JPH09107980A - 新規生理活性タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト由来の新規な生理活性タンパクを見出
し、該タンパクの物理化学的及び生物学的性状を明らか
にすることにより生体機能の制御並びに種々の疾患の原
因を解明し、該種々の疾患の全く新しい治療薬を開発す
る。 【解決手段】 ヒト卵巣、胸腺及び白血球において特異
的に高発現が見られ、高い基質特異性を有するセリンプ
ロテアーゼ活性を有する新規生理活性タンパクを提供す
ることにより、該タンパクの機能異常及び／または該タ
ンパクと相互作用するタンパクのホルモン作用の破錠に
よる細胞の分化、成熟及び／または増殖の異常に起因す
る生理状態及び疾患の予防薬及び治療薬を開発する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来の新規生
理活性タンパク及び該タンパクをコードするＤＮＡ並び
に該タンパクに反応性を有する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトのＤＮＡには約３０億の塩基が含ま
れ、この中には生体自身及び生体の機能を維持するため
の未知数のタンパクのアミノ酸配列の情報が含まれてい
る。近年の生命工学技術の発展によりかなり多くのタン
パクのアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列が明らかにされてきているが、未だにその存
在すら明らかにされていないタンパクは数知れない。例
えばホルモン等の生理活性タンパクについても、未だ見
出されていない生理活性タンパクは数多く存在すると考
えられる。そのような未知なる生理活性タンパクを探索
する手法の１つとして、ある特定の生体組織あるいは細
胞等から多数のＤＮＡを取得し、それらのＤＮＡの塩基
配列を既に生理活性が解明されている既知の生理活性タ
ンパクのＤＮＡの塩基配列と比較することにより新規な
ＤＮＡを見出し、該新規なＤＮＡの塩基配列と高い相同
性を有するＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有する既
知のタンパクの生理活性を情報源として、該新規なＤＮ
Ａによりコードされるアミノ酸配列を有する新規タンパ
クの生理活性を究明する手法が有効な方法として一般的
に行われている。

【０００３】このようにして見出された新規な生理活性
タンパクの生理活性は、それ自体固有のものであるが、
該新規タンパクと高いアミノ酸配列（あるいは塩基配
列）の相同性を有する既知の生理活性タンパクの生理活
性及び機能と比較的類似している場合が多いことがこれ
までの研究成果から明らかである。

【０００４】大腸菌由来のｈｔｒＡと称されるセリンプ
ロテアーゼは、熱ショック蛋白の一種であり、この遺伝
子の欠損株は耐熱性を失う他、野生株に比べＨ₂Ｏ₂及び
Ｏ^2-に対する抵抗性が低下することが報告されている。
このことからｈｔｒＡは大腸菌内で生成された熱変性タ
ンパク及び酸化変性タンパクを分解し、タンパクの新生
を促す役割を担っていると考えられている。事実、ｈｔ
ｒＡ欠損大腸菌は野生株に比べ、マウス体内での生存時
間が短いことが報告されているが、これは白血球の持つ
酸化反応を利用した殺菌作用により生ずる酸化変性タン
パクが分解されず菌体内に蓄積されてしまうため死滅し
やすいものと考えられている（バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioche
m. Biophys. Res. Commun.）、第１７６巻、第７３０〜
第７３６頁、１９９１年；ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー（J. Bacteriol.）、第１７２巻、第１７９１
〜第１７９７頁、１９９０年）；インフェクシャス・イ
ミュニティー（Infect.Immun.）、第６２巻、第１００
０〜第１００７ページ、１９９４年）；及びインフェク
シャス・イミュニティー、第６２巻、第４１３５〜第４
１３９ページ、１９９４年など）。

【０００５】インスリン様増殖因子（ＩＧＦ、Insulin-
like Growth Factor、ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−II）に代
表されるソマトメジンと総称されるペプチドは、成長ホ
ルモン（ＧＨ、Growth Hormone）依存的に血中及び骨組
織を含む種々の局所組織に存在し、軟骨への硫酸塩の
取込みの促進、細胞の増殖及び分化の促進、並びに
インスリン様の作用を示す等の生理活性を有する。これ
らのＩＧＦは、血液中あるいは組織中ではＩＧＦに特異
的な結合タンパクであるインスリン様成長因子結合タン
パク（ＩＧＦＢＰ、Insulin-like Growth Factor Bindi
ng Protein）と結合した形で存在し、ＩＧＦのホルモン
作用は、このＩＧＦＢＰによりモジュレートされてい
る。

【０００６】ＩＧＦのモジュレータータンパクとしての
ＩＧＦＢＰは、これまでに６種類（ＩＧＦＢＰ−１〜Ｉ
ＧＦＢＰ−６）が知られており、各々、血液中、羊水及
び乳中等、並びに血液系細胞、卵巣由来の細胞、骨由来
の細胞、結合組織由来の細胞、肝臓由来の細胞あるいは
胸腺由来の細胞等の種々の組織に由来する細胞で発現さ
れることが知られている。ヒトＩＧＦＢＰは、各々のＮ
末端側及びＣ末端側にかなり高いアミノ酸配列相同性を
有し、１６個のシステイン（Ｃｙｓ）が同一位置に保存
されている。これらのＮ末端側及びＣ末端側のシステイ
ン残基に富む領域は、ＩＧＦの結合領域における重要な
領域と考えられており、特にＣ末端側の領域がＩＧＦの
結合に深く関与していると考えられている（モレキュラ
ーエンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）、第５巻、
第７号、第９８７〜第９９４頁、１９９１年；ア・ワー
クショップ・オン・インシュリンライク・グロースファ
クター・バインディングプロテインズ（A Workshop on
Insulin-like Growth Factor Binding Proteins）、カ
ナダ、１９８９年、７月、ブリンクマン（Brinkman）
ら）；ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．、第２９１巻、第２号、第
２６４〜第２６８頁、１９９１年；グロースレギュレー
ション（Growth Regulation）、第２巻、第２号、第６
９〜第７９頁、１９９２年；ジャーナルオブバイオロジ
カルケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２６９巻、第
３２号、第２０３８８〜第２０３９３頁、１９９４
年）。一方、Ｎ末端側のシステイン残基に富む領域は、
ＩＧＦの結合に関与する一方で、ＩＧＦの遊離を制御す
ることによりＩＧＦのホルモン活性の発現のモジュレー
ションに関与していると考えられる（Fertil. Steri
l.、第６３巻、第２号、第３１４〜第３２１頁、１９９
５年等）。

【０００７】このような構造的共通性を有するＩＧＦＢ
Ｐの機能については、特にＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ
−２、ＩＧＦＢＰ−３及びＩＧＦＢＰ−４について比較
的よく研究されており、各々のＩＧＦＢＰのＩＧＦ活性
モジュレート作用が解明されつつある。ＩＧＦＢＰ−１
（ＢＰ２５、ＢＰ２８、LowMW-BP、Placental Protein-
12、Pregnancy-associated endotherial alpha-1-globu
lin）は、例えば、ヒト羊水、HEPG2細胞、Placental Pr
otein-12及び胎児血漿等から単離される成長ホルモン非
依存性のタンパクでる。ヒトＩＧＦＢＰ−１は、特にＩ
ＧＦ−Iに対して高い親和性を示すこと、並びにその血
中濃度が夜間、低血糖状態及びインスリン依存性糖尿病
で増加し、食事摂取、糖負荷及びインスリン持続投与で
減少する。これらの事実からＩＧＦＢＰ−１は、ＩＧＦ
−Ｉ特異的なＩＧＦ作用抑制性のモジュレータータンパ
クであると考えられている（ホルモンと臨床、第３９
巻、第１２６１〜第１２６９頁、１９９１年；ボーン
（The Bone）、第５巻、第１号、第４５〜第５４頁、１
９９１年；ディアベテスジャーナル（Diabetes Journa
l）、第２０巻、第２２頁、１９９２年等）。

【０００８】ＩＧＦＢＰ−２（ＢＰ３Ａ（ラット）、Ｂ
Ｐ−ＭＤＢＫ）は、例えば、ヒト脳脊髄液、ヒト胎児肝
臓、ヒトRhabdomyosarcoma細胞、ラットBRL3A細胞、ヒ
ト胎児血清及びMDBK細胞等から単離される年齢依存性の
タンパクである。ヒトＩＧＦＢＰ−２は、特にＩＧＦ−
IIに対して高い親和性を示すこと、並びにその血中濃度
が胎児期、低血糖を呈する膵外腫瘍、小人症患者、糖尿
病患者、絶食時及び成長ホルモン（ＧＨ）欠乏症に増加
する。これらの事実からＩＧＦＢＰ−２は、ＩＧＦ−II
特異的なＩＧＦ作用抑制性のモジュレータータンパクで
あると考えられている（ホルモンと臨床（前記に同
じ）；ボーン（前記に同じ）；ディアベテスジャーナル
（前記に同じ）等）。

【０００９】ＩＧＦＢＰ−３（ＢＰ５３、HighMW-BP）
は、例えば、ヒト血漿中及びヒト乳中から単離され、血
中では最も多く存在するタンパクである。ヒトＩＧＦＢ
Ｐ−３は、ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−II 双方に同等に特異
的であり、またその血中濃度は、ＧＨ依存的であって末
端肥大症では増加し小人症、ＧＨ分泌不全症では低値で
あること、並びに思春期にかけて増加する。これらの事
実からＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ特異的なＩＧＦ作用増
強性のモジュレータータンパクであると考えられている
（ホルモンと臨床（前記に同じ）；ボーン（前記に同
じ）；ディアベテスジャーナル（前記に同じ）等）。

【００１０】ＩＧＦＢＰ−４は、例えば、ヒト骨芽細胞
の培養液から単離されるタンパクである。ヒトＩＧＦＢ
Ｐ−４は、特にＩＧＦ−Iに特異的であり、またその産
生は骨吸収抑制タンパクである副甲状腺ホルモン（ＰＴ
Ｈ）及びＰＴＨ関連タンパク（ＰＴＨｒＰ）により促進
され、その血中濃度は骨粗鬆症患者で増加する。これら
の事実からＩＧＦＢＰ−４は、ＩＧＦ−I特異的なＩＧ
Ｆ作用抑制性のモジュレータータンパクであると考えら
れている（ホルモンと臨床（前記に同じ）；ボーン（前
記に同じ）；ディアベテスジャーナル（前記に同じ）
等）。これまで述べたように、ＩＧＦＢＰは、単にＩＧ
Ｆのキャリアータンパクとしてだけでなく、ＩＧＦのホ
ルモン活性（例えば、インスリン作用、細胞増殖促進作
用等）を、各々抑制的あるいは増強的にモジュレートす
るＩＧＦ作用モジュレータータンパクとして重要な役割
を担っている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】これまで知られていな
い新規な生理活性タンパク及び該タンパクをコードする
ＤＮＡを見出し、該新規なタンパクの物理化学的性状を
明らかにすることは、該タンパクの生物学的性状を明ら
かにすることにより生体機能の制御並びに種々の疾患の
原因を解明し、該種々の疾患の全く新しい治療薬を開発
するための有効な手がかりとなる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト卵
巣、胸腺及び白血球、特に卵巣で特異的に高発現が見ら
れる生理活性タンパクに関して鋭意研究した結果、
（１）大腸菌由来セリンプロテアーゼであり細胞内での
酸化変性蛋白及び熱変性蛋白の分解除去並びに蛋白新生
促進に深く関与するｈｔｒＡ、（２）同じく大腸菌由来
セリンプロテアーゼであるＤｏ、及び（３）ヒトＩＧＦ
ＢＰのＮ末端側であってＩＧＦのホルモン作用のモジュ
レーションに深く関与するＮ末端側のシステイン残基に
富む領域の各々と高いアミノ酸配列相同性を有し、高い
基質特異性を有するセリンプロテアーゼ活性を有する全
く新しい生理活性タンパク並びに該タンパクをコードす
るＤＮＡを見出し本発明を完成するに到った。

【００１３】本発明の新規タンパクは、（１）細胞内で
の酸化変性蛋白及び熱変性蛋白の分解除去並びに細胞内
での蛋白新生促進に関与する既知セリンプロテアーゼに
高いアミノ酸配列相同性を有するだけでなく、実際に高
い基質特異性を有するセリンプロテアーゼ活性を有する
こと、（２）細胞の分化、成熟及び／または増殖の制御
に関与するＩＧＦの作用発現のモジュレーションに深く
係わるＩＧＦＢＰのＮ末端領域との高いアミノ酸配列相
同性を有することに加え、（３）細胞の新生、分化及び
／または増殖並びに細胞内での蛋白の新陳代謝が活発な
卵巣、胸腺及び白血球において特異的に高発現が見られ
るという特徴を有する。これらのことから、本発明のタ
ンパクは、細胞の分化、成熟及び／または増殖の制御だ
けでなく、当該細胞の分化、成熟及び／または増殖に関
与する他のタンパクのホルモン作用のモジュレーション
を担うタンパク分解活性（酵素活性）を有した生理活性
タンパクであると考えられる。従って、本発明のタンパ
クまたはそのフラグメント及び本発明のタンパクに反応
性を有する抗体またはその一部は、本タンパクの上述の
ような機能及び／または本タンパクと相互作用するタン
パクのホルモン作用の破錠による細胞の分化、成熟及び
／または増殖の異常並びに細胞内タンパクの新陳代謝の
異常に起因する生理状態及び疾患の予防薬及び治療薬と
して有用である。予防・治療学的側面を挙げるならば、
本発明のタンパクは細胞内の酸化変性蛋白及び熱変性蛋
白の分解除去並びに細胞内での蛋白新生促進に関与する
可能性を有していることから、例えば、血管内での酸化
変性蛋白及び熱変性蛋白の分解除去の機能異常に起因す
る血管の肥厚及びマクロファージの泡沫化に伴う動脈硬
化症の予防薬・治療薬としての開発が期待できる。ま
た、本発明のタンパクは、卵巣に非常に高い発現が見ら
れることから、卵細胞の分化、成熟及び／または増殖の
制御に関与すると考えられ、例えば避妊薬等としての開
発が期待できる。

【００１４】さらに、本発明のタンパク、ＤＮＡ及び抗
体は、本発明のタンパクと相互作用を有するタンパクの
解明、本発明のタンパク並びに本発明のタンパクと相互
作用を有する該タンパクが関連する疾患の解明、並びに
該疾患の治療薬を開発するための試薬として有用であ
る。また、本発明のＤＮＡ及び抗体は、本発明のタンパ
クの生物学的性状及び機能を明らかにするために用いら
れる試薬としても有用であることは言うまでもない。

【００１５】本発明は、即ち、下記のＤＮＡ、タンパ
ク、抗体並びに製造方法を初めて提供するものである。 （１）配列表配列番号２に記載される塩基配列を有する
ＤＮＡ。 （２）配列表配列番号４に記載されるアミノ酸配列を実
質的にコードするＤＮＡ。 （３）配列表配列番号３に記載される塩基配列を有する
ＤＮＡ。 （４）配列表配列番号６に記載されるアミノ酸配列を実
質的にコードするＤＮＡ。 （５）配列表配列番号５に記載される塩基配列を有する
ＤＮＡ。 （６）実質的に配列表配列番号４に記載されるアミノ酸
配列を有するタンパク。 （７）実質的に配列表配列番号６に記載されるアミノ酸
配列を有するタンパク。 （８）前記（１）乃至（５）記載のＤＮＡを含む発現ベ
クター。 （９）前記（３）または（５）記載のＤＮＡを含む前記
（８）記載の発現ベクター。 （１０）前記（８）または（９）記載の発現ベクターで
形質転換された形質転換細胞。 （１１）国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１９６で識別
される細胞株であることを特徴とする前記（１０）記載
の形質転換細胞。 （１２）前記（６）または（７）記載のタンパクまたは
そのフラグメントに反応性を有する抗体または抗体の一
部。 （１３）抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴
とする前記（１２）記載の抗体または抗体の一部。 （１４）前記（１０）または（１１）記載の形質転換細
胞を培地中で培養し、培養上清中に生成されたタンパク
を取得することを特徴とする前記（６）または（７）記
載のタンパクの製造方法。 （１５）前記（６）または（７）記載のタンパクまたは
そのフラグメント及び薬学的に許容され得る担体を含ん
でなる医薬組成物。 （１６）前記（１２）または（１３）記載の抗体または
抗体の一部及び薬学的に許容され得る担体を含んでなる
医薬組成物。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明のタンパク、ＤＮＡ
及び抗体の一般的製造方法並びに本発明で用いる語句の
意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明す
る。本発明のタンパクは、ヒト由来のタンパクであり、
種々の組織由来の細胞、具体的には、卵巣、胸腺、肝
臓、結合組織及び骨等の組織あるいは白血球に由来する
タンパクである。本発明のタンパクの好ましい態様とし
ては、実質的に配列表配列番号４または６に示されるア
ミノ酸配列を有するタンパクが挙げられる。

【００１７】ここで「実質的に」とは、配列表配列番号
４または６に示されるアミノ酸配列を有するタンパクと
実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸
配列中の１以上、好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置
換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有
するタンパク、並びに該アミノ酸配列に１以上、好まし
くは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を
有するタンパクをも包含することを意味する。本発明の
タンパクは、後述するような遺伝子組換え技術のほか、
化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野
において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適
宜用いることにより製造することができる。

【００１８】本発明のＤＮＡは、配列表配列番号１に記
載される塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡであり、
さらには前述の本発明のタンパクを実質的にコードする
ＤＮＡであって、本発明のタンパクをコードし得るいか
なる塩基配列をも包含する。具体的な態様としては、配
列表配列番号４または６で示されるアミノ酸配列を有す
るタンパク、あるいは該アミノ酸配列中に１以上、好ま
しくは１乃至５個のアミノ酸を置換、欠失及び／または
修飾するか、若しくは該アミノ酸配列に１以上、好まし
くは１乃至５個のアミノ酸を挿入することによって得ら
れる生物学的同等物を実質的にコードするＤＮＡであ
り、より具体的には、配列表配列番号３または５で示さ
れる塩基配列を有するＤＮＡである。

【００１９】ここで、「実質的」とは、アミノ酸配列中
の各々のアミノ酸をコードする各々のコドンは、同一の
アミノ酸をコードするコドンであればどのようなコドン
であってもよいことを意味する。また、本発明のＤＮＡ
は、いかなる方法で得られるものであってもよい。例え
ばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲ
ノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得
られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ
法で増幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適
当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するも
のである。

【００２０】本発明のタンパクをコードするＤＮＡは、
常法に従って本発明のタンパクのｍＲＮＡからｃＤＮＡ
をクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプラ
イシング処理する方法、化学合成する方法等により取得
することができる。 （１）例えば、本発明のタンパクのｍＲＮＡからｃＤＮ
Ａをクローン化する方法としては、以下の方法が例示さ
れる。まず、本発明のタンパクを発現・産生する前述の
ような組織あるいは細胞から該本発明のタンパクをコー
ドするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えば
グアニジンチオシアネート法（チャーグウィン（Chirgw
in）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、第１８
巻、第５２９４頁、１９７９年）、熱フェノール法もし
くはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮ
Ａをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース
等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけること
によって行うことができる。

【００２１】次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例
えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤ
マらの方法（モレキュラーセルバイオロジー（Mol.Cel
l.Biol.）、第２巻、第１６１頁、１９８２年及び同誌
第３巻、第２８０頁、１９８３年）やホフマン（Hoffma
n）らの方法（ジーン（Gene）、第２５巻、第２６３
頁、１９８３年）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮ
Ａの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプ
ラスミドベクターもしくはファージベクターに組み込
み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケ
ージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）す
ることによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。

【００２２】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるク
ローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、
λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的ス
クリーニングに供する場合は、宿主内で本発明のタンパ
クをコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有
したベクターであることが好ましい。プラスミドにｃＤ
ＮＡを組み込む方法としては、例えばマニアティス（Ma
niatis）らの方法（モレキュラークローニング、ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, second edition）、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）、第1.53頁、１９８９年）に記載の方法などが挙げ
られる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む
方法としては、ヒュン（Hyunh）らの方法（ＤＮＡクロ
ーニング、プラクティカルアプローチ（DNA Cloning, a
practical approach）、第1巻、第49頁、１９８５年）
などが挙げられる。簡便には、市販のクローニングキッ
ト（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。この
ようにして得られる組換えプラスミドやファージベクタ
ーは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＨＢ１０１、
ＤＨ５αまたはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主
に導入する。

【００２３】プラスミドを宿主に導入する方法として
は、（モレキュラークローニング、ア・ラボラトリー・
マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, second edition）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー（Cold Spring HarborLaboratory）、第1.74
頁、１９８９年）に記載の塩化カルシウム法または塩化
カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーショ
ン法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に
導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッ
ケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が
例示される。インビトロパッケージングは、市販のイン
ビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン
製、アマシャム製等）を用いることによって簡便に行う
ことができる。

【００２４】上記の方法によって作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーから、本発明のタンパクをコードするｃＤＮ
Ａを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング
法を組み合わせることによって行うことができる。例え
ば、別個に本発明のタンパクのアミノ酸配列に対応する
と考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、
これを³²Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニ
ーハイブリダイゼーション法（クランシュタイン（Crun
stein）ら、プロシーディングスオブナショナルアカデ
ミーオブサイエンス（Proc. Natl.Acid. Sci. USA）、
第７２巻、第３９６１頁、１９７５年）またはプラーク
ハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, second edition , Cold Spring Harbo
r Laboratory、第2.108 頁、１９８９年）により、目的
のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方
法、ＰＣＲプライマーを作製し本発明のタンパクの特定
領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮ
Ａ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられ
る。また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λ
ｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡ
ライブラリーを用いる場合には、本発明のタンパクに反
応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目
的のクローンを選択することができる。大量にクローン
を処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニン
グ法を用いることが好ましい。

【００２５】この様にして得られたＤＮＡの塩基配列は
マキサム・ギルバート法（マキサム（Maxam）ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA.、第７４巻、第５６０頁、１９
７７年）あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌ
クレオチド合成鎖停止の方法（サンガー（Sanger）ら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第７４巻、第５４６３
〜５４６７頁、１９７７年）によって決定することがで
きる。本発明のタンパクをコードする遺伝子は、その全
部または一部を上記のようにして得られるクローンから
制限酵素等により切り出すことにより取得できる。

【００２６】（２）また、前述のような本発明のタンパ
クを発現する細胞に由来するゲノムＤＮＡから本発明の
タンパクをコードするＤＮＡを単離することによる調製
方法としては、例えば以下の方法が例示される。該細胞
を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶
解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白
質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより
消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分
消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコ
スミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の
配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮ
Ａプローブを用いる方法等により検出し、該クローンか
ら本発明のタンパクをコードする遺伝子の全部または一
部を制限酵素等により切り出し取得する。

【００２７】（３）また、化学的合成による本発明のＤ
ＮＡの製造は、配列表配列番号３または５に記載される
塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができ
る。さらに本発明は、上述の本発明のタンパクをコード
するＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。本発明
の組換えベクターとしては、原核細胞及び／または真核
細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるも
のであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよび
ファージベクターが包含される。当該組換えベクター
は、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクタ
ー（プラスミドＤＮＡおよびバクテリアファージＤＮ
Ａ）に本発明のタンパクをコードするＤＮＡを常法によ
り連結することによって調製することができる。用いら
れる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来の
プラスミドとして例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC1
3、pUC19など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH1
9、pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB1
10、pTP5、pC194などが例示される。また、ファージと
しては、λファージなどのバクテリオファージが、さら
にレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイ
ルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビト
ロゲン製）が例示される。

【００２８】本発明のタンパクをコードするＤＮＡを発
現させ本発明のタンパクを生産させる目的においては、
発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原
核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本
発明のタンパクをコードする遺伝子を発現し、これら蛋
白質を生産する機能を有するものであれば特に制限され
ない。例えば、pMAL C2 、pEF-BOS（ヌクレイックアシ
ッドリサーチ（NucleicAcid Research）、第１８巻、第
５３２２頁、１９９０年等）あるいはpME18S（実験医学
別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を
挙げることができる。

【００２９】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる
場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−
オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコ
ードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域およ
び複製可能単位から構成される。宿主として酵母、動物
細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少な
くともプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクを
コードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ま
しい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エン
ハンサー配列、本発明のタンパクをコードする遺伝子の
５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合
部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域また
は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に
応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を
含んでいてもよい。

【００３０】細菌中で本発明のタンパクを発現させるた
めのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモータ
ー、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列（例
えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主が
エシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモー
ターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明のタ
ンパクを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ
０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモ
ーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチル
ス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロ
モーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。ま
た、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ
４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好
ましくは、ＳＶ−４０、レトロウイルスである。しか
し、特にこれらに限定されるものではない。また、発現
にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。

【００３１】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。終止コドンとしては、常
用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が例示
される。ターミネーター領域としては、通常用いられる
天然または合成のターミネーターを用いることができ
る。複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列
を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然
のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然の
プラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および
合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとして
は、E. coliではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはそ
の人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理
して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２
μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳
動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミ
ドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC
37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149等があげられ
る。

【００３２】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例えば
それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。選択マーカー
としては、通常使用されるものを常法により用いること
ができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、ま
たはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示され
る。

【００３３】遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺
伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素
遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデ
カルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカ
ルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。本発明
の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、
開始コドン、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ、終
止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に
適当な複製可能単位に連結することによって調製するこ
とができる。またこの際、所望により制限酵素での消化
やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法
により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、
他のレストリクションサイトなど）を用いることができ
る。

【００３４】本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベク
ターを宿主細胞に導入することにより調製することがで
きる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発
現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特
に限定されず、本発明の技術分野において通常使用され
る天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種
々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス
属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、
動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。

【００３５】好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であ
り、具体的には大腸菌（ＤＨ５α、ＴＢ１、ＨＢ１０１
等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２
／０、ＮＳ−１またはＮＩＨ3 Ｔ3等）、ラット由来細
胞、ハムスター由来細胞（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サ
ル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１お
よびＶｅｌｏ等）およびヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍
体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびＮ
ａｍａｌｗａ等）などが例示される。

【００３６】発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転
換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことが
できる。例えば、細菌（E.coli、Bacillus subtilis
等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２年
）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet.、第１６８
巻、第１１１頁、１９７９年）やコンピテント法（ジャ
ーナルオブモレキュラーバイオロジー（J. Mol. Bio
l.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、
Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばハイネン
（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、
第７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法
（J. Bacteriol. 、第１５３巻、第１６３頁、１９８３
年）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Gr
aham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、
第４５６頁、１９７３年）、昆虫細胞の場合は、例えば
サマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell. Biol.、第
３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によっ
てそれぞれ形質転換することができる。

【００３７】本発明のタンパクは、上記の如く調製され
る発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体
を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養するこ
とによって製造することができる。栄養培地は、宿主細
胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源も
しくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源と
しては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デン
プン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源と
しては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ
酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉
エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。
また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩
化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシ
ウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリ
ン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）な
ど）を含んでいてもよい。培養は当業界において知られ
ている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培
地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパクが大量に
生産されるように適宜選択される。

【００３８】なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる
具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれら
に限定されるものではない。宿主が細菌、放線菌、酵
母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液
体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である
培地である。宿主がE. coliの場合、好ましい培地とし
てＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mo
l. Genet、Cold Spring Harbor Laboratory、第４３１
頁、１９７２年）等が例示される。かかる場合、培養
は、必要により通気、攪拌しながら、通常１４〜４３
℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がBacillus
属菌の場合、必要により通気、攪拌をしながら、通常３
０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。

【００３９】宿主が酵母である場合、培地として、例え
ばBurkholder最小培（ボスチアン（Bostian）、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA、第７７巻、第４５０５頁、１９
８０年）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望まし
い。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行
なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。宿
主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の
胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（サイエンス（Scienc
e）、第１２２巻、第５０１頁、１９５２年）、ＤＭＥ
Ｍ培地（バイロロジー（Virology）、第８巻、 第３９
６頁、１９５９ 年）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am.
Med. Assoc.、第１９９巻、第５１９頁、１９６７
年）、１９９培地（proc. Soc. Exp. Biol. Med.、第７
３巻、第１頁、１９５０年）等を用いることができる。
培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常
約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要によ
り通気や攪拌を行うこともできる。

【００４０】宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清
を含むGrace's培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第
８２巻、第８４０４頁、１９８５年）等が挙げられ、そ
のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２
０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通
気や攪拌を行うこともできる。

【００４１】本発明のタンパクは、上記培養により得ら
れる培養物より以下のようにして取得できる。すなわ
ち、本発明のタンパクが、培養物のうち培養液中に存在
する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の
方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然また
は合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いら
れる常法に従って該本発明のタンパクを精製、単離す
る。単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法
等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾
過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換ク
ロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。

【００４２】一方、本発明のタンパクが培養された形質
転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合
は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌
体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば
超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の
細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や
ろ過などの方法で本発明のタンパクを含有する膜画分を
得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤
を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液
を先に例示したような常法を用いることにより、単離、
精製することができる。

【００４３】本発明における「抗体」とは、ポリクロー
ナル抗体（抗血清）あるいはモノクローナル抗体を意味
し、好ましくはモノクローナル抗体である。具体的に
は、前述の本発明のタンパクまたはそのフラグメントに
反応性を有する抗体である。本発明の「抗体」は、本発
明のタンパク（天然体、組換体、合成物、細胞等）を、
マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサ
ギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子
組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体及びヒト型抗
体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランス
ジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体も包含
する。またモノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイ
ソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好
ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。

【００４４】本発明で言うポリクローナル抗体（抗血
清）あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製
造方法によって製造することができる。即ち、例えば、
抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freun
d's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウ
ス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、
イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくは
マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギ
に免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物か
ら得た血清から取得することができる。またモノクロー
ナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と
自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）
からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクロ
ーン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的
親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを
選択することによって製造される。

【００４５】モノクローナル抗体は、具体的には下記の
ようにして製造することができる。即ち、前述のような
本発明のタンパクあるいは該タンパクを発現している細
胞等を発現している等を免疫原として、該免疫原を、必
要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvan
t）とともに、マウス、ラット、ハムスター、モルモッ
トあるいはウサギ、好ましくはマウス、ラットあるいは
ハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの
ような他の動物由来の抗体を産生するように作出された
トランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静
脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射
するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通
常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を
行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された
該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。

【００４６】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法
（ネイチャー(Nature)、第２５６巻、第４９５〜第４９
７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って
行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺
乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁
桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ま
しくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサ
ギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラ
ットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ
細胞との細胞融合させることにより調製される。

【００４７】細胞融合に用いられるミエローマ細胞とし
ては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（６
５３）、P3/NSI/1-Ag4-1（ＮＳ−１）、P3/X63-Ag8.U1
（Ｐ３Ｕ１）、SP2/0-Ag14（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、PA
I、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-A
g.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-
2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用す
ることができる。モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマ
を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖
の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作で
用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬ
ＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより
行なうことができる。

【００４８】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウ
ス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、
好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウス
の腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、ま
たは哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが
できる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞
種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に
合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、
培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用
いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地か
ら誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施するこ
とが可能である。

【００４９】基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１
２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥ
Ｍ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、
ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、
ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培
地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば
血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あ
るいは有機物質等を含有することができる。モノクロー
ナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水
を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カ
プロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラ
フィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブ
リンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィーに供すること等により行う
ことができる。

【００５０】本発明における「キメラ抗体」は、遺伝子
工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体
的には、例えば、その可変領域がマウスイムノグロブリ
ン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイム
ノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマ
ウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のキメラモノク
ローナル抗体を意味する。ヒトイムノグロブリン由来の
定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇ
Ｅ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有
するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体
の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノ
グログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒ
トＩｇＧの定常領域である。本発明におけるキメラモノ
クローナル抗体は、例えば以下のようにして製造するこ
とができる。しかしながら、そのような製造方法に限定
されるものでないことは言うまでもない。

【００５１】例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナ
ル抗体は、実験医学（臨時増刊号）、第１．６巻、第１
０号、１９８８年及び特公平３−７３２８０号公報等を
参照しながら作製することができる。即ち、マウスモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した
該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取
得した活性なＶH遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再
配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロム
リンをコードするＤＮＡから取得したＣH遺伝子（Ｈ鎖
定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリド
ーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードす
るＤＮＡから取得した活性なＶL遺伝子（Ｌ鎖可変領域
をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイ
ムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣL遺
伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発
現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに
挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形
質転換細胞を培養することにより作製することができ
る。

【００５２】具体的には、まず、マウスモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマから常法によりＤＮＡを抽出
後、該ＤＮＡを適切な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄIII等）を用いて消化し、電気泳動に付して（例
えば０．７％アガロースゲル使用）サザンブロット法を
行う。泳動したゲルを例えばエチジウムブロマイド等で
染色し、写真撮影後、マーカーの位置を付し、ゲルを２
回水洗し、０．２５ＭのＨＣｌ溶液に１５分間浸す。次
いで、０．４ＮのＮａＯＨ溶液に１０分間浸し、その間
緩やかに振盪する。常法により、フィルターに移し、４
時間後フィルターを回収して２×ＳＳＣで２回洗浄す
る。フィルターを十分乾燥した後、ベイキング（７５
℃、３時間）を行う。ベイキング終了後に、該フィルタ
ーを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液に入れ、６５
℃で３０分間処理する。次いで、３×ＳＳＣ／０．１％
ＳＤＳ溶液に浸す。得られたフィルターをプレハイブリ
ダイゼーション液と共にビニール袋に入れ、６５℃で３
〜４時間処理する。

【００５３】次に、この中に³²Ｐ標識したプローブＤＮ
Ａ及びハイブリダイゼーション液を入れ、６５℃で１２
時間程度反応させる。ハイブリダイゼーション終了後、
適切な塩濃度、反応温度および時間（例えば、２×ＳＳ
Ｃ−０．１％ＳＤＳ溶液、室温、１０分間）のもとで、
フィルターを洗う。該フィルターをビニール袋に入れ、
２×ＳＳＣを少量加え、密封し、オートラジオグラフィ
ーを行う。上記サザンブロット法により、マウスモノク
ローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖を各々コードする再配列さ
れたＶＤＪ遺伝子及びＶＪ遺伝子を同定する。同定した
ＤＮＡ断片を含む領域をショ糖密度勾配遠心にて分画
し、ファージベクター（例えば、Charon 4A、Charon 2
8、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４等）に組み込み、該フ
ァージベクターで大腸菌（例えば、LE392、NM539等）を
形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。そのゲノ
ムライブラリーを適当なプローブ（Ｈ鎖Ｊ遺伝子、Ｌ鎖
（κ）Ｊ遺伝子等）を用いて、例えばベントンデイビス
法（サイエンス(Science)、第１９６巻、第１８０〜第
１８２頁、１９７７年）に従って、プラークハイブリダ
イゼーションを行い、再配列されたＶＤＪ遺伝子あるい
はＶＪ遺伝子を各々含むポジティブクローンを得る。得
られたクローンの制限酵素地図を作製し、塩基配列を決
定し、目的とする再配列されたＶH(VDJ)遺伝子あるいは
ＶL(VJ)遺伝子を含む遺伝子が得られていることを確認
する。

【００５４】一方、キメラ化に用いるヒトＣH遺伝子及
びヒトＣL遺伝子を別に単離する。例えば、ヒトＩｇＧ1
とのキメラ抗体を作製する場合には、ＣH遺伝子である
Ｃγ1遺伝子とＣL遺伝子であるＣκ遺伝子を単離する。
これらの遺伝子はマウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免
疫グロブリン遺伝子の塩基配列の高い相同性を利用して
ヒトＣγ1遺伝子及びヒトＣκ遺伝子に相当するマウス
Ｃγ1遺伝子及びマウスＣκ遺伝子をプローブとして用
い、ヒトゲノムライブラリーから単離することによって
得ることができる。

【００５５】具体的には、例えば、クローンＩｇ１４６
（プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエ
ンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７５巻、第４７
０９〜第４７１３頁、１９７８年）からの３ｋｂのＨｉ
ｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片とクローンＭＥＰ１０（プロ
シーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA)、第７８巻、第４７４〜第
４７８頁、１９８１年）からの６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片をプローブとして用い、ヒトのラムダCharon 4Aの
ＨａｅIII−ＡｌｕＩゲノムライブラリー（セル(Cel
l)、第１５巻、第１１５７〜第１１７４頁、１９７８
年）中から、ヒトＣκ遺伝子を含み、エンハンサー領域
を保持しているＤＮＡ断片を単離する。また、ヒトＣγ
1遺伝子は、例えばヒト胎児肝細胞ＤＮＡをＨｉｎｄIII
で切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、５．
９ｋｂのバンドをλ７８８に挿入し、前記のプローブを
用いて単離する。

【００５６】このようにして単離されたマウスＶH遺伝
子とマウスＶL遺伝子、及びヒトＣH遺伝子とヒトＣL遺
伝子を用いて、プロモーター領域及びエンハンサー領域
などを考慮しながらマウスＶH遺伝子の下流にヒトＣH遺
伝子を、またマウスＶL遺伝子の下流にヒトＣL遺伝子
を、適切な制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、例え
ばｐＳＶ２ｇｐｔあるいはｐＳＶ２ｎｅｏ等の発現ベク
ターに常法に従って組み込む。この際、マウスＶH遺伝
子／ヒトＣH遺伝子とマウスＶL遺伝子／ヒトＣL遺伝子
のキメラ遺伝子は、一つの発現ベクターに同時に配置さ
れてもよいし、各々別個の発現ベクターに配置すること
もできる。

【００５７】このようにして作製したキメラ遺伝子挿入
発現ベクターを、例えばP3X63・Ag8・653細胞あるいは SP
210細胞といった、自らは抗体を産生していない骨髄腫
細胞にプロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン
法、リン酸カルシウム法あるいは電気穿孔法等により導
入する。形質転換細胞は、発現ベクターに導入された薬
物耐性遺伝子に対応する薬物含有培地中での培養により
選別し、目的とするキメラモノクローナル抗体産生細胞
を取得する。このようにして選別された抗体産生細胞の
培養上清中から目的のキメラモノクローナル抗体を取得
する。

【００５８】本発明における「ヒト型抗体（CDR-grafte
d抗体）」は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナ
ル抗体であって、具体的には、例えば、その超可変領域
の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクロー
ナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であ
り、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由
来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒ
トイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴と
するヒト型モノクローナル抗体を意味する。

【００５９】ここで、超可変領域の相補性決定領域と
は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相
補的に直接結合する部位である３つの領域（Complement
arity-determining residue；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、Ｃ
ＤＲ３）を指し、また可変領域の枠組領域とは、該３つ
相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つ
の領域（Framework；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ
４）を指す。換言すれば、例えばマウスモノクローナル
抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以
外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と
置き代わったモノクローナル抗体を意味する。ヒトイム
ノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有
のアミノ酸配列を有するが、本発明におけるヒト型モノ
クローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属
するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。
好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。また、ヒト
イムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域についても
限定されるものではない。

【００６０】本発明におけるヒト型モノクローナル抗体
は、例えば以下のようにして製造することができる。し
かしながら、そのような製造方法に限定されるものでな
いことは言うまでもない。例えば、マウスモノクローナ
ル抗体に由来する組換ヒト型モノクローナル抗体は、特
表平４−５０６４５８号公報及び特開昭６２−２９６８
９０号公報等を参照して、遺伝子工学的に作製すること
ができる。即ち、マウスモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤ
Ｒ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なく
とも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒト
イムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対
応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ
鎖遺伝子と、前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖Ｃ
ＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離す
る。

【００６１】単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒ
トＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに
導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖
遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクタ
ーに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒ
トＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝
子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入するこ
ともできる。このようにして作製された発現ベクターで
宿主細胞を形質転換することによりヒト型モノクローナ
ル抗体産生形質転換細胞を得、該形質転換細胞を培養す
ることにより培養上清中から目的のヒト型モノクローナ
ル抗体を得る。

【００６２】本発明における「ヒト抗体」とは、イムノ
グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領
域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全て
の領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由
来するイムノグロブリンである。ヒト抗体は、常法に従
って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子
をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込む
ことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原
で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗
体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製
造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトラ
ンスジェニックマウスは、ネイチャージェネティックス
(Nature Genetics)、第７巻、第１３〜第２１頁、１９
９４年；特表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開
ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月
号、第４０〜第５０頁、１９９５年；ネイチャー(Natur
e)、第３６８巻、第８５６〜第８５９頁、１９９４年；
及び特表平６−５００２３３号公報に記載の方法に従っ
て作製することができる。

【００６３】本発明における「抗体の一部」とは、前述
の本発明における抗体、好ましくはモノクローナル抗体
の一部分の領域を意味し、具体的にはＦｖ、Ｆ（ａ
ｂ’）₂、Ｆａｂ’あるいはＦａｂである。ここで、
「Ｆ（ａｂ’）₂」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロ
ブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素である
ペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造
され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフ
ィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメン
トを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理する
と、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィ
ド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL
（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領
域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなる
Ｈ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合によ
り結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造するこ
とができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各
々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理する
と、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィ
ド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ
領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメント
を製造することができる。この抗体フラグメントをＦ
（ａｂ’）₂という。

【００６４】本発明のタンパク、該タンパクのフラグメ
ント、該タンパクに反応性を有する抗体あるいは抗体の
一部は、医薬組成物として提供することができ、具体的
には、該タンパク、抗体あるいは抗体フラグメントを有
効成分として、薬学的に許容され得る担体、即ち、賦形
剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝
剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味
剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等の一つ以上と
ともに、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カ
プセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤ある
いはシロップ剤等の形態の医薬組成物にすることができ
る。

【００６５】

【実施例】以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限
定されるものではないことは言うまでもない。

【００６６】実施例１ 骨芽細胞様細胞の取得 変形性関節患者（６３歳の女性）の人工関節置換手術に
おける臼蓋海綿骨リ−ミング時に切除された骨（１０
ｇ）を採取した。当該骨を、１〜２mmになるように粉砕
した後、ＤＭＥＭ培養液（DMEM high glucose、ギブコ
（Gibco）製、３０ｍｌ）で１０回洗浄した。次いで、
コラ−ゲナ−ゼ、シグマ（Sigma）製、２ｍｇ／ｍｌ）
ＤＮａｓｅＩ（シグマ製、0.1ｍｇ／ｍｌ）からなるＰ
ＢＳ溶液（３０ｍｌ）で２時間振騰した。上清を除き、
残渣を１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清、Fetal Calf Seru
m、イルビン（Irvine）製）を含むＤＭＥＭ培養液（８
０ｍｌ）で洗浄し粉砕骨片を得た。粉砕骨片は、１０％
ＦＣＳ（同前）を含むＤＭＥＭ培養液（１５ｍｌ）を含
むＦ７５培養シャ−レ（１５枚）に入れて炭酸ガスイン
キュベ−タ−中（３７℃）で５週間培養した。これから
アウトグロースした細胞を骨芽細胞様細胞の初代培養と
した。この細胞は図１の写真に示した形態を有してい
た。

【００６７】１回継代後の細胞を５×１０^-9Ｍの1,25-
(OH)2D3及び２％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で７２
時間培養した後、アルカリフォスファターゼ及びオステ
オカルシンに対するモノクローナル抗体を用いた免疫染
色試験及びアルカリフォスファタ−ゼの酵素活性の染色
試験（ＡＢＣキット、フナコシ製）により、これらの細
胞が、オステオカルシン（ＢＧＰ）およびアルカリフォ
スファタ−ゼ（ＡＬＰ）を分泌することが確認された。
各々の染色試験の結果を、図２乃至図４に示す（図２：
抗ＢＧＰ抗体（ＩｇＧ１）及びコントロールＩｇＧ１に
よる染色；図３：抗ＡＬＰ抗体（ＩｇＧ２ａ）及びコン
トロールＩｇＧ２ａによる染色；図４：ＡＬＰ活性染
色）。

【００６８】実施例２ 骨芽細胞様細胞からのｍＲＮＡ
の取得 グアニジンイソシアネート法（Guanidine thiocyanate
method）により常法に従って、実施例１で取得した骨芽
細胞様細胞（１０⁸個）からＲＮＡを抽出し、１０ｍｇ
のＲＮＡを得た。次いで、ｍＲＮＡ抽出キット（Quick
Prep.Micro mRNA purification、ファルマシア（Pharma
cia）製）を用いて、常法により該ＲＮＡ（１００μ
ｇ）から、５μｇのｍＲＮＡを得た。

【００６９】実施例３ ２本鎖ＤＮＡの合成 実施例２で得たｍＲＮＡ（１μｇ）を、ＤＥＰＣ（diet
hyl pirocarbonate）処理した蒸留水（１２μｌ）に溶
解した。次いで、１ｍｇ／ｍｌのｐＵＣ１９Ｐｓｔ３５
Ｔ１ベクタ−プライマ−（１μｌ）を加え、７０℃で３
分間処理した。ｐＵＣ１９Ｐｓｔ３５Ｔ１ベクタ−プラ
イマ−は、以下のようにして調製した。ｐＵＣ１９をＰ
ｓｔＩで切断後、ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（Terminal Deoxynucleotidyl Transf
erase）を用いてＰｓｔＩ切断による３’末端に３５塩
基サイズのオリゴｄＴを結合させた。次いで、該溶液に
３０ユニット／ｍｌのＲＮａｓｅインヒビター（ニッポ
ンジ−ン製、１μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（１０ｍＭ
のｄＡＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＣＴＰ
及び１０ｍＭのｄＴＴＰからなる水溶液、２μｌ）、
０．１ＭのＤＴＴ（２μｌ）、及びバッファ−溶液（組
成：１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１
８７ｍＭのＫＣｌ及び７．５ｍＭのＭｇＣｌ₂）（４μ
ｌ）を添加した。

【００７０】３７℃で５分間保温させた後、逆転写酵素
（Superscript II、Gibco BRL製、１μｌ）を添加し、
３７℃で３０分間保温しｃＤＮＡを合成した。該ｃＤＮ
Ａ溶液を４℃に冷却した後、ＤＥＰＣ処理した蒸留水
（９２μｌ）、反応バッファ−（組成：２１８ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）及び４４ｍＭのＭｇＣｌ
₂）（３２μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（３μｌ）、
０．１ＭのＤＴＴ（６μｌ）、２０ユニットの大腸菌由
来DNAリガ−ゼ（２μｌ、Gibco BRL製）、４０ユニット
のＤＮＡポリメラ−ゼ（４μｌ、Gibco BRL製）、及び
１．５ユニットのＲＮａｓｅＨ（０．５６μｌ、Gibco
BRL製）を添加し、１６℃で１時間反応させて２本鎖Ｄ
ＮＡを合成した。該反応溶液を６５℃で２５分間保温す
ることにより、反応液中の酵素を失活させ２本鎖ＤＮＡ
溶液とした。

【００７１】実施例４ ３’方向性ｃＤＮＡライブラリ
−の作製 実施例３で合成した２本鎖ＤＮＡ溶液（５０μｌ）に、
１０×Low buffer(組成：５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＭｇＣｌ₂、及び１０
ｍＭのＤＴＴ）（５μｌ）、２ＭのＫＣｌ（５μｌ）、
蒸留水（５０μｌ）、１０ユニットのＭｂｏＩ（ＮＥ
Ｂ、２μｌ）、及びＢａｍＨＩ（１μｌ）を加え、３７
℃で３０分間インキュベ−トした。次いで該反応溶液
を、６５℃で３０インキュベ−トした後、ＭｂｏＩ及び
ＢａｍＨＩで切断された２本鎖ＤＮＡ溶液（１１３μ
ｌ）を得た。

【００７２】該溶液（２０μｌ）を用いてＤＮＡ結合反
応を行った。該ＤＮＡ溶液（２０μｌ）に５×セカンド
バッファー（組成：２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．９）及び５０ｍＭのＭｇＣｌ₂）（２０μｌ）、
蒸留水（７０μｌ）、及びＤＮＡリガ−ゼ（３μｌ）を
加え、１６℃で終夜インキュベ−トした後、ＤＮＡリガ
−ゼ反応混合溶液として−２０℃で保存した。得られた
ＤＮＡリガ−ゼ反応混合溶液（５μｌ）により大腸菌
（ＤＨ５α）のコンピ−テントセル（トーヨーボー（TO
YOBO）製）を形質転換し、１０２０個のアンピシリン耐
性のコロニ−を得た。残りのＤＮＡリガ−ゼ反応混合溶
液を用いて３０００個のアンピシリン耐性のコロニ−を
得、これを３’方向性ｃＤＮＡライブラリ−とした。

【００７３】実施例５ ｃＤＮＡライブラリ−の各クロ
−ンのＤＮＡの塩基配列の決定 実施例４で得られた３’方向性ｃＤＮＡライブラリ−か
ら無作為に１０００クロ−ンを抽出し、各クローンのＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。各々のクロ−ンを、アンピ
シリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１．５ｍ
ｌ）中で３７℃で終夜培養した。次いで、ボイリング
（Boiling）法を用いて、各菌体からプラスミドＤＮＡ
を抽出した。各々のプラスミドＤＮＡの塩基配列を、Cy
cle Sequence ABI Dye Sequenceキットを用いて決定し
た。得られた１０００クロ−ンの各々の塩基配列を、ボ
ディーマッピング（Body Mapping）での頻度情報を比較
して任意の数クロ−ンを選択し、そのうちの１つのクロ
−ンをＧＳ２４２２と命名した。このＧＳ２４２２クロ
−ンは、プラスミドｐＵＣ１９のＰｓｔＩとＢａｍＨＩ
の両制限酵素切断部位の間に３６０塩基対のＤＮＡ断片
が挿入されている（配列表配列番号１）。

【００７４】実施例６ 骨芽細胞由来完全鎖ｃＤＮＡラ
イブラリ−の作製 実施例３で作製した２本鎖ＤＮＡを、常法に従ってはま
ずＤＮＡポリメラ−ゼ反応に付した。実施例３で作製し
た２本鎖ＤＮＡ溶液（２０μｌ）に１μｇ／μｌＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（１μｌ）を加え、３７度で１０分間
保温した。次いでＤＮＡライゲ−ションキット（Ver.
1、宝酒造製）を用いて、該ＤＮＡ溶液を直ちに下記リ
ガ−ゼ反応に付した。該ＤＮＡ溶液（２０μｌ）にＡ液
（８０μｌ）を加え攪拌した。次いでＢ液（２０μｌ）
を加え攪拌した後、１６℃で３０分間保温した。この反
応溶液（１０μｌ）で、大腸菌（ＤＨ５α）のコンピ−
テントセル（TOYOBO製、１００μｌ）を形質転換した。
上述のＤＮＡポリメラ−ゼ反応乃至大腸菌の形質転換ま
での操作を繰返し、２万クロ−ンの形質転換体を得、骨
芽細胞由来完全鎖ｃＤＮＡライブラリ−とした。

【００７５】実施例７ 完全鎖を有するＧＳ２４２２ク
ロ−ンの単離 コロニーハイブリダイゼーション法を用いて常法によ
り、実施例６で作製した完全鎖ｃＤＮＡライブラリーか
ら以下のようにしてＧＳ２４２２の完全鎖のｃＤＮＡク
ロ−ンを以下のようにして選択した。コロニ−ハイブリ
ダイゼ−ションに用いるＤＮＡプロ−ブは、GeneAmp PC
R Reagent Kit (パーキンエルマーシータス（Perkin El
mer Cetus）製）を用い、実施例５で得たＧＳ２４２２
クロ−ンのＤＮＡを鋳型にして下記のようにして調製し
た。

【００７６】ＰＣＲ反応は、実施例５で得たＧＳ２４２
２クローンのプラスミド（１ｎｇ）、１μＭのＭ１３プ
ライマー（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'）、１μＭのＭ１
３リバースプライマー（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'）、
２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、２００
μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＴＴＰ、２．５ユニッ
トのAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂、及び0.001％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンから
なる溶液（１００μｌ）を用いて、９５℃で１分間、５
５℃で１分間及び７２℃で１分間からなる反応を２５サ
イクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲにより得られ
たＤＮＡ混合物（２５μｌ）を、フェノール及びＣＨＣ
ｌ₃で処理した後、エタノール沈澱させた。回収した沈
澱物を蒸留水（１６μｌ）に溶解した後、蒸留水（１７
μｌ）、Ｋバッファー（組成：２００ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０
ｍＭのDithiothreitol、１０００ｍＭのＫＣｌ）、Ｓｐ
ｈＩ（１μｌ、１０ユニット／μｌ、タカラ製）、Ｍｂ
ｏＩ（１μｌ、１０ユニット／μｌ、タカラ製）及びＨ
ｉｎｄIII（１μｌ、１０ユニット／μｌ、タカラ製）
を加え１時間反応させた。

【００７７】得られた反応液を、１％のアガロ−ス（Ag
arose L、ニッポンジ−ン製）を用いたゲル電気泳動に
付し、約３６０塩基対のＤＮＡ断片を含むゲル片（１０
０μｌ）を回収した。該ゲル片に蒸留水（８０μｌ）、
バッファ−（組成：５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ６．５）及び５ｍＭのＥＤＴＡ）（２０μｌ）を
加え、６５℃で１０分間保温した。次いで、４０℃に冷
却後、１ユニットのβアガラーゼＩ（beta-Agarase I、
ニッポンジ−ン製)を加え、１時間保温した。該溶液
を、１５Ｋｇで１５分間遠心し、上清を回収した。得ら
れた上清をエタノ−ル沈澱してプロ−ブＤＮＡを回収
し、ＴＥバッファ−（組成：１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡ）（１０μｌ）
に溶解した。

【００７８】プロ−ブＤＮＡの放射ラベル化は、Random
Primer DNA Labeling Kit Ver.2（宝酒造製）を用い
た。プロ−ブＤＮＡ（１μｌ（２５ｎｇ））、ランダム
プライマー（２μｌ）、［α-³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３００
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、５μｌ（５０μＣｉ）、ｄＮＴＰ
（０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．
２ｍＭのＴＴＰからなる溶液）（２．５μｌ）、バッフ
ァ−（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及
び５０ｍＭのＭｇＣｌ₂）（２．５μｌ）、蒸留水（１
１μｌ）及び２ユニット／μｌのExo-free Klenow Frag
ment (１μｌ、２ユニット／μｌ、宝酒造製）を混合し
３７℃で１０分間、続いて６５℃で５分間保温した後、
４℃に冷却した。得られた反応溶液を放射性ＤＮＡプロ
−ブとした。

【００７９】実施例６で作製した完全鎖ｃＤＮＡライブ
ラリ−の形質転換体（３０００クローン）を、寒天プレ
−ト（１５ｃｍ、１５枚）上に重ならないように植え、
３７℃で１０時間培養した。ニトロセルロ−スフィルタ
−を寒天プレ−ト上に置き、コロニ−をニトロセルロ−
スフィルタ−に吸着させた後、ニトロセルロ−スフィル
タ−を取り外した。

【００８０】以下の処理を連続して行うことにより、ニ
トロセルロ−スフィルタ−に各コロニ−のプラスミドＤ
ＮＡを吸着させた。フィルタ−を、０．５ＭのＮａＯＨ
溶液で十分に浸された濾紙上に５分間静置させた。次い
で、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液で十分
に浸された濾紙上に５分間静置させた。更に０．５Ｍの
ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１．２５ＭのＮａＣ
ｌからなる溶液で十分に浸された濾紙上に５分間静置さ
せた後、１０分間風乾させた。最後に減圧下、８０℃で
２時間処理した。プラスミドＤＮＡを固定化したフィル
タ−は１×Denhardt'溶液（組成：０．０２％のＢＳ
Ａ、０．０２％ポリビニルピロリドン、及び０．０２％
フィコ−ル）、０．５％のＳＤＳ及び６×ＳＳＣ溶液
（組成：０．９ＭのＮａＣｌ及び０．０９Ｍのクエン酸
ナトリウム）、及び１００μｇ／ｍｌの変性したサケの
ＤＮＡからなるプレハイブリダイゼ−ション溶液（２０
ｍｌ）に浸し熱シ−ル密閉可能なバッグ中で、６５℃で
２時間インキュベ−トした。

【００８１】次にプレハイブリダイゼ−ション溶液を除
いた後、ハイブリダイゼ−ション溶液を加え、上述と同
様に６５℃で２２時間インキュベ−トした。ハイブリダ
イゼ−ション溶液は、プリハイブリダイゼ−ション溶液
（２０ｍｌ）に、９４℃で５分間反応させた後直ちに４
℃で急冷処理した放射性DNAプロ−ブ溶液（２５μｌ）
を加えることにより調製した。次いで、フィルタ−を、
２×ＳＳＣ（組成：０．３ＭのＮａＣｌ及び０．０３Ｍ
のクエン酸ナトリウム）（１００ｍｌ）と０．１％ＳＤ
Ｓからなる溶液を用い、６５℃で３０分間インキュベ−
トした後、さらに０．１×ＳＳＣ（組成：0.01５ＭのＮ
ａＣｌ及び0.0015Ｍのクエン酸ナトリウム）（１００ｍ
ｌ）と０．１％のＳＤＳからなる溶液を用いて、６５℃
で３０分間インキュベ−トした。フィルタ−をラッピン
グしてオ−トラジオグラフィ−に付し、１１個の黒化像
を得、該黒化像に対応する部分のコロニーをニトロセル
ロ−スフィルタ−から得た。

【００８２】得られた各々のコロニ−を培養し、ボイリ
ング（Boiling）法を用いて常法によりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄIIIあるいはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIとＨ
ｉｎｃIIの２通りの組合わせにより制限酵素切断した。
切断されたＤＮＡ断片を、１％のアガロ−スゲル電気泳
動で分離した（図５）。次いで、全てのＤＮＡ断片を、
ニトロセルロ−スフィルタ−にトランスファ−させた。
このフィルタ−を用いて、前述と同様にしてハイブリダ
イゼ−ションを行った（図６）。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
III制限酵素切断により得られた１４００塩基対のＤＮ
Ａ断片に黒化像が認められるクロ−ン（図５乃至図６に
おけるクローン番号３）を取得し、ＧＳ２４２２の完全
鎖を含むクローンを取得した。

【００８３】この完全鎖ＧＳ２４２２クローンに挿入さ
れているＤＮＡの塩基配列を決定した。既存のＤＮＡデ
ータベースによる検索によりこのＧＳ２４２２クローン
に挿入されているＤＮＡの翻訳領域は全く新しいＤＮＡ
であり、このＤＮＡは全く新しい生理活性タンパクをコ
ードすることが確認され、このＤＮＡによりコードされ
る新規生理活性タンパクを同様にＧＳ２４２２と命名し
た。この新規な生理活性タンパクＧＳ２４２２は、１４
４０塩基のＤＮＡによりコードされる４８０残基のアミ
ノ酸からなり（配列表配列番号２乃至４）、Ｎ末の２７
残基のシグナル配列が切断されて４５３残基のタンパク
となる（配列表配列番号５及び６）。また、このＧＳ２
４２２タンパクは、ＩＧＦのホルモン作用のモジュレー
ションに深く関与すると考えられているヒトＩＧＦＢＰ
のＮ末端側のシステイン残基に富む領域と高いアミノ酸
配列相同性を有する（図７）。このことから、本発明の
タンパクは、細胞の分化、成熟及び／または増殖の制
御、並びに細胞の分化、成熟及び／または増殖に関与す
るタンパクのホルモン作用のモジュレーションを担う生
理活性タンパクであると考えられる。さらに、エラスタ
ーゼインヒビター（IELA ANESU：イソギンチャク（An
emonia Sulcata(Snake-locks Sea Anemone)由来（Biol.
chem. Hoppe-Seyler、第３６８巻、第１２９７〜１３０
４頁、１９８７年）、IEL1 MOMCH：ニガウリ（Bitter
Gourd(Momordica charanta)）由来（J. Biochem.、第
１０５巻、第８８〜９２頁、１９８９年）、ICE1 ASC
LU及びICE2 ASCLU：回虫（Ascaris Lumbricoides）由
来（Arch. Biochem. Biophys.、第２３２巻、第１４３
〜第１６１頁、１９８４年））と高いアミノ酸配列相同
性を有する部位を有する（図８）。ことから、本タンパ
クは、エラスターゼ等のプロテアーゼ反応が関与する生
物現象において特異的な活性を示すタンパクであると考
えられる。

【００８４】実施例８ ＧＳ２４２２タンパクの発現及
び精製並びにＧＳ２４２２タンパクに対する抗体の製造 ＜８−１＞ 基本的実験手法 新規生理活性タンパクＧＳ２４２２の発現における基本
的実験手法を以下に述べる。なお、以下にのべる手法は
遺伝子組換技術を用いた組換タンパクの発現において一
般的に使用されている方法を用い常法に従って行った。

【００８５】＜８−１−１＞ 制限酵素によるＤＮＡの
切断 ＤＮＡの切断は、常法に従って、ＤＮＡ１μｇに対し、
市販の制限酵素（３〜５ユニット）を付属のバッファー
（１／１０量）とともに加え、総量５０μｌとし、３７
℃ で1時間反応させることにより行った。また末端の平
滑化は、常法に従って、エタノール沈澱させたＤＮＡサ
ンプル８μｌに対し 市販のＳ１ヌクレアーゼ（１μ
ｌ）を付属のバッファー（１μｌ）を加え、３７℃で５
分間反応させることにより行った。

【００８６】＜８−１−２＞ ＤＮＡ断片の回収 ＜８−１−１＞で制限酵素切断したＤＮＡサンプルを電
気泳動に供し、目的のＤＮＡ断片を２％アガロースＬゲ
ル（Agarose L gel）から切り出した。次いで、２％ア
ガロースＬゲルブロック（Agarose L gel block）１０
０μｌ当たり１０×βアガラーゼＩ（β-Agarase I）バ
ッファー（２０μｌ）及び蒸留水（８０μｌ）を加え、
６５℃で１０分間保温しゲルを完全に融解させた。ゲル
融解液を４０℃に冷却した後、β-Agarase I（１μｌ）
を添加し、１時間反応させた 。次いで、２Ｍの酢酸ナ
トリウム（２０μｌ、ｐＨ５．２）を加え、氷中で１５
分間放置した後、遠心分離（15000rpm、４℃、１５分
間）を行い上清を回収した。上清にエタノール（６００
μｌ）を加え−８０℃ で３０分間放置した後、さらに
遠心分離（15000rpm、４℃、分間）を行い上清を除去し
た。沈澱物に７０％エタノール（１ｍｌ）を加え遠心分
離（15000rpm、４℃、１５分間）を行った後、上清を除
去し沈澱物を風乾させて目的のＤＮＡ断片を回収した。

【００８７】＜８−１−３＞ ＤＮＡのライゲーション
（連結） ＤＮＡのライゲーションには、市販のライゲーションキ
ット（宝酒造製）を用いて常法により行った。線状化し
たベクターＤＮＡと該ベクターに挿入されるインサート
ＤＮＡ（適当量）を混合した後、４〜８倍量のライゲー
ション溶液Ａ（Ligation solution A）を添加しよく攪
拌した。次いで、ＤＮＡ溶液と等量のライゲーション溶
液Ｂ（Ligation solution B）を添加しよく攪拌した。
反応は、１６℃で３０分間行った。得られた反応液（２
０μｌ）を、形質転換に用いた。

【００８８】＜８−１−４＞ 形質転換 形質転換されるコンピテントセル（100μｌ）と＜８−
１−３＞で得られたライゲーション反応液（２０μｌ）
を混合し氷中で３０分間放置した。混合液を４２℃で２
分間処理した後、再び氷中で１分間放置した。次いで、
ＬＢ培地（１ｍｌ、組成：Bacto-Trypton（１０ｇ）、B
acto-Yeast extract（５ｇ）、ＮａＣｌ（５ｇ）、及び
蒸留水）を加え振とう（３００rpm／分、３７℃、１時
間)した後、分取した１００μｌ及び残り全量を、各々
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレー
ト（Bacto-Agar（１５ｇ）含有）に塗布し、３７℃で一
晩培養した。

【００８９】＜８−１−５＞ 大腸菌からのプラスミド
ＤＮＡの調製 少量調製の場合には、＜８−１−４＞で培養したＬＢプ
レートから取得した単一コロニーを、ＬＢ培養液（２ｍ
ｌ）を含むマイクロチューブに植菌し一晩振とう培養
（３００rpm／分、３７℃）した。プラスミド抽出装置
（ＰＩ−１１、クラボウ製）を用いて、培養液からプラ
スミドを回収した。プラスミドＤＮＡの大量調製は以下
のようにして行った。＜８−１−４＞で培養したＬＢプ
レートから取得した単一コロニーを、５０ｍｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む２×ＬＢ培養液（５ｍｌ）に植菌し
激しく振とうしながら一晩培養（３００rpm／分、３７
℃）した。次いで、培養液（４ｍｌ）を、アンピシリン
を含むＬＢ培養液（４００ｍｌ）に加え、１Ｌフラスコ
中３７℃で一晩培養した。遠心分離（5,000rpm、４℃、
１０分間）して細胞（ペレット）を回収し、チューブ
（５０ｍｌ）中で氷冷ＴＥＧ（７ｍｌ、組成：２５ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、及び５０ｍ
Ｍのグルコース、ｐＨ８．０）溶液に再懸濁させた。

【００９０】次いで、ライソザイム（Lysozyme、１４０
ｍｇ、生化学工業製）を加え、氷上で１０分間放置し
た。０．２ＮのＮａＯＨ（１４ｍｌ）及び１％ＳＤＳ溶
液を加え、緩やかに攪拌した後、氷上で５分間放置し
た。さらに、氷冷した３ＭのＫＯＡｃ（１０．５ｍｌ）
を加え、激しく攪拌した。遠心分離（9,000rpm、４℃、
２０分）により得られた上清を、新しい遠心チューブに
採取し、０．６倍量の２−プロパノールを加え、室温下
で３０分間静置した。遠心分離（9,000rpm、４℃、２０
分）によりＤＮＡを回収し、ＴＥ溶液（６ｍｌ、組成：
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び１ｍＭののＥＤＴ
Ａ）中に再懸濁させた。懸濁液にＣｓＣｌ（７ｍｇ）及
びEthdiumbromide溶液（０．７ｍｌ、和光純薬製）を加
え、超遠心分離（55,000rpm、２０℃、１６時間）し
て、閉環したＤＮＡを回収した。５ＮのＮａＣｌで飽和
した等量の２−プロパノールを加え激しく攪拌した。静
置（３分間）後、有機相を除去した。この抽出を４回繰
り返した。水相を回収し、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）によ
り２４時間透析してＣｓＣｌを除去し、プラスミドＤＮ
Ａを取得した。

【００９１】＜８−１−６＞ ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳーＰＡＧＥ） サンプルに６×ＳＤＳ化バッファー（１／６量、組成：
２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１％Ｓ
ＤＳ、２０％スクロース、0.025％ブロモフェノールブ
ルー、及び１％の２−メルカプトエタノール）を加え９
４℃で５分間加熱した。得られたサンプルを４〜２０％
濃度勾配ゲルまたは８％ゲル（TEFCO製）を用いて泳動
バッファーに加え、電気泳動（１２０Ｖ、２時間）し
た。次いで、ゲルをＣＢＢ染色液（０．１％のCoomassi
e brilliant blue、１０％酢酸、及び４０％メタノー
ル）に浸して染色し（３０分間）、脱色液（７％酢酸、
及び５％メタノール）に移して脱色した。

【００９２】＜８−１−７＞ ウェスタンブロッティン
グ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、電気泳動槽（TEFCO製）を用
いてトランスファー（２０Ｖ、２時間）を行ないニトロ
セルロースメンブラン（０．４５ミクロン、バイオラッ
ド（BIORAD）製） に転写した。メンブランを５％ スキ
ムミルクでブロッキングした後、ＧＳ２４２２タンパク
で免疫して作製したマウスの抗血清を一次抗体として１
時間結合させた。次いで、ＴＢＳＴ（組成：Tris buffe
red saline（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び５００ｍ
ＭのＮａＣｌ）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄
した後、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（horser
adish peroxidase）を結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ及
びＩｇＭ抗体（ケミコン（CHEMICON）製）を二次抗体と
して１時間結合させた。ＴＢＳＴで２回洗浄した後ＴＢ
Ｓ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び５００ｍＭのＮａＣ
ｌ）で洗浄しホースラディッシュパーオキシダーゼコン
ジュゲート基質キット（Horseradish peroxidase conju
gate substrate、バイオラッド（BIORAD）製）を用いて
発色を行なった。

【００９３】＜８−２＞ 大腸菌発現用プラスミドの構
築 実施例７で取得したＧＳ２４２２クローン（ＧＳ２４２
２／ｐＵＣ１９、１０μｇ）を、＜８−１−１＞の方法
に従ってＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン製）及びＨｉｎｄ
III（ニッポンジーン製）で切断し、ＧＳ２４２２タン
パクをコードする領域のＤＮＡを＜８−１−２＞の方法
に従って回収した。得られたＤＮＡ断片を、＜８−１−
３＞の方法に従って、同様にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄII
Iで切断して得られたプラスミドpBluescript II SK+（T
OYOBO製）とライゲーションした。次いで＜８−１−４
＞の方法に従って、得られたライゲーション反応液を大
腸菌ＴＢ１に形質転換し、アンピシリンを含むプレート
に蒔いて形質転換体を得た。形質転換体コロニーから＜
８−１−５＞の方法に従ってプラスミドＤＮＡを大量調
製した。得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＹＮ６６と命
名した。

【００９４】ｐＹＮ６６（１０μｇ）をＢｇｌＩ及びＸ
ｈｏＩ（ニッポンジーン製）で切断して１７００ｂｐ及
び３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を、ＰｖｕIIで切断し１７５ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。一方、マルトース結合タンパク（Maltose
Binding Protein、ＭＢＰ）をコードするＤＮＡが挿入
されている発現用プラスミドｐＭＡＬ−Ｃ２（５μｇ、
ニューイングランドバイオラボ（New England Bio Lab
s.）製）を、ＳｍａＩ及びＳａｌＩで切断してＤＮＡ断
片を回収した。上述のようにして得られた３本のＤＮＡ
断片を＜８−１−３＞の方法に従ってライゲ−ションし
た後、大腸菌ＴＢ１を形質転換した。この形質転換体
を、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１９６で国際寄託
した。＜８−１−５＞の方法に従って、形質転換体コロ
ニーから大腸菌発現用プラスミドを大量に調製した。こ
の大腸菌発現用プラスミドをｐＴＳ５３１と命名した
（図９）。このｐＴＳ５３１を用いて発現されるＧＳ２
４２２タンパクとＭＢＰとの融合タンパクを、ファクタ
ーＸａで切断することによりＧＳ２４２２タンパクが得
られる。

【００９５】＜８−３＞ 大腸菌におけるＧＳ２４２２
の発現及び精製 ＜８−３−１＞ 発現 アンピシリン及び０．２％グルコースを含むＬＢブロス
（１Ｌ）に、ｐＴＳ５３１で形質転換した大腸菌ＴＢ１
の前培養液（１／１００量）を加え、Ｏ．Ｄ．が０．５
となるように振とう培養（３００rpm／分、３７℃）し
た。次いで、最終濃度が０．３ｍＭとなるようにＩＰＴ
Ｇ（Isopropanol-β-D-thiogalactopyranoside）を加
え、さらに振とう培養（３時間）を行った。培養液を遠
心分離（７０００rpm、４℃、１５分間）し上清を除
き、に沈殿した菌体を冷カラムバッファー（５０ｍｌ、
組成：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのメルカプトエ
タノール）に懸濁した。またプロテアーゼによる分解を
抑えるため０．１ＭのＰＭＳＦ（５０μｌ、Phenylmeth
ylsulfonyl Fluoride）を添加した。

【００９６】以下の操作は、特に断りのない限り４℃の
条件下で行った。菌体の懸濁液を、超音波処理（氷冷
下、５分間）して菌体を破壊した。次いで、遠心分離
（９０００rpm、４℃、１５分間）により、可溶性画分
を回収した。得られた可溶性画分の蛋白量の吸光度を波
長２８０ｎｍで測定し、Ｏ．Ｄ．が２．５となるように
氷冷カラムバッファーで希釈した。さらに、最終濃度が
０．１ｍＭとなるようにＰＭＳＦを添加してカラムアプ
ライ用のサンプルとした。また、得られた菌体の全タン
パクについて＜８−１−６＞の方法に従ってＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（図１０、レーン２）を、また＜８−１−７＞の
方法に従って抗ＭＢＰ血清（New England Bio Labs.
製）に対するウェスタンブロッティング（図１１、レー
ン２）を行った。

【００９７】＜８−３−２＞ アフィニティーカラムに
よるＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの精製 アミロースレジン（Amylose resin、１５ｍｌ、BIORAD
製）を簡易カラム（φ２．５×１０ｃｍ）に詰め、８カ
ラム量の氷冷カラムバッファーで洗浄し平衡化した。ポ
ンプを用いて流速が１ｍｌ／分となるように保ちなが
ら、＜８−３−２＞で取得したサンプルをカラムにロー
ドし、１０カラム量の氷冷カラムバッファーでゲルを洗
浄した。融合タンパク質の溶出は、１０ｍＭのマルトー
スを含む氷冷カラムバッファーで行い、各々４ｍｌで分
画した。各々の画分について＜８−１−６＞の方法に従
ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０、レーン３）を、また＜
８−１−７＞の方法に従って抗ＭＢＰ血清（New Englan
d Bio Labs.製）に対するウェスタンブロッティング
（図１１、レーン３）を行い融合タンパク質の分析を行
った。ウェスタンブロッティングにおいて融合タンパク
質の完全長と思われる付近にバンドを示す画分を有効画
分とし、この有効画分について更に高度精製を行った。

【００９８】＜８−３−３＞ ゲル濾過クロマトグラフ
ィーによるＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの精製 ＜８−３−２＞のアフィニティークロマトグラフィーで
得た有効溶出画分（１０ｍｌ）を、５ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して１２時間透析した後、凍
結乾燥を行った。乾燥標品を、６Ｍのグアニジン及び
０．３ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（１
ｍｌ、ｐＨ６．５）で溶解した。ＳＭＡＲＴシステム
（ファルマシアバイオテック（Pharmacia Biotech）
製）に接続したTSKgel G3000SWXL（７．８ＩＤ×３０ｃ
ｍ、東ソー製）を前記緩衝液で平衡化した後、融合タン
パク質溶解液（１００μｌ）を添加し、流速０．３ｍｌ
／分で溶出した。各々の分画（２００μｌ）について、
＜８−１−６）の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１
０、レーン４）を行い、また＜８−１−７＞の方法に従
って、抗ＭＢＰ血清（New England Bio Labs.製）に対
するウェスタンブロッティング（図１１、レーン４）を
行い融合タンパク質の溶出位置と純度を調べた。なお、
本クロマトグラフィ−を１０回行った。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析において、５．５ｍｌ溶出位置の画分に、完全長
と予想される１０６ｋＤａの位置にメインバンドが、ま
た９３ｋＤａ及び６０ｋＤａの位置にその分解物と考え
られるマイナ−バンドが確認された。いずれのバンドも
ウェスタンブロッティングにおいて免疫反応を示した。

【００９９】得られたＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパ
クを含む有効画分（１０ｍｌ）を、０．２ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対
して１２時間透析した後、凍結乾燥を行い、Milli Q水
（５００μｌ）で溶解した。溶解液に１ｍｇ／ｍｌのフ
ァクターＸａ（Factor Xa、５μｌ）添加して２５℃で
２４時間インキュベ−トした。酵素反応終了後、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（図１２：レーン３）及び抗ＭＢＰ血清を用
いたウェスタンブロッティング（図１３：レーン２）を
行い、ファクターＸａによる融合タンパクの切断を調べ
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、１０６ｋＤａ、９
３ｋＤａ、及び６０ｋＤａのバンドは検出されず、５９
ｋＤａ及び４７ｋＤａのバンドをメインバンドとして認
めた。ウェスタンブロッティング分析において、５９ｋ
Ｄａのバンドは抗ＭＢＰ血清と免疫反応を示さず４７ｋ
Ｄａのバンドのみが免疫反応を示した。このことから５
９ｋＤａのバンドがＧＳ２４２２タンパクであり、４７
ｋＤａのバンドがＭＢＰであると考えられた。

【０１００】酵素反応液を遠心分離（10000×ｇ、１分
間）して得た沈澱に、４ｍＭのＥＤＴＡを含む８０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加して攪拌し、
さらに遠心分離（10000×ｇ、１分間）して沈澱の洗浄
を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返した後、沈澱
画分及び各上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２：レ
ーン４）及び抗ＭＢＰ血清を用いたウェスタンブロッテ
ィング（図１３：レーン３）を行った。ＳＤＳーＰＡＧ
Ｅ分析を行った結果、沈澱洗浄画分に５９ｋＤａのメイ
ンバンドが、また遠心上清画分に４７ｋＤａのメインバ
ンドが認められた。また、ウェスタンブロッティング分
析において、沈澱洗浄画分の５９ｋＤａのバンドは抗Ｍ
ＢＰ血清と免疫反応を示さず、また４７ｋＤａのバンド
が免疫反応を示した。この結果から、遠心処理によりＧ
Ｓ２４２２タンパクとＭＢＰが完全に分離されたことが
確認された。この沈澱洗浄画分をＧＳ２４２２タンパク
の精製標品とした（収量１００μｇ）。

【０１０１】＜８−４＞ ＧＳ２４２２タンパクに対す
る抗体の製造 ＜８−３＞で得た精製ＧＳ２４２２タンパクを、６Ｍの
グアニジン及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを
含むＰＢＳに対して透析（１２時間）した後、さらに１
Ｍのアルギニン及び５０ｍＭのシステインを含むＰＢＳ
に対して透析（２４時間）して得られたＧＳ２４２２タ
ンパクを免疫原として用いた。ＧＳ２４２２タンパク
（１容量）とフロイント完全アジュバント（1容量、シ
グマ（Sigma）製）を混和して得られたエマルジョン
（２５０μｌ、抗原量１０μｇ）を、ＢＡＬＢ／ｃマウ
ス（６週齢、雌、チャールズリバー製）に腹腔内投与
し、初回免疫した。該免疫原をフロイント不完全アジュ
バント（シグマ製）と混和して得られたエマルジョンを
用い、腹腔内投与により追加免疫を初回免疫後２週間隔
で３回行った。最終免疫から１週間後に心臓を直刺して
全血を採取した。

【０１０２】また、別法としてフットパッド投与法も行
った。ＧＳ２４２２タンパク（１容量）とフロイント完
全アジュバント（１容量）を混和して得られたエマルジ
ョン（５０μｌ、抗原量２μｇ）を、ＢＡＬＢ／ｃマウ
スのフットパッド内に半量ずつ投与し、初回免疫した。
追加免疫は、ＧＳ２４２２タンパク（１容量）とＰＢＳ
（１容量）を混和物（５０μｌ）をフットパッドに半量
ずつ投与することにより行った。追加免疫は、初回免疫
から３日間隔で３回及び１週間間隔で５回行った。最終
免疫から１週間後に心臓を直刺して全血を採取した。採
取した全血を静置（４℃、１２時間）した後、遠心分離
（１５００×ｇ、１０分間）により上清を抗血清（ポリ
クローナル抗体）として回収し、マウス１匹当たり４０
０〜５００μｌの抗血清を取得した。＜８−３−１＞乃
至＜８−３−３＞で得られた精製度の異なる種々のＭＢ
Ｐ／ＧＳ２４２２融合タンパク及びＧＳ２４２２タンパ
クについて、本抗血清を用いてウェスタンブロッティン
グを行った（図１４及び図１５）。本抗血清は、１０６
ｋＤａのＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパク及び５９ｋ
ＤａのＧＳ２４２２タンパクと免疫反応を示し、本抗血
清がＧＳ２４２２タンパクに反応性を有することが確認
された（図１４：レーン３及びレーン４、図１５：レー
ン３及びレーン４）。

【０１０３】＜８−５＞ 動物細胞発現用プラスミドの
構築 実施例７で取得したＧＳ２４２２クローン（ＧＳ２４２
２／ｐＵＣ１９、１０μｇ）を、＜８−１−１＞の方法
に従ってＥｃｏＲＩで消化した後、ＳｐｈＩで消化し
た。次いでＳ１ヌクレアーゼ（ニッポンジーン製）で処
理して末端を平滑化し、ＧＳ２４２２タンパクをコード
するＤＮＡ領域を＜８−１−２＞の方法に従って回収し
た。また、ｐＥＦ−ＢＯＳ（５μｇ：Nucleic Acids Re
search、第１８巻、第５３２２頁、１９９０年等）ある
いはｐＭＥ１８Ｓ（東京大学丸山和夫先生より入手）を
ＢｓｔＸＩで消化し、ＳＩヌクレアーゼ処理して末端を
平滑化し、５．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。得られ
たＧＳ２４２２をコードするＤＮＡとｐＥＦ−ＢＯＳま
たはｐＭＥ１８ＳのＤＮＡ断片を、＜８−１−３＞の方
法に従ってライゲーションを行った。ライゲーション反
応液で＜８−１−４＞の方法に従って大腸菌ＤＨ５αを
形質転換した後、アンピシリンを含むプレートに植菌し
て転換体を選択した後、＜８−１−５＞ の方法に従っ
てコロニーからプラスミドＤＮＡを大量に調製した。こ
の動物細胞発現用プラスミドをｐＴＳ５３３と命名した
（図１６）。

【０１０４】＜８−６＞ 動物細胞での発現 サル由来細胞ＣＯＳ７を、１０％ＦＣＳ（JRH Bioscien
ces製）及びペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO-B
RL製）を含有するＤＭＥＭ培地（Low Glucose、日研生
物医学研究所製）で培養した後細胞を回収し、最終的に
１×１０⁷個細胞／ｍｌとなるように５ｍＭのＭｇＣｌ₂
を含むＫＰＢＳ（組成：３０ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭの
ＮａＨＰＯ₄、１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、及び１２０ｍ
ＭのＫＣｌ）に懸濁した。この細胞懸濁液（０．５ｍ
ｌ）と＜８−５＞で得たプラスミドＤＮＡ（ｐＴＳ５３
３、２０μｇ）を混合し、氷中に１０分間放置した。次
いで、パルス（９６０μＦＤ、２３０Ｖ）処理（１回）
を行い氷中に７分放置した後、ＤＭＥＭ培地（６．５ｍ
ｌ）を加えて更に室温で１０分放置した。さらに１０％
ＦＣＳ及びＤＭＥＭ（総量２０ｍｌ）を添加した後、該
細胞懸濁液（１０ｍｌ）をシャーレ（φ：１０ｃｍ）に
移して３７℃で２４〜３６時間培養した。

【０１０５】次いで、ＰＢＳ（組成：３０ｍＭのＮａＣ
ｌ、８ｍＭのＮａＨＰＯ₄、及び１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ
₄）で２回洗浄した後、ＦＣＳを含有しないＤＭＥＭ培
地で培養（３７℃、１時間）した。さらにＰＢＳで洗浄
した後、ＦＣＳを含有しないＤＭＥＭ培地（２０ｍｌ）
で２４時間培養を行った。培養上清を回収し、凍結乾燥
法で５０倍に濃縮した。また、細胞を１×１０⁶個づつ
を回収し、ＳＤＳ化してサンプルとした。得られた濃縮
培養上清及びＳＤＳ化細胞サンプルを、各々還元下（２
−メルカプトエタノールで還元）及び非還元下で＜８−
１−６＞及び＜８−１−７＞の方法に従ってＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（図１７）及びウェスタンブロッティング（図１
８）を行った。ウェスタンブロッティングは、＜８−４
＞で調製したＧＳ２４２２に対する抗血清を用いて行っ
た。ウェスタンブロッティングの結果、還元下及び非還
元下の双方において培養上清サンプル及びＳＤＳ化細胞
サンプルともにＧＳ２４２２タンパクの完全長と考えら
れるメインバンドが５５ｋＤａ付近に確認された。この
ことからＧＳ２４２２タンパクが、動物細胞において生
理活性型として発現されていることが確認された。

【０１０６】実施例９ ＧＳ２４２２タンパク精製標品
のアミノ酸解析 実施例８＜８−３＞で得たＧＳ２４２２タンパク精製標
品のアミノ酸配列を下記のようにして解析した。ＧＳ２
４２２タンパク精製標品（１０μｇ）に、８Ｍの尿素、
２．５ｍＭのＤＴＴ及び１０ｍＭのＣａＣｌ₂を含む
０．４Ｍの炭酸水素アンモニウム溶液（５５μｌ）を加
えて溶解した後、３７℃で１時間インキュベートした。
室温まで冷却した後、１００ｍＭのヨードアセタミド
（５μｌ）を添加して、室温で３０分間インキュベート
した。次いで精製水（１４０μｌ）を添加した後、シー
クエンスグレードＴＰＣＫ処理トリプシン（１ｍｇ／ｍ
ｌ、ＴＰＣＫ：L-1-Tosylamido-2-phenylethylchlorome
thyl keton）を１μｌ添加して３７℃で１時間インキュ
ベートし、ＧＳ２４２２タンパクを断片化した。０．５
Ｍの酢酸溶液（２００μｌ）添加して反応を停止させ
た。反応溶液を、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化し
たμRPC C2/C18 SC2.1/10カラムに添加した後、アセト
ニトリルを用いた濃度勾配法（０〜１００％）による逆
相クロマトグラフィーにより断片化ＧＳ２４２２ペプチ
ドを溶出、分離した（図１９）。

【０１０７】検出された４９のピークの内の任意の４つ
のピークに対応する画分（図１９のピークＡ、Ｂ，Ｃ及
びＤ）について気相化シークエンサーを用いてアミノ酸
配列を決定した。ピークＣの画分には２種類のペプチド
断片が含まれており、総計で５つのペプチド断片のアミ
ノ酸配列が同定された。ピークＡのペプチド断片のアミ
ノ酸配列はＩＫＤＶＤＥＫであり、ピークＢのペプチド
断片のアミノ酸配列はＦＬＴＥＳＨＤＲであり、ピーク
Ｃのペプチド断片のアミノ酸配列はＫＬＰＦＳＫＲ及び
ＶＫＶＥＬＫであり、ピークＤのペプチド断片のアミノ
酸配列はＡＱＡＧＬＣＶＣＡＳＳＥＰＶＣＧＳＤＡＮＴ
ＹＡＮＬＣＱＬＲであった。同定されたいずれのアミノ
酸配列も実施例７で得たＧＳ２４２２遺伝子から推定さ
れるアミノ酸配列の一部と各々一致しており、抗体作製
等に用いたＧＳ２４２２タンパク精製標品がＧＳ２４２
２遺伝子の遺伝子産物に相違ないことが確認された。

【０１０８】実施例１０ ヒト各種臓器におけるＧＳ２
４２２遺伝子の発現 ヒトの各種臓器（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、
腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、
結腸、白血球）におけるＧＳ２４２２をコードする遺伝
子に対するｍＲＮＡの発現量を下記のようにして調べ
た。なお、本試験に用いられる試薬の内、特に記載のな
いものは、半井化学（株）製のもの使用した。＜８−２
＞でＧＳ２４２２クローン（ＧＳ２４２２／ｐＵＣ１
９）から取得したＧＳ２４２２をコードするＤＮＡを、
２５ｎｇ／４５μｌとなるように精製水で希釈し、加熱
（９５℃、５分間）してＤＮＡを変性させた後、氷水中
で急冷した。このＤＮＡを、ＤＮＡラベリングシステム
（REDIPRIME（商標）DNA Labelling System、アマシャ
ム（Amersham）製）を用いて添付のプロトコールに従っ
て、[α-³²Ｐ]ｄＣＴＰ（アマシャム製）で標識した。
次いで、得られた標識ＤＮＡを前記と同様にして熱変性
させプローブとなした。

【０１０９】上述のヒト各種臓器から抽出したｍＲＮＡ
を転写したメンブレン（Human Multiple Tissue Northe
r (MTN) Blot及びHuman Multiple Tissue Norther (MT
N) Blot II、クローンテック（CLONTECH）製）を、ハイ
ブリダイゼーションバッファー（１２ｍｌ、組成：５×
ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、３ＭのＮａＣｌ、０．２
ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ及び０．０２ＭのＮａ₂ＥＤＴ
Ａを、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ７．４に調整したも
の。）、５×Denhardt's溶液（日本ジーン製）、１００
μｇ／ｍｌのサケの新鮮な変性精子ＤＮＡ（日本ジーン
製）、１％ＳＤＳ、及び５０％フォルムアミド（日本ジ
ーン製））に浸し、４２℃で６時間反応させた。次い
で、メンブレンを、前記プローブを混合したハイブリダ
ーゼーションバッファー（１２ｍｌ）に浸し、４２℃で
１８時間さらに反応させた。

【０１１０】反応終了後、メンブレンを洗浄した。洗浄
は、２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３ＭのＮａＣｌ
及び０．３ＭのＮａ₃Citrate・Ｈ₂Ｏを１Ｍの塩酸でｐ
Ｈ７．０に調整したもの。）及び０．１％ＳＤＳからな
る溶液を用いて２回（各々室温で１５分間）、さらに
０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液で２回
（各々５０℃で３０分間）行った。洗浄後、メンブレン
をラップで覆い、イメージングプレートを３０分間感光
させた後、ＢＡＳ２０００（富士写真フィルム製）を用
いて、検出されたバンドの強度（放射活性：ＰＳＬ）を
測定した。結果を図２０に示す。本試験の結果、ＧＳ２
４２２をコードするＤＮＡは、試験された１６種類全て
の臓器において発現が見られ、特に卵巣、胸腺及び白血
球において強い発現が見られた。とりわけ卵巣での発現
が顕著であった。

【０１１１】実施例１１ ＧＳ２４２２タンパクのタン
パク分解活性（酵素活性） ＧＳ２４２２タンパクのタンパク分解活性（酵素分解活
性）を下記のようにして測定した。実施例８＜８−６＞
で得たＧＳ２４２２遺伝子導入ｐＴＳ５３３で形質転換
したＣＯＳ７細胞培養上清を酵素溶液として用いた。５
０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl, pH8.0, 100μ
ｌ）に溶解したＢＳＡ（Bovine Serum Albumin；ウシ血
清アルブミン、シグマ製、５μｇ）及び同緩衝液に溶解
したβカゼイン（β-Casein、シグマ製、５μｇ）の各
々に、当量の酵素溶液を加え、５０℃で５時間または２
０時間反応させた。各々の反応液から４０μｌづつ分取
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。基質の分子量の関係か
ら、ＢＳＡを基質とした酵素反応溶液の電気泳動では、
４〜２０％の濃度勾配ゲルを用い（図２１、レーン５乃
至８。レーン８はマーカータンパク）、βカゼインを基
質とした酵素反応溶液の電気泳動では、１６％のゲルを
用いた（図２２、レーン５乃至８。レーン８はマーカー
タンパク）。なお、対照としてＧＳ２４２２遺伝子を含
まないベクター（ｐＭＥ１８Ｓ）で形質転換した形質転
換細胞の培養上清を酵素溶液として同様の反応を行った
（図２１、レーン１乃至４、並びに図２２、レーン１乃
至４。なお、レーン４はマーカータンパク）。ＧＳ２４
２２タンパクによるＢＳＡを分解は見られなっかたが、
βカゼインは５時間の反応で分解が見られ、２０時間の
反応ではほぼ完全に分解された。対照実験での酵素反応
ではβカゼインの分解がほとんど見られないことから、
ＧＳ２４２２タンパクは蛋白分解活性（酵素活性）を有
することが明らかとなった。さらに、βカゼインが分子
量の異なるポリペプチド鎖に分解されていることから、
ＧＳ２４２２タンパクはエンドペプチダーゼであること
が予想される。

【０１１２】実施例１２ 合成ペプチド基質に対するＧ
Ｓ２４２２の酵素活性 合成ペプチド基質に対するＧＳ２４２２の蛋白分解活性
（酵素活性）を下記のように測定した。蛍光体である4-
Methylcoumaryl-7-amido（ＭＣＡ）をＣ末端に含む９種
類のペプチドの各々を終濃度が３００ｍＭとなるように
１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（pH7.8）に溶解し、基
質として用いた。基質溶液５０μｌｍに対し同量の酵素
溶液（ＧＳ２４２２タンパク含有）を加え、３７℃で一
晩反応させた後、３５５ｎｍ（励起）及び４６０ｎｍで
の蛍光強度を測定した。ペプチド基質としては、下記の
９種類を用いた。t-butyloxycarbonyl[Boc]-Phe-Ser-Ar
g-MCA、Boc-Val-Leu-Lys-MCA、Boc-Val-Pro-Arg-MCA、P
ro-Phe-Arg-MCA、succinyl[Suc]-Ala-Ala-Ala-MCA、Suc
-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA、Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MC
A、Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA、及びSuc-Leu-Leu-Va
l-Tyr-MCA ＧＳ２４２２タンパクは、いづれのペプチド基質に対し
ても蛋白分解活性を示さなかった。

【０１１３】実施例１３ プロテアーゼ阻害剤による蛋
白分解活性阻害試験 既知のプロテアーゼ阻害剤によるＧＳ２４２２タンパク
のタンパク分解活性（酵素活性）阻害効果を下記のよう
にして測定した。ＧＳ２４２２タンパクを含む酵素溶液
（実施例１１に同じ）を、予め既知の代表的なプロテア
ーゼ阻害剤と５分間インキュベートした後に、実施例１
１と同様にして２０時間酵素反応を行い、反応溶液をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図２３）。なお本試験におい
ては、基質としてβカゼインを用い、プロテアーゼ阻害
剤として、セリンプロテアーゼ阻害剤として知られてい
るＤＦＰ（Diisopropyl fluorophosphate、）、ＰＭＳ
Ｆ（Phenylmethylsulfonyl fluoride）、ＴＰＣＫ（L-1
-Tosylamido-2-phenylethylchloromethyl keton）、Ｔ
ＬＣＫ（N-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone）、ロ
イペプチン（Leupeptin）、メタロプロテアーゼ阻害剤
として知られているＥＤＴＡ（Ethylenediaminetetraac
etic acid）、及びシステインプロテアーゼ阻害剤とし
て知られているヨードアセタミド（Iodoacetamido）を
用いた。ＧＳ２４２２によるβカゼインの分解は、ＰＭ
ＳＦ及びＴＰＣＫで弱く阻害され、ＤＦＰで完全に阻害
されたことから、ＧＳ２４２２タンパクはセリンプロテ
アーゼであることが予想される。ＧＳ２４２２タンパク
の活性中心近傍のアミノ酸配列は、大腸菌由来のセリン
プロテアーゼであるｈｔｒＡタンパク及びＤｏタンパク
と高い相同性を有することからもＧＳ２４２２タンパク
がセリンプロテアーゼであることが裏付けられる（図２
４及び図２５）。また、実施例１１及び１２で得られた
結果を考慮すると、ＧＳ２４２２タンパクはかなりの高
い基質特異性を有すると考えられる。

【０１１４】

【発明の効果】本発明は、ヒト卵巣、胸腺及び白血球、
特に卵巣で特異的に高発現が見られ、（１）大腸菌由来
セリンプロテアーゼであり細胞内での酸化変性蛋白及び
熱変性蛋白の分解除去並びに蛋白新生促進に深く関与す
るｈｔｒＡ、（２）同じく大腸菌由来セリンプロテアー
ゼであるＤｏ、及び（３）ヒトＩＧＦＢＰのＮ末端側で
あってＩＧＦのホルモン作用のモジュレーションに深く
関与するＮ末端側のシステイン残基に富む領域の各々と
高いアミノ酸配列相同性を有し、高い基質特異性を有す
るセリンプロテアーゼ活性を有する新規生理活性タンパ
ク、該タンパクをコードするＤＮＡ、該タンパクに反応
性を有する抗体並びに該タンパクの製造方法を提供する
ものである。

【００１５】本発明の新規タンパクの、（１）細胞内で
の酸化変性蛋白及び熱変性蛋白の分解除去並びに細胞内
での蛋白新生促進に関与する既知セリンプロテアーゼに
高いアミノ酸配列相同性を有するだけでなく、実際に高
い基質特異性を有するセリンプロテアーゼ活性を有する
こと、（２）細胞の分化、成熟及び／または増殖の制御
に関与するＩＧＦの作用発現のモジュレーションに深く
係わるＩＧＦＢＰのＮ末端領域との高いアミノ酸配列相
同性を有することに加え、（３）細胞の新生、分化及び
／または増殖並びに細胞内での蛋白の新陳代謝が活発な
卵巣、胸腺及び白血球において特異的に高発現が見られ
るという特徴から、本発明のタンパクまたはそのフラグ
メント及び本発明のタンパクに反応性を有する抗体また
はその一部は、本タンパクの上述のような機能及び／ま
たは本タンパクと相互作用するタンパクのホルモン作用
の破錠による細胞の分化、成熟及び／または増殖の異常
並びに細胞内タンパクの新陳代謝の異常に起因する生理
状態及び疾患の予防薬及び治療薬として有用である。本
発明のタンパクは細胞内の酸化変性蛋白及び熱変性蛋白
の分解除去並びに細胞内での蛋白新生促進に関与する可
能性を有していることから、例えば、血管内での酸化変
性蛋白及び熱変性蛋白の分解除去の機能異常に起因する
血管の肥厚及びマクロファージの泡沫化に伴う動脈硬化
症の予防薬・治療薬としての開発が期待できる。また、
本発明のタンパクは、卵巣に非常に高い発現が見られる
ことから、卵細胞の分化、成熟及び／または増殖の制御
に関与すると考えられ、例えば避妊薬等としての開発が
期待できる。

【００１６】さらに、本発明のタンパク、ＤＮＡ及び抗
体は、本発明のタンパクと相互作用を有するタンパクの
解明、本発明のタンパク並びに本発明のタンパクと相互
作用を有する該タンパクが関連する疾患の解明、並びに
該疾患の治療薬を開発するための試薬として有用であ
る。また、本発明のＤＮＡ及び抗体は、本発明のタンパ
クの生物学的性状及び機能を明らかにするために用いら
れる試薬としても有用であることは言うまでもない。

【０１１７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：360 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：骨芽細胞様細胞 配列： GATCCGCAGG CAGAAGCTCT GCCCTTCTGT ATCCTATGTA TGCAGTGTGC 50 TTTTTCTTGC CAGCTTGGGC CATTCTTGCT TAGACAGTCA GCATTTGTCT 100 CCTCCTTTAA CTGAGTCATC ATCTTAGTCC AACTAATGCA GTCGATACAA 150 TGCGTAGATA GAAGAAGCCC CACGGGAGCC AGGATGGGAC TGGTCGTGTT 200 TGTGCTTTTC TCCAAGTCAG CACCCAAAGG TCAATGCACA GAGACCCCGG 250 GTGGGTGAGC GCTGGCTTCT CAAACGGCCG AAGTTGCCTC TTTTAGGAAT 300 CTCTTTGGAA TTGGGAGCAC GATGACTCTG AGTTTGAGCT ATTAAAGTAC 350 TTCTTACAAA 360

【０１１８】配列番号：2 配列の長さ：2075 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（5'及び3'末端塩基配列を含むcD
NA） 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：骨芽細胞様細胞 直接の起源：完全鎖ＧＳ２４２２クローン 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：88 .. 1530 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：88 .. 168 特徴を決定した方法：E 配列： AGCTCGAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT CCTCTAGAGC CGGCCCTCGC 50 CCTGTCCGCC GCCACCGCCG CCGCCGCCAG AGTCGCC ATG CAG ATC 96 Met Gln Ile -25 CCG CGC GCC GCT CTT CTC CCG CTG CTG CTG CTG CTG CTG GCG 138 Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala -20 -15 GCG CCC GCC TCG GCG CAG CTG TCC CGG GCC GGC CGC TCG GCG 180 Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala -10 -5 1 CCT TTG GCC GCC GGG TGC CCA GAC CGC TGC GAG CCG GCG CGC 222 Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg 5 10 15 TGC CCG CCG CAG CCG GAG CAC TGC GAG GGC GGC CGG GCC CGG 264 Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg 20 25 30 GAC GCG TGC GGC TGC TGC GAG GTG TGC GGC GCG CCC GAG GGC 306 Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly 35 40 45 GCC GCG TGC GGC CTG CAG GAG GGC CCG TGC GGC GAG GGG CTG 348 Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu 50 55 60 CAG TGC GTG GTG CCC TTC GGG GTG CCA GCC TCG GCC ACG GTG 390 Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala Ser Ala Thr Val 65 70 CGG CGG CGC GCG CAG GCC GGC CTC TGT GTG TGC GCC AGC AGC 432 Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys Ala Ser Ser 75 80 85 GAG CCG GTG TGC GGC AGC GAC GCC AAC ACC TAC GCC AAC CTG 474 Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn Leu 90 95 100 TGC CAG CTG CGC GCC GCC AGC CGC CGC TCC GAG AGG CTG CAC 516 Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His 105 110 115 CGG CCG CCG GTC ATC GTC CTG CAG CGC GGA GCC TGC GGC CAA 558 Arg Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln 120 125 130 GGG CAG GAA GAT CCC AAC AGT TTG CGC CAT AAA TAT AAC TTT 600 Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe 135 140 ATC GCG GAC GTG GTG GAG AAG ATC GCC CCT GCC GTG GTT CAT 642 Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His 145 150 155 ATC GAA TTG TTT CGC AAG CTT CCG TTT TCT AAA CGA GAG GTG 684 Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val 160 165 170 CCG GTG GCT AGT GGG TCT GGG TTT ATT GTG TCG GAA GAT GGA 726 Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly 175 180 185 CTG ATC GTG ACA AAT GCC CAC GTG GTG ACC AAC AAG CAC CGG 768 Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn Lys His Arg 190 195 200 GTC AAA GTT GAG CTG AAG AAC GGT GCC ACT TAC GAA GCC AAA 810 Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala Lys 205 210 ATC AAG GAT GTG GAT GAG AAA GCA GAC ATC GCA CTC ATC AAA 852 Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys 215 220 225 ATT GAC CAC CAG GGC AAG CTG CCT GTC CTG CTG CTT GGC CGC 894 Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg 230 235 240 TCC TCA GAG CTG CGG CCG GGA GAG TTC GTG GTC GCC ATC GGA 936 Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly 245 250 255 AGC CCG TTT TCC CTT CAA AAC ACA GTC ACC ACC GGG ATC GTG 978 Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val 260 265 270 AGC ACC ACC CAG CGA GGC GGC AAA GAG CTG GGG CTC CGC AAC 1020 Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn 275 280 TCA GAC ATG GAC TAC ATC CAG ACC GAC GCC ATC ATC AAC TAT 1062 Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr 285 290 295 GGA AAC TCG GGA GGC CCG TTA GTA AAC CTG GAC GGT GAA GTG 1104 Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val 300 305 310 ATT GGA ATT AAC ACT TTG AAA GTG ACA GCT GGA ATC TCC TTT 1146 Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe 315 320 325 GCA ATC CCA TCT GAT AAG ATT AAA AAG TTC CTC ACG GAG TCC 1188 Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser 330 335 340 CAT GAC CGA CAG GCC AAA GGA AAA GCC ATC ACC AAG AAG AAG 1230 His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys 345 350 TAT ATT GGT ATC CGA ATG ATG TCA CTC ACG TCC AGC AAA GCC 1272 Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala 355 360 365 AAA GAG CTG AAG GAC CGG CAC CGG GAC TTC CCA GAC GTG ATC 1314 Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile 370 375 380 TCA GGA GCG TAT ATA ATT GAA GTA ATT CCT GAT ACC CCA GCA 1356 Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala 385 390 395 GAA GCT GGT GGT CTC AAG GAA AAC GAC GTC ATA ATC AGC ATC 1398 Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val Ile Ile Ser Ile 400 405 410 AAT GGA CAG TCC GTG GTC TCC GCC AAT GAT GTC AGC GAC GTC 1440 Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val Ser Asp Val 415 420 ATT AAA AGG GAA AGC ACC CTG AAC ATG GTG GTC CGC AGG GGT 1482 Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg Gly 425 430 435 AAT GAA GAT ATC ATG ATC ACA GTG ATT CCC GAA GAA ATT GAC 1524 Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp 440 445 450 CCA TAG GCAGAGGCAT GAGCTGGACT TCATGTTTCC CTCAAAGACT 1570 Pro CTCCCGTGGA TGACGGATGA GGACTCTGGG CTGCTGGAAT AGGACACTCA 1620 AGACTTTTGA CTGCCATTTT GTTTGTTCAG TGGAGACTCC CTGGCCAACA 1670 GAATCCTTCT TGATAGTTTG CAGGCAAAAC AAATGTAATG TTGCAGATCC 1720 GCAGGCAGAA GCTCTGCCCT TCTGTATCCT ATGTATGCAG TGTGCTTTTT 1770 CTTGCCAGCT TGGGCCATTC TTGCTTAGAC AGTCAGCATT TGTCTCCTCC 1820 TTTAACTGAG TCATCATCTT AGTCCAACTA ATGCAGTCGA TACAATGCGT 1870 AGATAGAAGA AGCCCCACGG GAGCCAGGAT GGGACTGGTC GTGTTTGTGC 1920 TTTTCTCCAA GTCAGCACCC AAAGGTCAAT GCACAGAGAC CCCGGGTGGG 1970 TGAGCGCTGG CTTCTCAAAC GGCCGAAGTT GCCTCTTTTA GGAATCTCTT 2020 TGGAATTGGG AGCACGATGA CTCTGAGTTT GAGCTATTAA AGTACTTCTT 2070 ACAAA 2075

【０１１９】配列番号：3 配列の長さ：1443 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：骨芽細胞様細胞 直接の起源：完全鎖ＧＳ２４２２クローン 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1 .. 1443 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1 .. 81 特徴を決定した方法：E 配列： ATG CAG ATC CCG CGC GCC GCT CTT CTC CCG CTG CTG CTG CTG 42 Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu -25 -20 -15 CTG CTG GCG GCG CCC GCC TCG GCG CAG CTG TCC CGG GCC GGC 84 Leu Leu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly -10 -5 1 CGC TCG GCG CCT TTG GCC GCC GGG TGC CCA GAC CGC TGC GAG 126 Arg Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu 5 10 15 CCG GCG CGC TGC CCG CCG CAG CCG GAG CAC TGC GAG GGC GGC 168 Pro Ala Arg Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly 20 25 CGG GCC CGG GAC GCG TGC GGC TGC TGC GAG GTG TGC GGC GCG 210 Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly Ala 30 35 40 CCC GAG GGC GCC GCG TGC GGC CTG CAG GAG GGC CCG TGC GGC 252 Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys Gly 45 50 55 GAG GGG CTG CAG TGC GTG GTG CCC TTC GGG GTG CCA GCC TCG 294 Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala Ser 60 65 70 GCC ACG GTG CGG CGG CGC GCG CAG GCC GGC CTC TGT GTG TGC 336 Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys 75 80 85 GCC AGC AGC GAG CCG GTG TGC GGC AGC GAC GCC AAC ACC TAC 378 Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr 90 95 GCC AAC CTG TGC CAG CTG CGC GCC GCC AGC CGC CGC TCC GAG 420 Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu 100 105 110 AGG CTG CAC CGG CCG CCG GTC ATC GTC CTG CAG CGC GGA GCC 462 Arg Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala 115 120 125 TGC GGC CAA GGG CAG GAA GAT CCC AAC AGT TTG CGC CAT AAA 504 Cys Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys 130 135 140 TAT AAC TTT ATC GCG GAC GTG GTG GAG AAG ATC GCC CCT GCC 546 Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala 145 150 155 GTG GTT CAT ATC GAA TTG TTT CGC AAG CTT CCG TTT TCT AAA 588 Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys 160 165 CGA GAG GTG CCG GTG GCT AGT GGG TCT GGG TTT ATT GTG TCG 630 Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser 170 175 180 GAA GAT GGA CTG ATC GTG ACA AAT GCC CAC GTG GTG ACC AAC 672 Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn 185 190 195 AAG CAC CGG GTC AAA GTT GAG CTG AAG AAC GGT GCC ACT TAC 714 Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr 200 205 210 GAA GCC AAA ATC AAG GAT GTG GAT GAG AAA GCA GAC ATC GCA 756 Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala 215 220 225 CTC ATC AAA ATT GAC CAC CAG GGC AAG CTG CCT GTC CTG CTG 798 Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu 230 235 CTT GGC CGC TCC TCA GAG CTG CGG CCG GGA GAG TTC GTG GTC 840 Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val 240 245 250 GCC ATC GGA AGC CCG TTT TCC CTT CAA AAC ACA GTC ACC ACC 882 Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr 255 260 265 GGG ATC GTG AGC ACC ACC CAG CGA GGC GGC AAA GAG CTG GGG 924 Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly 270 275 280 CTC CGC AAC TCA GAC ATG GAC TAC ATC CAG ACC GAC GCC ATC 966 Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile 285 290 295 ATC AAC TAT GGA AAC TCG GGA GGC CCG TTA GTA AAC CTG GAC 1008 Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp 300 305 GGT GAA GTG ATT GGA ATT AAC ACT TTG AAA GTG ACA GCT GGA 1050 Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly 310 315 320 ATC TCC TTT GCA ATC CCA TCT GAT AAG ATT AAA AAG TTC CTC 1092 Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu 325 330 335 ACG GAG TCC CAT GAC CGA CAG GCC AAA GGA AAA GCC ATC ACC 1134 Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr 340 345 350 AAG AAG AAG TAT ATT GGT ATC CGA ATG ATG TCA CTC ACG TCC 1176 Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser 355 360 365 AGC AAA GCC AAA GAG CTG AAG GAC CGG CAC CGG GAC TTC CCA 1218 Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro 370 375 GAC GTG ATC TCA GGA GCG TAT ATA ATT GAA GTA ATT CCT GAT 1260 Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp 380 385 390 ACC CCA GCA GAA GCT GGT GGT CTC AAG GAA AAC GAC GTC ATA 1302 Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val Ile 395 400 405 ATC AGC ATC AAT GGA CAG TCC GTG GTC TCC GCC AAT GAT GTC 1344 Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val 410 415 420 AGC GAC GTC ATT AAA AGG GAA AGC ACC CTG AAC ATG GTG GTC 1386 Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val 425 430 435 CGC AGG GGT AAT GAA GAT ATC ATG ATC ACA GTG ATT CCC GAA 1428 Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu 440 445 GAA ATT GAC CCA TAG 1443 Glu Ile Asp Pro 450

【０１２０】配列番号：4 配列の長さ：480 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu -25 -20 -15 Leu Leu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly -10 -5 1 Arg Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu 5 10 15 Pro Ala Arg Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly 20 25 Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly Ala 30 35 40 Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys Gly 45 50 55 Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala Ser 60 65 70 Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys 75 80 85 Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr 90 95 Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu 100 105 110 Arg Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala 115 120 125 Cys Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys 130 135 140 Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala 145 150 155 Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys 160 165 Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser 170 175 180 Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn 185 190 195 Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr 200 205 210 Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala 215 220 225 Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu 230 235 Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val 240 245 250 Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr 255 260 265 Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly 270 275 280 Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile 285 290 295 Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp 300 305 Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly 310 315 320 Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu 325 330 335 Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr 340 345 350 Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser 355 360 365 Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro 370 375 Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp 380 385 390 Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val Ile 395 400 405 Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val 410 415 420 Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val 425 430 435 Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu 440 445 Glu Ile Asp Pro 450

【０１２１】配列番号：5 配列の長さ：1362 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：骨芽細胞様細胞 直接の起源：完全鎖ＧＳ２４２２クローン 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1 .. 1362 特徴を決定した方法：E 配列： GGC CGC TCG GCG CCT TTG GCC GCC GGG TGC CCA GAC CGC TGC 42 Gly Arg Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys 1 5 10 GAG CCG GCG CGC TGC CCG CCG CAG CCG GAG CAC TGC GAG GGC 84 Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu Gly 15 20 25 GGC CGG GCC CGG GAC GCG TGC GGC TGC TGC GAG GTG TGC GGC 126 Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly 30 35 40 GCG CCC GAG GGC GCC GCG TGC GGC CTG CAG GAG GGC CCG TGC 168 Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys 45 50 55 GGC GAG GGG CTG CAG TGC GTG GTG CCC TTC GGG GTG CCA GCC 210 Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala 60 65 70 TCG GCC ACG GTG CGG CGG CGC GCG CAG GCC GGC CTC TGT GTG 252 Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val 75 80 TGC GCC AGC AGC GAG CCG GTG TGC GGC AGC GAC GCC AAC ACC 294 Cys Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr 85 90 95 TAC GCC AAC CTG TGC CAG CTG CGC GCC GCC AGC CGC CGC TCC 336 Tyr Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser 100 105 110 GAG AGG CTG CAC CGG CCG CCG GTC ATC GTC CTG CAG CGC GGA 378 Glu Arg Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly 115 120 125 GCC TGC GGC CAA GGG CAG GAA GAT CCC AAC AGT TTG CGC CAT 420 Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg His 130 135 140 AAA TAT AAC TTT ATC GCG GAC GTG GTG GAG AAG ATC GCC CCT 462 Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro 145 150 GCC GTG GTT CAT ATC GAA TTG TTT CGC AAG CTT CCG TTT TCT 504 Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser 155 160 165 AAA CGA GAG GTG CCG GTG GCT AGT GGG TCT GGG TTT ATT GTG 546 Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val 170 175 180 TCG GAA GAT GGA CTG ATC GTG ACA AAT GCC CAC GTG GTG ACC 588 Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr 185 190 195 AAC AAG CAC CGG GTC AAA GTT GAG CTG AAG AAC GGT GCC ACT 630 Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr 200 205 210 TAC GAA GCC AAA ATC AAG GAT GTG GAT GAG AAA GCA GAC ATC 672 Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile 215 220 GCA CTC ATC AAA ATT GAC CAC CAG GGC AAG CTG CCT GTC CTG 714 Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu 225 230 235 CTG CTT GGC CGC TCC TCA GAG CTG CGG CCG GGA GAG TTC GTG 756 Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val 240 245 250 GTC GCC ATC GGA AGC CCG TTT TCC CTT CAA AAC ACA GTC ACC 798 Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr 255 260 265 ACC GGG ATC GTG AGC ACC ACC CAG CGA GGC GGC AAA GAG CTG 840 Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu 270 275 280 GGG CTC CGC AAC TCA GAC ATG GAC TAC ATC CAG ACC GAC GCC 882 Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala 285 290 ATC ATC AAC TAT GGA AAC TCG GGA GGC CCG TTA GTA AAC CTG 924 Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu 295 300 305 GAC GGT GAA GTG ATT GGA ATT AAC ACT TTG AAA GTG ACA GCT 966 Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala 310 315 320 GGA ATC TCC TTT GCA ATC CCA TCT GAT AAG ATT AAA AAG TTC 1008 Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe 325 330 335 CTC ACG GAG TCC CAT GAC CGA CAG GCC AAA GGA AAA GCC ATC 1050 Leu Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile 340 345 350 ACC AAG AAG AAG TAT ATT GGT ATC CGA ATG ATG TCA CTC ACG 1092 Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr 355 360 TCC AGC AAA GCC AAA GAG CTG AAG GAC CGG CAC CGG GAC TTC 1134 Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe 365 370 375 CCA GAC GTG ATC TCA GGA GCG TAT ATA ATT GAA GTA ATT CCT 1176 Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro 380 385 390 GAT ACC CCA GCA GAA GCT GGT GGT CTC AAG GAA AAC GAC GTC 1218 Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val 395 400 405 ATA ATC AGC ATC AAT GGA CAG TCC GTG GTC TCC GCC AAT GAT 1260 Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp 410 415 420 GTC AGC GAC GTC ATT AAA AGG GAA AGC ACC CTG AAC ATG GTG 1302 Val Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val 425 430 GTC CGC AGG GGT AAT GAA GAT ATC ATG ATC ACA GTG ATT CCC 1344 Val Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro 435 440 445 GAA GAA ATT GAC CCA TAG 1362 Glu Glu Ile Asp Pro 450

【０１２２】配列番号：6 配列の長さ：453 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Arg Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys 1 5 10 Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu Gly 15 20 25 Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly 30 35 40 Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys 45 50 55 Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala 60 65 70 Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val 75 80 Cys Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr 85 90 95 Tyr Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser 100 105 110 Glu Arg Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly 115 120 125 Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg His 130 135 140 Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro 145 150 Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser 155 160 165 Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val 170 175 180 Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr 185 190 195 Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr 200 205 210 Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile 215 220 Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu 225 230 235 Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val 240 245 250 Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr 255 260 265 Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu 270 275 280 Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala 285 290 Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu 295 300 305 Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala 310 315 320 Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe 325 330 335 Leu Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile 340 345 350 Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr 355 360 Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe 365 370 375 Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro 380 385 390 Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val 395 400 405 Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp 410 415 420 Val Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val 425 430 Val Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro 435 440 445 Glu Glu Ile Asp Pro 450

【０１２３】

【図面の簡単な説明】

【図１】変形性関節患者由来の骨から取得した骨芽細胞
様細胞の形態を示す顕微鏡写真。

【図２】免疫染色試験による骨芽細胞様細胞の抗オステ
オカルシン（ＢＧＰ）モノクローナル抗体に対する反応
性を示す顕微鏡写真。写真左側は、抗ＢＧＰモノクロー
ナル抗体（ＩｇＧ１）に対する反応性を、また写真右側
はコントロールＩｇＧ１モノクローナル抗体に対する反
応性を示す。

【図３】免疫染色試験による骨芽細胞様細胞の抗アルカ
リフォスファターゼ（ＡＬＰ）モノクローナル抗体に対
する反応性を示す顕微鏡写真。写真左側は、抗ＡＬＰモ
ノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）に対する反応性を、ま
た写真右側はコントロールＩｇＧ２ａモノクローナル抗
体に対する反応性を示す。

【図４】ＡＬＰ活性染色試験による骨芽細胞様細胞の抗
ＡＬＰモノクローナル抗体に対する反応性を示す顕微鏡
写真。

【図５】骨芽細胞様細胞完全鎖ｃＤＮＡライブラリーか
ら選択したＧＳ２４２２の完全鎖ｃＤＮＡを含むクロー
ンのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡの泳動状態を
示す写真。写真上段は制限酵素による切断前のプラスミ
ドＤＮＡの泳動状態を、写真中段はＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄIIIによる切断後のＤＮＡ断片の泳動状態を、及び
写真下段はＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＨｉｎｃIIに
よる切断後のＤＮＡ断片の泳動状態を示す。なお、写真
中の番号はクローン番号を示す。

【図６】ＧＳ２４２２クローンから得た３’末端ＤＮＡ
をプローブとして用いたサザーンブロッティングにより
骨芽細胞様細胞完全鎖ｃＤＮＡライブラリーから選択し
た完全鎖ｃＤＮＡを含むクローンのオートラジオグラフ
ィーによるＤＮＡの泳動状態を示す写真。写真上段は制
限酵素による切断前のプラスミドＤＮＡの泳動状態を、
写真中段はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIによる切断後の
ＤＮＡ断片の泳動状態を、及び写真下段はＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄIII及びＨｉｎｃIIによる切断後のＤＮＡ断片
の泳動状態を示す。なお、写真中の番号はクローン番号
を示す。

【図７】ＧＳ２４２２タンパクとＩＧＦＢＰとがアミノ
酸配列相同性を示す領域のアミノ酸配列を示す図。＊印
は、ＧＳ２４２２タンパクと各々のＩＧＦＢＰのアミノ
酸が一致していることを示す。

【図８】ＧＳ２４２２タンパクとエラスターゼインヒビ
ターとがアミノ酸配列相同性を示す領域のアミノ酸配列
を示す図。＊印は、ＧＳ２４２２タンパクと各々のエラ
スターゼインヒビターのアミノ酸が一致していることを
示す。

【図９】プラスミドｐＴＳ５３１の制限酵素地図を示す
図。

【図１０】プラスミドｐＴＳ５３１を大腸菌で発現させ
て得た精製度の異なるタンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る泳動状態を示す写真。レーン１はマーカータンパクの
泳動状態を、レーン２は大腸菌により発現された全タン
パクの泳動状態を、レーン３はアフィニティーカラムク
ロマトグラフィーにより精製して得たＭＢＰ／ＧＳ２４
２２融合タンパクの泳動状態を、及びレー４はをゲル濾
過クロマトグラフィーにより精製して得たＭＢＰ／ＧＳ
２４２２融合タンパクの泳動状態を示す。なお、レーン
１のマーカータンパクの分子量は、各々上から１１２ｋ
Ｄａ、８４ｋＤａ、５３．２ｋＤａ、３４．９ｋＤａ、
２８．７ｋＤａ、及び２０．７ｋＤａを示す。

【図１１】抗ＭＢＰ血清を用いたウェスタンブロッティ
ング解析における、プラスミドｐＴＳ５３１を大腸菌で
発現させて得た精製度の異なるタンパクの抗ＭＢＰ血清
に対する反応性を示す電気泳動パターンを示す写真。レ
ーン１はマーカータンパクを、レーン２は大腸菌により
発現された全タンパクの反応性を、レーン３はアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーにより精製して得たＭ
ＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの反応性を、及びレー
ン４はをゲル濾過クロマトグラフィーにより精製して得
たＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの反応性を示す。
なお、レーン１のマーカータンパクの分子量は、各々上
から１１２ｋＤａ、８４ｋＤａ、５３．２ｋＤａ、３
４．９ｋＤａ、２８．７ｋＤａ、及び２０．７ｋＤａを
示す。

【図１２】ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製して
得たＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクをファクターＸ
ａで処理して得たタンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳
動状態を示す写真。レーン１はマーカータンパクの泳動
状態を、レーン２はＸａ処理前のＭＢＰ／ＧＳ２４２２
融合タンパクの泳動状態を、レーン３はＸａで処理して
得たタンパク（ＭＢＰ及びＧＳ２４２２）の泳動状態
を、及びレーン４はＸａで処理して得たタンパク（ＭＢ
Ｐ及びＧＳ２４２２）からＭＢＰを除去した後のＧＳ２
４２２タンパクの泳動状態を示す。なお、レーン１のマ
ーカータンパクの分子量は、各々上から１１２ｋＤａ、
８４ｋＤａ、５３．２ｋＤａ、３４．９ｋＤａ、２８．
７ｋＤａ、及び２０．７ｋＤａを示す。

【図１３】抗ＭＢＰ血清を用いたウェスタンブロッティ
ング解析における、ゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製して得たＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクをファ
クターＸａで処理して得たタンパクの抗ＭＢＰ血清に対
する反応性を示す電気泳動パターンを示す写真。レーン
１はマーカータンパクを、レーン２はＸａで処理して得
たタンパク（ＭＢＰ及びＧＳ２４２２）の反応性を、及
びレーン３はＸａで処理して得たタンパク（ＭＢＰ及び
ＧＳ２４２２）からＭＢＰを除去した後のＧＳ２４２２
タンパクの反応性を示す。なお、レーン１のマーカータ
ンパクの分子量は、各々上から１１２ｋＤａ、８４ｋＤ
ａ、５３．２ｋＤａ、３４．９ｋＤａ、２８．７ｋＤ
ａ、及び２０．７ｋＤａを示す。

【図１４】抗ＧＳ２４２２血清を用いたウェスタンブロ
ッティング解析における、ＧＳ２４２２の抗ＧＳ２４２
２血清に対する反応性を示す電気泳動パターンを示す写
真。レーン１はマーカータンパクを、レーン２は大腸菌
により発現された全タンパクの反応性を、レーン３はア
フィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製して
得たＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの反応性を、及
びレーン４はをゲル濾過クロマトグラフィーにより精製
して得たＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの反応性を
示す。なお、レーン１のマーカータンパクの分子量は、
各々上から１１２ｋＤａ、８４ｋＤａ、５３．２ｋＤ
ａ、３４．９ｋＤａ、２８．７ｋＤａ、及び２０．７ｋ
Ｄａを示す。

【図１５】抗ＧＳ２４２２血清を用いたウェスタンブロ
ッティング解析における、ＧＳ２４２２の抗ＧＳ２４２
２血清に対する反応性を示す電気泳動パターンを示す写
真。レーン１はマーカータンパクを、レーン２はＸａ処
理前のＭＢＰ／ＧＳ２４２２融合タンパクの反応性を、
レーン３はＸａで処理して得たタンパク（ＭＢＰ及びＧ
Ｓ２４２２）の反応性を、及びレーン４はＸａで処理し
て得たタンパク（ＭＢＰ及びＧＳ２４２２）からＭＢＰ
を除去した後のＧＳ２４２２タンパクの反応性を示す。
なお、レーン１のマーカータンパクの分子量は、各々上
から１１２ｋＤａ、８４ｋＤａ、５３．２ｋＤａ、３
４．９ｋＤａ、２８．７ｋＤａ、及び２０．７ｋＤａを
示す。

【図１６】プラスミドｐＴＳ５３３の制限酵素地図を示
す図。

【図１７】プラスミドｐＴＳ５３３をＣＯＳ７で発現さ
せて得たＧＳ２４２２タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る泳動状態を示す写真。レーン１は標品ＭＢＰ（還元
下）の泳動状態を、レーン２はｐＭＥ１８Ｓによる形質
転換細胞を培養して得た培養上清（還元下）の泳動状態
を、レーン３はＧＳ２４２２をコードするＤＮＡが挿入
されていないｐＭＥ１８Ｓによる形質転換細胞を培養し
て得た細胞のＳＤＳ化細胞（還元下）の泳動状態を、レ
ーン４及びレーン９はマーカータンパクの泳動状態を、
レーン５はｐＴＳ５３３による形質転換細胞を培養して
得た培養上清（還元下）の泳動状態を、レーン６はｐＴ
Ｓ５３３による形質転換細胞を培養して得た細胞のＳＤ
Ｓ化細胞（還元下）の泳動状態を、レーン７はｐＴＳ５
３３による形質転換細胞を培養して得た培養上清（非還
元下）の泳動状態を、レーン８はｐＴＳ５３３による形
質転換細胞を培養して得た細胞のＳＤＳ化細胞（非還元
下）の泳動状態を示す。

【図１８】抗ＧＳ２４２２血清を用いたウェスタンブロ
ッティング解析における、プラスミドｐＴＳ５３３をＣ
ＯＳ７で発現させて得たＧＳ２４２２タンパクの抗ＧＳ
２４２２血清に対する反応性を示す電気泳動パターンを
示す写真。レーン１は標品ＭＢＰ（還元下）の反応性
を、レーン２はｐＭＥ１８Ｓによる形質転換細胞を培養
して得た培養上清（還元下）の反応性を、レーン３はＧ
Ｓ２４２２をコードするＤＮＡが挿入されていないｐＭ
Ｅ１８Ｓによる形質転換細胞を培養して得た細胞のＳＤ
Ｓ化細胞（還元下）の反応性を、レーン４及びレーン９
ハマーカータンパクを、レーン５はｐＴＳ５３３による
形質転換細胞を培養して得た培養上清（還元下）の反応
性を、レーン６はｐＴＳ５３３による形質転換細胞を培
養して得た細胞のＳＤＳ化細胞（還元下）の反応性を、
レーン７はｐＴＳ５３３による形質転換細胞を培養して
得た培養上清（非還元下）の反応性を、レーン８はｐＴ
Ｓ５３３による形質転換細胞を培養して得た細胞のＳＤ
Ｓ化細胞（非還元下）の反応性を示す。

【図１９】トリプシン処理により断片化したＧＳ２４２
２精製標品の逆相クロマトグラフィーによるクロマトグ
ラムを示す図。ピークＡはペプチド断片（ＩＫＤＶＤＥ
Ｋ）に、ピークＢはペプチド断片（ＦＬＴＥＳＨＤＲ）
に、ピークＣはペプチド断片（ＫＬＰＦＳＫＲ及びＶＫ
ＶＥＬＫ）に、並びにピークＤはペプチド断片（ＡＱＡ
ＧＬＣＶＣＡＳＳＥＰＶＣＧＳＤＡＮＴＹＡＮＬＣＱＬ
Ｒ）に相応する。

【図２０】ＧＳ２４２２をコードするＤＮＡに対するｍ
ＲＮＡの各種ヒト臓器での発現量を示す図。

【図２１】ＢＳＡに対するＧＳ２４２２タンパクの蛋白
分解酵素活性測定試験における、ＢＳＡのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる泳動状態を示す写真。レーン１及びレーン８
はマーカータンパクを、レーン２乃至４はＧＳ２４２２
をコードするＤＮＡが挿入されていないｐＭＥ１８Ｓに
よる形質転換細胞を培養して得た培養上清とＢＳＡを、
各々０時間、５時間及び２０時間酵素反応させた場合の
ＢＳＡの泳動状態を、並びにレーン５乃至７はｐＴＳ５
３３による形質転換細胞を培養して得た培養上清とＢＳ
Ａを、各々０時間、５時間及び２０時間酵素反応させた
場合のＢＳＡの泳動状態を示す。なお、レーン１のマー
カータンパクの分子量は、各々上から１９９．０ｋＤ
ａ、１２０．０ｋＤａ、８７．０ｋＤａ及び４８．１ｋ
Ｄａを示す。レーン８のマーカータンパクの分子量は、
各々上から１１２．０ｋＤａ、８４．０ｋＤａ、５３．
０ｋＤａ、３４．９ｋＤａ、２８．５ｋＤａ及び２０．
８ｋＤａを示す。

【図２２】βカゼインに対するＧＳ２４２２タンパクの
蛋白分解酵素活性測定試験における、βカゼインのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる泳動状態を示す写真。レーン１及び
レーン８はマーカータンパクを、レーン２乃至４はＧＳ
２４２２をコードするＤＮＡが挿入されていないｐＭＥ
１８Ｓによる形質転換細胞を培養して得た培養上清とβ
カゼインを、各々０時間、５時間及び２０時間酵素反応
させた場合のβカゼインの泳動状態を、及びレーン５乃
至７はｐＴＳ５３３による形質転換細胞を培養して得た
培養上清とβカゼインを、各々０時間、５時間及び２０
時間酵素反応させた場合のβカゼインの泳動状態を示
す。なお、レーン１のマーカータンパクの分子量は、各
々上から１９９．０ｋＤａ、１２０．０ｋＤａ、８７．
０ｋＤａ及び４８．１ｋＤａを示す。レーン８のマーカ
ータンパクの分子量は、各々上から１１２．０ｋＤａ、
８４．０ｋＤａ、５３．０ｋＤａ、３４．９ｋＤａ、２
８．５ｋＤａ及び２０．８ｋＤａを示す。

【図２３】βカゼインに対するＧＳ２４２２タンパクの
蛋白分解酵素活性の各種セリンプロテアーゼ阻害剤によ
る阻害試験における、βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる泳動状態を示す写真。レーン１はマーカータンパク
を、レーン２は阻害剤で未処理の場合の泳動状態を、レ
ーン３はＤＦＰ（１ｍＭ）で処理した場合の泳動状態
を、レーン４はＰＭＳＦ（１ｍＭ）で処理した場合の泳
動状態を、レーン５はＴＰＣＫ（１ｍＭ）で処理した場
合の泳動状態を、レーン６はＴＬＣＫ（１ｍＭ）で処理
した場合の泳動状態を、レーン７はロイペプチン（０．
１ｍＭ）で処理した場合の泳動状態を、レーン８はＥＤ
ＴＡ（１ｍＭ）で処理した場合の泳動状態を、及びレー
ン９はヨードアセタミド（１ｍＭ）で処理した場合の泳
動状態を示す。なお、レーン１のマーカータンパクの分
子量は、各々上から１１２．０ｋＤａ、８４．０ｋＤ
ａ、５３．０ｋＤａ、３４．９ｋＤａ、２８．５ｋＤａ
及び２０．８ｋＤａを示す。

【図２４】ＧＳ２４２２タンパクと大腸菌由来セリンプ
ロテアーゼであるｈｔｒＡ及びＤｏとのアミノ酸配列相
同性を示す図。枠で囲われたアミノ酸は、ＧＳ２４２２
タンパクとｈｔｒＡタンパク及びＤｏタンパクのアミノ
酸が一致していることを示す。

【図２５】ＧＳ２４２２タンパクと大腸菌由来セリンプ
ロテアーゼであるｈｔｒＡ及びＤｏとのアミノ酸配列相
同性を示す図。枠で囲まれたアミノ酸は、ＧＳ２４２２
タンパクとｈｔｒＡタンパク及びＤｏタンパクのアミノ
酸が一致していることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 21/08 ＡＥＤＤ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ ＡＥＤ 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 丹羽 靖 大阪府高槻市紫町１番１号 日本たばこ産 業株式会社医薬総合研究所内 (72)発明者 佐藤 俊宏 大阪府高槻市紫町１番１号 日本たばこ産 業株式会社医薬総合研究所内

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号２に記載される塩基配列
   を有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表配列番号４に記載されるアミノ酸
   配列を実質的にコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表配列番号３に記載される塩基配列
   を有するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表配列番号６に記載されるアミノ酸
   配列を実質的にコードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表配列番号５に記載される塩基配列
   を有するＤＮＡ。
6. 【請求項６】 実質的に配列表配列番号４に記載される
   アミノ酸配列を有するタンパク。
7. 【請求項７】 実質的に配列表配列番号６に記載される
   アミノ酸配列を有するタンパク。
8. 【請求項８】 請求項１乃至請求項５記載のＤＮＡを含
   む発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項３または請求項５記載のＤＮＡを
   含む請求項８記載の発現ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項８または請求項９記載の発現ベ
    クターで形質転換された形質転換細胞。
11. 【請求項１１】 形質転換細胞が、国際寄託番号ＦＥＲ
    Ｍ ＢＰ−５１９６で識別される細胞株であることを特
    徴とする請求項１０記載の形質転換細胞。
12. 【請求項１２】 請求項６または請求項７記載のタンパ
    クまたはそのフラグメントに反応性を有する抗体または
    抗体の一部。
13. 【請求項１３】 抗体が、モノクローナル抗体であるこ
    とを特徴とする請求項１２記載の抗体または抗体の一
    部。
14. 【請求項１４】 請求項１０または請求項１１記載の形
    質転換細胞を培地中で培養し、培養上清中に生成された
    タンパクを取得することを特徴とする請求項６または請
    求項７記載のタンパクの製造方法。
15. 【請求項１５】 請求項６または請求項７記載のタンパ
    クまたはそのフラグメント及び薬学的に許容され得る担
    体を含んでなる医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１２または請求項１３記載の抗
    体または抗体の一部及び薬学的に許容され得る担体を含
    んでなる医薬組成物。