JPH09107997A - 標的核酸の増幅方法及び増幅キット並びにｐｃｒ用組成物 - Google Patents

標的核酸の増幅方法及び増幅キット並びにｐｃｒ用組成物

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JPH09107997A
JPH09107997A JP8125929A JP12592996A JPH09107997A JP H09107997 A JPH09107997 A JP H09107997A JP 8125929 A JP8125929 A JP 8125929A JP 12592996 A JP12592996 A JP 12592996A JP H09107997 A JPH09107997 A JP H09107997A
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David Robert Patterson
ロバート パターソン デビッド
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＰＣＲの増幅効率を高めること。 【解決手段】 標的核酸を含むと思われる試料に、前記
標的核酸の領域に対してこれにハイブリダイズするに十
分な相補性を示す少なくとも２種の、各々が少なくとも
一つのホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレ
オチドプライマーと、少なくとも４種のヌクレオシドト
リホスフェートと、耐熱性重合剤と、エキソヌクレアー
ゼとを接触させて反応混合物を形成させる工程、前記反
応混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼを不活化さ
せる工程、及びプライマー伸長生成物を形成させる工程
を含む標的核酸の増幅方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によって少量の標的核酸の増幅、検出が可能にな
る。実際にＰＣＲを制限するものとして、前の反応から
同伴(carryover) されてくる核酸の増幅による汚染が偽
陽性の結果をもたらすことや、プライマーのダイマーな
どその他の非特異的生成物の生成、増幅が偽陰性の結果
をもたらすことが挙げられる。本発明は、エキソヌクレ
アーゼの存在下でホスホロチオエート化プライマーを使
用し、前増幅断種(preamplification sterilization)を
行うＰＣＲ法を提供することによって、これらの制限を
克服するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲの技術によって、微量の標的核酸
を増幅した後に検出することができる。ＰＣＲの詳細に
ついては、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号
（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕ
ｌｌｉｓ）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉ
ｓら）の記載をはじめとし、当該技術分野では周知であ
る。一般に、標的核酸の変性鎖にオリゴヌクレオチドプ
ライマーをアニールし、ポリメラーゼによってデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェートを重合させてプライマー
伸長生成物を形成させる。典型的なＰＣＲ法では、鋳型
核酸を変性させ、プライマーをアニーリングし、そして
そのアニール後のプライマーを耐熱性ポリメラーゼの作
用により伸長させるサイクルを繰り返す。この方法によ
り、標的核酸は指数的に増幅することになり、試料中に
極微量で存在する標的の検出が可能になる。
【０００３】ＰＣＲ法は、生物工学研究、臨床診断及び
法律をはじめとする様々な分野において広く用いられて
いる。しかしながら、この方法論は、最適とはならない
効率及び特異性をもたらす実際上の制限を免れることが
できない。具体的には、ＰＣＲ実験の最初のサイクルが
開始される前に（すなわち、「零サイクル」におい
て）、増幅用試薬を室温以下で混合して保存しておくこ
とが典型的である。耐熱性ポリメラーゼ、例えばサーマ
ス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）
ポリメラーゼは、０℃においても活性が残存しているた
め、ストリンジェンシー(stringency)の低いプライミン
グ及び伸長によって比較的多量の非特異的産物が生成し
うる。この非特異的産物は、零サイクルアーチファクト
として知られているが、３’末端に相同性を有するプラ
イマーの結合によって形成されるプライマー−ダイマー
（二量体）を含む。往々にして極微量である標的濃度に
対し、ＰＣＲで用いられるプライマーの濃度はマイクロ
モルレベルにあるため、プライマー−ダイマーの生成が
優勢となる。このため、プライマー−ダイマーは特に一
般的な零サイクルアーチファクトである。他のプライマ
ー系増幅法、例えば、固相増幅法でも、同様にプライマ
ー−ダイマーアーチファクトの問題がある。
【０００４】増幅の際の零サイクルアーチファクトの形
成は実際上重要な問題である。プライマーやデオキシリ
ボヌクレオシドをはじめとする試薬は消耗する恐れがあ
り、また非特異的副産物は、ポリメラーゼの標的やその
他反応の限定成分に対して競争的インヒビターとして作
用する。その結果、増幅効率は低下し、またアッセイの
精度も低下する場合がある。同様に、先に増幅された試
料からの同伴によるプライマー−ダイマーの存在もまた
有害である。増幅効率の低下はアッセイの検出限界に悪
影響を及ぼし、潜在的に偽陰性の結果をもたらす恐れが
ある。本発明により例示されるように、プライマー−ダ
イマーの形成によって、標的増幅の効率が、着色ゲル上
で増幅生成物が検出できなくなるほど低下する場合もあ
る。このような結果は、ＨＩＶのような病原性生物の検
査には明らかに望ましくないものである。
【０００５】均一系のＰＣＲ反応では特異性が特に重要
である。例えば、欧州特許出願公開第４８７２１８号
（Ｍｉｔｏｍａ）及び同第５１２３３４号（Ｈｉｇｕｃ
ｈｉ）を参照されたい。均一系アッセイでは、増幅中又
は増幅後の反応混合物を、二本鎖核酸との反応により検
出可能な蛍光変化を起こす蛍光顔料と接触させることに
より、ＰＣＲの増幅と検出が組み合わせられる。例え
ば、ＰＣＲをエチジウムブロミドの存在下で実施する場
合、二本鎖ＤＮＡの生成量は、遊離のエチジウムブロミ
ドが二本鎖ＤＮＡに挿入されるにつれ増加する蛍光量と
相関する。一般に、増幅工程と検出工程は同一容器の中
で行われる。蛍光変化は分光測定法で検出されるので、
検出にはＰＣＲ生成物の分離もハイブリダイゼーション
も必要がない。検出は、一般に二本鎖ＤＮＡの形成に基
づき、また標的ＤＮＡと非特異的産物を区別することが
できないため、プライマー−ダイマーのような二本鎖ア
ーチファクトの形成は、均一系アッセイの特異性にとっ
て致命的な問題である。
【０００６】ＰＣＲにおける実際上重要な別の制限は、
実験室環境内に存在する外因性ＤＮＡによる汚染又は先
に増幅されたＤＮＡ（アンプリコン）の同伴による汚染
が、後の増幅において鋳型として作用しうることであ
る。アンプリコン(amplicon)の同伴は一般に偽陽性の結
果をもたらし、またプライマー−ダイマーの同伴は偽陰
性の結果をもたらす。
【０００７】これらの制限を克服し、ＰＣＲの特異性及
び効率を高めるための方法がいろいろと開発されてい
る。理論的には、３’−相同性を含まないプライマーを
選ぶことによってプライマー−ダイマーによるアーチフ
ァクトは回避することができる。しかし実際には、特に
プライマーの混合物を必要とする用途では、多少の３’
−相同性は避けられないことがある。標的対象の複数種
の菌株又はアレルを同時増幅する場合は、多数のプライ
マーを必要とする典型的な用途である。
【０００８】特異性は、ストリンジェンシーを増大する
ことによっても、例えば、アニーリング温度を高くする
又は変性溶剤を含有させることによっても改良すること
ができる。しかしながら、ストリンジェンシーの増大
は、比較的低いストリンジェンシーで増幅された恐れの
ある標的の突然変異形を検出することができるアッセイ
の能力が低下するので、偽陰性の結果をもたらす場合が
ある。
【０００９】零サイクルアーチファクトを減少させる別
の方法、いわゆる「ホットスタート法」は、ポリメラー
ゼを高温の試薬混合物へ添加することによって反応を開
始させるものである。〔例えば、ＥｒｌｉｃｈらのＳｃ
ｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３（１９９１）を参照され
たい。〕プライマーの交差反応によって生じる反応性中
間体は熱的に不安定であるため、プライマー−ダイマー
が減少する。しかしながら、この方法では、便利な室温
で調製することができず、またポリメラーゼを多数（典
型的には９６本）のＰＣＲ用チューブに手作業で添加す
ることによる時間的誤差が原因で複雑にならざるをえな
い。さらにまた、「ホットスタート法」は、酵素添加の
際にチューブを開放しなければならないため、アンプリ
コン及び／又はプライマー−ダイマーによる同伴汚染の
可能性が増大することになる。
【００１０】ストリンジェンシーの高いプライミングに
適した温度に達するまで、一種以上のＰＣＲ成分を他の
成分から物理的に分離しておくために、パラフィンビー
ズやオーバーレイなどの熱的に不安定な物理的遮蔽物が
用いられている〔例えば、Ｈｅｂｅｒｔら、（１９９
３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ＣｅｌｌｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ、７：２４９を参照されたい〕。しかしなが
ら、これらの方法は一般に不便であり、また手先の器用
さがかなり必要である。
【００１１】零サイクルアーチファクトを抑制するため
に、Ｔａｑポリメラーゼに対する熱的に不安定な抗体を
使用して低温におけるＴａｑポリメラーゼを阻害する方
法がある。〔例えば、Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９４年、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：５０６；米国特
許第５，３３８，６７１号明細書（Ｓｃａｌｉｃｅら）
を参照されたい。〕ＰＣＲの熱サイクルにおいて温度を
上昇させた時に、該抗体は熱変性を受けて、活性なポリ
メラーゼが解放される。しかしながら、アビッド(avid)
な抗体であってもポリメラーゼ活性を完全に阻害するこ
とはない。例えば、１００μｌの体積中１０ナノモルの
濃度にあるポリメラーゼに対して作用する親和力が１０
10Ｍ-1である１マイクロモルの抗体は、平衡状態におい
て６千万個の活性ポリメラーゼ分子を遊離させるであろ
う。ＰＣＲに用いられるプライマー量は比較的多量であ
るため、依然として相当数のプライマー−ダイマー中間
体が形成されて増幅される恐れがある。
【００１２】アンプリコンの同伴を最小限に抑えるため
に各種の前増幅断種法が開発されている。酵素ウラシル
−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を前増幅工程で使用
し、零サイクル中に生じた産物を内部のウラシル残基で
切断する方法もある。〔例えば、Ｌｏｎｇｏら、１９９
０年、Ｇｅｎｅ ９３：１２５；Ｅｓｐｙら、１９９３
年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２３６
１を参照されたい〕ＰＣＲにおいてデオキシチミジント
リホスフェート（ｄＴＴＰ）の代わりにデオキシウリジ
ントリホスフェート（ｄＵＴＰ）を使用すると、ＰＣＲ
生成物を鋳型ＤＮＡと区別することができる。その予備
混合物に酵素ＵＮＧを含めると、第一回目のＰＣＲサイ
クルの前に反応系に存在する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡか
らのウラシルの切除が触媒される。その結果生じた非塩
基性(abasic)ポリヌクレオチドは加水分解を受けやす
く、ＰＣＲの際に鋳型として機能することができない。
ＵＮＧは熱変性により不活化されると報告されている
が、残存活性によって、ＰＣＲで合成された増幅生成物
が切断されることがある。さらに、Ｌｏｎｇｏらは、Ｕ
ＮＧ処理の有無で増幅生成物の相対量を比較し、ＵＮＧ
処理を含む反応で増幅した標的の強度が低下したことを
報告している。このように、ＵＮＧ処理では、生成物の
増幅効率の問題を解決することは期待できないであろ
う。さらに、塩基対１００個未満のアプリコン（例え
ば、プライマー−ダイマー）を攻撃する上で、ＵＮＧは
非効率的であると報告されている（Ｅｐｓｙら）。
【００１３】エキソヌクレアーゼによる前増幅断種につ
いても報告されている。Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒら（１９
９２）、Ｇｅｎｅ、１１７：１０７に、ファージＴ７エ
キソヌクレアーゼはＰＣＲ同伴産物分子を不活化するこ
とができるが、報告によるとゲノムのＤＮＡ標的は損な
われないことが記載されている。汚染性のアンプリコン
は、ゲノム標的分子に対する幾何学的対称性によって優
先的に不活化されると報告されている。Ｚｈｕら（１９
９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：
２５１に、アンプリコン及びプライマー−ダイマーの同
伴を減少させるために予備ＰＣＲ断種としてエキソヌク
レアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ ＩＩＩ）を使用することが記
載されている。Ｅｘｏ ＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの３’
ヒドロキシル末端から５’−モノヌクレオチドを逐次切
断する反応を触媒し、さらにゲノムＤＮＡはそのフラン
キングＤＮＡ配列の長さによって大部分が損なわれずに
残ると報告されている。
【００１４】前増幅断種にＥｘｏ ＩＩＩのようなエキ
ソヌクレアーゼを使用する方法は、該エキソヌクレアー
ゼが二本鎖ＤＮＡに対して特異的であるとの報告に基づ
いている。Ｅｘｏ ＩＩＩについて具体的に言えば、従
来技術ではＥｘｏ ＩＩＩは一本鎖標的ＤＮＡを切断し
ないことが明らかである。例えば、Ｚｈｕら、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃａｔａｌｏｇ，１９９４，１３６を参照され
たい。エキソヌクレアーゼに一本鎖プライマーを切断す
る活性がいくらかでもあれば、増幅効率は低下し、そし
て偽陰性の結果をもたらす可能性が増大する。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明によると、Ｚｈ
ｕらが記載したＥｘｏ ＩＩＩのようなエキソヌクレア
ーゼを用いて前増幅断種を行うと、低濃度のゲノム標的
からの信号が低減することが発見された。信号が低減さ
れた結果、特に疾病の診断では偽陰性の結果をもたらす
可能性が高くなり、重大な意味が付随することになる。
標的信号の低減は特にゲノム標的の切断が原因とされて
いる。本発明によると、増幅効率の低下の原因が、Ｅｘ
ｏ ＩＩＩの二本鎖特異性に関する従来技術の教示とは
反対に、一本鎖プライマーの切断にあることが発見され
た。このため、本発明は、従来認識されていなかった問
題を明らかにし、さらにその問題の解決策を提供するこ
とで、ＰＣＲの効率を高めることを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的核酸を含
むと思われる試料に、前記標的核酸の領域に対してこれ
にハイブリダイズするに十分な相補性を示す少なくとも
２種の、各々が少なくとも一つのホスホロチオエート結
合を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと、少なく
とも４種のヌクレオシドトリホスフェートと、耐熱性重
合剤と、エキソヌクレアーゼとを接触させて反応混合物
を形成させる工程、前記反応混合物を加熱して前記エキ
ソヌクレアーゼを不活化させる工程、及びプライマー伸
長生成物を形成させる工程を含む標的核酸の増幅方法に
関する。
【００１７】本発明はさらに、標的核酸の増幅キットで
あって、同じ容器又は別個の容器に、耐熱性重合剤と、
エキソヌクレアーゼと、前記核酸の領域に対してこれに
ハイブリダイズするに十分な相補性を示す少なくとも２
種のオリゴヌクレオチドプライマーとを含み、前記オリ
ゴヌクレオチドプライマーの各々が少なくとも一つのホ
スホロチオエート結合を有する、標的核酸の増幅キット
を提供する。別の実施態様では、本発明は、エキソヌク
レアーゼと少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライ
マーとを含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーの各
々が少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有す
る、ＰＣＲ用組成物を提供する。この組成物は、耐熱性
重合剤、ヌクレオシドトリホスフェート、該重合剤に対
するモノクローナル抗体及びその他のＰＣＲ用試薬をさ
らに含有してもよい。
【００１８】発明の詳細な説明 本発明は、標的核酸の増幅方法を提供することにより、
アンプリコンやプライマー−ダイマーの同伴汚染並びに
その他の零サイクルアーチファクトを、増幅効率を損な
うことなく従来のＰＣＲ法よりも減少させるものであ
る。具体的には、本発明の方法は、前増幅工程において
エキソヌクレアーゼを使用して同伴ＤＮＡ及び零サイク
ルアーチファクトを切断することと、これまで予期でき
なかった該エキソヌクレアーゼによるプライマーの切断
を防止するためにホスホロチオエート化プライマーを使
用することによって構成される。
【００１９】ＰＣＲの原理や標的核酸の増幅及び検出の
条件については当該技術分野では周知であり、例えば、
米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、
同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第
４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）をはじめとす
る当業者には周知の数多くの文献にも記載されている。
簡単に説明すると、標的核酸を含むと思われる試料を、
増幅すべき領域の側部に並ぶ標的配列に相補的な２種の
オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で加熱して二本
鎖核酸を変性させる。プライマーは分離した標的鎖にア
ニールし、それぞれの３’ヒドロキシル末端から耐熱性
ポリメラーゼなどの重合剤によって伸長される。ＰＣＲ
によって二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでも増幅するこ
とができる。また、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにする
ことにより、ＲＮＡを標的として機能させることもでき
る。変性工程、プライマーアニーリング工程及びＤＮＡ
合成工程を別々の温度で行い、サイクルを繰り返すこと
により標的核酸が指数的に蓄積することになる。ＰＣＲ
の容器は一般に密栓されたプラスチック製容器である
か、又は米国特許第５，２２９，２９７号に記載されて
いるようなキュベットもしくはパウチである。ＰＣＲ増
幅用の試薬は、一般に単一容器内で混合され、プライマ
ー、ヌクレオシドトリホスフェート（一般にはｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ）、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム含有緩衝剤、
及び標的核酸を含む。ＰＣＲ用の試薬及び条件は当業者
には周知であり、例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９８
９年、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ． ２：
２１７に記載されている。ＲＮＡ標的を増幅するため
に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他に又は代わりに逆転
写酵素を使用することができる。逆転写酵素活性を有す
る耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのように、耐熱性の逆転写
酵素が特に有用である。ＲＮＡ標的のＰＣＲ増幅法は当
業者には周知であり、例えば、米国特許第５，１７６，
９９５号、同第５，３１０，６５２号及び同第５，３２
２，７７０号に記載されている。本発明はまた、別のプ
ライマーをベースにした核酸増幅法、例えば、国際特許
出願公開ＷＯ９３００４４７号公報に記載されているＬ
ＣＲ及びｇａｐＬＣＲにも有用である。
【００２０】本発明は、標的核酸の増幅効率を改善し且
つ偽陰性や偽陽性の結果を減少するために既知の核酸増
幅法を改良するものである。具体的には、本発明の方法
は、プライマー−ダイマーをはじめとする零サイクルア
ーチファクトの形成を減少すると共に標的ＤＮＡの増幅
効率を高めるものである。プライマー−ダイマーは２種
のプライマーとそれらの相補的配列から成る二本鎖ＰＣ
Ｒ生成物であることができる。プライマー間にさらに別
の塩基が挿入されてもよい（Ｅｒｌｉｃｈら、１９９１
年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６４３）。プライマー
−ダイマーの形成は、プライマーの３’末端に相同性が
ある場合に特に起こりやすく、そして増幅された標的を
検出できないほど増幅効率が低下することになり、偽陰
性の結果をもたらす恐れがある。本発明の方法によって
克服される既知のＰＣＲ法の別の制限は、同伴汚染物の
増幅である。ＰＣＲ試料は、前のＰＣＲで生じたアンプ
リコン、増幅可能な生成物分子又はプライマー−ダイマ
ー分子によって汚染される場合がある。このような分子
が増幅されると一般に間違った結果が得られる。
【００２１】このように、本発明の方法によると、偽陰
性及び偽陽性の結果が減少すると共に、増幅効率が高め
られる。本発明の方法によると、３’エキソヌクレアー
ゼの存在下で前増幅断種を実施する。二本鎖ＤＮＡを優
先的に切断するエキソヌクレアーゼが好適である。この
前増幅断種工程によってプライマー−ダイマーのような
二本鎖アーチファクトの他、同伴アンプリコンも切断さ
れる。好ましい実施態様では、３’エキソヌクレアーゼ
は、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ
（Ｅｘｏ ＩＩＩ）、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ及び
リボヌクレアーゼＩＩから成る群より選ばれる。最も好
ましい実施態様では、エキソヌクレアーゼはＥｘｏ Ｉ
ＩＩである。エキソヌクレアーゼは当業者であれば周知
であり、また市販されている。
【００２２】本発明によると、全く意外なことに、二本
鎖ＤＮＡに特異的であると報告されているエキソヌクレ
アーゼが、それにもかかわらず一本鎖ＤＮＡプライマー
を切断しうることが発見された。一本鎖プライマーは、
標的配列の増幅を低減或いは排除してしまうほど切断さ
れることがあり、ひいては非効率的な増幅又は偽陰性の
結果をもたらす恐れがある。本発明の方法は、この問題
を、ＰＣＲにおいてホスホロチオエート化プライマーを
使用することによって解決するものである。ホスホロチ
オエート化プライマーはエキソヌクレアーゼによる消化
から保護されるので、このようなプライマーをＰＣＲに
おいて使用すると、試料１個当たりのエキソヌクレアー
ゼ使用量を増加させること、及び／又はインキュベーシ
ョン時間を延長することが可能となる。エキソヌクレア
ーゼ使用量を増加させる及び／又はインキュベーション
時間を延長すると、ヌクレアーゼによる予備処理の効率
が改善されるため、プライマー−ダイマー分子やＰＣＲ
生成物の同伴による悪影響がさらに防止されることにな
る。
【００２３】ホスホロチオエート化プライマーは、ヌク
レオチドのリン酸基の非架橋性酸素の一つ又は二つが硫
黄に置き換えられているオリゴヌクレオチドプライマー
である。オリゴヌクレオチド内にホスホロチオエートに
よるヌクレオチド間結合が存在すると、エキソヌクレア
ーゼが阻害されるので、ホスホロチオエート化プライマ
ーの切断が遅延又は排除される。ホスホロチオエート化
プライマーは、当該技術分野で周知の化学的又は酵素的
方法によって調製することができ、例えば、Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎ（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５４：３６７；Ｚｏｎら（１９９１）Ａｎｔｉ−Ｃａｎ
ｃ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５３９；Ｏｌｓｅｎら（１
９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８７：１４５１及び米国特許第５，００３，０９７
号明細書に記載されている。ホスホロチオエート化ヌク
レオチド誘導体もまた市販されている。
【００２４】プライマーのヌクレオチド間結合の一つ又
は二つ以上又はすべてがホスホロチオエート部分である
ことができる。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオ
チドは１〜４個のホスホロチオエート結合を含有する。
ホスホロチオエート結合の少なくとも一つが、プライマ
ーの３’末端に関して最後の位置、最後から二番目の位
置、三番目の位置、四番目の位置又は五番目の位置にあ
ることが好ましい。好ましい実施態様では、ホスホロチ
オエート結合はプライマーの３’末端に隣接して位置し
ている。別の好ましい実施態様では、プライマーは、そ
の３’末端に関して少なくとも最後の位置と最後から二
番目の位置とにホスホロチオエート結合を含有する。さ
らに別の好ましい実施態様では、プライマーは、その
３’末端に関して少なくとも最後の位置にホスホロチオ
エート結合を含有する。当業者であれば、実施例１及び
実施例３に記載したようなモデル系においてリン酸化プ
ライマーと３’エキソヌクレアーゼの存在下での増幅を
評価することによって、ホスホロチオエート残基の適切
な数及び所在を決定することは可能である。
【００２５】本発明の方法では、標的核酸を含有する試
料とすべてのＰＣＲ試薬とを、エキソヌクレアーゼとホ
スホロチオエート化プライマーの存在下で予備インキュ
ベートすることによってＰＣＲ増幅を実施する。得られ
た反応混合物を該エキソヌクレアーゼを不活化させるに
十分な条件下で加熱した後、プライマー伸長生成物を形
成、増幅させる。
【００２６】本発明の方法は、均一系アッセイ又は均一
系検出システムとして当該技術分野で知られているＰＣ
Ｒ増幅法及び検出法に特に有用である。このようなシス
テムは当該技術分野では周知であり、例えば、欧州特許
出願公開第９１３１００６２．４（４８７２１８）号及
び同第９２１０６９８９．４（５１２３３４）号公報に
記載されている。均一系システムでは、増幅されたＤＮ
Ａの検出は、二本鎖ＤＮＡに蛍光性化合物が結合するこ
とによって誘発される蛍光変化に基づくものである。検
出は一般に二本鎖ＤＮＡの形成に基づき、標的ＤＮＡと
非特異的産物とを区別するものではないため、プライマ
ー−ダイマーのような二本鎖アーチファクトの形成は、
均一系アッセイの特異性を損なうことになる。本発明に
よると、プライマー−ダイマーが減少するため、均一系
検出法の特異性が向上する。
【００２７】ＰＣＲに必要な試薬は、当業者には周知で
あるが、一般には標的核酸の保存領域に対してこれにハ
イブリダイズするに十分な相補性を示す少なくとも２種
のオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のヌクレオシ
ドトリホスフェートと、耐熱性重合剤と、そして該重合
剤に必要な補助因子とを含む。好ましいヌクレオシドト
リホスフェートは、デオキシリボヌクレオシドトリホス
フェートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
（総称としてｄＮＴＰとも記載する）である。ヌクレオ
シドトリホスフェートは市販品として入手可能である。
【００２８】プライマーは、適当な条件下、すなわちヌ
クレオシドトリホスフェート、重合剤、好適な温度、ｐ
Ｈ及び緩衝剤の下、標的核酸にアニールして核酸合成の
開始点として作用することができる天然又は合成された
オリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、標的核酸に
対してこれにハイブリダイズするに十分な相補性を示す
配列を有し、そして重合剤の存在下で伸長生成物の合成
をプライムするに十分な鎖長、典型的にはヌクレオチド
１０〜６０個分、を有する。プライマーは、当業者には
周知の自動合成法によって合成することができる。ホス
ホロチオエート化プライマーの合成については先に記載
した通りである。プライマーを設計する上での検討事項
については当該技術分野では周知である。プライマー
は、あるプライマーから合成された伸長生成物が、その
相補体から分離された場合に、別のプライマーの伸長生
成物のための鋳型として役に立てるように、増幅すべき
特定の核酸の鎖配列に実質的に相補的となるように選定
される。プライマーは標的の領域に対して正確な相補性
を有することが好ましい。
【００２９】重合剤は、プライマー伸長生成物の合成を
完成させるように作用する化合物である。重合剤は耐熱
性であり、すなわちＰＣＲにおいてＤＮＡ鎖を変性する
際に典型的に用いられる温度（例、９３〜９５℃）に短
時間加熱された場合に永久的には不活性化されず、しか
も高温における活性が優先的である。好ましい実施態様
では、重合剤は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであって、例
として、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus l
itoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Baci
llus stearothermophilus ）、メタノサーマス・フェル
ビドゥス（Methanothermus fervidus ）、サーマス・ア
クアティクス（Thermus aquaticus ）、Ｔ．フラブス
（T. flavus ）、Ｔ．ラクテウス（T. lacteus）、Ｔ．
ルベンス（T. rubens ）、Ｔ．ルバー（T. ruber）及び
Ｔ．サーモフィルス（ T. thermophilus）といった好熱
菌、又はデスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococ
cusmobilis ）、メタノバクテリウム・サーモオートト
ロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcu
m ）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobusso
lfataricus ）、Ｓ．アシドカルダリウス（S. acidocal
darius ）及びサーモプラスマ・アシドフィルム（Therm
oplasma acidophilum）といった好熱性古細菌から得ら
れたＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましい実施態様
では、重合剤はサーマス・アクアティクス（Thermus aq
uaticus ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、サーマス・サーモ
フィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）ポリメラ
ーゼ又はサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus l
itoralis）ポリメラーゼである。また、耐熱性逆転写酵
素や逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼも重合剤と
して包含されるものである。
【００３０】耐熱性ポリメラーゼは、市販品として入手
すること、或いは当該技術分野で周知の方法によって得
ることができる。具体的には、Ｔａｑポリメラーゼは、
組換え形や天然形（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔ
ｕｓ）のものが市販されているか、或いはＬａｗｙｅｒ
ら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：
６４２７又は米国特許第４，８８９，８１８号に記載さ
れている方法によって製造することができる。Ｔｔｈポ
リメラーゼは、Ｆｉｎｎｚｙｍｅ社（フィンランド）や
株式会社東洋紡より市販されている。サーモコッカス・
リトラリス（Thermococcus litoralis）ポリメラーゼ
は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから市販
されており、また米国特許第５，３２２，７８５号に記
載された方法で製造することもできる。
【００３１】この前増幅工程では、上記耐熱性重合剤に
特異的な抗体を含めることにより、増幅工程前の重合剤
を阻害しておくこともできる。抗体は、当業者には周知
の方法によって得ることができ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ
ｅら、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。本発明に
よると、用語「抗体」には、常套手法によって製造され
たモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、組換え
法で製造された抗体、化学的又は組換え法で製造された
抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、が包含
される。好ましい実施態様では、抗体はモノクローナル
抗体である。
【００３２】本発明の好ましい実施態様では、抗体はＴ
ａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ又はサーモコッ
カス・リトラリス（thermococcus litoralis）ポリメラ
ーゼに対するモノクローナル抗体である。より好ましい
実施態様では、抗体はＴａｑポリメラーゼに対するモノ
クローナル抗体である。Ｔａｑポリメラーゼに対するモ
ノクローナル抗体は当該技術分野では周知であり、例え
ば、米国特許第５，３３８，６７１号明細書に記載され
ている。本発明によると、重合剤に対して特異的である
と定義される抗体は、約２０〜４０℃の温度において重
合剤の酵素活性を阻害することができる抗体である。本
発明の抗体は、ＰＣＲの熱的サイクルにおいて用いられ
る高温によって不活化される。ポリメラーゼの酵素活性
を阻害できる抗体の能力は、Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９
４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：５０６に記
載されているように、当業者には周知のアッセイによっ
て測定することができる。
【００３３】本発明により用いられるエキソヌクレアー
ゼは、市販品を利用すること、或いは当該技術分野で周
知の方法で得ることが可能であり、例えば、エキソヌク
レアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ ＩＩＩ）、エキソヌクレアー
ゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ及びリボヌクレアー
ゼＩＩが挙げられる。エキソヌクレアーゼは当業者には
周知であり、また、例えば、Ｆａｓｍａｎ編、１９８９
年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａ
ｔｏｎ，ＦＬ．に記載されている。本発明によると、特
に３’エキソヌクレアーゼが考えられる。二本鎖ＤＮＡ
又は一本鎖ＤＮＡを優先的に攻撃するエキソヌクレアー
ゼを使用してもよい。二本鎖ＤＮＡを優先的に攻撃する
エキソヌクレアーゼが好ましい。好ましい実施態様にお
けるエキソヌクレアーゼはＥｘｏ ＩＩＩである。別の
好ましい実施態様では、２種以上のエキソヌクレアーゼ
を使用する。例えば、Ｅｘｏ ＩＩＩのような二本鎖Ｄ
ＮＡを優先的に切断するエキソヌクレアーゼの混合物
を、Ｅｘｏ Ｉのような一本鎖ＤＮＡを優先的に切断す
るエキソヌクレアーゼと一緒に使用することができる。
９５℃におけるエキソヌクレアーゼの不活化は、熱的サ
イクルにおけるエキソヌクレアーゼ活性をさらに防止す
る。従って、エキソヌクレアーゼは９５℃において不活
性でなければならない。
【００３４】本発明は、標的核酸を含むと思われる試料
において、標的核酸を増幅し、またその後必要に応じて
該核酸を検出するための方法を提供するものである。試
料としては、標的核酸を含むと思われるいずれの試料で
あってもよく、例えば、組織試料、血液、毛髪、体液、
細菌、ウイルス、菌類、細菌感染細胞、ウイルス感染細
胞、等が挙げられる。標的核酸はＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。ＰＣＲ増幅に適した位置において標
的核酸の様々な鎖にハイブリダイズすることができるプ
ライマーを設計するためには、増幅すべき配列の両端に
位置する相当数の塩基が既知でなければならない。標的
核酸は、例えば、試料からタンパク質や細胞物質を除去
することによって、ＰＣＲに先立ち組織試料から抽出又
は部分抽出することができる。試料から核酸を抽出する
方法については周知であり、また、例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ及びＳａｉｋｉら、１９８５年、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１００８に記載されている。
【００３５】本発明の増幅方法では、試料又は試料から
抽出された核酸調製物を、少なくとも１個のホスホロチ
オエート結合を含有するように変性された２種以上のオ
リゴヌクレオチドプライマー、４種のヌクレオシドトリ
ホスフェート、耐熱性重合剤及び適当な緩衝剤をはじめ
とする典型的なＰＣＲ用試薬と接触させると共に、さら
にエキソヌクレアーゼと接触させることにより反応混合
物を準備する。別の実施態様では、その反応混合物に、
該重合剤に特異的な抗体を含有させる。
【００３６】プライマー、ヌクレオシドトリホスフェー
ト、重合剤及び適当な緩衝剤をはじめとする常用のＰＣ
Ｒ試薬は、ＰＣＲに一般に適した濃度で用いられ、当業
者であれば周知である。好ましい実施態様では、ヌクレ
オシドトリホスフェートはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰである。好ましい実施態様では、重合剤
は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。好ましいＤＮＡポ
リメラーゼはＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ
及びサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litor
alis）ポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に
好ましい。
【００３７】重合剤に特異的な抗体は、該重合剤を室温
において阻害する上で有効な濃度において用いられる。
この抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ルであること、又は抗体フラグメントであることができ
る。好ましい実施態様では、抗体はモノクローナル抗体
であって、重合剤に対して約５〜約５００のモル比率で
用いられる。最も好ましい実施態様では、重合剤はＴａ
ｑポリメラーゼであり、抗体はＴａｑポリメラーゼに特
異的なモノクローナル抗体である。エキソヌクレアーゼ
は、約０．００１単位／μＬ〜約１０単位／μＬの濃度
範囲で使用することができる。好ましい実施態様では、
エキソヌクレアーゼはＥｘｏ ＩＩＩであって、約０．
０１単位／μＬ〜約０．５単位／μＬの濃度範囲で使用
される。最も好ましい実施態様では、Ｅｘｏ ＩＩＩを
約０．２単位／μＬの濃度で使用する。Ｅｘｏ ＩＩＩ
の１単位とは、三重水素で標識されたＤＮＡ二本鎖から
３７℃で３０分間に１ナノモルの可溶性ヌクレオチドを
生ぜしめるに必要なＥｘｏ ＩＩＩの量として定義され
ている。当業者であれば、標的濃度やその他の実験条件
に応じて適切なエキソヌクレアーゼ濃度を決めることは
可能である。
【００３８】試料をＰＣＲ試薬、ホスホロチオエート化
プライマー及びエキソヌクレアーゼと接触させた後、熱
サイクルに先立ち、その反応混合物を加熱してエキソヌ
クレアーゼを不活化させる。好ましい実施態様では、混
合物を約８５〜９５℃に約３〜１０分間加熱する。最も
好ましい実施態様では、混合物を室温で約０〜約８時間
静置した後、約４０℃で最長約５分間インキュベート
し、その後約８５℃〜約９５℃に少なくとも約３分間加
熱する。
【００３９】熱変性に続いて、アニーリング、伸長及び
変性から成る標準的なＰＣＲサイクルを実施する。サイ
クル変数は、当業者には周知であり、特定の条件に容易
に適合させることができる。この増幅法は自動化された
連続法で行うことが好ましい。自動化ＰＣＲに適した装
置は、当業者には周知であり、例えば、米国特許第４，
９６５，１８８号、同第５，０８９，２３３号及び同第
５，２２９，２９７号に記載されている。さらに当業者
であれば、例えば、ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気
泳動法で分離してエチジウムブロミド着色により可視化
する方法で、又は増幅された核酸とハイブリダイズ可能
な標識プローブによるハイブリダイゼーション検出法
で、又はその他当業者には周知の各種検出方法で、増幅
生成物を容易に検出することもできる。
【００４０】さらに本発明は、同じ容器又は別個の容器
に、耐熱性重合剤と、エキソヌクレアーゼと、各々が少
なくとも一つのホスホロチオエート結合を有する少なく
とも２種のプライマーとを含むＰＣＲ用のキットを提供
する。別の実施態様では、このキットは、該重合剤に特
異的な抗体をさらに含む。また、例えば、ＰＣＲ重合剤
に特異的なさらに別の抗体や、ヌクレオシドトリホスフ
ェート、プライマー及び緩衝剤をはじめとするＰＣＲ用
試薬を含めるために、さらに別の容器を設けることもで
きる。
【００４１】好ましい実施態様では、重合剤はＤＮＡポ
リメラーゼである。より好ましい実施態様では、該ポリ
メラーゼはＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ又
はサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoral
is）ポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に好
ましい。好ましい抗体は、Ｔａｑポリメラーゼに対して
特異的なモノクローナル抗体である。別の好ましい実施
態様では、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼ
Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ又は
リボヌクレアーゼＩＩである。Ｅｘｏ ＩＩＩが特に好
ましい。オリゴヌクレオチドプライマーは、その３’末
端に関して最初の５個の位置の少なくとも一つに、好ま
しくは該３’末端に関して少なくとも最後の位置に、ホ
スホロチオエート結合を含有する。本発明のキットは、
ＰＣＲアッセイにおいて標的核酸の増幅効率を向上させ
る上で有用である。
【００４２】本発明はさらに、ＰＣＲの増幅に有用な、
具体的には、非特異的核酸の生成を減少させ且つＰＣＲ
の際の同伴汚染物の増幅を低減するのに有用な組成物を
提供する。本発明の組成物は、エキソヌクレアーゼと少
なくとも２種のプライマーを含み、そのプライマーの各
々には少なくとも一つのホスホロチオエート結合が含ま
れる。該組成物はまた、耐熱性重合剤、ヌクレオシドト
リホスフェート、該重合剤に対する抗体、緩衝剤、等そ
の他のＰＣＲ用試薬を含有することができる。好ましい
実施態様では、反応混合物は、Ｅｘｏ ＩＩＩと少なく
とも２種のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、その
オリゴヌクレオチドプライマーの各々には、その３’末
端に関して少なくとも最後の位置にホスホロチオエート
結合が含まれる。以下、実施例によって本発明をさらに
説明する。
【００４３】
【実施例】実施例１ ：ＰＣＲに対するエキソヌクレアーゼＩＩＩの
影響 比較的低濃度のＥｘｏ ＩＩＩがゲノム標的のＰＣＲ増
幅に与える影響について、ＨＩＶを検出するためのモデ
ル系で検討した。このモデル系は、組み込まれたＨＩＶ
−１ゲノムを１コピー含有する８Ｅ５ ＨＵＴ／ＨＩＶ
細胞系統から得られたＨＩＶ標的を検出するために下記
配列を有するプライマーＳＫ３８及びＢＷ１７を使用す
るものである。 プライマーＳＫ３８： 5'-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3' (配列番号：１) プライマーＢＷ１７： 5'-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3' (配列番号：２) オリゴヌクレオチドプライマーは、米国特許第５，００
３，０９７号明細書に従いPerkin-Elmer/Applied Biosy
stems Division Model 380B の３本カラム式ＤＮＡ合成
装置を用いた固相ホスホルアミダイト法によって調製し
た。Ｔａｑポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体
は米国特許第５，３３８，６７１号明細書の記載に従い
調製した。Ｔａｑポリメラーゼは、欧州特許出願公開第
０ ４８２７１４号公報に記載されているように組換え
法で調製した。
【００４４】ＰＣＲ混合物には下記の試薬を含有させ
た。 （１）１．０×ＰＣＲ緩衝剤（１０ｍＭ トリスＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ） （２）ＳＫ３８ＰＣＲプライマー （３）ＢＷ１７ＰＣＲプライマー （４）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ（各０．２ｍ
Ｍ） （５）ｄＵＴＰ（０．４ｍＭ） （６）Ｔａｑポリメラーゼ（ＰＣＲ混合物１００μＬ当
たり８単位：１単位は、７４℃で３０分間に伸長核酸鎖
へ全部で１０ナノモルのヌクレオチドを導入するのに要
する酵素活性の量として定義される） （７）Ｔａｑ抗体、Ｔａｑポリメラーゼに対してモル比
５：１（ＴＰ４−９．２ＡＴＣＣ ＨＢ１１８０７）及
び５０：１（ＴＰ１−１２．２ ＡＴＣＣ ＨＢ１１１
２７） （８）ニシン精子ＤＮＡ（ＰＣＲ混合物１００μＬ当た
り１μｇ） （９）１００コピーのＨＩＶ（８Ｅ５ ＨＵＴ／ＨＩＶ
細胞系統） （１０）ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）
【００４５】個々のＰＣＲプライマーは以下の量で各々
使用した。 （１）４００ｎＭ （２）１００ｎＭ （３）４０ｎＭ （４）２０ｎＭ （５）１０ｎＭ （６）４ｎＭ （７）１ｎＭ （８）０．４ｎＭ
【００４６】ＰＣＲは、上記プライマー量で、ＰＣＲ混
合物１μＬ当たり０．０２単位のエキソヌクレアーゼＩ
ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロット番号３２０００）を存在
させるか又はさせずに実施した。ＰＣＲの増幅は、米国
特許第５，０８９，２３３号明細書に記載されているプ
ロトタイプの分析装置を使用し、米国特許第５，２２
９，２９７号明細書に記載されているＣｌｉｎｉｃａｌ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＰＣＲパウチにおいて実施
した。どの試料も２回繰り返して実験し、そしてＰＣＲ
の前に室温で２時間放置してＰＣＲ混合物中のエキソヌ
クレアーゼＩＩＩを活性にさせておいた。２時間のイン
キュベーション後、９５℃、３分間の予備加熱からなる
標準のＰＣＲサイクル条件を試料に施し、エキソヌクレ
アーゼＩＩＩとＴａｑ抗体を熱変性させてから４０サイ
クルのＰＣＲ（１サイクル当たり融解工程＝９５℃、１
５秒及びアニール／伸長工程＝６４℃、３５秒）を実施
した。ＰＣＲの生成物はＣｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ Ｐｏｕｃｈ検出システムを用いて検出し
た。その検出スポットを、青色で０（白色、最少増幅又
は全くなし）から１０（濃青色、最大増幅）まで段階化
されている色基準を用いて視覚的に読み取った。その目
視結果を下記表に記載し、エキソヌクレアーゼＩＩＩの
有る無し（＋／−）で試料の色評価を比較した。
【００４７】 プライマー量 Ｅｘｏ ＩＩＩ（＋） Ｅｘｏ ＩＩＩ（−） ４００ｎＭ ７，６．５ ７，６．５ １００ｎＭ ０，０ ７，７．５ ４０ｎＭ ０，０ ７，６．５ ２０ｎＭ ０，０ ２，４ １０ｎＭ ０，０ ０，０ ４ｎＭ ０，０ ０，０ １ｎＭ ０，０ ０，０ ０．４ｎＭ ０，０ ０，０
【００４８】エキソヌクレアーゼＩＩＩを含む試料では
プライマー濃度が４分の１に低下すると結果は陰性とな
ったが、エキソヌクレアーゼＩＩＩを含まない試料では
プライマー濃度が１０分の１に低下しても結果は変わら
なかった。エキソヌクレアーゼＩＩＩを含まない試料で
はプライマー濃度が２０分の１に低下してもなおＰＣＲ
増幅を示した。これらの結果から、エキソヌクレアーゼ
ＩＩＩは、ＰＣＲ混合物中のプライマー濃度が低下する
につれてＰＣＲ増幅に負の効果を与えることが明白であ
る。従って、エキソヌクレアーゼＩＩＩを含む試料では
ＰＣＲの増幅効率は低下しているものと仮定でき、この
ことはプライマー濃度が４００ｎＭの場合でさえも恐ら
くは当てはまる。
【００４９】実施例２：Ｅｘｏ ＩＩＩは二本鎖ＤＮＡ
及び一本鎖ＤＮＡを切断する。エキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉが、製造業者の断定及び関連する科学文献（Ｚｈｕ
ら、１９９１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１９：２５１）の記述に反して、一本鎖ＤＮＡを切
断しうることについて調査した。一本鎖ＤＮＡ標的、二
本鎖ＤＮＡ標的及び一本鎖オリゴヌクレオチドプライマ
ーを、それぞれ単独で、又は様々な組合せで、エキソヌ
クレアーゼＩＩＩを存在させるか又は存在させないで、
前増幅断種工程に供した。
【００５０】一本鎖の１００マーＤＮＡ標的（合成モデ
ル系、Ｓｙｎ−１と命名）を濃度１×１０-10 Ｍで使用
した。Ｓｙｎ−１標的の配列は以下の通り。 5'-AAT-CGA-GTA-AGA-CTT-CAC-TGC-TGA-GAA-TCT-CAG-AGA
-ATC-TAG-ATA-TCC-TGC-ATG-TCT-AAA-TAT-TGA-ATA-CGA-C
AT-TAC-ACG-AGT-CAA-GAC-TCA-CTA-GAC-A-3' （配列番号：３） 二本鎖標的（実施例１に記載したＨＩＶモデル系）を濃
度１×１０-8Ｍで使用 した。ＰＣＲプライマーのＳｙｎ−１正方向： 5'-GTA-AGA-CTT-CAC-TGC-TGA-GAA-TCT-CAG-3' （配列番号：４） Ｓｙｎ−１逆方向： 5'-TGT-CTA-GTG-AGT-CTT-GAC-TCG-TGT-AAT-3' （配列番号：５） ＳＫ３８及びＢＷ１７を全濃度２μＭで（すなわち、１
種のプライマーを含む試料の場合は２μＭで、また２種
のプライマーを含む試料の場合は各々１μＭで）使用し
た。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロッ
ト番号３２０００）は試料５０μＬ当たり０、１０又は
２０単位で使用した。
【００５１】試料は、典型的な前増幅断種条件（３０
℃、３０分）の下でインキュベートした。酵素による加
水分解は、９５℃、５分間のインキュベーションでエキ
ソヌクレアーゼＩＩＩを熱変性することによって停止さ
せた。その反応混合物の少量のアリコート（１６μＬ）
を４％アガロースゲル上、標準条件下で電気泳動し、エ
チジウムブロミド染色法で可視化した。ゲル上で観察さ
れた結果を表Ｉに示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】試料の２番及び３番では、標的のバンドが
試料１番よりもゲルの下方へ移動しており、一本鎖標的
の分子量がＥｘｏ ＩＩＩによる切断で低下したことを
示唆している。試料２番及び３番の標的バンドの信号に
ついても試料１番より小さくなっており、一本鎖標的が
Ｅｘｏ ＩＩＩによって切断されたことを示唆してい
る。この実験は、Ｅｘｏ ＩＩＩが一本鎖及び二本鎖の
どちらのＤＮＡも切断することを例示している。
【００５５】（エキソヌクレアーゼＩＩＩと反応させて
いない）正の対照試料では、すべての試料において信号
の強いバンドが得られた。試料２番及び３番を除き、試
料５０μＬ当たり１０又は２０単位のエキソヌクレアー
ゼＩＩＩで処理したＤＮＡ種（一本鎖ＤＮＡ、二本鎖Ｄ
ＮＡ、短鎖ＰＣＲプライマー及び１００マー標的配列；
二本鎖ＤＮＡはＳＫ１８／ＢＷ１７系のＰＣＲ生成物と
した）はいずれも切断され、電気泳動ゲル上では検出不
能となった。このエキソヌクレアーゼＩＩＩによる一本
鎖ＤＮＡの切断は、実施例１で認められたＰＣＲに対す
るエキソヌクレアーゼＩＩＩの負の効果を説明するもの
である。ＰＣＲ反応における重要な試薬であるＰＣＲプ
ライマーの破壊によってプライマー濃度が低下するの
で、ＰＣＲの増幅効率も低下する。
【００５６】実施例３：ホスホロチオエート化プライマ
ーはエキソヌクレアーゼＩＩＩによる切断を防止する。
この実験では、実施例１に記載したＳＫ３８／ＢＷ１７
ＨＩＶ ＰＣＲモデル系を使用した。未修飾プライマ
ーの代わりにホスホロチオエート化プライマーをＰＣＲ
で使用して、その修飾プライマーがエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩによる切断を防止するか否かについて調べた。エ
キソヌクレアーゼＩＩＩによる標的ＤＮＡの切断を除外
するため、標的ＤＮＡが存在しない試料についても実験
した。３’−ヒドロキシル基に関して最後の位置及び最
後から２番目の位置にホスホロチオエート結合を有する
ＰＣＲ用プライマーＳＫ３８及びＢＷ１７を、米国特許
第５，００３，０９７号明細書に記載されている方法
（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖ
ａの技術公報添付のカタログ番号４０−４０３６−ｘｘ
にも記載されている）に従ってＨ−ホスホネート化学法
で調製した。
【００５７】全ての試料が以下の試薬を含有した。５ｍ
Ｍのマグネシウムを含有する１．０×ＰＣＲ緩衝剤；Ｓ
Ｋ３８ ＰＣＲプライマー、未修飾（ＳＯＡ）又はホス
ホロチオエート化（Ｔｈｉｏ），４００ｎＭ；ＢＷ１７
ＰＣＲプライマー、未修飾（ＳＯＡ）又はホスホロチ
オエート化（Ｔｈｉｏ），４００ｎＭ；ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ及びｄＧＴＰ、各々０．２ｍＭ；ｄＵＴＰ、０．４
ｍＭ；Ｔａｑポリメラーゼ、ＰＣＲ混合物１００μＬ当
たり８単位；Ｔａｑ抗体、Ｔａｑポリメラーゼに対して
モル比５：１（ＴＰ４−９．２）及び５０：１（ＴＰ１
−１２．２）；ニシン精子、ＰＣＲ混合物１００μＬ当
たり１μｇ；ＴＥ緩衝液
【００５８】試料１〜１０は、８Ｅ５ ＨＵＴ／ＨＩＶ
細胞系統から得られたＨＩＶゲノム標的を１０コピー含
有するものとした。これらの試料は、表ＩＩに示したよ
うに各種濃度（ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり０、５、
１０、１５、２０単位）のエキソヌクレアーゼＩＩＩを
含有した。
【００５９】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓのＰＣＲパウチとプロトタイプの分析装置を用いてＰ
ＣＲ増幅を実施した。どの試料も２回繰り返して実験
し、そしてＰＣＲの前に室温で１時間放置してＰＣＲ混
合物中のエキソヌクレアーゼＩＩＩを活性にさせておい
た。試料１１〜１８では、エキソヌクレアーゼＩＩＩに
よる１時間のインキュベーションの後に、ゲノムの標的
ＤＮＡを混合物に添加した。その１時間のインキュベー
ション後、９５℃、３分間の予備加熱からなる標準のＰ
ＣＲサイクル条件を試料に施し、エキソヌクレアーゼＩ
ＩＩとＴａｑ抗体を熱変性させてから４０サイクルのＰ
ＣＲ（１サイクル当たり融解工程＝９５℃、１５秒及び
アニール／伸長工程＝６４℃、３５秒）を実施した。Ｐ
ＣＲの増幅に続いて、一試料につきレプリカの一方をＣ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｏｕｃｈ
検出システムを用いて検出した。その検出スポットを、
青色で０（白色）から１０（濃青色）まで段階化されて
いる色基準を用いて視覚的に読み取った。レプリカの他
方から得られたＰＣＲ生成物をＰＣＲパウチから集め、
２．５％アガロースゲル上で電気泳動させてエチジウム
ブロミドで染色することにより検出した。ゲルにＵＶ光
を照射し、ポラロイド（商標）写真を撮影した。
【００６０】
【表３】
【００６１】＊ａ；Ｅｘｏ ＩＩＩによるインキュベー
ション後に標的を添加。 ｂ；Ｅｘｏ ＩＩＩによるインキュベーション前に標的
を添加。
【００６２】パウチの検出結果とゲルの可視化結果を表
ＩＩに示した。試料２〜５の結果は、標準のプライマー
を使用した場合にはエキソヌクレアーゼＩＩＩによって
ＰＣＲ増幅が検出不能にされたことを示している。この
エキソヌクレアーゼＩＩＩのＰＣＲに対する負の効果
は、ゲノムの標的ＤＮＡの切断ではなく、未修飾プライ
マーの切断が原因であるものとすることができる。この
ことは、エキソヌクレアーゼＩＩＩによるインキュベー
ションの後に標的ＤＮＡを添加した試料１１〜１４でも
負の結果が得られていることから明白である。試料６〜
１０及び１５〜１８の結果から明らかなように、ホスホ
ロチオエート化ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲを阻害する
ことがなく、むしろ増幅され易いので、日常実験として
使用することができる。さらに、ホスホロチオエート化
ＰＣＲプライマーはエキソヌクレアーゼＩＩＩによる切
断から保護されているが、未修飾プライマーは保護され
ていない。
【００６３】エキソヌクレアーゼＩＩＩをホスホロチオ
エート化ＰＣＲプライマーと組み合わせて使用すると、
試料７〜１０のゲルバンド強度を試料１及び６のそれと
比較してみると明らかなように、生成物の収量が増加す
ることになる。これらの結果は、増幅前にエキソヌクレ
アーゼＩＩＩがＰＣＲプライマー−ダイマーを切断する
ことができ、しかもホスホロチオエート化ＰＣＲプライ
マーがエキソヌクレアーゼＩＩＩから保護されているこ
とによって、ＰＣＲの増幅効率が増大したものと解釈す
ることができる。
【００６４】実施例４：低濃度のゲノム標的ＤＮＡはエ
キソヌクレアーゼＩＩＩによって切断されることがな
い。この実験では、実施例１に記載したＳＫ３８／ＢＷ
１７ ＨＩＶモデル系を使用した。実施例３の場合と同
様に未修飾（ＳＯＡ）プライマー又はホスホロチオエー
ト化（Ｔｈｉｏ）プライマーのいずれかの存在下、各種
濃度のエキソヌクレアーゼＩＩＩを存在させて２種の濃
度のゲノム標的（８Ｅ５ ＨＵＴ／ＨＩＶ細胞系統から
得られたＨＩＶゲノム標的１０コピー及び１００コピ
ー）を増幅させた。
【００６５】いずれの試料も以下の試薬を含有した。５
ｍＭのマグネシウムを含有する１．０×ＰＣＲ緩衝剤；
ＳＫ３８ ＰＣＲプライマー、未修飾（ＳＯＡ）又は実
施例３に記載のホスホロチオエート化（Ｔｈｉｏ），４
００ｎＭ；ＢＷ１７ ＰＣＲプライマー、未修飾（ＳＯ
Ａ）又は実施例３に記載のホスホロチオエート化（Ｔｈ
ｉｏ），４００ｎＭ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴ
Ｐ、各々０．２ｍＭ；ｄＵＴＰ、０．４ｍＭ；Ｔａｑポ
リメラーゼ、ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり８単位；Ｔ
ａｑ抗体、Ｔａｑポリメラーゼに対してモル比５：１
（ＴＰ４−９．２）及び５０：１（ＴＰ１−１２．
２）；ニシン精子、ＰＣＲ混合物１００μＬ当たり１μ
ｇ；ＴＥ緩衝液
【００６６】試料１〜１６は、ＨＩＶ標的を１０コピー
含有するものとした。試料１７〜３２は、ＨＩＶ標的を
１００コピー含有するものとした。試料１〜８及び１７
〜２４は未修飾（ＳＯＡ）プライマーを含有し、また試
料９〜１６及び２５〜３２はホスホロチオエート化（Ｔ
ｈｉｏ）プライマーを含有するものとした。これらの試
料には、表ＩＩＩに示したように各種濃度のエキソヌク
レアーゼＩＩＩを含有させた。
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】＊評価不能：試料１７〜２５についてはパ
ウチの結果が得られなかった。 Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＰＣＲパ
ウチとプロトタイプの分析装置を用いてＰＣＲ増幅を実
施した。どの試料も２回繰り返して実験し、そしてＰＣ
Ｒの前に室温で２時間放置してＰＣＲ混合物中のエキソ
ヌクレアーゼＩＩＩを活性にさせておいた。その２時間
のインキュベーション後、９５℃、３分間の予備加熱か
らなる標準のＰＣＲサイクル条件を試料に施し、エキソ
ヌクレアーゼＩＩＩとＴａｑ抗体を熱変性させてから４
０サイクルのＰＣＲ（１サイクル当たり融解工程＝９５
℃、１５秒及びアニール／伸長工程＝６４℃、３５秒）
を実施した。ＰＣＲの増幅に続いて、各試料につきレプ
リカの一方をＣｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓのＰｏｕｃｈ検出システムを用いて検出した。その検
出スポットを、青色で０（白色）から１０（濃青色）ま
で段階化されている色基準を用いて視覚的に読み取っ
た。レプリカの他方から得られたＰＣＲ生成物をＰＣＲ
パウチから集め、２．５％アガロースゲル上で電気泳動
させてエチジウムブロミドで染色することにより検出し
た。ゲルにＵＶ光を照射し、ポラロイド（商標）写真を
撮影した。
【００７０】結果を表ＩＩＩに示した。これらの結果か
ら、実施例２の結果、すなわち、エキソヌクレアーゼＩ
ＩＩが未修飾の一本鎖ＰＣＲプライマーをその生成物を
検出不能にするほど切断し、しかもホスホロチオエート
化ＰＣＲプライマーがエキソヌクレアーゼＩＩＩによる
消化から保護されていることが確認された。従って、ホ
スホロチオエート化ＰＣＲプライマーを使用することに
より、一試料当たりのエキソヌクレアーゼＩＩＩ使用量
を増加させること、及びインキュベーション時間を延長
することが可能となる。また、エキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉの使用量を増加させると、プライマー−ダイマー分子
の阻害効果に対する保護や、ＰＣＲ生成物及びプライマ
ー−ダイマーの形にあるＰＣＲ同伴物に対する保護がさ
らに強化される。
【００７１】ゲルのバンド強度によって明らかなよう
に、エキソヌクレアーゼＩＩＩとホスホロチオエート化
ＰＣＲプライマーを含有する試料では試験した全濃度の
エキソヌクレアーゼＩＩＩにおいて、またＳＯＡ未修飾
プライマーとエキソヌクレアーゼＩＩＩを含有する試料
ではＰＣＲ混合物１００μＬ当たり２単位又は４単位に
おいて、どちらのプライマー種についてもエキソヌクレ
アーゼＩＩＩを含まない試料と比較して、生成物の収量
が増加していることがわかる。これは、ＰＣＲを行う前
にエキソヌクレアーゼＩＩＩがＰＣＲプライマー−ダイ
マー分子を切断することができ、ＰＣＲ反応の増幅効率
が高められるためである。しかしながら、ＳＯＡ未修飾
ＰＣＲプライマーを含む試料では、エキソヌクレアーゼ
ＩＩＩは、その一本鎖ＤＮＡ切断活性によって若干高い
レベルではＰＣＲのインヒビターになる。ホスホロチオ
エート化プライマーを使用した１０コピーのＨＩＶ試料
によるＰＣＲパウチ色評価とゲル生成物バンドとの一致
から明らかなように、ゲノムの標的ＤＮＡは、一試料当
たりのコピー数が少ない場合でも、高濃度のエキソヌク
レアーゼＩＩＩによって切断されることはない。
【００７２】実施例５：エキソヌクレアーゼＩＩＩとホ
スホロチオエート化プライマーを組み合わせたＰＣＲ同
伴物の断種 この実験は、ホスホロチオエート化ＰＣＲプライマーを
含むＰＣＲ混合物１００μＬ当たり２０単位のエキソヌ
クレアーゼＩＩＩの断種効率を測定するものである。さ
らに、エキソヌクレアーゼＩＩＩとホスホロチオエート
化プライマーのＰＣＲアンプリコンを断種できる性能
を、約１０6 のアンプリコンの断種能を有すると報告
（Ｌｏｎｇｏら）されているウラシル−Ｎ−グリコシラ
ーゼと比較した。
【００７３】ＳＫ３８／ＢＷ１７ ＨＩＶ ＰＣＲモデ
ル系を、先の増幅から集められたＰＣＲ同伴物に適用し
た。このＰＣＲ同伴物は、１μＬ当たり１０11のアンプ
リコンを含むと推定されている十分な強度の増幅前のＰ
ＣＲ生成物であり、また生成物がチミジンの代わりにウ
ラシルを含有するように増幅中にはＴＴＰの代わりにｄ
ＵＴＰが用いられた。この前増幅生成物を４％アガロー
ス電気泳動にかけ、生成物を非特異的産物から単離し
た。次いで、その生成物のバンドをアガロースゲルから
切り出して、Ｑｉａｇｅｎのゲル精製キットによって精
製した。次いで、この精製されたＰＣＲ生成物を希釈
し、希釈物１μＬ当たり下記の推定量のＰＣＲ同伴アン
プリコンを調製した。 （１）１０×希釈＝１０10アンプリコン／１μＬ； （２）１０3 ×希釈＝１０8 アンプリコン／１μＬ； （３）１０5 ×希釈＝１０6 アンプリコン／１μＬ； （４）１０7 ×希釈＝１０4 アンプリコン／１μＬ； （５）１０9 ×希釈＝１０2 アンプリコン／１μＬ；
【００７４】下記の標準ＰＣＲ試薬を含むが（ＰＣＲ混
合物１００μＬ当たり１０コピーのゲノムＨＩＶ標的を
含有する正の対照試料を除いて）ゲノムの標的は含有し
ないＰＣＲ混合物１００μＬに、各同伴希釈物を１μＬ
添加した。５ｍＭのマグネシウムを含有する１．０×Ｐ
ＣＲ緩衝剤；ＳＫ３８ ＰＣＲプライマー（実施例３に
記載のホスホロチオエート化物）；ＢＷ１７ ＰＣＲプ
ライマー（実施例３に記載のホスホロチオエート化
物）；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、各々０．２ｍ
Ｍ；ｄＵＴＰ、０．４ｍＭ；Ｔａｑポリメラーゼ、ＰＣ
Ｒ混合物１００μＬ当たり８単位；Ｔａｑ抗体、Ｔａｑ
ポリメラーゼに対してモル比５：１（ＴＰ４−９．２）
及び５０：１（ＴＰ１−１２．２）；ニシン精子、ＰＣ
Ｒ混合物１００μＬ当たり１μｇ；ＴＥ緩衝液
【００７５】これらの試料を、表ＩＶに示したように、
断種試薬を含まない場合、ＥｘｏＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ、ロット番号３２０００、ＰＣＲ混合物１００μＬ当
たり２０単位）を含む場合、又はＵＮＧ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、ロット番号０６４２、ＰＣＲ混合物１００μＬ当た
り１単位）を含む場合を、単独で又は組み合わせて試験
した。
【００７６】
【表６】
【００７７】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓのＰＣＲパウチとプロトタイプの分析装置を用いてＰ
ＣＲ増幅を実施した。どの試料もＰＣＲの前に室温で２
時間放置してＰＣＲ混合物中のエキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉ及びＵＮＧを活性にさせておいた。その２時間のイン
キュベーション後、９５℃、１０分間の予備加熱を試料
に施し、ＵＮＧ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びＴａｑ
抗体を熱変性させた。次いで、４０サイクルの標準ＰＣ
Ｒ条件（１サイクル当たり融解工程＝９５℃、１５秒及
びアニール／伸長工程＝６４℃、３５秒）を実施した。
ＰＣＲの増幅に続いて、各試料につきＣｌｉｎｉｃａｌ
ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＰｏｕｃｈ検出システムを
用いて検出した。その検出スポットを、青色で０（白
色）から１０（濃青色）まで段階化されている色基準を
用いて視覚的に読み取った。各試料の結果を表ＩＶに示
した。これらの結果は、ホスホロチオエート化プライマ
ーを含有するＰＣＲ混合物１００μＬ当たり２０単位の
エキソヌクレアーゼＩＩＩが、少なくとも１０，０００
のアンプリコンを断種できることを例示している。この
断種法は、ＵＮＧによって達成されるレベルに匹敵し、
ホスホロチオエート化プライマーが断種を妨害しないこ
とを示唆している。
【００７８】実施例６：プライマー−ダイマーの同伴物
を排除する際のＵＮＧとＥｘｏ ＩＩＩの効果の比較 ＳＫ３８／ＢＷ１７プライマーを含有するが標的は含ま
ない（すなわち、プライマー−ダイマーの形成が促進さ
れる条件）増幅混合物からプライマー−ダイマー同伴物
を得、これをＰＣＲ試料に加えてから１×１０〜１×１
０8 の各種希釈で室温でインキュベーションを行った。
このようにして生じたプライマー−ダイマーは、エチジ
ウム染色ゲル上のバンドとして可視化するには弱すぎる
ものであるが、その存在は、下記より明らかになるよう
に、明白であった。ＰＣＲ混合物は実施例１に記載した
試薬を含有したが、但し、ホスホロチオエート化プライ
マーを使用した。試料１を除くすべての試料に、８Ｅ５
ＨＵＴ／ＨＩＶ細胞系統から得られたＨＩＶゲノム標
的１００コピーを含有させた。試料２は同伴物を含有し
ないものとし、また試料３は環境的同伴物に晒したもの
とした。これらの試料は、下記条件下で３回繰り返して
試験した：（Ａ）同伴物の防止を行わない方法；（Ｂ）
ＵＮＧ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ロット番号０６４
２）、１単位／ＰＣＲ反応混合物１００μＬ；及び
（Ｃ）Ｅｘｏ ＩＩＩ、２０単位／ＰＣＲ反応混合物１
００μＬ。いずれの場合にもホスホロチオエート化プラ
イマーを使用した。グループＡの試料には、標準のＰＣ
Ｒサイクルに入る前に、室温で１０分間のインキュベー
ションを施した。グループＢの試料には、室温で１０分
間のインキュベーションを施した後、５０℃で２分間の
インキュベーションを施し、次いで、標準のＰＣＲサイ
クルに入った後、７２℃で保持した。グループＣの試料
には、室温で２時間のインキュベーションを施した後、
標準のＰＣＲサイクルに入った。各試料のアリコートを
標準条件下、４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、
そしてエチジウムブロミド染色法で可視化した。以下の
結果が得られた。
【００７９】
【表７】
【００８０】＊数字はプライマー−ダイマー同伴物の希
釈率を示す。
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】ＵＮＧ処理によると、生成物のバンドがプ
ライマー−ダイマー同伴物の１×１０6 希釈物で検出さ
れ、未処理の場合より１０００倍の改良を示した。〔従
前の実験では、処理を行わない場合には、生成物のバン
ドはプライマー−ダイマー同伴物の１×１０10希釈物に
おいて検出可能であることが示されている。〕チオエー
ト化プライマーを存在させたＥｘｏ ＩＩＩ処理による
と、生成物のバンドはプライマー−ダイマー同伴物の１
×１０3 希釈物で検出され、ＵＮＧ処理の場合より１０
００倍の改良を、また未処理の場合より１×１０7 倍の
改良を示している。従って、Ｅｘｏ ＩＩＩは、プライ
マー−ダイマーの同伴物を排除する上で、ＵＮＧより
も、また未処理の場合よりも、優れている。
【００８４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
【００８５】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
【００８６】配列番号：３ 配列の長さ：１００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 AATCGAGTAA GACTTCACTG CTGAGAATCT CAGAGAATCT AGATATCCTG CATGTCTAAA TATTGAATAC GACATTACAC GAGTCAAGAC TCACTAGACA 100
【００８７】配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 GTAAGACTTC ACTGCTGAGA ATCTCAG 27
【００８８】配列番号：５ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 TGTCTAGTGA GTCTTGACTC GTGTAAT 27
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デビッド ロバート パターソン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14607, ロチェスター，ザイヤー ストリート 33 (72)発明者 ジョン ウィリアム ヘンダーソン サザ ーランド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14620, ロチェスター，カルバー ロード 57

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）標的核酸を含むと思われる試料
    に、（１）前記標的核酸の領域に対してこれにハイブリ
    ダイズするに十分な相補性を示す少なくとも２種の、各
    々が少なくとも一つのホスホロチオエート結合を含有す
    るオリゴヌクレオチドプライマー、（２）少なくとも４
    種のヌクレオシドトリホスフェート、（３）耐熱性重合
    剤、及び（４）少なくとも１種の３’エキソヌクレアー
    ゼを接触させて反応混合物を形成させる工程と、 （ｂ）前記反応混合物を加熱して前記エキソヌクレアー
    ゼを不活化させる工程と、 （ｃ）プライマー伸長生成物を形成させる工程とを含む
    標的核酸の増幅方法。
  2. 【請求項２】 前記標的核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであ
    る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオシドトリホスフェートがｄ
    ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰである、請求
    項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼであ
    る、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・
    アクアティクス（Thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポリ
    メラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermo
    philus）ポリメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリス
    （Thermococcus litoralis）ポリメラーゼから成る群よ
    り選ばれた、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記試料を前記重合剤に特異的な抗体と
    接触させて前記反応混合物を形成する工程をさらに含
    む、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記重合剤がＴａｑポリメラーゼであ
    り、そして前記抗体がＴａｑポリメラーゼに対するモノ
    クローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記３’エキソヌクレアーゼが、エキソ
    ヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌ
    クレアーゼＶＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＩＩから成る
    群より選ばれた、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記プライマーの各々が、その３’末端
    に関して少なくとも最後の位置にホスホロチオエート結
    合を含有する、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記プライマーの各々が、その３’末
    端に関して少なくとも最後の位置と最後から二番目の位
    置とにホスホロチオエート結合を含有する、請求項１に
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記３’エキソヌクレアーゼがエキソ
    ヌクレアーゼＩＩＩである、請求項１、９又は１０に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記エキソヌクレアーゼＩＩＩが反応
    混合物１マイクロリットル当たり０．００１〜１０単位
    の濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記エキソヌクレアーゼＩＩＩが反応
    混合物１マイクロリットル当たり０．２単位の濃度で存
    在する、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記反応混合物が２種の３’エキソヌ
    クレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記３’エキソヌクレアーゼの一方が
    二本鎖ＤＮＡを優先的に切断し、その他方が一本鎖ＤＮ
    Ａを優先的に切断する、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記加熱の温度が８５℃〜９５℃であ
    る、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 プライマー伸長生成物を検出する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記検出を、蛍光性化合物が二本鎖Ｄ
    ＮＡに結合した際に誘発される蛍光変化を測定する方法
    で実施する、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 標的核酸の増幅キットであって、同じ
    容器又は別個の容器に、耐熱性重合剤と、少なくとも１
    種の３’エキソヌクレアーゼと、前記核酸の領域に対し
    てこれにハイブリダイズするに十分な相補性を示す少な
    くとも２種のオリゴヌクレオチドプライマーとを含み、
    前記オリゴヌクレオチドプライマーの各々が少なくとも
    一つのホスホロチオエート結合を有する、標的核酸の増
    幅キット。
  20. 【請求項２０】 同じ容器又は別個の容器に、前記重合
    剤に特異的な抗体をさらに含む、請求項１９に記載のキ
    ット。
  21. 【請求項２１】 前記重合剤が、サーマス・アクアティ
    クス（thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、
    サーマス・サーモフィルス（thermus thermophilus）ポ
    リメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリス（thermoco
    ccus litoralis）ポリメラーゼから成る群より選ばれ
    た、請求項１９に記載のキット。
  22. 【請求項２２】 前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌ
    クレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌク
    レアーゼＶＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＩＩから成る群
    より選ばれた、請求項１９に記載のキット。
  23. 【請求項２３】 前記３’エキソヌクレアーゼがエキソ
    ヌクレアーゼＩＩＩである、請求項１９に記載のキッ
    ト。
  24. 【請求項２４】 前記プライマーの各々が、その３’末
    端に関して少なくとも最後の位置にホスホロチオエート
    結合を含有する、請求項１９に記載のキット。
  25. 【請求項２５】 前記プライマーの各々が、その５’末
    端に関して少なくとも最後から二番目の位置と最後の位
    置とにホスホロチオエート結合を含有する、請求項１９
    に記載のキット。
  26. 【請求項２６】 少なくとも１種の３’エキソヌクレア
    ーゼと、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーとを含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーの各々
    が少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有する、
    ＰＣＲ用組成物。
  27. 【請求項２７】 耐熱性重合剤をさらに含む、請求項２
    ６に記載の組成物。
  28. 【請求項２８】 前記耐熱性重合剤がＤＮＡポリメラー
    ゼである、請求項２７に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】 前記ポリメラーゼが、サーマス・アク
    アティクス（Thermus aquaticus ）（Ｔａｑ）ポリメラ
    ーゼ、サーマス・サーモフィルス（Thermusthermophilu
    s）ポリメラーゼ及びサーモコッカス・リトラリス（The
    rmococcus litoralis）ポリメラーゼから成る群より選
    ばれた、請求項２８に記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 少なくとも４種のヌクレオシドトリホ
    スフェートをさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
  31. 【請求項３１】 前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌ
    クレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌク
    レアーゼＶＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＩＩから成る群
    より選ばれた、請求項２６に記載の組成物。
  32. 【請求項３２】 エキソヌクレアーゼＩＩＩと、少なく
    とも２種のオリゴヌクレオチドプライマーとを含み、前
    記オリゴヌクレオチドプライマーの各々が、その３’末
    端に関して少なくとも最後の位置にホスホロチオエート
    結合を含有する、ＰＣＲ用組成物。
JP8125929A 1995-05-22 1996-05-21 標的核酸の増幅方法及び増幅キット並びにｐｃｒ用組成物 Pending JPH09107997A (ja)

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