JPH09121857A - アルカリプロテアーゼ、その製造方法、用途及びそのプロテアーゼを生産する微生物 - Google Patents
アルカリプロテアーゼ、その製造方法、用途及びそのプロテアーゼを生産する微生物Info
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- JPH09121857A JPH09121857A JP7308493A JP30849395A JPH09121857A JP H09121857 A JPH09121857 A JP H09121857A JP 7308493 A JP7308493 A JP 7308493A JP 30849395 A JP30849395 A JP 30849395A JP H09121857 A JPH09121857 A JP H09121857A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 界面活性剤存在下において安定性の高いプロ
テアーゼ、その製造法、そのプロテアーゼの用途、及び
そのプロテアーゼを生産する微生物の提供。 【解決手段】 バチルスｓｐ．の新菌株（受託番号FERM
P-15214号）、その菌株又はその変異株を培養し得られ
る以下の性質を有する洗剤： (1)タンパク質及びペプチ
ドを加水分解する、 (2)カゼインを基質とし３０℃にて
１０分間反応させた至適ｐＨが１２付近、 (3)カゼイン
を基質とし３０℃で２４時間インキュベートした安定ｐ
Ｈが５〜１１、 (4)カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１
０分間反応させた至適作用温度が６０℃付近、 (5)ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が 290
00±2000、 (6)等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法による等電点が10.1±0.5、 (7)ＬＡＳ 500ｐｐｍ溶
液中での残存活性は４０℃３０分後６０％以上、５５℃
１５分後２０％以上。
テアーゼ、その製造法、そのプロテアーゼの用途、及び
そのプロテアーゼを生産する微生物の提供。 【解決手段】 バチルスｓｐ．の新菌株（受託番号FERM
P-15214号）、その菌株又はその変異株を培養し得られ
る以下の性質を有する洗剤： (1)タンパク質及びペプチ
ドを加水分解する、 (2)カゼインを基質とし３０℃にて
１０分間反応させた至適ｐＨが１２付近、 (3)カゼイン
を基質とし３０℃で２４時間インキュベートした安定ｐ
Ｈが５〜１１、 (4)カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１
０分間反応させた至適作用温度が６０℃付近、 (5)ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が 290
00±2000、 (6)等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法による等電点が10.1±0.5、 (7)ＬＡＳ 500ｐｐｍ溶
液中での残存活性は４０℃３０分後６０％以上、５５℃
１５分後２０％以上。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルカリプ
ロテアーゼに関する。さらに詳しく言えば、界面活性剤
と熱に対する安定性に優れたアルカリプロテアーゼ、そ
の製造方法、その洗浄剤等への用途、及びそのアルカリ
プロテアーゼを生産する微生物に関する。
ロテアーゼに関する。さらに詳しく言えば、界面活性剤
と熱に対する安定性に優れたアルカリプロテアーゼ、そ
の製造方法、その洗浄剤等への用途、及びそのアルカリ
プロテアーゼを生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来技術】近年、環境汚染が問題となり、洗剤成分と
してのリン酸塩の使用が規制されるに伴って、酵素を洗
剤に配合して、洗浄力を高めることが行なわれている。
現在では、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リ
パーゼ等を配合した酵素入り洗剤が上市されている。中
でもプロテアーゼは、衣類に付着する有機汚垢の１０〜
４０％を占め、従来の洗剤成分だけでは除去しきれない
タンパク質汚れを効率よく分解し、洗浄力を高めるため
の洗浄成分として不可欠になっている。洗剤用プロテア
ーゼとしては、アルカリ域で活性を示す微生物由来の酵
素が、従来数多く知られており、カズサーゼ（昭和電工
（株））、サビナーゼ（ノヴォ(NOVO)社製）、マキサカ
ル（ギスト(GIST)社製）、アルカラーゼ（ノヴォ(NOVO)
社製）、バイオサム（昭和電工（株））等が用いられて
いる。また、自動食器洗浄機の普及に伴って、自動食器
洗浄機用洗剤に配合可能な酵素が求められている。卵
黄、乳製品等のタンパク質性の食器汚れに対して、プロ
テアーゼが有効である。ただし、一般に酵素は高温水中
で使用すると失活が促進されるので優れた安定性が要求
される。現在この目的にはエスペラーゼ（ノヴォ(NOVO)
社製）等が用いられているが、十分な活性、安定性を兼
ね備えているとは言えない。これまでに知られているプ
ロテアーゼで界面活性剤に対して最も安定性の高いの
は、バチルスＳＤ５２１株の産するプロテアーゼ（特開
平3-191781号）であるが、更に安定性の高いプロテアー
ゼが望まれている。
してのリン酸塩の使用が規制されるに伴って、酵素を洗
剤に配合して、洗浄力を高めることが行なわれている。
現在では、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リ
パーゼ等を配合した酵素入り洗剤が上市されている。中
でもプロテアーゼは、衣類に付着する有機汚垢の１０〜
４０％を占め、従来の洗剤成分だけでは除去しきれない
タンパク質汚れを効率よく分解し、洗浄力を高めるため
の洗浄成分として不可欠になっている。洗剤用プロテア
ーゼとしては、アルカリ域で活性を示す微生物由来の酵
素が、従来数多く知られており、カズサーゼ（昭和電工
（株））、サビナーゼ（ノヴォ(NOVO)社製）、マキサカ
ル（ギスト(GIST)社製）、アルカラーゼ（ノヴォ(NOVO)
社製）、バイオサム（昭和電工（株））等が用いられて
いる。また、自動食器洗浄機の普及に伴って、自動食器
洗浄機用洗剤に配合可能な酵素が求められている。卵
黄、乳製品等のタンパク質性の食器汚れに対して、プロ
テアーゼが有効である。ただし、一般に酵素は高温水中
で使用すると失活が促進されるので優れた安定性が要求
される。現在この目的にはエスペラーゼ（ノヴォ(NOVO)
社製）等が用いられているが、十分な活性、安定性を兼
ね備えているとは言えない。これまでに知られているプ
ロテアーゼで界面活性剤に対して最も安定性の高いの
は、バチルスＳＤ５２１株の産するプロテアーゼ（特開
平3-191781号）であるが、更に安定性の高いプロテアー
ゼが望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、界面活性剤存在下においてより安定性の高いアルカ
リプロテアーゼ、そのアルカリプロテアーゼの製造方
法、そのプロテアーゼを含む洗剤組成物等の用途、及び
そのようなプロテアーゼを生産する微生物を提供するこ
とにある。
は、界面活性剤存在下においてより安定性の高いアルカ
リプロテアーゼ、そのアルカリプロテアーゼの製造方
法、そのプロテアーゼを含む洗剤組成物等の用途、及び
そのようなプロテアーゼを生産する微生物を提供するこ
とにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、バチルス属の１
菌株である、バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４
株が生産するプロテアーゼＡＰＩ−２６が優れた安定性
を有し、また洗浄性にも優れていることを見出し、本発
明を完成するに至った。
に本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、バチルス属の１
菌株である、バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４
株が生産するプロテアーゼＡＰＩ−２６が優れた安定性
を有し、また洗浄性にも優れていることを見出し、本発
明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は １） 以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの条件を
充たすアルカリプロテアーゼ。 （ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存
活性を有する。 （ｂ）緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 （ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存
活性を有する；
充たすアルカリプロテアーゼ。 （ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存
活性を有する。 （ｂ）緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 （ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存
活性を有する；
【０００６】２） 以下の性質を有する前記１）に記載
のアルカリプロテアーゼ。 (1) 作用 タンパク質及びペプチドを加水分解する。 (2) 至適ｐＨ カゼインを基質とし３０℃にて１０分間反応させたとき
至適ｐＨは１２付近にある。 (3) 安定ｐＨ域 ３０℃で２４時間インキュベートしたとき、ｐＨ５〜１
１で安定である。 (4) 至適温度 カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１０分間反応させたと
き、至適温度が６０℃付近にある。 (5) 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量は29000±2000である。 (6) 等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点
は10.1±0.5である；
のアルカリプロテアーゼ。 (1) 作用 タンパク質及びペプチドを加水分解する。 (2) 至適ｐＨ カゼインを基質とし３０℃にて１０分間反応させたとき
至適ｐＨは１２付近にある。 (3) 安定ｐＨ域 ３０℃で２４時間インキュベートしたとき、ｐＨ５〜１
１で安定である。 (4) 至適温度 カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１０分間反応させたと
き、至適温度が６０℃付近にある。 (5) 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量は29000±2000である。 (6) 等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点
は10.1±0.5である；
【０００７】３） バチルス（Bacillus）属に属する微
生物が生産する前記１）乃至２）のいずれかに記載のア
ルカリプロテアーゼ； ４） バチルス（Bacillus）属に属する微生物がバチル
スｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-
15214）である前記３）に記載のアルカリプロテアー
ゼ； ５） 前記４に記載のプロテアーゼと免疫学的交差性を
示し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの条件を
充たすアルカリプロテアーゼ。 （ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存
活性を有する。 （ｂ）緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 （ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存
活性を有する；
生物が生産する前記１）乃至２）のいずれかに記載のア
ルカリプロテアーゼ； ４） バチルス（Bacillus）属に属する微生物がバチル
スｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-
15214）である前記３）に記載のアルカリプロテアー
ゼ； ５） 前記４に記載のプロテアーゼと免疫学的交差性を
示し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの条件を
充たすアルカリプロテアーゼ。 （ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存
活性を有する。 （ｂ）緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 （ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存
活性を有する；
【０００８】６） 前記１）乃至５）のいずれかに記載
のプロテアーゼの生産能を有するバチルス（Bacillus）
属に属する微生物またはその変異株を培養し、その培養
物から該プロテアーゼを採取することを特徴とするアル
カリプロテアーゼの製造方法； ７） バチルス（Bacillus）属に属する微生物がバチル
スｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-
15214）である前記６）に記載のアルカリプロテアーゼ
の製造方法； ８） バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受
託番号FERM P-15214）及びその変異株； ９） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテアー
ゼを含む洗浄剤組成物； １０） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテア
ーゼを含む洗剤； １１） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテア
ーゼを含む自動食器洗浄機用洗剤； １２） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテア
ーゼを蛋白質またはペプチドに作用させることを特徴と
するペプチドまたはアミノ酸の製造方法を提供する。 以下本発明を詳細に説明する。
のプロテアーゼの生産能を有するバチルス（Bacillus）
属に属する微生物またはその変異株を培養し、その培養
物から該プロテアーゼを採取することを特徴とするアル
カリプロテアーゼの製造方法； ７） バチルス（Bacillus）属に属する微生物がバチル
スｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番号FERM P-
15214）である前記６）に記載のアルカリプロテアーゼ
の製造方法； ８） バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受
託番号FERM P-15214）及びその変異株； ９） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテアー
ゼを含む洗浄剤組成物； １０） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテア
ーゼを含む洗剤； １１） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテア
ーゼを含む自動食器洗浄機用洗剤； １２） 前記１）乃至５）のいずれかに記載のプロテア
ーゼを蛋白質またはペプチドに作用させることを特徴と
するペプチドまたはアミノ酸の製造方法を提供する。 以下本発明を詳細に説明する。
【０００９】［酵素生産菌］本発明の酵素を生産する菌
株の１つであるバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１
４株は以下に述べる如く、菌学的性質からはBacillus f
irmusに近縁の菌株と判断されるが、いくつかの性質に
おいて他の公知の菌株と明らかに相違し、新規な菌と認
定された。
株の１つであるバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１
４株は以下に述べる如く、菌学的性質からはBacillus f
irmusに近縁の菌株と判断されるが、いくつかの性質に
おいて他の公知の菌株と明らかに相違し、新規な菌と認
定された。
【００１０】菌学的性質：本発明に係るバチルスｓｐ.
(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株は、以下に示す菌学的性質
を示す。 (a)形態：桿菌、 (b)グラム染色性：＋、 (c)胞子形成能：＋、 (d)胞子形態：楕円形、 (e)運動性：＋、 (f)酸素に対する態度：好気性、 (g)カタラーゼ生産：＋、 (h)嫌気下での生育：−、 (i)ＶＰ反応：−、 (j)ＶＰブロスのｐＨ：6.2 、 (k)酸の生成： グルコース − アラビノース − キシロース − マンニトール − (l)グルコースからのガスの生成：−、 (m)ゼラチンの液化：＋、 (n)デンプンの分解：＋、 (o)クエン酸塩類の利用：−、 (p)プロピオン酸塩の利用：−、 (q)フェニルアラニンデアミネーション：−、 (r)卵黄反応：−、 (s)硝酸塩の還元：−、 (t)ｐＨ6.8 での生育：＋、 (u)ｐＨ5.7 での生育：＋、 (v)５％塩化ナトリウム存在下での生育：＋、 (w)７％塩化ナトリウム存在下での生育：＋、 (x)１０℃での生育：＋、 (y)３０℃での生育：＋、 (z)５５℃での生育：＋、 (aa)菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：４５％。
(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株は、以下に示す菌学的性質
を示す。 (a)形態：桿菌、 (b)グラム染色性：＋、 (c)胞子形成能：＋、 (d)胞子形態：楕円形、 (e)運動性：＋、 (f)酸素に対する態度：好気性、 (g)カタラーゼ生産：＋、 (h)嫌気下での生育：−、 (i)ＶＰ反応：−、 (j)ＶＰブロスのｐＨ：6.2 、 (k)酸の生成： グルコース − アラビノース − キシロース − マンニトール − (l)グルコースからのガスの生成：−、 (m)ゼラチンの液化：＋、 (n)デンプンの分解：＋、 (o)クエン酸塩類の利用：−、 (p)プロピオン酸塩の利用：−、 (q)フェニルアラニンデアミネーション：−、 (r)卵黄反応：−、 (s)硝酸塩の還元：−、 (t)ｐＨ6.8 での生育：＋、 (u)ｐＨ5.7 での生育：＋、 (v)５％塩化ナトリウム存在下での生育：＋、 (w)７％塩化ナトリウム存在下での生育：＋、 (x)１０℃での生育：＋、 (y)３０℃での生育：＋、 (z)５５℃での生育：＋、 (aa)菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％）：４５％。
【００１１】上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上
の性質を“バージーズ・マニュアル・オブ・システマチ
ック・バクテリオロジー”VOL.2(1986) William ＆ Wil
kinsを参考にして他の菌株と比較すると以下の通りであ
る。本発明に係るバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１
１４株は糖からの酸の生成や、５０℃での生育において
バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）の典型的な
性状を示さなかった。一方、公知の菌株であるＳＤ５２
１株はグルコースから酸を生成し、硝酸塩を還元し、ｐ
Ｈ6.8で生育せず、５０℃で生育しない。ＮＣＩＢ１０
３０９はグルコース、アラビノース、マンニトールから
酸を生成する。ＰＢ９２はグルコース、キシロースから
酸を生成し、プロピオン酸塩を利用出来る。以上の菌学
的性質から明らかなように本菌株ＳＤ１１４株は中温菌
であり、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）と
近縁のバチルスｓｐ.(Bacillussp.)と判断され、他の公
知菌株とも相違する。従って、本菌株はバチルス（Baci
llus）属に属する新菌株と認められた。本菌株は工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15214として寄託
されている。
の性質を“バージーズ・マニュアル・オブ・システマチ
ック・バクテリオロジー”VOL.2(1986) William ＆ Wil
kinsを参考にして他の菌株と比較すると以下の通りであ
る。本発明に係るバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１
１４株は糖からの酸の生成や、５０℃での生育において
バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）の典型的な
性状を示さなかった。一方、公知の菌株であるＳＤ５２
１株はグルコースから酸を生成し、硝酸塩を還元し、ｐ
Ｈ6.8で生育せず、５０℃で生育しない。ＮＣＩＢ１０
３０９はグルコース、アラビノース、マンニトールから
酸を生成する。ＰＢ９２はグルコース、キシロースから
酸を生成し、プロピオン酸塩を利用出来る。以上の菌学
的性質から明らかなように本菌株ＳＤ１１４株は中温菌
であり、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）と
近縁のバチルスｓｐ.(Bacillussp.)と判断され、他の公
知菌株とも相違する。従って、本菌株はバチルス（Baci
llus）属に属する新菌株と認められた。本菌株は工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15214として寄託
されている。
【００１２】また、上記ＳＤ１１４株を元菌株として自
然または誘発突然変異により、上記菌株が生産する性質
を有するプロテアーゼを生産する変異株を得て、本発明
によるプロテアーゼ生産菌として用いることが出来る。
これらの変異株を調製する方法としては、従来知られて
いる慣用の方法、例えば元菌株を紫外線照射あるいはＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ
ＴＧ）等の薬剤による人工突然変異処理を施して、スキ
ムミルク等を含む寒天培地に広げ、生育してくる菌株の
中からコロニーのまわりに形成されるクリアゾーンが、
より大きいコロニーを選抜し、生産性の優れた菌株を選
別する方法を用いることが出来る。また本発明の酵素を
生産する性質を有するプロテアーゼ遺伝子を適当な自己
複製するＤＮＡと連結し、これを用いて適当な宿主細胞
を形質転換し、遺伝子増幅効果によって生産性を向上さ
せることもできる。
然または誘発突然変異により、上記菌株が生産する性質
を有するプロテアーゼを生産する変異株を得て、本発明
によるプロテアーゼ生産菌として用いることが出来る。
これらの変異株を調製する方法としては、従来知られて
いる慣用の方法、例えば元菌株を紫外線照射あるいはＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ
ＴＧ）等の薬剤による人工突然変異処理を施して、スキ
ムミルク等を含む寒天培地に広げ、生育してくる菌株の
中からコロニーのまわりに形成されるクリアゾーンが、
より大きいコロニーを選抜し、生産性の優れた菌株を選
別する方法を用いることが出来る。また本発明の酵素を
生産する性質を有するプロテアーゼ遺伝子を適当な自己
複製するＤＮＡと連結し、これを用いて適当な宿主細胞
を形質転換し、遺伝子増幅効果によって生産性を向上さ
せることもできる。
【００１３】［プロテアーゼの製造方法］本発明のプロ
テアーゼを製造するに際して使用される培地は、本発明
のプロテアーゼ生産菌が増殖し、プロテアーゼを生産し
得るものならば任意のものでよい。例えば、炭素源とし
てはグルコース、マルトース、シュークロース、可溶性
デンプン等が用いられ、窒素源としては、大豆かす、ご
まかす、ふすまかす、コーンスティープリカー等の有機
窒素源が用いられる。また、この他にリン酸塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩等の無機塩類が添加される。本発
明においては、培養は好気的条件下で、例えば通気撹拌
法や振とう培養法で行う。培養温度は２０〜４０℃の範
囲で良いが、生育の最も良好な３０〜３７℃が望まし
い。初発ｐＨは９〜１０、培養中のｐＨは 8.5〜１０が
それぞれ好ましい。培養時間は１６〜６０時間程度であ
り、プロテアーゼ活性が最高に達した時に培養を終了す
るのが望ましい。このように得られる培養液から目的と
するプロテアーゼの精製は一般の酵素の分離精製に準じ
て行うことが出来る。遠心分離、またはろ過等によって
菌体、培地固形物を除去し、上清またはろ液を得ること
が出来る。これらの分離液に可溶性塩類、親水性有機溶
媒を添加し、蛋白質を沈殿させる塩析法、溶媒沈殿法、
噴霧乾燥法、凍結乾燥法等により本発明のプロテアーゼ
を得る。さらにイオン交換クロマトグラフィー及びゲル
ろ過クロマトグラフィー等の精製法を組み合わせ、精製
することが出来る。かくして得られる本発明のプロテア
ーゼをＡＰＩ−２６と命名した。ＡＰＩ−２６の活性は
以下に示す方法にて測定される。
テアーゼを製造するに際して使用される培地は、本発明
のプロテアーゼ生産菌が増殖し、プロテアーゼを生産し
得るものならば任意のものでよい。例えば、炭素源とし
てはグルコース、マルトース、シュークロース、可溶性
デンプン等が用いられ、窒素源としては、大豆かす、ご
まかす、ふすまかす、コーンスティープリカー等の有機
窒素源が用いられる。また、この他にリン酸塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩等の無機塩類が添加される。本発
明においては、培養は好気的条件下で、例えば通気撹拌
法や振とう培養法で行う。培養温度は２０〜４０℃の範
囲で良いが、生育の最も良好な３０〜３７℃が望まし
い。初発ｐＨは９〜１０、培養中のｐＨは 8.5〜１０が
それぞれ好ましい。培養時間は１６〜６０時間程度であ
り、プロテアーゼ活性が最高に達した時に培養を終了す
るのが望ましい。このように得られる培養液から目的と
するプロテアーゼの精製は一般の酵素の分離精製に準じ
て行うことが出来る。遠心分離、またはろ過等によって
菌体、培地固形物を除去し、上清またはろ液を得ること
が出来る。これらの分離液に可溶性塩類、親水性有機溶
媒を添加し、蛋白質を沈殿させる塩析法、溶媒沈殿法、
噴霧乾燥法、凍結乾燥法等により本発明のプロテアーゼ
を得る。さらにイオン交換クロマトグラフィー及びゲル
ろ過クロマトグラフィー等の精製法を組み合わせ、精製
することが出来る。かくして得られる本発明のプロテア
ーゼをＡＰＩ−２６と命名した。ＡＰＩ−２６の活性は
以下に示す方法にて測定される。
【００１４】［酵素活性測定法］ｐＨ１０の５０ｍＭ
Atkins-Pantinのほう酸緩衝液５００μｌに、適当に希
釈した酵素液５０μｌを加え、３０℃で３〜５分プレイ
ンキュベートする。この溶液にｐＨ１０の２％ハマース
テインカゼイン溶液５００μｌを加え、１０分後トリク
ロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液（0.132Ｍ ＴＣＡ：酢酸緩衝
液でｐＨ４に調整）２ｍｌを加えて反応を停止させる。
３０℃１０分以上放置後、No.2のフィルターペーパー
（東洋ろ紙）を用いてろ過する。ろ液１ｍｌに0.4 Ｍ炭
酸ソーダ５ｍｌ、水で６倍希釈のフェノール試薬１ｍｌ
を添加し、３０℃で２０分間放置して発色させた後、６
６０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素単位は３０
℃、ｐＨ１０でカゼインを基質として反応させたとき、
ＴＣＡ画分中に１秒間にチロシン１モル相当の６６０ｎ
ｍの発色を示す分解物を生成するプロテアーゼ活性を１
カタール（１katal）とする。
Atkins-Pantinのほう酸緩衝液５００μｌに、適当に希
釈した酵素液５０μｌを加え、３０℃で３〜５分プレイ
ンキュベートする。この溶液にｐＨ１０の２％ハマース
テインカゼイン溶液５００μｌを加え、１０分後トリク
ロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液（0.132Ｍ ＴＣＡ：酢酸緩衝
液でｐＨ４に調整）２ｍｌを加えて反応を停止させる。
３０℃１０分以上放置後、No.2のフィルターペーパー
（東洋ろ紙）を用いてろ過する。ろ液１ｍｌに0.4 Ｍ炭
酸ソーダ５ｍｌ、水で６倍希釈のフェノール試薬１ｍｌ
を添加し、３０℃で２０分間放置して発色させた後、６
６０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素単位は３０
℃、ｐＨ１０でカゼインを基質として反応させたとき、
ＴＣＡ画分中に１秒間にチロシン１モル相当の６６０ｎ
ｍの発色を示す分解物を生成するプロテアーゼ活性を１
カタール（１katal）とする。
【００１５】［プロテアーゼの性質］次に本発明で得ら
れるプロテアーゼ（ＡＰＩ−２６）の理化学的性質につ
いて述べる。 (1)作用及び基質特異性 タンパク質及びペプチド、例えばカゼイン、ヘモグロビ
ン、アルブミン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タン
パクなどを分解する。
れるプロテアーゼ（ＡＰＩ−２６）の理化学的性質につ
いて述べる。 (1)作用及び基質特異性 タンパク質及びペプチド、例えばカゼイン、ヘモグロビ
ン、アルブミン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タン
パクなどを分解する。
【００１６】(2)至適ｐＨ 至適ｐＨの測定法：緩衝液としてBritton-Robinsonの広
域緩衝液を使用した。また至適ｐＨを調べるに当たって
は、１％カゼインを含む各ｐＨ緩衝液中に、酵素を約２
０nkatal／ｍｌとるように加え、３０℃で１０分間反応
させ活性を測定し、ｐＨ11.7での活性を１００とし表１
及び図１に示した。本酵素はｐＨ１２付近に至適ｐＨを
有することが分かる。
域緩衝液を使用した。また至適ｐＨを調べるに当たって
は、１％カゼインを含む各ｐＨ緩衝液中に、酵素を約２
０nkatal／ｍｌとるように加え、３０℃で１０分間反応
させ活性を測定し、ｐＨ11.7での活性を１００とし表１
及び図１に示した。本酵素はｐＨ１２付近に至適ｐＨを
有することが分かる。
【００１７】(3)安定ｐＨ域 安定ｐＨ域の測定法：各ｐＨの緩衝液に酵素を約２０nk
atal／ｍｌとなるように加え、３０℃で２４時間インキ
ュベートした後の活性を測定した。インキュベート前の
活性を１００として、各ｐＨでの残存活性を表２及び図
２に示した。本酵素の安定ｐＨ域は３０℃で５〜１１で
あることが分かる。
atal／ｍｌとなるように加え、３０℃で２４時間インキ
ュベートした後の活性を測定した。インキュベート前の
活性を１００として、各ｐＨでの残存活性を表２及び図
２に示した。本酵素の安定ｐＨ域は３０℃で５〜１１で
あることが分かる。
【００１８】
【表１】 表１ ｐＨ 7.1 7.9 9.0 9.9 10.6 11.2 11.7 12.1 活性 19 35 46 64 79 86 100 94
【００１９】
【表２】 表２ ｐＨ 4 5 6 7 8 9 10 11 12 残存活性 0 100 100 100 100 100 100 100 0
【００２０】(4)至適温度 至適温度の測定法：基質として１％のカゼイン及び２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid、エ
チレンジアミン四酢酸) を含むｐＨ１０の２５ｍＭ Atk
ins-Pantinほう酸緩衝液を５分間各温度でプレインキュ
ベートした後、酵素を添加し１０分間各温度で反応させ
た。６０℃での活性を１００として各温度での相対活性
を表３及び図３に示す。本酵素は６０℃付近に至適温度
を有することが分かる。
Ｍ ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid、エ
チレンジアミン四酢酸) を含むｐＨ１０の２５ｍＭ Atk
ins-Pantinほう酸緩衝液を５分間各温度でプレインキュ
ベートした後、酵素を添加し１０分間各温度で反応させ
た。６０℃での活性を１００として各温度での相対活性
を表３及び図３に示す。本酵素は６０℃付近に至適温度
を有することが分かる。
【００２１】
【表３】 表３ 温度（℃） 30 40 50 60 70 活性 13 25 49 100 35
【００２２】(5)阻害剤の影響 以下の条件及び方法により本酵素に対する各種阻害剤の
影響を調べた。５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）で、
本酵素を約２０nkatal／ｍｌになるように調製し、ＥＤ
ＴＡ、ＰＣＭＶ（ｐ−メルクリ安息香酸）、ＰＭＳＦ
（フェニルメタンスルホニルフルオリド）を表４に示し
た濃度で添加し、３０℃３０分間インキュベート後活性
を測定した。阻害剤無添加のものを１００％とした相対
活性で表した結果を表４に示す。表４から明らかなよう
に本酵素はＰＭＳＦにより著しく阻害されることから、
セリンプロテアーゼであることがわかる。
影響を調べた。５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ１０）で、
本酵素を約２０nkatal／ｍｌになるように調製し、ＥＤ
ＴＡ、ＰＣＭＶ（ｐ−メルクリ安息香酸）、ＰＭＳＦ
（フェニルメタンスルホニルフルオリド）を表４に示し
た濃度で添加し、３０℃３０分間インキュベート後活性
を測定した。阻害剤無添加のものを１００％とした相対
活性で表した結果を表４に示す。表４から明らかなよう
に本酵素はＰＭＳＦにより著しく阻害されることから、
セリンプロテアーゼであることがわかる。
【００２３】
【表４】表４阻害剤 濃 度 活 性 無添加 １００ ＰＣＭＶ １ｍＭ １００ ＰＭＳＦ １０ｍＭ 0.7ＥＤＴＡ ５ｍＭ ９９
【００２４】(6)分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、
本酵素の分子量は、29000±2000と算出された。 (7)等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られ
た等電点は10.1±0.5である。
本酵素の分子量は、29000±2000と算出された。 (7)等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られ
た等電点は10.1±0.5である。
【００２５】(8)安定性 以下に示す条件のうち少なくとも１つを充たす。 (a) 界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸
緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）５００ｐｐ
ｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存活性を有
する。 (b) 緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 (c) 界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸
緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５０
０ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存活
性を有する。
緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）５００ｐｐ
ｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存活性を有
する。 (b) 緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 (c) 界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸
緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５０
０ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存活
性を有する。
【００２６】［抗ＡＰＩ２６抗体との交差性］本発明の
プロテアーゼは、以下の測定条件で好ましくは抗ＡＰＩ
−２６抗体と交差反応を示す。 交差反応測定条件：抗原であるＡＰＩ−２６を２ｍｇ／
ｍｌに調製し、等量のフロイント完全アジュバンド（Fr
eund's complete adjuvant）と混合し、完全に油中水滴
状（Waterin oil）にする。２羽の雌ウサギにこの試料
１ｍｌを０日目、２１日目、４２日目、６３日目の間隔
で注射する。７０日目に全採血し、抗体を含む血清を調
製する。交差反応はオークタロニー（Ouchterlony）法
（Acta.Med.Scan.133, 76-79(1950)）によって評価す
る。すなわち、中央の穴に１ｍｇ／ｍｌのＡＰＩ２６ま
たは同濃度の他プロテアーゼ１０μｌ添加し、周りの穴
に２のｎ乗系列（ｎ＝１，２，３，４，５，６，７）で
希釈した抗血清を添加し、湿潤箱に入れて３７℃で一晩
放置し沈降線を観察する。ＡＰＩ２６に対して沈降線を
形成する限界の濃度の少なくとも４倍以上の濃度で沈降
線を形成する場合、抗ＡＰＩ−２６抗体と交差性を有す
ると判断する。
プロテアーゼは、以下の測定条件で好ましくは抗ＡＰＩ
−２６抗体と交差反応を示す。 交差反応測定条件：抗原であるＡＰＩ−２６を２ｍｇ／
ｍｌに調製し、等量のフロイント完全アジュバンド（Fr
eund's complete adjuvant）と混合し、完全に油中水滴
状（Waterin oil）にする。２羽の雌ウサギにこの試料
１ｍｌを０日目、２１日目、４２日目、６３日目の間隔
で注射する。７０日目に全採血し、抗体を含む血清を調
製する。交差反応はオークタロニー（Ouchterlony）法
（Acta.Med.Scan.133, 76-79(1950)）によって評価す
る。すなわち、中央の穴に１ｍｇ／ｍｌのＡＰＩ２６ま
たは同濃度の他プロテアーゼ１０μｌ添加し、周りの穴
に２のｎ乗系列（ｎ＝１，２，３，４，５，６，７）で
希釈した抗血清を添加し、湿潤箱に入れて３７℃で一晩
放置し沈降線を観察する。ＡＰＩ２６に対して沈降線を
形成する限界の濃度の少なくとも４倍以上の濃度で沈降
線を形成する場合、抗ＡＰＩ−２６抗体と交差性を有す
ると判断する。
【００２７】［プロテアーゼ作用方法］本発明のプロテ
アーゼをタンパク質やペプチドに作用させることにより
ペプチドやアミノ酸を製造することが出来る。また、タ
ンパク質やペプチドを成分に含む目的物質に作用させる
ことにより目的物質の加工に使用することが出来る。そ
の方法としては、従来用いられてきた方法において、従
来酵素の代わりに本発明のプロテアーゼを使用する形態
をとることが出来る。さらに従来酵素が失活してしまう
ような過酷な条件においても、本発明のプロテアーゼが
活性を保持する限りは使用可能である。例えば５０ｐｐ
ｍ以上５００ｐｐｍ以下のＬＡＳ存在下は勿論のこと、
５００ｐｐｍ以上のＬＡＳ存在下においても使用可能で
ある。ただし、好ましくは３０００ｐｐｍ以下、より好
ましくは３００ｐｐｍ以下で使用する。また、温度に関
しては４８℃以上の高温においても使用可能である。た
だし、好ましくは７５℃以下、より好ましくは７０℃以
下にて使用する。
アーゼをタンパク質やペプチドに作用させることにより
ペプチドやアミノ酸を製造することが出来る。また、タ
ンパク質やペプチドを成分に含む目的物質に作用させる
ことにより目的物質の加工に使用することが出来る。そ
の方法としては、従来用いられてきた方法において、従
来酵素の代わりに本発明のプロテアーゼを使用する形態
をとることが出来る。さらに従来酵素が失活してしまう
ような過酷な条件においても、本発明のプロテアーゼが
活性を保持する限りは使用可能である。例えば５０ｐｐ
ｍ以上５００ｐｐｍ以下のＬＡＳ存在下は勿論のこと、
５００ｐｐｍ以上のＬＡＳ存在下においても使用可能で
ある。ただし、好ましくは３０００ｐｐｍ以下、より好
ましくは３００ｐｐｍ以下で使用する。また、温度に関
しては４８℃以上の高温においても使用可能である。た
だし、好ましくは７５℃以下、より好ましくは７０℃以
下にて使用する。
【００２８】［用途］本発明のアルカリプロテアーゼは
既存のアルカリプロテアーゼに比べて各種市販洗浄剤溶
液中や界面活性剤存在下で高い安定性を有する。また熱
に対しても安定であり、洗濯や食器洗浄で使用される温
水中においてタンパク質の汚れを効率的に分解するの
で、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることが出来る。
その他の用途としては、例えば、飼料加工、食品加工
（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、羊毛加工、皮革
加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄等があり、また
入浴剤や脱毛剤に配合することも出来る。
既存のアルカリプロテアーゼに比べて各種市販洗浄剤溶
液中や界面活性剤存在下で高い安定性を有する。また熱
に対しても安定であり、洗濯や食器洗浄で使用される温
水中においてタンパク質の汚れを効率的に分解するの
で、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることが出来る。
その他の用途としては、例えば、飼料加工、食品加工
（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、羊毛加工、皮革
加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄等があり、また
入浴剤や脱毛剤に配合することも出来る。
【００２９】［洗浄剤組成物］本発明により、前記の性
質を有するアルカリプロテアーゼを配合した洗浄剤組成
物が提供される。本発明の洗浄剤組成物に配合されるア
ルカリプロテアーゼの量には特に限定はないが、洗浄液
１リットル当たり、１０〜１０００nkatalに相当する量
を配合するのが適当である。この配合量が少なすぎると
十分な洗浄効果の向上が得られず、また逆に多過ぎた場
合には酵素配合量に比して洗浄効果の向上が大きくな
く、経済性の点で好ましくない。
質を有するアルカリプロテアーゼを配合した洗浄剤組成
物が提供される。本発明の洗浄剤組成物に配合されるア
ルカリプロテアーゼの量には特に限定はないが、洗浄液
１リットル当たり、１０〜１０００nkatalに相当する量
を配合するのが適当である。この配合量が少なすぎると
十分な洗浄効果の向上が得られず、また逆に多過ぎた場
合には酵素配合量に比して洗浄効果の向上が大きくな
く、経済性の点で好ましくない。
【００３０】本発明に従えば、前記アルカリプロテアー
ゼは従来公知の任意の洗浄剤組成物に洗剤組成物の組成
を何等変更することなく配合することができ、本発明の
洗浄剤組成物の成分については特に限定はない。そのよ
うな洗浄剤組成物の代表例をあげれば、洗浄剤組成物重
量当たり１０〜５０重量％の界面活性剤、０〜５０重量
％のビルダー、１〜５０重量％のアルカリ剤あるいは無
機電解質、0.1〜５重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白
剤、蛍光染料、ケーキング防止剤及び酸化防止剤からな
る群より選ばれる少なくとも１種以上の配合成分からな
る洗浄剤組成物があげられる。
ゼは従来公知の任意の洗浄剤組成物に洗剤組成物の組成
を何等変更することなく配合することができ、本発明の
洗浄剤組成物の成分については特に限定はない。そのよ
うな洗浄剤組成物の代表例をあげれば、洗浄剤組成物重
量当たり１０〜５０重量％の界面活性剤、０〜５０重量
％のビルダー、１〜５０重量％のアルカリ剤あるいは無
機電解質、0.1〜５重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白
剤、蛍光染料、ケーキング防止剤及び酸化防止剤からな
る群より選ばれる少なくとも１種以上の配合成分からな
る洗浄剤組成物があげられる。
【００３１】界面活性剤としては石鹸、例えば直鎖また
は分岐アルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド硫酸
塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基
を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及
びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が
付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩のよ
うな脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミドス
ルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オレフ
ィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィンの各
スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または
分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳香族
スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはア
ルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオ
キサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは
複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル
カルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩または
エステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアル
ケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニル
リン酸塩の如きリン酸エステル系界面活性剤、スルホン
酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直鎖
または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、
エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレ
ンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加した
アルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコー
ル、直鎖または分岐鎖のアルキル基を有し、エチレンオ
キサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイ
ドのうちの単独あるいは複数成分が付加したポリオキシ
エチレンアルキルフェニルエーテル、高級脂肪酸アルカ
ノールアミドまたはそのアルキレンオキサイド付加物、
ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンモノエステ
ル、アルキルまたはアルケニルアミンオキサイド、テト
ラアルキルアンモニウム塩型カチオン界面活性剤など洗
剤組成物として通常配合される界面活性剤であればいず
れも使用可能であり、陰イオン性界面活性剤の場合の対
イオンとしてはナトリウムイオンまたはカリウムイオン
であることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独ま
たは２種以上の混合物として使用される。
は分岐アルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド硫酸
塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基
を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及
びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が
付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩のよ
うな脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミドス
ルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オレフ
ィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィンの各
スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または
分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳香族
スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはア
ルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオ
キサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは
複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル
カルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩または
エステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアル
ケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニル
リン酸塩の如きリン酸エステル系界面活性剤、スルホン
酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直鎖
または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、
エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレ
ンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加した
アルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコー
ル、直鎖または分岐鎖のアルキル基を有し、エチレンオ
キサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイ
ドのうちの単独あるいは複数成分が付加したポリオキシ
エチレンアルキルフェニルエーテル、高級脂肪酸アルカ
ノールアミドまたはそのアルキレンオキサイド付加物、
ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンモノエステ
ル、アルキルまたはアルケニルアミンオキサイド、テト
ラアルキルアンモニウム塩型カチオン界面活性剤など洗
剤組成物として通常配合される界面活性剤であればいず
れも使用可能であり、陰イオン性界面活性剤の場合の対
イオンとしてはナトリウムイオンまたはカリウムイオン
であることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独ま
たは２種以上の混合物として使用される。
【００３２】ビルダー及びアルカリ剤あるいは無機電解
質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸
塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩
などのリン酸塩、エタン−１，１−ジホスホン酸、エタ
ン−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１−ヒドロ
キシ−１，１−ジホスホン酸及びその誘導体、エタンヒ
ドロキシ−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１，
２−ジカルボキシ−１，２−ジホスホン酸、メタンヒド
ロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、２−ホスホノブ
タン−１，２−ジカルボン酸、１−ホスホノブタン−
２，３，４−トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハ
ク酸などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩
などのアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコ
ン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カル
ボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離
高分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキ
シメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シ
ョ糖、ラクトースなどのカルボキシメチル化物、ペンタ
エリスリトールのカルボキシメチル化物、グルコン酸の
カルボキシメチル化物、ベンゼンポリカルボン酸、シュ
ウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸などの
有機酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、炭酸
塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸塩などの無機塩
をアルカリ金属塩として用いることができ、またデンプ
ン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリウム、ベントナ
イトなどの無機化合物を用いることができ、更には有機
アルカリ剤としてトリエタノールアミン、ジエタノール
アミン、モノエタノールアミン、トリイソプロパノール
アミンなどを用いることができる。
質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸
塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩
などのリン酸塩、エタン−１，１−ジホスホン酸、エタ
ン−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１−ヒドロ
キシ−１，１−ジホスホン酸及びその誘導体、エタンヒ
ドロキシ−１，１，２−トリホスホン酸、エタン−１，
２−ジカルボキシ−１，２−ジホスホン酸、メタンヒド
ロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、２−ホスホノブ
タン−１，２−ジカルボン酸、１−ホスホノブタン−
２，３，４−トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハ
ク酸などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩
などのアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコ
ン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カル
ボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離
高分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキ
シメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シ
ョ糖、ラクトースなどのカルボキシメチル化物、ペンタ
エリスリトールのカルボキシメチル化物、グルコン酸の
カルボキシメチル化物、ベンゼンポリカルボン酸、シュ
ウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸などの
有機酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、炭酸
塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸塩などの無機塩
をアルカリ金属塩として用いることができ、またデンプ
ン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリウム、ベントナ
イトなどの無機化合物を用いることができ、更には有機
アルカリ剤としてトリエタノールアミン、ジエタノール
アミン、モノエタノールアミン、トリイソプロパノール
アミンなどを用いることができる。
【００３３】本発明の洗浄剤組成物は、前述の如く、界
面活性剤、本発明のアルカリプロテアーゼ、アルカリ剤
または無機電解質を必須の構成成分として含むが、その
他必要に応じて両性界面活性剤、例えば過炭酸ソーダ、
過ホウ酸ソーダなどの漂白剤、漂白活性剤、色素、ビル
ダー、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセル
ロースなどの再汚染防止剤、ケーキング防止剤、酸化防
止剤、耐食剤、蛍光増白剤、起泡増進剤、リパーゼなど
のその他の酵素を必要に応じて含ませることができる。
面活性剤、本発明のアルカリプロテアーゼ、アルカリ剤
または無機電解質を必須の構成成分として含むが、その
他必要に応じて両性界面活性剤、例えば過炭酸ソーダ、
過ホウ酸ソーダなどの漂白剤、漂白活性剤、色素、ビル
ダー、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセル
ロースなどの再汚染防止剤、ケーキング防止剤、酸化防
止剤、耐食剤、蛍光増白剤、起泡増進剤、リパーゼなど
のその他の酵素を必要に応じて含ませることができる。
【００３４】本発明の洗浄剤組成物に酵素を配合するに
は如何なる方法をもって行ってもよいが、微粉末状で配
合することは、洗剤取扱い時の発塵による洗剤使用者や
洗剤工業における作業者の安全衛生上好ましいことでは
なく、溶液状態あるいはあらかじめ発塵性をおさえた形
状に賦形しておくことが好ましい。この賦形は通常良く
用いられるマルメ造粒、押し出し造粒、流動造粒、遠心
流動造粒やその他の方法のいずれによるものであっても
良く、本発明の洗浄剤組成物に配合する酵素の形状は特
にこれらの方法によって賦形されたものに限定されるも
のではない。なお、本発明のアルカリプロテアーゼは安
定性が高いため、通常、酵素の製剤（賦形）が行われる
温度以上の温度、例えば５０℃以上での賦形も可能であ
る。
は如何なる方法をもって行ってもよいが、微粉末状で配
合することは、洗剤取扱い時の発塵による洗剤使用者や
洗剤工業における作業者の安全衛生上好ましいことでは
なく、溶液状態あるいはあらかじめ発塵性をおさえた形
状に賦形しておくことが好ましい。この賦形は通常良く
用いられるマルメ造粒、押し出し造粒、流動造粒、遠心
流動造粒やその他の方法のいずれによるものであっても
良く、本発明の洗浄剤組成物に配合する酵素の形状は特
にこれらの方法によって賦形されたものに限定されるも
のではない。なお、本発明のアルカリプロテアーゼは安
定性が高いため、通常、酵素の製剤（賦形）が行われる
温度以上の温度、例えば５０℃以上での賦形も可能であ
る。
【００３５】本発明の洗浄剤組成物の具体例としては、
本発明のアルカリプロテアーゼを含む洗濯用洗剤や自動
食器洗浄機用洗剤等の洗剤が挙げられるが、その一例と
して市販の洗剤に本発明のアルカリプロテアーゼを添加
したものが挙げられる。
本発明のアルカリプロテアーゼを含む洗濯用洗剤や自動
食器洗浄機用洗剤等の洗剤が挙げられるが、その一例と
して市販の洗剤に本発明のアルカリプロテアーゼを添加
したものが挙げられる。
【００３６】
【実施例】次に実施例を挙げて説明するが、本発明は下
記の実施例に限定されるものではない。なお、実施例に
記載の市販洗剤はすべて、予めそれに含まれる酵素粒剤
を選別除去する等して実質的に酵素を含まないものを調
製して使用した。 実施例１：バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株
の培養法 カゼイン１％、肉エキス１％及びポリペプトン１％を含
有し、かつ炭酸ナトリウムでｐＨ 7.5に調整した培地３
００ｍｌ中で３５℃、６６時間振とう培養し、培養液中
に酵素を分泌生産させた。この培養液を、４℃、1000Ｇ
で遠心分離し、上清をとり、活性を測定したところ、約
５０nkatal／ｍｌであった。
記の実施例に限定されるものではない。なお、実施例に
記載の市販洗剤はすべて、予めそれに含まれる酵素粒剤
を選別除去する等して実質的に酵素を含まないものを調
製して使用した。 実施例１：バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株
の培養法 カゼイン１％、肉エキス１％及びポリペプトン１％を含
有し、かつ炭酸ナトリウムでｐＨ 7.5に調整した培地３
００ｍｌ中で３５℃、６６時間振とう培養し、培養液中
に酵素を分泌生産させた。この培養液を、４℃、1000Ｇ
で遠心分離し、上清をとり、活性を測定したところ、約
５０nkatal／ｍｌであった。
【００３７】実施例２：ＡＰＩ−２６酵素精製法 実施例１で得られた微生物培養液の上清を除菌膜処理
し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した。この濃縮
液を３０〜６０％飽和の硫安塩析を行った。さらに得ら
れた沈殿を１ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む２５ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ 7.5に溶解し、同緩衝液で透析した。続
いて該溶液をｐＨ 7.5でＣＭセルロファイン（ＣＭ-cel
lulofine）Ｃ−５００カラム（生化学工業製）吸着さ
せ、１ｍＭＣａＣｌ2 を含む０〜１Ｍ ＫＣｌ濃度勾配
法により溶出し、比活性がイオン交換クロマトグラフィ
ー前の約８倍に上昇した酵素画分を回収した。このサン
プルを用いてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行っ
たところ単一バンドとして検出された。
し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した。この濃縮
液を３０〜６０％飽和の硫安塩析を行った。さらに得ら
れた沈殿を１ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む２５ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ 7.5に溶解し、同緩衝液で透析した。続
いて該溶液をｐＨ 7.5でＣＭセルロファイン（ＣＭ-cel
lulofine）Ｃ−５００カラム（生化学工業製）吸着さ
せ、１ｍＭＣａＣｌ2 を含む０〜１Ｍ ＫＣｌ濃度勾配
法により溶出し、比活性がイオン交換クロマトグラフィ
ー前の約８倍に上昇した酵素画分を回収した。このサン
プルを用いてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行っ
たところ単一バンドとして検出された。
【００３８】実施例３：温度安定性 0.1ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ１０の５０ｍＭ Atkins-
Pantin ほう酸緩衝液に約２０nkatal/ml度になるように
本発明の酵素（ＡＰＩ２６）、Subtilisin10309 （NCIB
10309 株の産する酵素）、ＰＢ９２（バチルスＰＢ９２
株の産する酵素）、ＳＤ５２１（バチルスＳＤ５２１株
の産する酵素）を加え、５５℃でインキュベートする。
経時的にサンプリングし、残存活性を３０℃で測定し
た。熱処理なしの活性を１００としたときの各時間での
残存活性を表５示す。但しSubtilisin 10309、ＰＢ９
２、ＳＤ５２１はそれぞれ特公昭51-8401号、特開昭51-
125407号、特開平3-191781号に記載の方法で調製した。
表５及び図４から分かるようにＡＰＩ２６は優れた温度
安定性を有する。
Pantin ほう酸緩衝液に約２０nkatal/ml度になるように
本発明の酵素（ＡＰＩ２６）、Subtilisin10309 （NCIB
10309 株の産する酵素）、ＰＢ９２（バチルスＰＢ９２
株の産する酵素）、ＳＤ５２１（バチルスＳＤ５２１株
の産する酵素）を加え、５５℃でインキュベートする。
経時的にサンプリングし、残存活性を３０℃で測定し
た。熱処理なしの活性を１００としたときの各時間での
残存活性を表５示す。但しSubtilisin 10309、ＰＢ９
２、ＳＤ５２１はそれぞれ特公昭51-8401号、特開昭51-
125407号、特開平3-191781号に記載の方法で調製した。
表５及び図４から分かるようにＡＰＩ２６は優れた温度
安定性を有する。
【００３９】
【表５】 表５：温度安定性（５５℃） 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30 ＡＰＩ２６ 100 70 43 25 30 Subtilisin 10309 100 4 3 3 3 ＰＢ９２ 100 5 3 4 3 ＳＤ５２１ 100 20 13 10 8
【００４０】実施例４：界面活性剤安定性 本酵素の界面活性剤に対する安定性を調べた。 測定法：0.１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Atkins-Pa
ntinほう酸緩衝液ｐＨ１０にＬＡＳを５００ｐｐｍとな
るように溶解する。この溶液に約２０nkatal／ｍｌ濃度
になるように酵素（ＡＰＩ２６、Subtilisin 10309、Ｐ
Ｂ９２、ＳＤ５２１）を加え、４０℃及び５５℃でイン
キュベートし残存活性を３０℃で経時的に測定した。時
間０での活性を１００とした時の各時間での残存活性を
表６（４０℃）及び表７（５５℃）に示す。ＡＰＩ２６
は従来の酵素に比べて格段に優れた界面活性剤安定性を
有することが分かる。
ntinほう酸緩衝液ｐＨ１０にＬＡＳを５００ｐｐｍとな
るように溶解する。この溶液に約２０nkatal／ｍｌ濃度
になるように酵素（ＡＰＩ２６、Subtilisin 10309、Ｐ
Ｂ９２、ＳＤ５２１）を加え、４０℃及び５５℃でイン
キュベートし残存活性を３０℃で経時的に測定した。時
間０での活性を１００とした時の各時間での残存活性を
表６（４０℃）及び表７（５５℃）に示す。ＡＰＩ２６
は従来の酵素に比べて格段に優れた界面活性剤安定性を
有することが分かる。
【００４１】
【表６】 表６：界面活性剤存在下での安定性（４０℃） 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30 ＡＰＩ２６ 100 100 100 99 97 Subtilisin 10309 100 0 0 0 0 ＰＢ９２ 100 0 0 0 0 ＳＤ５２１ 100 7 5 0 0
【００４２】
【表７】 表７：界面活性剤存在下での安定性（５５℃） 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30 ＡＰＩ２６ 100 65 40 20 15 Subtilisin 10309 100 0 0 0 0 ＰＢ９２ 100 0 0 0 0 ＳＤ５２１ 100 3 0 0 0
【００４３】実施例５：ＡＰＩ−２６酵素の洗剤溶液中
での安定性 以下の条件及び方法により市販洗剤ウルトラアリエル
（Ultra Ariel）（Ｐ＆Ｇ社製）、スーパーチアー（Sup
er Cheer）（Ｐ＆Ｇ社製）、タイド・グリィース・リリ
ーシング（Tide Grease Releasing）（Ｐ＆Ｇ社製）溶
液中での本酵素の安定性を調べた。５０ｍＭ Atkins-Pa
ntinほう酸緩衝液ｐＨ１０ ５０ｐｐｍＣａ2+洗剤濃度
1000ｐｐｍの溶液で本酵素ＡＰＩ２６及び他酵素Subtil
isin 10309、ＰＢ９２、ＳＤＩ５２１を約２０nkatal／
ｍｌになるように加え、５５℃または４０℃でインキュ
ベートし、残存活性を３０℃で経時的に測定した。時間
０での活性を１００とした時の各時間での残存活性を表
８〜１０及び図５〜図７に示す。この結果からＡＰＩ２
６は他の酵素と比較して著しく洗剤溶液中で安定性が高
いことが分かる。
での安定性 以下の条件及び方法により市販洗剤ウルトラアリエル
（Ultra Ariel）（Ｐ＆Ｇ社製）、スーパーチアー（Sup
er Cheer）（Ｐ＆Ｇ社製）、タイド・グリィース・リリ
ーシング（Tide Grease Releasing）（Ｐ＆Ｇ社製）溶
液中での本酵素の安定性を調べた。５０ｍＭ Atkins-Pa
ntinほう酸緩衝液ｐＨ１０ ５０ｐｐｍＣａ2+洗剤濃度
1000ｐｐｍの溶液で本酵素ＡＰＩ２６及び他酵素Subtil
isin 10309、ＰＢ９２、ＳＤＩ５２１を約２０nkatal／
ｍｌになるように加え、５５℃または４０℃でインキュ
ベートし、残存活性を３０℃で経時的に測定した。時間
０での活性を１００とした時の各時間での残存活性を表
８〜１０及び図５〜図７に示す。この結果からＡＰＩ２
６は他の酵素と比較して著しく洗剤溶液中で安定性が高
いことが分かる。
【００４４】
【表８】 表８：ウルトラアリエル（Ultra Ariel）（５５℃） 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30 ＡＰＩ２６ 100 90 82 75 65 Subtilisin 10309 100 75 48 35 22 ＰＢ９２ 100 73 46 33 21 ＳＤ５２１ 100 81 53 44 31
【００４５】
【表９】 表９：スーパーチアー（Super Cheer）（５５℃） 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30 ＡＰＩ２６ 100 90 80 71 63 Subtilisin 10309 100 25 7 5 3 ＰＢ９２ 100 26 8 5 4 ＳＤ５２１ 100 41 25 10 9
【００４６】
【表１０】 表１０：タイド・グリィース・リリーシング（Tide Grease Releasing） （４０℃） 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30 ＡＰＩ２６ 100 98 92 84 81 Subtilisin 10309 100 65 40 30 21 ＰＢ９２ 100 66 41 28 20 ＳＤ５２１ 100 72 66 52 39
【００４７】実施例６：ＡＰＩ−２６酵素含有液体洗剤
洗浄性試験 実施例１と同様にして得られた培養液の上清を除菌膜処
理し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した後、噴霧
乾燥法により粗酵素を調製した。これを用いて、市販の
液体洗剤タイド（Tide）（Ｐ＆Ｇ）に添加した際の洗浄
効果を調べた。タイドに粗酵素を１００nkatal／ｍｌと
なるように加え、本酵素を配合した洗剤を調製し、それ
を４０℃で４週間保存した。カルシウムイオン（Ｃ
ａ2+）濃度が４０ｐｐｍの水１リットルに対し、この４
週間保存した洗剤を２ｇ添加し汚染布を洗浄後、白度を
測定し、洗浄効率を求めた。なお、汚染布はＥＭＰＡ−
１１６５ｃｍ×５ｃｍのものを各１０枚用いた。また、
洗浄効率は以下の式によって定義する。
洗浄性試験 実施例１と同様にして得られた培養液の上清を除菌膜処
理し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した後、噴霧
乾燥法により粗酵素を調製した。これを用いて、市販の
液体洗剤タイド（Tide）（Ｐ＆Ｇ）に添加した際の洗浄
効果を調べた。タイドに粗酵素を１００nkatal／ｍｌと
なるように加え、本酵素を配合した洗剤を調製し、それ
を４０℃で４週間保存した。カルシウムイオン（Ｃ
ａ2+）濃度が４０ｐｐｍの水１リットルに対し、この４
週間保存した洗剤を２ｇ添加し汚染布を洗浄後、白度を
測定し、洗浄効率を求めた。なお、汚染布はＥＭＰＡ−
１１６５ｃｍ×５ｃｍのものを各１０枚用いた。また、
洗浄効率は以下の式によって定義する。
【００４８】洗浄効率（％）＝（洗濯後の布の白度−汚
染布の白度）／（非汚染布の白度−汚染布の白度）×１
００
染布の白度）／（非汚染布の白度−汚染布の白度）×１
００
【００４９】対照としてＳＤ５２１も同時に試験した。
結果を表１１に示す。この結果から液体洗剤中にＡＰＩ
２６を添加することは有効であることが分かる。
結果を表１１に示す。この結果から液体洗剤中にＡＰＩ
２６を添加することは有効であることが分かる。
【００５０】
【表１１】表１１酵素 洗浄効率（％） ＡＰＩ２６ ６２ Subtilisin 10309 ５５ ＰＢ９２ ５４ ＳＤ５２１ ５８無添加 ５２
【００５１】実施例７：ＡＰＩ−２６酵素含有自動食器
洗浄機用洗剤洗浄性試験 実施例６に記載のＡＰＩ−２６粗酵素を用いて、自動食
器洗浄機での洗浄効果を調べた。まず、市販洗剤（商品
名ハイウォッシュＳ；株式会社エヌシーシー；成分はポ
リエチレンアルキレンエーテル、過炭酸ナトリウム、炭
酸塩、硫酸塩、有機酸塩）とＡＰＩ−２６粗酵素を重量
比２０：１の割合で混合して酵素含有自動食器洗浄機用
洗剤を調製し、これを洗浄時0.21％となるように使用し
て以下の条件により洗浄性を試験した。
洗浄機用洗剤洗浄性試験 実施例６に記載のＡＰＩ−２６粗酵素を用いて、自動食
器洗浄機での洗浄効果を調べた。まず、市販洗剤（商品
名ハイウォッシュＳ；株式会社エヌシーシー；成分はポ
リエチレンアルキレンエーテル、過炭酸ナトリウム、炭
酸塩、硫酸塩、有機酸塩）とＡＰＩ−２６粗酵素を重量
比２０：１の割合で混合して酵素含有自動食器洗浄機用
洗剤を調製し、これを洗浄時0.21％となるように使用し
て以下の条件により洗浄性を試験した。
【００５２】洗浄条件 使用機種：松下電器（株）製自動食器洗い機ＮＰ−６０
０洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌
道上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの。 洗浄温度：５℃〜５５℃まで徐々に上昇する。 使用水：硬度 3.5°ＤＨの水、 酵素濃度：0.01％、 洗浄時の循環水量： 2.5リットル、 汚染皿の調製：卵黄１ｇを直径２５ｃｍの磁性の皿に塗
布し、一昼夜風乾したもの２枚試験に供する。
０洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌
道上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの。 洗浄温度：５℃〜５５℃まで徐々に上昇する。 使用水：硬度 3.5°ＤＨの水、 酵素濃度：0.01％、 洗浄時の循環水量： 2.5リットル、 汚染皿の調製：卵黄１ｇを直径２５ｃｍの磁性の皿に塗
布し、一昼夜風乾したもの２枚試験に供する。
【００５３】［洗浄力評価法］洗浄後の皿にアミドシュ
ニッツ液反応により、皿上の紫色面積（Ｐ1 ）を写真判
定によって測り、汚染面積から下記の式によって洗浄率
を求めた。
ニッツ液反応により、皿上の紫色面積（Ｐ1 ）を写真判
定によって測り、汚染面積から下記の式によって洗浄率
を求めた。
【００５４】 洗浄率（％）＝｛（Ｐ0 −Ｐ1 ）／Ｐ0 ｝×１００ 但し、Ｐ0 ：皿の面積
【００５５】求めた洗浄率は表１２に示した。対照とし
てＳＤ５２１も同時に試験した。この結果より、本酵素
を含むサンプルは洗浄作用が強く、今回特別に設定した
強固な汚れに対しても効果的に作用して１００％の洗浄
率を示し、自動洗浄機用洗剤の洗浄力の改善に大きく寄
与していることことが分かる。
てＳＤ５２１も同時に試験した。この結果より、本酵素
を含むサンプルは洗浄作用が強く、今回特別に設定した
強固な汚れに対しても効果的に作用して１００％の洗浄
率を示し、自動洗浄機用洗剤の洗浄力の改善に大きく寄
与していることことが分かる。
【００５６】
【表１２】 表１２ 洗浄率（％） ＡＰＩ２６ １００ ＳＤ５２１ ９８ 酵素無添加 ８０
【００５７】
【発明の効果】本発明のアルカリプロテアーゼは既存の
アルカリプロテアーゼに比べて各種市販洗剤溶液中や界
面活性剤存在下で高い安定性を有し、また熱に対しても
安定であり、洗濯や食器洗浄においてタンパク質の汚れ
を効率的に分解するので、洗剤に配合して洗浄力の増強
を図ることが出来る。また、蛋白質やペプチドに作用さ
せて他のペプチドやアミノ酸を製造する際にその安定性
を利用して経済的なプロセスが可能となる。本発明のバ
チルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株及びその変異
株は、取扱い易い中温菌であり、本発明のアルカリプロ
テアーゼの生産等において有用である。また、バチルス
（Bacillus）属に属する微生物またはその変異株を培養
する本発明のプロテアーゼの製造方法により本発明のア
ルカリプロテアーゼを効率良く生産することが出来る。
アルカリプロテアーゼに比べて各種市販洗剤溶液中や界
面活性剤存在下で高い安定性を有し、また熱に対しても
安定であり、洗濯や食器洗浄においてタンパク質の汚れ
を効率的に分解するので、洗剤に配合して洗浄力の増強
を図ることが出来る。また、蛋白質やペプチドに作用さ
せて他のペプチドやアミノ酸を製造する際にその安定性
を利用して経済的なプロセスが可能となる。本発明のバ
チルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株及びその変異
株は、取扱い易い中温菌であり、本発明のアルカリプロ
テアーゼの生産等において有用である。また、バチルス
（Bacillus）属に属する微生物またはその変異株を培養
する本発明のプロテアーゼの製造方法により本発明のア
ルカリプロテアーゼを効率良く生産することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明酵素の至適ｐＨ範囲を示すグラフであ
る。
る。
【図２】 本発明酵素の安定ｐＨ域範囲を示すグラフで
ある。
ある。
【図３】 本発明酵素の至適温度範囲を示すグラフであ
る。
る。
【図４】 本発明酵素及び公知酵素の５５℃の温度にお
ける安定性を示すグラフである。
ける安定性を示すグラフである。
【図５】 本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤ウルトラ
アリエル中５５℃における安定性を示すグラフである。
アリエル中５５℃における安定性を示すグラフである。
【図６】 本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤スーパー
チアー中５５℃における安定性を示すグラフである。
チアー中５５℃における安定性を示すグラフである。
【図７】 本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤タイド・
グリィース・リリーシング中４０℃における安定性を示
すグラフである。
グリィース・リリーシング中４０℃における安定性を示
すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成８年１１月７日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
学工業技術研究所
【旧受託番号】 微工研菌寄第Ｐ−１５２１４
号
号
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
学工業技術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５７３６
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (12)
- 【請求項１】 以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つ
の条件を充たすアルカリプロテアーゼ。 （ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存
活性を有する。 （ｂ）緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 （ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存
活性を有する。 - 【請求項２】 以下の性質を有する請求項１に記載のア
ルカリプロテアーゼ。 (1) 作用 タンパク質及びペプチドを加水分解する。 (2) 至適ｐＨ カゼインを基質とし３０℃にて１０分間反応させたとき
至適ｐＨは１２付近にある。 (3) 安定ｐＨ域 ３０℃で２４時間インキュベートしたとき、ｐＨ５〜１
１で安定である。 (4) 至適温度 カゼインを基質とし、ｐＨ１０で１０分間反応させたと
き、至適温度が６０℃付近にある。 (5) 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量は29000±2000である。 (6) 等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点
は10.1±0.5である。 - 【請求項３】 バチルス（Bacillus）属に属する微生物
が生産する請求項１乃至２のいずれかに記載のアルカリ
プロテアーゼ。 - 【請求項４】 バチルス（Bacillus）属に属する微生物
がバチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１４株（受託番
号FERM P-15214）である請求項３に記載のアルカリプロ
テアーゼ。 - 【請求項５】 請求項４に記載のプロテアーゼと免疫学
的交差性を示し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１
つの条件を充たすアルカリプロテアーゼ。 （ａ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、４０℃で３０分後に６０％以上の残存
活性を有する。 （ｂ）緩衝液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう酸緩衝液
（ｐＨ１０）、0.1ｍＭＥＤＴＡ）中、５５℃で１５分
後に４０％以上の残存活性を有する。 （ｃ）界面活性剤溶液（５０ｍＭ Atkins-Pantin ほう
酸緩衝液（ｐＨ１０）、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ、ＬＡＳ５
００ｐｐｍ）中、５５℃で１５分後に２０％以上の残存
活性を有する。 - 【請求項６】 請求項１乃至５のいずれかに記載のプロ
テアーゼの生産能を有するバチルス（Bacillus）属に属
する微生物またはその変異株を培養し、その培養物から
該プロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプ
ロテアーゼの製造方法。 - 【請求項７】 バチルス（Bacillus）属に属する微生物
がバチルスｓｐ．（Bacillus sp.）ＳＤ１１４株（受託
番号FERM P-15214）である請求項６に記載のアルカリプ
ロテアーゼの製造方法。 - 【請求項８】 バチルスｓｐ.(Bacillus sp.)ＳＤ１１
４株（受託番号FERMP-15214）及びその変異株。 - 【請求項９】 請求項１乃至５のいずれかに記載のプロ
テアーゼを含む洗浄剤組成物。 - 【請求項１０】 請求項１乃至５のいずれかに記載のプ
ロテアーゼを含む洗剤。 - 【請求項１１】 請求項１乃至５のいずれかに記載のプ
ロテアーゼを含む自動食器洗浄機用洗剤。 - 【請求項１２】 請求項１乃至５のいずれかに記載のプ
ロテアーゼを蛋白質またはペプチドに作用させることを
特徴とするペプチドまたはアミノ酸の製造方法。
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