第１
    アミド、置換アミド、並びにアミノ、ヒドロキシル、ア
    ルデヒド、ホスホリルおよびスルフィドリル基と反応性
    の基から選択され；基Ｚ1およびＺ2は、各環が５または
    ６個の原子を有する１、２または３個の縮合芳香族環を
    完成するのに必要な原子を表し、炭素原子、並びに任意
    に２個以下の酸素、窒素および硫黄原子から選択され；
    但し、ＸおよびＹが同じである場合、Ｒ1〜Ｒ7の少なく
    とも１つは水素またはＣ1−Ｃ4アルキル以外である）。
  4. 【請求項４】 Ｒ2〜Ｒ7が同じまたは異なるものであ
    り、−Ｒ9または−Ｌ−Ｒ9であり、ここで、Ｒ9は ＊ 水溶性を低下させる中性基、例えば、水素およびハ
    ロゲン原子； ＊ 水溶性を高める極性基、例えば、アミド、スルホネ
    ート、スルフェート、ホスフェート、第４アンモニウ
    ム、グアニジニウム、ヒドロキシルおよびホスホネー
    ト； ＊ 標識反応に用いうる官能基、例えば、任意に置換さ
    れたアミノ、アジド、ヒドロキシル、スルフィドリル、
    イミダゾール、カルボキシルおよびカルボニル基、例え
    ばアルデヒドまたはケトン、並びにアミノ、ヒドロキシ
    ル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフィドリル基と
    反応性の基； ＊ 反応基、例えば、スクシンイミジルエステル、イソ
    チオシアネート、イソシアネート、無水物、ハロアセト
    アミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホアミ
    ダイト、酸ハライド、アシルアジド、アルキルイミデー
    ト、ヒドラジド、アリールイミデート、ヒドロキシルア
    ミン、カルボジイミド； ＊ 蛍光分子の吸収および発光波長をシフトする電子供
    与および吸引基、例えばアミド、シアノ、ニトロ、アル
    コキシ、スチリル、アリールおよびヘテロアリール基； ＊ 脂質および炭化水素可溶化基、例えばアルキル、ア
    リールおよびアラルキル基；から選択され；そしてＬは
    直鎖または分枝鎖Ｃ1-27アルキル、Ｃ2-20モノエーテル
    もしくはポリエーテルおよびＣ2-20モノアミドもしくは
    ポリアミドよりなる群から選択される、請求項１、２ま
    たは３に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ1が、水素、アリール、ヘテロアリー
    ル、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロゲン、ヒドロキ
    シ、炭素原子数２６以下のアルキル基、アミノ、第４ア
    ミノ、アセタール、ケタール、ホスホリル、スルフィド
    リル、水への可溶化基、および−（ＣＨ2）nＱから選択
    され、ここで、１＜ｎ＜２６であり、Ｑはアミノ、置換
    アミノ、第４アミノ、アルデヒド、アセタール、ケター
    ル、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロ
    キシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレー
    ト、アミド、ニトロ、並びにアミノ、ヒドロキシル、ア
    ルデヒド、ホスホリルおよびスルフィドリルと反応性の
    基から選択される、請求項１、２または３に記載の化合
    物。
  6. 【請求項６】 Ｒ9が、水素、Ｃ1-6アルコキシ、第１ア
    ミン、第２アミン、第４アンモニウム、アミド、シア
    ノ、ニトロ、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ス
    ルホネート、スルフェート、ホスフェート、ヒドロキシ
    ル、ホスホネート、アジド、スルフィドリル、イミダゾ
    ール、カルボキシル、アルデヒド、ケタール、スクシン
    イミジルエステル、イソチオシアネート、イソシアネー
    ト、無水物、ハロアセトアミド、マレイミド、スルホニ
    ルハライド、ホスホアミダイト、酸ハライド、アシルア
    ジド、イミデート、ヒドラジド、ヒドロキシルアミンお
    よびカルボジイミド；並びにアミノ、ヒドロキシル、ア
    ルデヒド、ホスホリルまたはスルフィドリル基と反応性
    の基から選択され；そしてＬが、直鎖または分枝鎖Ｃ
    1-27アルキル、Ｃ2-20モノエーテルもしくはポリエーテ
    ルおよびＣ2-20モノアミドもしくはポリアミドよりなる
    群から選択される、請求項４に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 ｉ） ６，６′−ジスルホ−メソ−カル
    ボキシメチル ビス−（ベンゾチアゾリル）メチンボロ
    ンジフルオリド、 ｉｉ） α−カルボキシメチル−５，５′−ジスルホ−
    ３，３′−エチレン−オキサシアニン、 ｉｉｉ） ３，３′−エチレン−６−スルファチア−
    ５′−カルボキシメチル−６′−スルファオキサモノメ
    チンシアニン、 ｉｖ） ５−カルボキシメチル−ビスー（ベンズオキサ
    ゾリル）メチンボロンジフルオリド、 ｖ） α−カルボキシメチル−３，３′−エチレンチア
    シアニン、 ｖｉ） メソ−カルボキシメチル−ベンズオキサゾリル
    −ベンゾチアゾリルモノメチンボロンジフルオリド、か
    ら選択される、請求項１に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 式（Ａ）： 【化５】 （式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ1、Ｚ2、Ｒ1およびＲ4〜Ｒ7は前記
    定義通りである）の化合物またはそのプロトン化形を、
    結合Ｔ（Ｔは前記定義通りである）の形成に適した化合
    物と反応させることを含む、請求項１〜７のいずれかに
    記載の化合物の製造方法。
  9. 【請求項９】 Ｒ4〜Ｒ7で任意に置換されている下式ま
    たはそのプロトン化形の化合物： 【化６】 （式中、 基Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は所望の溶解性、反応
    性およびスペクトル特性を蛍光化合物にもたらすように
    選択され；ＸおよびＹは同じまたは異なるものであり、
    ビス置換炭素、酸素、硫黄、セレニウム、ＣＨ＝ＣＨお
    よびＮ−Ｗから選択され、ここで、Ｎは窒素であり、Ｗ
    は水素、基−（ＣＨ2）nＲ8から選択され、ここで、ｎ
    は１〜２６の整数であり、Ｒ8は水素、アミノ、アルデ
    ヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリー
    ル、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、ス
    ルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、第４アミ
    ノ、ニトロ、第１アミド、置換アミド、並びにアミノ、
    ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルおよびスルフィ
    ドリル基と反応性の基から選択され；基Ｚ1およびＺ
    2は、各環が５または６個の原子を有する１、２または
    ３個の縮合芳香族環を完成するのに必要な原子を表し、
    炭素原子、並びに任意に２個以下の酸素、窒素および硫
    黄原子から選択される）。
  10. 【請求項１０】 非極性物質に蛍光性を与える方法であ
    って、非極性物質中に、基Ｒ1〜Ｒ7の少なくとも１つが
    非荷電基である請求項１〜７のいずれかに記載の化合物
    を溶解する工程を含む方法。
  11. 【請求項１１】 極性物質に蛍光性を与える方法であっ
    て、極性物質中に、Ｒ基の少なくとも１つが荷電基およ
    び極性基よりなる群から選択される請求項１〜７のいず
    れかに記載の化合物を溶解する工程を含む方法。
  12. 【請求項１２】 標的物質に蛍光性を与える方法であっ
    て、 ｉ） アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、カルボニル
    およびスルフィドリル基よりなる群から選択される少な
    くとも１つの官能基を有し、そしてこれらの少なくとも
    １つの官能基と共有結合しうる少なくとも１つの反応基
    を有する標的物質；および ｉｉ） Ｒ基の少なくとも１つがアミノ、ヒドロキシ
    ル、ホスホリル、カルボニルおよびスルフィドリル基よ
    りなる群から選択される官能基であるか；またはＲ基の
    少なくとも１つがこれらの少なくとも１つの官能基と共
    有結合しうる反応基である、請求項１〜７のいずれかに
    記載の蛍光化合物のある量を、前記蛍光化合物の前記少
    なくとも１つの官能基または反応基を、前記標的物質の
    前記少なくとも１つの反応基または官能基に共有結合さ
    せるのに十分な時間、インキュベートする工程を含む方
    法。
  13. 【請求項１３】 核酸の配列を決定する方法であって、 ｉ） 配列決定される前記核酸の試料、配列決定される
    前記核酸の少なくとも一部に対して相補的なプライマー
    核酸配列、デオキシヌクレオチドおよび配列決定反応を
    停止するための少なくとも１種のジデオキシヌクレオチ
    ド供給材料、並びにポリメラーゼを用意し； ｉｉ） 核酸の連鎖延長および連鎖停止反応を行い； ｉｉｉ） オリゴヌクレオチドフラグメントを大きさに
    従って分ける；の各工程を含み、前記ジデオキシヌクレ
    オチドまたは前記プライマー核酸配列の１つ以上を、請
    求項１〜７のいずれかに記載の化合物で標識することを
    特徴とする方法。
JP8146335A 1995-06-07 1996-06-07 固定化モノメチンシアニン染料 Pending JPH09100416A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/474,057 US5986093A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Monomethine cyanines rigidized by a two-carbon chain
US474057 1995-06-07
US08/474,056 US5852191A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Rigidized monomethine cyanines
US474056 1995-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH09100416A true JPH09100416A (ja) 1997-04-15

Family

ID=27044333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8146335A Pending JPH09100416A (ja) 1995-06-07 1996-06-07 固定化モノメチンシアニン染料

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0747448B1 (ja)
JP (1) JPH09100416A (ja)
AT (1) ATE227322T1 (ja)
AU (1) AU719182B2 (ja)
CA (1) CA2178304A1 (ja)
DE (2) DE69624623T2 (ja)
GB (1) GB2301832B (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525024A (ja) * 2004-01-30 2007-08-30 イーストマン コダック カンパニー エレクトロルミネッセンス・デバイスのための有機素子
JP2008530063A (ja) * 2005-02-15 2008-08-07 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） 不飽和ジピロメテン−ボロンホウ素炭素
WO2015174662A1 (ko) * 2014-05-16 2015-11-19 에스케이케미칼주식회사 피로메텐 붕소 착화합물을 포함하는 염료
WO2015174663A1 (ko) * 2014-05-16 2015-11-19 에스케이케미칼주식회사 피로메텐 붕소 착화합물을 포함하는 염료

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1042407B1 (en) * 1997-12-17 2001-09-12 Carnegie-Mellon University Rigidized trimethine cyanine dyes
US6133445A (en) 1997-12-17 2000-10-17 Carnegie Mellon University Rigidized trimethine cyanine dyes
US6403807B1 (en) 1999-07-06 2002-06-11 Surromed, Inc. Bridged fluorescent dyes, their preparation and their use in assays
WO2003107010A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Rutgers, The State University Of New Jersey Reagents and procedures for high-specificity labeling
CN1878525B (zh) * 2003-12-24 2011-06-22 李勇男 用于桑拿浴室的远红外辐射发生器及提供有该发生器的桑拿浴室
US7074503B2 (en) 2004-01-30 2006-07-11 Eastman Kodak Company Organic element for electroluminescent devices
US7070868B2 (en) 2004-01-30 2006-07-04 Eastman Kodak Company Organic element for electroluminescent devices
US7425221B2 (en) 2004-09-13 2008-09-16 L'oreal S.A. Composition comprising at least one substituted derivative of carbocyanine, method for treating keratin fibers using it, device and use
US7419511B2 (en) 2004-09-13 2008-09-02 L'oreal, S.A. Compositions comprising at least one substituted carbocyanin derivative, processes for treating keratin fibers using them, device therefor and uses thereof
US7427301B2 (en) 2004-09-13 2008-09-23 L'ORéAL S.A. Composition comprising at least one substituted carbocyanin derivative, process for treating keratin fibers using it, device therefor and use thereof
US7381572B2 (en) 2004-12-23 2008-06-03 Rutgers, The State University Of New Jersey Reagents and procedures for multi-label high-specificity labeling
US7282373B2 (en) 2004-12-23 2007-10-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Ultra-high specificity fluorescent labeling
EP1954763B1 (en) 2005-11-28 2016-11-16 Dako Denmark A/S Cyanine dyes and methods for detecting a target using said dyes
US8206842B2 (en) 2009-04-06 2012-06-26 Global Oled Technology Llc Organic element for electroluminescent devices
ES2678211T3 (es) 2012-03-27 2018-08-09 Ventana Medical Systems, Inc. Conjugados de señalización y procedimientos de uso

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE464808A (ja) * 1944-11-11
GB610064A (en) * 1945-11-17 1948-10-11 Kodak Ltd Improvements in methods of making cyanine dyes and in photographic emulsions containing them
GB618889A (en) * 1946-07-23 1949-03-01 Kodak Ltd Improvements in the manufacture of n:n-alkylenebenzimidazocyanine dyes
US4490463A (en) * 1983-03-03 1984-12-25 Eastman Kodak Company Alkanediyl bridged benzimidazolo monomethine cyanine dyes, processes for their preparation, and photographic emulsions and elements containing such dyes
US5274113A (en) * 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525024A (ja) * 2004-01-30 2007-08-30 イーストマン コダック カンパニー エレクトロルミネッセンス・デバイスのための有機素子
JP2008530063A (ja) * 2005-02-15 2008-08-07 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） 不飽和ジピロメテン−ボロンホウ素炭素
WO2015174662A1 (ko) * 2014-05-16 2015-11-19 에스케이케미칼주식회사 피로메텐 붕소 착화합물을 포함하는 염료
WO2015174663A1 (ko) * 2014-05-16 2015-11-19 에스케이케미칼주식회사 피로메텐 붕소 착화합물을 포함하는 염료

Also Published As

Publication number Publication date
GB9611290D0 (en) 1996-07-31
GB2301832A (en) 1996-12-18
DE69624623D1 (de) 2002-12-12
EP0747448A3 (en) 1997-03-05
AU719182B2 (en) 2000-05-04
DE29610062U1 (de) 1996-11-07
ATE227322T1 (de) 2002-11-15
DE69624623T2 (de) 2003-07-24
EP0747448A2 (en) 1996-12-11
CA2178304A1 (en) 1996-12-08
GB2301832B (en) 1998-03-11
AU5478796A (en) 1996-12-19
EP0747448B1 (en) 2002-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5852191A (en) Rigidized monomethine cyanines
US6133445A (en) Rigidized trimethine cyanine dyes
JPH09100416A (ja) 固定化モノメチンシアニン染料
US6686145B1 (en) Rigidized trimethine cyanine dyes
JP5671525B2 (ja) 蛍光染料、合成方法及びその利用
AU2010273431B2 (en) Novel fluorescent dyes and uses thereof
US5981747A (en) Monomethine cyanines rigidized by a two-carbon chain
US20120015373A1 (en) Acridone derivatives as labels for fluorescence detection of target materials
JP2006056885A (ja) 水溶性ローダミン色素およびその結合体
EP1606351A4 (en) CYANINE DYES WITH MESO SUBSTITUTION AS A MARKER
EP1751236A2 (en) Long wavelength thiol-reactive fluorophores
US20040073014A1 (en) Fluorescent dyes, energy transfer couples and methods
JP2003506567A (ja) 蛍光染料および／またはマーカーとしてのアシルスルホンアミド−置換ポリメチン染料の使用
EP1758917A1 (en) Substituted azaporphyrins as fluorescence labels
JP2001002951A (ja) 新規な蛍光色素およびその蛍光マーカーとしての使用
WO2002068537A2 (en) Fluorescent dye
WO2000056933A1 (en) Chemically reactive plane-rigidized cyanine dyes and their derivatives