JPH09124698A - ヒトｐｅｃ−６０様蛋白質およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents
ヒトｐｅｃ−６０様蛋白質およびそれをコードするｄｎａInfo
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- JPH09124698A JPH09124698A JP7280272A JP28027295A JPH09124698A JP H09124698 A JPH09124698 A JP H09124698A JP 7280272 A JP7280272 A JP 7280272A JP 28027295 A JP28027295 A JP 28027295A JP H09124698 A JPH09124698 A JP H09124698A
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 胃組織が分泌している消化管ホルモンである
ヒトＰＥＣ−６０様蛋白質およびそれをコードするヒト
ｃＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配
列番号２で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。ヒトＰＥ
Ｃ−６０様蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、およびこ
のヒトｃＤＮＡの組換え体を発現させることにより該蛋
白質を提供することができる。
ヒトＰＥＣ−６０様蛋白質およびそれをコードするヒト
ｃＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配
列番号２で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ。ヒトＰＥ
Ｃ−６０様蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、およびこ
のヒトｃＤＮＡの組換え体を発現させることにより該蛋
白質を提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＰＥＣ−６０
様蛋白質、およびそれをコードしているｃＤＮＡに関す
る。本発明の蛋白質は、消化器系疾患・免疫系疾患・神
経系疾患の治療や診断用医薬品として、あるいは該蛋白
質に対する抗体を作製するための抗原として用いること
が出来る。本発明の ヒトｃＤＮＡ は、遺伝子診断用プ
ローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることが出来
る。また、該ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大量生
産するための遺伝子源として用いることが出来る。
様蛋白質、およびそれをコードしているｃＤＮＡに関す
る。本発明の蛋白質は、消化器系疾患・免疫系疾患・神
経系疾患の治療や診断用医薬品として、あるいは該蛋白
質に対する抗体を作製するための抗原として用いること
が出来る。本発明の ヒトｃＤＮＡ は、遺伝子診断用プ
ローブや遺伝子治療用遺伝子源として用いることが出来
る。また、該ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大量生
産するための遺伝子源として用いることが出来る。
【０００２】
【従来技術】ＰＥＣ−６０（Ｎ末端がグルタミン酸、Ｃ
末端がシステインである６０アミノ酸残基からなるペプ
チド）は、グルコースによる灌流膵臓のインシュリン分
泌を抑制する蛋白質としてブタ小腸から単離された［Ａ
ｇｅｒｂｅｒｔｈ、Ｂ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８５９０−
８５９４（１９８９）］。一般に、このような消化管ホ
ルモンは、神経系にも見いだされる場合が多いが、最近
の免疫組織学的研究により、ＰＥＣ−６０と思われるペ
プチドが中枢及び末梢のカテコールアミン神経に局在し
ていることが示された［Ｆｕｘｅ、Ｋ． ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ５：１８１７−１８２
１（１９９４）］。さらに、末梢血の単球にも多く含ま
れ、血清中に分泌されていることから、免疫系において
も何らかの役割を担っていることが示唆された［Ｍｅｔ
ｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２６７：１９８２９−１９８３２（１９９
２）］。以上のように、ＰＥＣ−６０は、消化管、神経
系、免疫系などにおいて働いている多機能ホルモンであ
るので、ヒトＰＥＣ−６０が得られれば、医薬として利
用可能である。これまでにブタのＰＥＣ−６０ｃＤＮＡ
がクローン化されているが［Ｍｅｔｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９８
２９−１９８３２（１９９２）］、ヒトｃＤＮＡについ
ての報告はない。
末端がシステインである６０アミノ酸残基からなるペプ
チド）は、グルコースによる灌流膵臓のインシュリン分
泌を抑制する蛋白質としてブタ小腸から単離された［Ａ
ｇｅｒｂｅｒｔｈ、Ｂ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８５９０−
８５９４（１９８９）］。一般に、このような消化管ホ
ルモンは、神経系にも見いだされる場合が多いが、最近
の免疫組織学的研究により、ＰＥＣ−６０と思われるペ
プチドが中枢及び末梢のカテコールアミン神経に局在し
ていることが示された［Ｆｕｘｅ、Ｋ． ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ５：１８１７−１８２
１（１９９４）］。さらに、末梢血の単球にも多く含ま
れ、血清中に分泌されていることから、免疫系において
も何らかの役割を担っていることが示唆された［Ｍｅｔ
ｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２６７：１９８２９−１９８３２（１９９
２）］。以上のように、ＰＥＣ−６０は、消化管、神経
系、免疫系などにおいて働いている多機能ホルモンであ
るので、ヒトＰＥＣ−６０が得られれば、医薬として利
用可能である。これまでにブタのＰＥＣ−６０ｃＤＮＡ
がクローン化されているが［Ｍｅｔｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９８
２９−１９８３２（１９９２）］、ヒトｃＤＮＡについ
ての報告はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
ＰＥＣ−６０様蛋白質、および該蛋白質をコードするＤ
ＮＡを提供することである。
ＰＥＣ−６０様蛋白質、および該蛋白質をコードするＤ
ＮＡを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ヒトＰＥＣ−６０様蛋白質をコードするヒトｃＤ
ＮＡをクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本
発明はヒトＰＥＣ−６０様蛋白質である、配列番号１で
表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を提供する。また本
発明は上記蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号
１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡを提供する。
結果、ヒトＰＥＣ−６０様蛋白質をコードするヒトｃＤ
ＮＡをクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本
発明はヒトＰＥＣ−６０様蛋白質である、配列番号１で
表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を提供する。また本
発明は上記蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号
１で表される塩基配列を含むｃＤＮＡを提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の蛋白質は、ヒトの臓器、
細胞株などから単離する方法、本発明のアミノ酸配列に
基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、ある
いは本発明のヒトＰＥＣ−６０様蛋白質をコードするＤ
ＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などによ
り取得することができるが、組換えＤＮＡ技術で取得す
る方法が好ましく用いられる。例えば、本発明のｃＤＮ
Ａを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡ
を調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうこ
とによりインビトロで発現出来る。また翻訳領域を公知
の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大
腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋
白質を大量に発現させることができる。
細胞株などから単離する方法、本発明のアミノ酸配列に
基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、ある
いは本発明のヒトＰＥＣ−６０様蛋白質をコードするＤ
ＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などによ
り取得することができるが、組換えＤＮＡ技術で取得す
る方法が好ましく用いられる。例えば、本発明のｃＤＮ
Ａを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡ
を調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうこ
とによりインビトロで発現出来る。また翻訳領域を公知
の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大
腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋
白質を大量に発現させることができる。
【０００６】本発明のＤＮＡには、上記蛋白質をコード
するすべてのＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、化学合成
による方法、ｃＤＮＡクローニングによる方法などを用
いて取得することができる。
するすべてのＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、化学合成
による方法、ｃＤＮＡクローニングによる方法などを用
いて取得することができる。
【０００７】本発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来
ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来
る。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）+ＲＮ
Ａを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から
手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良
い。実施例ではヒト胃癌組織から単離したポリ（Ａ）+
ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法［Ｏｋ
ａｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０（１９８
２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅ
ｒ，Ｕ． ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｊ． Ｇｅｎｅ ２
５：２６３−２６９（１９８３）］などいかなる方法を
用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得
るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Ｋ
ａｔｏ、Ｓ． ｅｌ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １５０：２４
３−２５０（１９９４）］を用いることが望ましい。
ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来
る。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）+ＲＮ
Ａを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から
手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良
い。実施例ではヒト胃癌組織から単離したポリ（Ａ）+
ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法［Ｏｋ
ａｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０（１９８
２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅ
ｒ，Ｕ． ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｊ． Ｇｅｎｅ ２
５：２６３−２６９（１９８３）］などいかなる方法を
用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得
るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Ｋ
ａｔｏ、Ｓ． ｅｌ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １５０：２４
３−２５０（１９９４）］を用いることが望ましい。
【０００８】ｃＤＮＡのクローニングは、ｃＤＮＡライ
ブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの部分塩
基配列決定、塩基配列から予測されるアミノ酸配列によ
る蛋白質データベース検索によって行なう。ｃＤＮＡの
同定は、シーケンシングによる全塩基配列の決定、イン
ビトロ翻訳による蛋白質発現、大腸菌による発現によっ
て行なう。
ブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの部分塩
基配列決定、塩基配列から予測されるアミノ酸配列によ
る蛋白質データベース検索によって行なう。ｃＤＮＡの
同定は、シーケンシングによる全塩基配列の決定、イン
ビトロ翻訳による蛋白質発現、大腸菌による発現によっ
て行なう。
【０００９】本発明のｃＤＮＡは、配列番号１で表され
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号２で表されるものは、３９８ｂｐからなる
塩基配列を有し、２６１ｂｐのオープンリーディングフ
レームを有していた。このオープンリーディングフレー
ムは、８６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてお
り、Ｎ末端に２６アミノ酸残基からなるシグナル配列を
有していた。
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号２で表されるものは、３９８ｂｐからなる
塩基配列を有し、２６１ｂｐのオープンリーディングフ
レームを有していた。このオープンリーディングフレー
ムは、８６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてお
り、Ｎ末端に２６アミノ酸残基からなるシグナル配列を
有していた。
【００１０】なお、配列番号１あるいは配列番号２に記
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、本発明のｃＤＮＡと
同一のクローンを容易に得ることが出来る。
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、本発明のｃＤＮＡと
同一のクローンを容易に得ることが出来る。
【００１１】一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻
繁に認められる。従って配列番号１あるいは配列番号２
において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失お
よび／又は他のヌクレオチドによる置換がなされている
ｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。
繁に認められる。従って配列番号１あるいは配列番号２
において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失お
よび／又は他のヌクレオチドによる置換がなされている
ｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。
【００１２】同様に、これらの変更によって生じる、１
又は複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のア
ミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１
で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する
限り、本発明の範疇に入る。
又は複数個のアミノ酸の付加、欠失および／又は他のア
ミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１
で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する
限り、本発明の範疇に入る。
【００１３】本発明のｃＤＮＡには、配列番号１あるい
は２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロ
ーブとして用いることができる。
は２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロ
ーブとして用いることができる。
【００１４】
【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ、Ｓ． ｅｌ ａｌ．、
Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従
った。
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ、Ｓ． ｅｌ ａｌ．、
Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従
った。
【００１５】ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製 ヒト胃癌組織１ｇを５．５Ｍグアニジウムチオシアネー
ト溶液２０ｍｌ中でホモジナイズした後、文献［Ｏｋａ
ｙａｍａ、Ｈ． ｅｔ ａｌ．、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ．１６４、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７］に従い、７５０μ
ｇのｍＲＮＡを調製した。これを２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで洗浄したオリゴｄＴセルロースカラムにかけ、
上掲文献に従いポリ（Ａ）+ＲＮＡ１０μｇを得た。
ト溶液２０ｍｌ中でホモジナイズした後、文献［Ｏｋａ
ｙａｍａ、Ｈ． ｅｔ ａｌ．、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ．１６４、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７］に従い、７５０μ
ｇのｍＲＮＡを調製した。これを２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで洗浄したオリゴｄＴセルロースカラムにかけ、
上掲文献に従いポリ（Ａ）+ＲＮＡ１０μｇを得た。
【００１６】ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記ポリ（Ａ）+ＲＮＡ１０μｇを１００ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、ＲＮａｓｅを含まないバ
クテリア由来アルカリホスファターゼ１単位を添加し、
３７℃１時間反応させた。反応液をフェノール抽出後、
エタノール沈殿を行ない、ペレットを５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％２−
メルカプトエタノール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００溶液に溶解した。これに、タバコ由来酸ピロホス
ファターゼ（エピセンターテクノロジーズ社製）１単位
を添加して、総量１００μｌで３７℃１時間反応させ
た。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行な
い、ペレットを水に溶解し、脱キャップ処理したポリ
（Ａ）+ＲＮＡ溶液を得た。
酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、ＲＮａｓｅを含まないバ
クテリア由来アルカリホスファターゼ１単位を添加し、
３７℃１時間反応させた。反応液をフェノール抽出後、
エタノール沈殿を行ない、ペレットを５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％２−
メルカプトエタノール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００溶液に溶解した。これに、タバコ由来酸ピロホス
ファターゼ（エピセンターテクノロジーズ社製）１単位
を添加して、総量１００μｌで３７℃１時間反応させ
た。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行な
い、ペレットを水に溶解し、脱キャップ処理したポリ
（Ａ）+ＲＮＡ溶液を得た。
【００１７】脱キャップ処理したポリ（Ａ）+ＲＮＡ、
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド（５’−ｄＧ
−ｄＧ−ｄＧ−ｄＧ−ｄＡ−ｄＡ−ｄＴ−ｄＴ−ｄＣ−
ｄＧ−ｄＡ−Ｇ−Ｇ−Ａ−３’）３ｎｍｏｌを５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭＡＴＰ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、２５％ポリエチレングリコール水溶液に溶解し、Ｔ
４ＲＮＡリガーゼ５０単位を添加し、総量３０μｌで２
０℃１２時間反応させた。反応液をフェノール抽出後、
エタノール沈殿を行ない、ペレットを水に溶解し、キメ
ラオリゴキャップ付加ポリ（Ａ）+ＲＮＡを得た。
ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド（５’−ｄＧ
−ｄＧ−ｄＧ−ｄＧ−ｄＡ−ｄＡ−ｄＴ−ｄＴ−ｄＣ−
ｄＧ−ｄＡ−Ｇ−Ｇ−Ａ−３’）３ｎｍｏｌを５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭＡＴＰ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、２５％ポリエチレングリコール水溶液に溶解し、Ｔ
４ＲＮＡリガーゼ５０単位を添加し、総量３０μｌで２
０℃１２時間反応させた。反応液をフェノール抽出後、
エタノール沈殿を行ない、ペレットを水に溶解し、キメ
ラオリゴキャップ付加ポリ（Ａ）+ＲＮＡを得た。
【００１８】本発明者らが開発したベクターｐＫＡ１
（特開平４−１１７２９２号公報）をＫｐｎＩで消化
後、末端転移酵素により約６０個のｄＴテールを付加し
た。これをＥｃｏＲＶ消化して片側のｄＴテールを除去
したものをベクタープライマーとして用いた。
（特開平４−１１７２９２号公報）をＫｐｎＩで消化
後、末端転移酵素により約６０個のｄＴテールを付加し
た。これをＥｃｏＲＶ消化して片側のｄＴテールを除去
したものをベクタープライマーとして用いた。
【００１９】先に調製したキメラオリゴキャップ付加ポ
リ（Ａ）+ＲＮＡ６μｇを、ベクタープライマー１.２μ
ｇとアニールさせた後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１０ｍＭジチオスレイトール、１．２５ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ）溶液に溶
解し、逆転写酵素（ＧＩＢＣＯーＢＲＬ社製）２００単
位を添加し、総量２０μｌで４２℃１時間反応させた。
反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行ない、
ペレットを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ
ジチオスレイトール溶液に溶解した。これにＥｃｏＲＩ
１００単位を添加し、総量２０μｌで３７℃１時間反応
させた。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を
行ない、ペレットを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、５０μｇ／ｍｌ 牛血清アル
ブミン溶液に溶解した。これに大腸菌ＤＮＡリガーゼ６
０単位を添加し、１６℃１６時間反応させた。反応液に
２ｍＭｄＮＴＰ２μｌ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ４
単位、大腸菌ＲＮａｓｅＨ ０．１単位を添加し、１２
℃１時間ついで２２℃１時間反応させた。
リ（Ａ）+ＲＮＡ６μｇを、ベクタープライマー１.２μ
ｇとアニールさせた後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１０ｍＭジチオスレイトール、１．２５ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ）溶液に溶
解し、逆転写酵素（ＧＩＢＣＯーＢＲＬ社製）２００単
位を添加し、総量２０μｌで４２℃１時間反応させた。
反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行ない、
ペレットを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ
ジチオスレイトール溶液に溶解した。これにＥｃｏＲＩ
１００単位を添加し、総量２０μｌで３７℃１時間反応
させた。反応液をフェノール抽出後、エタノール沈殿を
行ない、ペレットを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、５０μｇ／ｍｌ 牛血清アル
ブミン溶液に溶解した。これに大腸菌ＤＮＡリガーゼ６
０単位を添加し、１６℃１６時間反応させた。反応液に
２ｍＭｄＮＴＰ２μｌ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ４
単位、大腸菌ＲＮａｓｅＨ ０．１単位を添加し、１２
℃１時間ついで２２℃１時間反応させた。
【００２０】次いでｃＤＮＡ合成反応液を用いて大腸菌
ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）の形質転換を行
なった。形質転換はエレクトロポレーション法によって
行なった。形質転換体の一部を１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有２ｘＹＴ寒天培地上に蒔いて３７℃一晩培養
した。寒天上に生じた任意のコロニーを拾い１００μｇ
／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地２ｍｌに接種して
３７℃２時間培養後、ヘルパーファージＭＫ１３ＫＯ７
（ファルマシア社）を感染させ、さらに３７℃一晩培養
した。培養液を遠心して、菌体と上清に分け、菌体から
はアルカリリシス法により２本鎖プラスミドＤＮＡを、
上清からは常法に従い一本鎖ファージＤＮＡを単離し
た。２本鎖プラスミドＤＮＡはＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで
二重消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動を行
ないｃＤＮＡインサートの大きさを求めた。一方一本鎖
ファージＤＮＡは、蛍光色素で標識したＭ１３ユニバー
サルプライマーとＴａｑポリメラーゼ（アプライドバイ
オシステムズ社製キット）を用いてシーケンス反応を行
なった後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオ
システムズ社）にかけてｃＤＮＡの５’末端約４００ｂ
ｐの塩基配列を決定した。配列データはホモ・プロテイ
ンｃＤＮＡバンクデータベースとしてファイル化した。
ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）の形質転換を行
なった。形質転換はエレクトロポレーション法によって
行なった。形質転換体の一部を１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有２ｘＹＴ寒天培地上に蒔いて３７℃一晩培養
した。寒天上に生じた任意のコロニーを拾い１００μｇ
／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地２ｍｌに接種して
３７℃２時間培養後、ヘルパーファージＭＫ１３ＫＯ７
（ファルマシア社）を感染させ、さらに３７℃一晩培養
した。培養液を遠心して、菌体と上清に分け、菌体から
はアルカリリシス法により２本鎖プラスミドＤＮＡを、
上清からは常法に従い一本鎖ファージＤＮＡを単離し
た。２本鎖プラスミドＤＮＡはＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで
二重消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動を行
ないｃＤＮＡインサートの大きさを求めた。一方一本鎖
ファージＤＮＡは、蛍光色素で標識したＭ１３ユニバー
サルプライマーとＴａｑポリメラーゼ（アプライドバイ
オシステムズ社製キット）を用いてシーケンス反応を行
なった後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオ
システムズ社）にかけてｃＤＮＡの５’末端約４００ｂ
ｐの塩基配列を決定した。配列データはホモ・プロテイ
ンｃＤＮＡバンクデータベースとしてファイル化した。
【００２１】ｃＤＮＡクローニング 上記ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したクローン
の塩基配列決定を行ない、得られた塩基配列を３フレー
ムのアミノ酸配列に変換した後、これらの配列でプロテ
インデータベースを検索した。解析ソフトウエアはＧＥ
ＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用い
た。その結果、クローンＨＰ００８３９が含有するプラ
スミドｐＨＰ００８３９によってコードされている蛋白
質が、ブタＰＥＣ−６０のアミノ酸配列と高い相同性を
有していることが判明した。このプラスミドの構造を図
１に示す。ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した
ところ、４２ｂｐの５’非翻訳領域、２６１ｂｐのオー
プンリーディングフレーム、９５ｂｐの３’非翻訳領域
からなる構造を有していた（配列番号２）。オープンリ
ーディングフレームは８６アミノ酸残基からなる蛋白質
をコードしており、この配列を用いてプロテインデータ
ベースを検索したところ、全領域にわたってブタＰＥＣ
−６０のアミノ酸配列と７３．３％という高い相同性を
有していた。表１に、本発明のヒトＰＥＣ−６０様蛋白
質（ＨＳ）とブタＰＥＣ−６０（ＳＳ）のアミノ酸配列
の比較を示す。＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基
を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ
表す。
の塩基配列決定を行ない、得られた塩基配列を３フレー
ムのアミノ酸配列に変換した後、これらの配列でプロテ
インデータベースを検索した。解析ソフトウエアはＧＥ
ＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用い
た。その結果、クローンＨＰ００８３９が含有するプラ
スミドｐＨＰ００８３９によってコードされている蛋白
質が、ブタＰＥＣ−６０のアミノ酸配列と高い相同性を
有していることが判明した。このプラスミドの構造を図
１に示す。ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した
ところ、４２ｂｐの５’非翻訳領域、２６１ｂｐのオー
プンリーディングフレーム、９５ｂｐの３’非翻訳領域
からなる構造を有していた（配列番号２）。オープンリ
ーディングフレームは８６アミノ酸残基からなる蛋白質
をコードしており、この配列を用いてプロテインデータ
ベースを検索したところ、全領域にわたってブタＰＥＣ
−６０のアミノ酸配列と７３．３％という高い相同性を
有していた。表１に、本発明のヒトＰＥＣ−６０様蛋白
質（ＨＳ）とブタＰＥＣ−６０（ＳＳ）のアミノ酸配列
の比較を示す。＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基
を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ
表す。
【００２２】 表１ _________________________________________________________________ HS MAVRQWVIALALAALLVVDREVPVAAGKLPFSRMPICEHMVESPTCSQMSNLVCGTDGLT **** **.*******..*******.*.* **********.***.**.. . ******.* SS MAVRLWVVALALAALFIVDREVPVSAEKQVFSRMPICEHMTESPDCSRIYDPVCGTDGVT HS YTNECQLCLARIKTKQDIQIMKDGKC *..**.******..******.***.* SS YESECKLCLARIENKQDIQIVKDGEC _________________________________________________________________
【００２３】インビトロ翻訳による蛋白質合成 本発明のｃＤＮＡを有するベクターｐＨＰ００８３９を
用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメ
ガ社製）によるインビトロ翻訳を行なった。この際［35
Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトー
プでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロト
コールに従って行なった。プラスミドｐＨＰ００８３９
２μｇを、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物５０μｌ、
緩衝液（キットに付属）４μｌ、アミノ酸混合液（Ｍｅ
ｔを含まない）２μｌ、［35Ｓ］メチオニン（アマーシ
ャム社）８μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ２μｌ、ＲＮａｓｉｎ ８０Ｕを含む総量
１００μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させた。
反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１２５
ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５％ブ
ロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μｌを
加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフ
ィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた結果、本発明
のｃＤＮＡは、分子量約１０ｋＤａの翻訳産物を生成し
た。この値は、配列番号２で表される塩基配列から予想
される蛋白質の予想分子量９，４５４と一致し、このｃ
ＤＮＡが確かに配列番号２で表される蛋白質をコードし
ていることが示された。
用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメ
ガ社製）によるインビトロ翻訳を行なった。この際［35
Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトー
プでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロト
コールに従って行なった。プラスミドｐＨＰ００８３９
２μｇを、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物５０μｌ、
緩衝液（キットに付属）４μｌ、アミノ酸混合液（Ｍｅ
ｔを含まない）２μｌ、［35Ｓ］メチオニン（アマーシ
ャム社）８μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼ２μｌ、ＲＮａｓｉｎ ８０Ｕを含む総量
１００μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させた。
反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１２５
ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５％ブ
ロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μｌを
加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフ
ィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた結果、本発明
のｃＤＮＡは、分子量約１０ｋＤａの翻訳産物を生成し
た。この値は、配列番号２で表される塩基配列から予想
される蛋白質の予想分子量９，４５４と一致し、このｃ
ＤＮＡが確かに配列番号２で表される蛋白質をコードし
ていることが示された。
【００２４】大腸菌による融合蛋白質の発現 ２本のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１（５’−Ｇ
ＣＧＧＴＣＴＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣ
ＡＡＧ−３’）とＰＲ２（５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣ
ＡＧＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ−３’）をＤＮ
Ａ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社）により
付属のプロトコールに従い合成した。
ＣＧＧＴＣＴＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣ
ＡＡＧ−３’）とＰＲ２（５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣ
ＡＧＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ−３’）をＤＮ
Ａ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社）により
付属のプロトコールに従い合成した。
【００２５】プラスミドｐＨＰ００８３９を１ｎｇとプ
ライマーＰＲ１、ＰＲ２それぞれ１００ｐｍｏｌｅを用
いて、ＰＣＲを行ない、Ｃ末端６０アミノ酸残基からな
る成熟蛋白質をコードしている領域を増幅した。フェノ
ール抽出、エタノール沈殿後、２０単位のＢｓａＩ（ニ
ューイングランドバイオラボス社）で消化後、クレノウ
処理を行ない、ついでＳａｌＩで消化し、反応産物を
１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２００ｂｐ
のＤＮＡ断片をゲルから切り出し精製した。
ライマーＰＲ１、ＰＲ２それぞれ１００ｐｍｏｌｅを用
いて、ＰＣＲを行ない、Ｃ末端６０アミノ酸残基からな
る成熟蛋白質をコードしている領域を増幅した。フェノ
ール抽出、エタノール沈殿後、２０単位のＢｓａＩ（ニ
ューイングランドバイオラボス社）で消化後、クレノウ
処理を行ない、ついでＳａｌＩで消化し、反応産物を
１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２００ｂｐ
のＤＮＡ断片をゲルから切り出し精製した。
【００２６】次いでｐＭＡＬTM−ｃ２（ニューイングラ
ンドバイオラボス社）１μｇを、２０単位のＸｍｎＩ
（ニューイングランドバイオラボス社）とＳａｌＩで消
化した後、０．６％アガロースゲル電気泳動にかけ、
６．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。ベク
ター断片とｃＤＮＡ断片をライゲーションキットにより
連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体
からプラスミドｐＭＡＬＰＥＣ６０を調製し、制限酵素
切断地図により目的とする組換え体を確認した。得られ
たプラスミドの構造を図２に示す。
ンドバイオラボス社）１μｇを、２０単位のＸｍｎＩ
（ニューイングランドバイオラボス社）とＳａｌＩで消
化した後、０．６％アガロースゲル電気泳動にかけ、
６．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから切り出した。ベク
ター断片とｃＤＮＡ断片をライゲーションキットにより
連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体
からプラスミドｐＭＡＬＰＥＣ６０を調製し、制限酵素
切断地図により目的とする組換え体を確認した。得られ
たプラスミドの構造を図２に示す。
【００２７】ｐＭＡＬＰＥＣ６０／ＪＭ１０９ の一晩
培養液１０ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有リ
ッチ培地（１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母抽
出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２ｇを含む）５０
０ｍｌに懸濁し、３７℃で振とう培養し、Ａ600が約
０．５になったときにイソプロピルチオガラクトシドを
１ｍＭになるように添加した。さらに３７℃で３時間培
養後、遠心によって集菌し、菌体をアミロースカラム用
カラム緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２５ｍｌに懸濁
した。この溶液を超音波処理後、遠心し、上澄をベッド
容積３．５ｍｌのアミロースカラム（ニューイングラン
ドバイオラボス社）にかけた。カラム体積の８倍量のカ
ラムバッファーでカラムを洗浄後、１０ｍＭマルトース
を含むカラム緩衝液２０ｍｌでマルトース結合蛋白質／
ＰＥＣ６０様蛋白質融合蛋白質を溶出し、１５．３ｍｇ
の融合蛋白質を得た。融合蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動にかけたところ、約５０ｋＤａの位置
に単一のバンドが認められた。この分子量の値は、マル
トース結合蛋白質／ＰＥＣ６０融合蛋白質の予想分子量
と一致する。
培養液１０ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有リ
ッチ培地（１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母抽
出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２ｇを含む）５０
０ｍｌに懸濁し、３７℃で振とう培養し、Ａ600が約
０．５になったときにイソプロピルチオガラクトシドを
１ｍＭになるように添加した。さらに３７℃で３時間培
養後、遠心によって集菌し、菌体をアミロースカラム用
カラム緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２５ｍｌに懸濁
した。この溶液を超音波処理後、遠心し、上澄をベッド
容積３．５ｍｌのアミロースカラム（ニューイングラン
ドバイオラボス社）にかけた。カラム体積の８倍量のカ
ラムバッファーでカラムを洗浄後、１０ｍＭマルトース
を含むカラム緩衝液２０ｍｌでマルトース結合蛋白質／
ＰＥＣ６０様蛋白質融合蛋白質を溶出し、１５．３ｍｇ
の融合蛋白質を得た。融合蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動にかけたところ、約５０ｋＤａの位置
に単一のバンドが認められた。この分子量の値は、マル
トース結合蛋白質／ＰＥＣ６０融合蛋白質の予想分子量
と一致する。
【００２８】マルトース結合蛋白質／ＰＥＣ６０融合蛋
白質１００μｇを含むカラムバッファー２００μｌにフ
ァクターＸａ １μｇを添加し、４℃で１２時間反応さ
せた。反応液をアミロースカラムにかけ素通りしてきた
分画を集め、１６μｇのＰＥＣ−６０様蛋白質を得た。
これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
たところ、本発明のＰＥＣ−６０様蛋白質に相当する約
７ｋＤａの位置にバンドが認められた。
白質１００μｇを含むカラムバッファー２００μｌにフ
ァクターＸａ １μｇを添加し、４℃で１２時間反応さ
せた。反応液をアミロースカラムにかけ素通りしてきた
分画を集め、１６μｇのＰＥＣ−６０様蛋白質を得た。
これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
たところ、本発明のＰＥＣ−６０様蛋白質に相当する約
７ｋＤａの位置にバンドが認められた。
【００２９】
【発明の効果】本発明はヒトＰＥＣ−６０様蛋白質、該
蛋白質をコードするＤＮＡ、および該蛋白質をコードす
るヒトｃＤＮＡを提供する。本発明の蛋白質は、消化器
系疾患・免疫系疾患・神経系疾患の治療や診断用医薬品
として、あるいは該蛋白質に対する抗体を作製するため
の抗原として用いることができる。該ＤＮＡを用いるこ
とにより、該蛋白質を大量に発現することができる。
蛋白質をコードするＤＮＡ、および該蛋白質をコードす
るヒトｃＤＮＡを提供する。本発明の蛋白質は、消化器
系疾患・免疫系疾患・神経系疾患の治療や診断用医薬品
として、あるいは該蛋白質に対する抗体を作製するため
の抗原として用いることができる。該ＤＮＡを用いるこ
とにより、該蛋白質を大量に発現することができる。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：１８０ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GGA AAG CTC CCT TTC TCA AGA ATG CCC ATC TGT GAA CAC ATG GTA GAG 48 Gly Lys Leu Pro Phe Ser Arg Met Pro Ile Cys Glu His Met Val Glu 1 5 10 15 TCT CCA ACC TGT TCC CAG ATG TCC AAC CTG GTC TGC GGC ACT GAT GGG 96 Ser Pro Thr Cys Ser Gln Met Ser Asn Leu Val Cys Gly Thr Asp Gly 20 25 30 CTC ACA TAT ACG AAT GAA TGC CAG CTC TGC TTG GCC CGG ATA AAA ACC 144 Leu Thr Tyr Thr Asn Glu Cys Gln Leu Cys Leu Ala Arg Ile Lys Thr 35 40 45 AAA CAG GAC ATC CAG ATC ATG AAA GAT GGC AAA TGC 180 Lys Gln Asp Ile Gln Ile Met Lys Asp Gly Lys Cys 50 55 60
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：３９８ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ホモ＝サピエンス 細胞の種類：胃癌組織 クローン名：ＨＰ００８３９ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４３．．３０３ 配列 GCAGGCCCCA GCCAGCTCAG GCTACACTAT CCCAGGATCA GC ATG GCC GTC CGC 54 Met Ala Val Arg 1 CAG TGG GTA ATC GCC CTG GCC TTG GCT GCC CTC CTT GTT GTG GAC AGG 102 Gln Trp Val Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Val Asp Arg 5 10 15 20 GAA GTG CCA GTG GCA GCA GGA AAG CTC CCT TTC TCA AGA ATG CCC ATC 150 Glu Val Pro Val Ala Ala Gly Lys Leu Pro Phe Ser Arg Met Pro Ile 25 30 35 TGT GAA CAC ATG GTA GAG TCT CCA ACC TGT TCC CAG ATG TCC AAC CTG 198 Cys Glu His Met Val Glu Ser Pro Thr Cys Ser Gln Met Ser Asn Leu 40 45 50 GTC TGC GGC ACT GAT GGG CTC ACA TAT ACG AAT GAA TGC CAG CTC TGC 246 Val Cys Gly Thr Asp Gly Leu Thr Tyr Thr Asn Glu Cys Gln Leu Cys 55 60 65 TTG GCC CGG ATA AAA ACC AAA CAG GAC ATC CAG ATC ATG AAA GAT GGC 294 Leu Ala Arg Ile Lys Thr Lys Gln Asp Ile Gln Ile Met Lys Asp Gly 70 75 80 AAA TGC TGATCCCACA GGAGCACCTC AAGCCATGAA GTGTCAGCTG GAGAACAGTG 350 Lys Cys 85 GTGGGCATGG AGAGGATATG ACATGAAATA AAAGATCCAG CCCAACTG 398
【００３２】
【図１】 プラスミドｐＨＰ００８３９の構造を表す図
である。
である。
【図２】 大腸菌用発現ベクターｐＭＡＬＰＥＣ６０の
構造を示す図である。
構造を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成８年１０月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来技術】ＰＥＣ−６０（Ｎ末端がグルタミン酸、Ｃ
末端がシステインである６０アミノ酸残基からなるペプ
チドとして命名）は、グルコースによる灌流膵臓のイン
シュリン分泌を抑制する蛋白質としてブタ小腸から単離
された［Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ、Ｂ． ｅｔ ａｌ．、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
８５９０−８５９４（１９８９）］。一般に、このよう
な消化管ホルモンは、神経系にも見いだされる場合が多
いが、最近の免疫組織学的研究により、ＰＥＣ−６０と
思われるペプチドが中枢及び末梢のカテコールアミン神
経に局在していることが示された［Ｆｕｘｅ、Ｋ． ｅ
ｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ５：１８１７−１
８２１（１９９４）］。さらに、末梢血の単球にも多く
含まれ、血清中に分泌されていることから、免疫系にお
いても何らかの役割を担っていることが示唆された［Ｍ
ｅｔｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． ２６７：１９８２９−１９８３２（１９９
２）］。以上のように、ＰＥＣ−６０は、消化管、神経
系、免疫系などにおいて働いている多機能ホルモンであ
るので、ヒトＰＥＣ−６０が得られれば、医薬として利
用可能である。これまでにブタのＰＥＣ−６０ｃＤＮＡ
がクローン化されているが［Ｍｅｔｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９８
２９−１９８３２（１９９２）］、ヒトｃＤＮＡについ
ての報告はない。
末端がシステインである６０アミノ酸残基からなるペプ
チドとして命名）は、グルコースによる灌流膵臓のイン
シュリン分泌を抑制する蛋白質としてブタ小腸から単離
された［Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ、Ｂ． ｅｔ ａｌ．、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
８５９０−８５９４（１９８９）］。一般に、このよう
な消化管ホルモンは、神経系にも見いだされる場合が多
いが、最近の免疫組織学的研究により、ＰＥＣ−６０と
思われるペプチドが中枢及び末梢のカテコールアミン神
経に局在していることが示された［Ｆｕｘｅ、Ｋ． ｅ
ｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ５：１８１７−１
８２１（１９９４）］。さらに、末梢血の単球にも多く
含まれ、血清中に分泌されていることから、免疫系にお
いても何らかの役割を担っていることが示唆された［Ｍ
ｅｔｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． ２６７：１９８２９−１９８３２（１９９
２）］。以上のように、ＰＥＣ−６０は、消化管、神経
系、免疫系などにおいて働いている多機能ホルモンであ
るので、ヒトＰＥＣ−６０が得られれば、医薬として利
用可能である。これまでにブタのＰＥＣ−６０ｃＤＮＡ
がクローン化されているが［Ｍｅｔｓｉｓ、Ｍ． ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９８
２９−１９８３２（１９９２）］、ヒトｃＤＮＡについ
ての報告はない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ヒトＰＥＣ−６０様蛋白質をコードするヒトｃＤ
ＮＡをクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本
発明はヒトＰＥＣ−６０様蛋白質である、配列番号１で
表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を提供する。また本
発明は上記蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号
２で表される塩基配列を含むｃＤＮＡを提供する。
結果、ヒトＰＥＣ−６０様蛋白質をコードするヒトｃＤ
ＮＡをクローン化し、本発明を完成した。すなわち、本
発明はヒトＰＥＣ−６０様蛋白質である、配列番号１で
表されるアミノ酸配列を含む蛋白質を提供する。また本
発明は上記蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号
２で表される塩基配列を含むｃＤＮＡを提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】本発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来
ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来
る。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）+ＲＮ
Ａを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から
手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良
い。実施例ではヒト胃癌組織から単離したポリ（Ａ）+
ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法［Ｏｋ
ａｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０（１９８
２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅ
ｒ，Ｕ． ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｊ． Ｇｅｎｅ ２
５：２６３−２６９（１９８３）］などいかなる方法を
用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得
るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Ｋ
ａｔｏ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １５０：２４
３−２５０（１９９４）］を用いることが望ましい。
ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来
る。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出した ポリ（Ａ）+ＲＮ
Ａを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から
手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良
い。実施例ではヒト胃癌組織から単離したポリ（Ａ）+
ＲＮＡを用いた。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法［Ｏｋ
ａｙａｍａ，Ｈ． ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１６１−１７０（１９８
２）］、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｕｂｌｅ
ｒ，Ｕ． ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，Ｊ． Ｇｅｎｅ ２
５：２６３−２６９（１９８３）］などいかなる方法を
用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得
るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Ｋ
ａｔｏ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ １５０：２４
３−２５０（１９９４）］を用いることが望ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】本発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表され
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号４で表されるものは、３９８ｂｐからなる
塩基配列を有し、２６１ｂｐのオープンリーディングフ
レームを有していた。このオープンリーディングフレー
ムは、８６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてお
り、Ｎ末端に２６アミノ酸残基からなるシグナル配列を
有していた。
る塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例え
ば、配列番号４で表されるものは、３９８ｂｐからなる
塩基配列を有し、２６１ｂｐのオープンリーディングフ
レームを有していた。このオープンリーディングフレー
ムは、８６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてお
り、Ｎ末端に２６アミノ酸残基からなるシグナル配列を
有していた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】なお、配列番号２あるいは配列番号４に記
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、本発明のｃＤＮＡと
同一のクローンを容易に得ることが出来る。
載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌク
レオチドプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、本発明のｃＤＮＡと
同一のクローンを容易に得ることが出来る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻
繁に認められる。従って配列番号２あるいは配列番号４
において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失お
よび／又は他のヌクレオチドによる置換がなされている
ｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。
繁に認められる。従って配列番号２あるいは配列番号４
において、１又は複数個のヌクレオチドの付加、欠失お
よび／又は他のヌクレオチドによる置換がなされている
ｃＤＮＡも本発明の範疇にはいる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】本発明のｃＤＮＡには、配列番号２あるい
は４で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロ
ーブとして用いることができる。
は４で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含む
ｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範
疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプロ
ーブとして用いることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】
【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．、
Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従
った。
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献［”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８９］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記
載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の
緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
ｃＤＮＡ合成は文献［Ｋａｔｏ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．、
Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０（１９９４）］に従
った。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】ｃＤＮＡクローニング 上記ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したクローン
の塩基配列決定を行ない、得られた塩基配列を３フレー
ムのアミノ酸配列に変換した後、これらの配列でプロテ
インデータベースを検索した。解析ソフトウエアはＧＥ
ＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用い
た。その結果、クローンＨＰ００８３９が含有するプラ
スミドｐＨＰ００８３９によってコードされている蛋白
質が、ブタＰＥＣ−６０のアミノ酸配列と高い相同性を
有していることが判明した。このプラスミドの構造を図
１に示す。ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した
ところ、４２ｂｐの５’非翻訳領域、２６１ｂｐのオー
プンリーディングフレーム、９５ｂｐの３’非翻訳領域
からなる構造を有していた（配列番号４）。オープンリ
ーディングフレームは８６アミノ酸残基からなる蛋白質
をコードしており、この配列を用いてプロテインデータ
ベースを検索したところ、全領域にわたってブタＰＥＣ
−６０のアミノ酸配列と７３．３％という高い相同性を
有していた。表１に、本発明のヒトＰＥＣ−６０様蛋白
質（ＨＳ）とブタＰＥＣ−６０（ＳＳ）のアミノ酸配列
の比較を示す。＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基
を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ
表す。
の塩基配列決定を行ない、得られた塩基配列を３フレー
ムのアミノ酸配列に変換した後、これらの配列でプロテ
インデータベースを検索した。解析ソフトウエアはＧＥ
ＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用い
た。その結果、クローンＨＰ００８３９が含有するプラ
スミドｐＨＰ００８３９によってコードされている蛋白
質が、ブタＰＥＣ−６０のアミノ酸配列と高い相同性を
有していることが判明した。このプラスミドの構造を図
１に示す。ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定した
ところ、４２ｂｐの５’非翻訳領域、２６１ｂｐのオー
プンリーディングフレーム、９５ｂｐの３’非翻訳領域
からなる構造を有していた（配列番号４）。オープンリ
ーディングフレームは８６アミノ酸残基からなる蛋白質
をコードしており、この配列を用いてプロテインデータ
ベースを検索したところ、全領域にわたってブタＰＥＣ
−６０のアミノ酸配列と７３．３％という高い相同性を
有していた。表１に、本発明のヒトＰＥＣ−６０様蛋白
質（ＨＳ）とブタＰＥＣ−６０（ＳＳ）のアミノ酸配列
の比較を示す。＊は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基
を、．は本発明の蛋白質と類似アミノ酸残基をそれぞれ
表す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】インビトロ翻訳による蛋白質合成 本発明のｃＤＮＡを有するベクターｐＨＰ００８３９を
用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメ
ガ社製）によるインビトロ翻訳を行なった。この際［35
Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトー
プでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロト
コールに従って行なった。プラスミドｐＨＰ００８３９
２μｇを、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物５０μｌ、
緩衝液（キットに付属）４μｌ、アミノ酸混合液（メチ
オニンを含まない）２μｌ、［35Ｓ］メチオニン（アマ
ーシャム社）８μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ２μｌ、ＲＮａｓｉｎ ８０Ｕを含む
総量１００μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させ
た。反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１
２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２
−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５
％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μ
ｌを加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグ
ラフィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた結果、本
発明のｃＤＮＡは、分子量約１０ｋＤａの翻訳産物を生
成した。この値は、配列番号２で表される塩基配列から
予想される蛋白質の予想分子量９，４５４と一致し、こ
のｃＤＮＡが確かに配列番号２で表される蛋白質をコー
ドしていることが示された。
用いて、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメ
ガ社製）によるインビトロ翻訳を行なった。この際［35
Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトー
プでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロト
コールに従って行なった。プラスミドｐＨＰ００８３９
２μｇを、ＴNＴウサギ網状赤血球溶解物５０μｌ、
緩衝液（キットに付属）４μｌ、アミノ酸混合液（メチ
オニンを含まない）２μｌ、［35Ｓ］メチオニン（アマ
ーシャム社）８μｌ（０．３７ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ２μｌ、ＲＮａｓｉｎ ８０Ｕを含む
総量１００μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させ
た。反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１
２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２
−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５
％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μ
ｌを加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグ
ラフィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた結果、本
発明のｃＤＮＡは、分子量約１０ｋＤａの翻訳産物を生
成した。この値は、配列番号２で表される塩基配列から
予想される蛋白質の予想分子量９，４５４と一致し、こ
のｃＤＮＡが確かに配列番号２で表される蛋白質をコー
ドしていることが示された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：６０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Lys Leu Pro Phe Ser Arg Met Pro Ile Cys Glu His Met Val Glu 1 5 10 15 Ser Pro Thr Cys Ser Gln Met Ser Asn Leu Val Cys Gly Thr Asp Gly 20 25 30 Leu Thr Tyr Thr Asn Glu Cys Gln Leu Cys Leu Ala Arg Ile Lys Thr 35 40 45 Lys Gln Asp Ile Gln Ile Met Lys Asp Gly Lys Cys 50 55 60 配列番号：２ 配列の長さ：１８０ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GGA AAG CTC CCT TTC TCA AGA ATG CCC ATC TGT GAA CAC ATG GTA GAG 48 Gly Lys Leu Pro Phe Ser Arg Met Pro Ile Cys Glu His Met Val Glu 1 5 10 15 TCT CCA ACC TGT TCC CAG ATG TCC AAC CTG GTC TGC GGC ACT GAT GGG 96 Ser Pro Thr Cys Ser Gln Met Ser Asn Leu Val Cys Gly Thr Asp Gly 20 25 30 CTC ACA TAT ACG AAT GAA TGC CAG CTC TGC TTG GCC CGG ATA AAA ACC 144 Leu Thr Tyr Thr Asn Glu Cys Gln Leu Cys Leu Ala Arg Ile Lys Thr 35 40 45 AAA CAG GAC ATC CAG ATC ATG AAA GAT GGC AAA TGC 180 Lys Gln Asp Ile Gln Ile Met Lys Asp Gly Lys Cys 50 55 60
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】
【配列表】 配列番号：３ 配列の長さ：８６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Val Arg Gln Trp Val Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Val Val Asp Arg Glu Val Pro Val Ala Ala Gly Lys Leu Pro Phe Ser 20 25 30 Arg Met Pro Ile Cys Glu His Met Val Glu Ser Pro Thr Cys Ser Gln 35 40 45 Met Ser Asn Leu Val Cys Gly Thr Asp Gly Leu Thr Tyr Thr Asn Glu 50 55 60 Cys Gln Leu Cys Leu Ala Arg Ile Lys Thr Lys Gln Asp Ile Gln Ile 65 70 75 80 Met Lys Asp Gly Lys Cys 85 配列番号：４ 配列の長さ：３９８ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ホモ＝サピエンス 細胞の種類：胃癌組織 クローン名：ＨＰ００８３９ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４３．．３０３ 配列 GCAGGCCCCA GCCAGCTCAG GCTACACTAT CCCAGGATCA GC ATG GCC GTC CGC 54 Met Ala Val Arg 1 CAG TGG GTA ATC GCC CTG GCC TTG GCT GCC CTC CTT GTT GTG GAC AGG 102 Gln Trp Val Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Val Asp Arg 5 10 15 20 GAA GTG CCA GTG GCA GCA GGA AAG CTC CCT TTC TCA AGA ATG CCC ATC 150 Glu Val Pro Val Ala Ala Gly Lys Leu Pro Phe Ser Arg Met Pro Ile 25 30 35 TGT GAA CAC ATG GTA GAG TCT CCA ACC TGT TCC CAG ATG TCC AAC CTG 198 Cys Glu His Met Val Glu Ser Pro Thr Cys Ser Gln Met Ser Asn Leu 40 45 50 GTC TGC GGC ACT GAT GGG CTC ACA TAT ACG AAT GAA TGC CAG CTC TGC 246 Val Cys Gly Thr Asp Gly Leu Thr Tyr Thr Asn Glu Cys Gln Leu Cys 55 60 65 TTG GCC CGG ATA AAA ACC AAA CAG GAC ATC CAG ATC ATG AAA GAT GGC 294 Leu Ala Arg Ile Lys Thr Lys Gln Asp Ile Gln Ile Met Lys Asp Gly 70 75 80 AAA TGC TGATCCCACA GGAGCACCTC AAGCCATGAA GTGTCAGCTG GAGAACAGTG 350 Lys Cys 85 GTGGGCATGG AGAGGATATG ACATGAAATA AAAGATCCAG CCCAACTG 398
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＣＪ Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＢ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＣＪ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質。 - 【請求項２】 請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 配列番号１で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なる、請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項５】 配列番号２で表される塩基配列からな
る、請求項３記載のｃＤＮＡ。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7280272A JPH09124698A (ja) | 1995-10-27 | 1995-10-27 | ヒトｐｅｃ−６０様蛋白質およびそれをコードするｄｎａ |
| EP96935398A EP0857732A4 (en) | 1995-10-27 | 1996-10-22 | HUMAN PEC-60-LIKE PROTEIN AND DNA CODING THEREFORE |
| PCT/JP1996/003061 WO1997015596A1 (en) | 1995-10-27 | 1996-10-22 | Human pec-60-like protein and dna encoding the same |
| US09/065,019 US6280968B1 (en) | 1995-10-27 | 1996-10-22 | Human PEC-60-like protein and DNA encoding the same |
| US09/671,483 US6703201B1 (en) | 1995-10-27 | 2000-09-27 | Human PEC-60-like protein and DNA encoding this protein |
| US09/941,309 US20020106777A1 (en) | 1995-10-27 | 2001-08-28 | Human PEC-60-like protein and DNA encoding this protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7280272A JPH09124698A (ja) | 1995-10-27 | 1995-10-27 | ヒトｐｅｃ−６０様蛋白質およびそれをコードするｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09124698A true JPH09124698A (ja) | 1997-05-13 |
Family
ID=17622687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7280272A Pending JPH09124698A (ja) | 1995-10-27 | 1995-10-27 | ヒトｐｅｃ−６０様蛋白質およびそれをコードするｄｎａ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6280968B1 (ja) |
| EP (1) | EP0857732A4 (ja) |
| JP (1) | JPH09124698A (ja) |
| WO (1) | WO1997015596A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014525586A (ja) * | 2011-08-31 | 2014-09-29 | オンコサイト コーポレーション | 大腸癌の処置および診断のための方法および組成物 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5858710A (en) * | 1996-11-06 | 1999-01-12 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Tumor-associated kazal inhibitor-like polypeptides and encoding polynucleotides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988003171A1 (en) * | 1986-10-30 | 1988-05-05 | Synergen Biologicals, Inc. | Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same |
| GB2199582A (en) | 1987-01-07 | 1988-07-13 | Bayer Ag | Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor |
| US5550213A (en) | 1993-12-27 | 1996-08-27 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Inhibitors of urokinase plasminogen activator |
-
1995
- 1995-10-27 JP JP7280272A patent/JPH09124698A/ja active Pending
-
1996
- 1996-10-22 WO PCT/JP1996/003061 patent/WO1997015596A1/ja not_active Ceased
- 1996-10-22 US US09/065,019 patent/US6280968B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-22 EP EP96935398A patent/EP0857732A4/en not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-08-28 US US09/941,309 patent/US20020106777A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014525586A (ja) * | 2011-08-31 | 2014-09-29 | オンコサイト コーポレーション | 大腸癌の処置および診断のための方法および組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997015596A1 (en) | 1997-05-01 |
| EP0857732A1 (en) | 1998-08-12 |
| EP0857732A4 (en) | 2001-03-14 |
| US20020106777A1 (en) | 2002-08-08 |
| US6280968B1 (en) | 2001-08-28 |
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