JPH09131174A - 微生物検出用プレ−ト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検体中のグラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌等
の微生物の検出と同時に、検出用試薬の劣化の有無及び
検体希釈液による影響の有無を確認し、判定の有効性を
判別できる微生物検出用プレ−トを提供する。 【解決手段】微生物由来成分検出用試薬を底部に位置さ
せた検体測定用ウエルと、前記微生物由来成分検出用試
薬を底部に位置させたポジテイブコントロ−ル用ウエル
及び／又は前記微生物由来成分検出用試薬を底部に位置
させたネガテイブコントロ−ル用ウエルとを１組とし、
これをプレ−ト上に１組若しくは前記微生物由来成分の
種類毎に複数組形成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、例えばグラム陰
性菌、グラム陽性菌、真菌等の微生物を目視で検出する
ための微生物検出用プレ−トに係り、詳記すれば、検出
用試薬の劣化の有無又は検体希釈液による影響の有無を
確認し、判定の有効性を同時に判別できる微生物検出用
プレ−トに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】エンドトキシン、（１→３）β−Ｄ−グ
ルカン（以下、β−グルカンと略記する。）及びペプチ
ドグリカン等は、各種微生物の細胞壁構成成分として知
られている。微生物の細胞壁中のこれら成分の有無を調
べることにより、検体中の真菌、グラム陰性菌、グラム
陽性菌等の微生物種の有無をある程度確定し得ること
は、従来から知られている。

【０００３】従来、検体中のこれら微生物種の有無を確
定する方法としては、エンドトキシン検出用試験紙を使
用する方法（特開平６−３４１９９３号明細書参照）が
知られていた。しかしながら、β−グルカン及びペプチ
ドグリカンのようなエンドトキシン以外の微生物由来成
分を検出することは、現実に行われていないし、知られ
てもいない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記従来のエンドトキ
シン検出用試験紙では、グラム陰性菌の有無を検出する
ことはできるが、グラム陽性菌及び真菌等の微生物種の
有無を検出することはできない。そればかりか、上記試
験紙は、試験紙に含有させた検出用試薬の劣化や検体希
釈液の影響等によって、発色しなかったり、誤って発色
する場合もあるので、その判定結果は信頼性の点で十分
満足すべきものではなかった。

【０００５】この発明は、検体中のグラム陰性菌、グラ
ム陽性菌、真菌等の微生物の検出と同時に、検出用試薬
の劣化の有無及び検体希釈液による影響の有無を確認
し、判定の有効性を判別できる微生物検出用プレ−トを
提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、微生物由来成分検出用試薬を底部に位置
させた検体測定用ウエルと、前記微生物由来成分検出用
試薬を底部に位置させたポジテイブコントロ−ル用ウエ
ル及び／又は前記微生物由来成分検出用試薬を底部に位
置させたネガテイブコントロ−ル用ウエルとを１組と
し、これをプレ−ト上に１組若しくは前記微生物由来成
分の種類毎に複数組形成させてなることを特徴とする。

【０００７】微生物由来成分検出用試薬を底部に位置さ
せるということは、微生物由来成分検出用試薬若しくは
該試薬含有物を、好ましくはフイルム状若しくはシ−ト
状とし、これを底部に保持させるか、或は単に底部に載
置し、ウエル開口をフイルムで覆う等して、前記フイル
ム状若しくはシ−ト状物等が開口から飛び出さないよう
にすることである。

【０００８】

【発明の実施の形態】次に、本発明の実施の形態を図面
に基づいて説明する。図１に示すように、長方形の板状
プレ−ト４上には、３個の円形のウエル１，２，３が形
成されている。尚、１は、微生物由来成分検出用試薬シ
−ト５を底部に保持させた検体測定用ウエルであり、２
は、同シ−ト５を底部に保持させたポジテイブコントロ
−ル用のウエルであり、３は、同シ−ト５を底部に保持
させたネガテイブコントロ−ル用のウエルである。

【０００９】ウエル底部に位置させる微生物由来成分検
出用試薬としては、エンドトキシン検出用試薬、β−グ
ルカン検出用試薬及びペプチドグリカン検出用試薬が挙
げられる。ポジテイブコントロ−ル用ウエル２には、ポ
ジテイブコントロ−ル液を添加する。ポジテイブコント
ロ−ル液は、上記微生物由来成分の溶液、例えば上記微
生物由来成分の精製品の水溶液である。従って、ポジテ
イブコントロ−ル液を添加すれば、当然着色する筈であ
り、着色しない場合は、微生物由来成分検出用試薬が劣
化していると判断される。尚、ここでいう精製品とは、
目的の微生物由来成分以外には、ウエル中の微生物由来
成分検出用試薬と反応する成分を含まないものを言う。
また、その精製方法は特に限定されず、この分野で通常
利用される方法は全て利用可能である。

【００１０】ネガテイブコントロ−ル用のウエル３に
は、ネガテイブコントロ−ル液を添加する。ネガテイブ
コントロ−ル液は、通常注射用水のような微生物由来成
分を含有しない水或は微生物由来成分を含有しない検体
希釈液を使用する。従って、ネガテイブコントロ−ル液
を添加しても、着色しない筈であり、着色した場合は、
微生物由来成分検出用試薬が劣化していると判断され
る。また、ネガテイブコントロ−ル液として、検体希釈
液を使用して着色した場合は、微生物由来成分検出用試
薬が劣化しているか、検体希釈液中に検出用試薬を着色
させる不純物が混入していると判断される。

【００１１】ポジテイブコントロ−ル用のウエル２とネ
ガテイブコントロ−ル用のウエル３とは、いずれか一方
でも良いが、判定の信頼性を十分確保するには、両方設
けるのが好ましい。ポジテイブコントロ−ル用及びネガ
テイブコントロ−ル用の微生物由来成分検出用試薬は、
対応する検体測定用に使用した微生物由来成分検出用試
薬と同じものを使用する。例えば、検体測定用ウエルに
エンドトキシン検出用試薬を保持させた場合は、それに
対応するポジテイブコントロ−ル用のウエル２とネガテ
イブコントロ−ル用のウエル３にも、エンドトキシン検
出用試薬を保持させる。

【００１２】上記実施例では、ウエル１，２，３は円形
に形成されているが、これは必ずしもこのようでなくと
も良く、他の形状であっても差し支えない。図２は、本
発明の他の実施例を示すものであり、四角形の板状プレ
−ト４に、エンドトキシン検出用ウエル１−１、２−
１、３−１、β−グルカン検出用ウエル１−２、２−
２、３−２及びペプチドグリカン検出用ウエル１−３、
２−３、３−３の合計９個の円形の凹状ウエルが形成さ
れている。尚、１−１、１−２、１−３は、検体用ウエ
ル、２−１、２−２、２−３は、ポジテイブコントロ−
ル用ウエル、３−１、３−２、３−３は、ネガテイブコ
ントロ−ル用ウエルである。

【００１３】エンドトキシン検出用ウエル１−１、２−
１、３−１の底部には、エンドトキシン検出用試薬シ−
ト５ａが保持され、β−グルカン検出用ウエル１−２、
２−２、３−２の底部には、β−グルカン検出用試薬シ
−ト５ｂが保持され、ペプチドグリカン検出用ウエル１
−３、２−３、３−３の底部には、ペプチドグリカン検
出用試薬シ−ト５ｃが保持されている。

【００１４】上記実施例では、検体用ウエル１−１、１
−２、１−３、ポジテイブコントロ−ル用ウエル２−
１、２−２、２−３及びネガテイブコントロ−ル用ウエ
ル３−１、３−２、３−３は、それぞれ用途毎に同一列
となるように形成され、エンドトキシン検出用ウエル１
−１、２−１、３−１、β−グルカン検出用ウエル１−
２、２−２、３−２及びペプチドグリカン検出用ウエル
１−３、２−３、３−３は、微生物由来成分毎に同一列
となるように形成されている。このように形成すること
によって、実験操作とその判別を容易に間違えずに行う
ことができる。

【００１５】板状プレ−ト４としては、検出用試薬等と
反応しないプラスチック等の適当な材料から形成するこ
とができる。板状プレ−ト４は、上面にウエルが形成で
きるものであれば良く、その形状は特に限定されない。
また、判定のし易さから、白色プレ−ト又は透明板の底
面を白色にしたプレ−トを使用するのが好ましい。上記
実施例では、１枚の板状プレ−ト４に９個のウエルを形
成しているが、エンドトキシン、β−グルカン及びペプ
チドグリカン検出用ウエル毎に別の板状プレ−トに形成
し、これらプレ−トを合わせてあるいは別々に使用する
ようにしても良い。

【００１６】ウエル底部に所定の検出用試薬を保持させ
る方法としては、これら試薬を、検体を加えたときに反
応し得る状態でウエル底部に保持させることができれば
良く、特に限定されない。例えば、これら検出用試薬を
シ−ト状の吸収性担体に担持させたものを調製し、これ
を該ウエル底部に保持させる方法、これら検出用試薬を
水溶性で且つ被膜形成能を有する高分子化合物を用いて
フイルム状（シ−ト状）としたものを調製し、これを該
ウエル底部に保持させる方法等が好ましい。

【００１７】上記検出用試薬を担持させる吸収性担体と
しては、例えばポリプロピレン，ポリエチレン，ポリフ
ッ化ビニリデン，ポリアクリロニトリル，ナイロン，ポ
リエチレン，ポリ酢酸ビニル，ポリテトラフロオロエチ
レン，ポリウレタン等のプラスチック、ガラス繊維、セ
ルロ−ス、例えばメチルセルロ−ス，酢酸セルロ−ス，
ニトロセルロ−ス等のセルロ−ス誘導体等を素材とする
吸収性担体（より具体的には、例えば、織布、不織布、
濾紙、スポンジ等）が挙げられる。

【００１８】また、水溶性で被膜形成能を有する高分子
化合物としては、例えばポリビニルアルコ−ル、例えば
ヒドロキシプロピルセルロ−ス，ヒドロキシプロピルメ
チルセルロ−ス，ヒドロキシエチルセルロ−ス等のセル
ロ−ス誘導体、例えばポリアクリル酸，ポリメタクリル
酸等のポリカルボン酸等が挙げられる。

【００１９】また、これら検出用試薬を吸収性担体に担
持させるには、例えば吸収性担体に、検出用試薬溶液を
含浸させた後に乾燥させる等の公知の方法によって行え
ば良い。それぞれの検出用試薬を担持させた吸収性担体
或はフイルムをウエル底部に保持させる方法としては、
例えば、これらをウエル形状に合わせて切り出し、ウエル
底部に接着させるか密嵌圧入保持させる方法、これらを
ウエルが貫通状態で形成された板状物と当該ウエルが形成
されていない板状物との間に挟み込んで接着させる方法
等が挙げられる。

【００２０】本発明の微生物検出用プレ−トのウエル底
部に担持させるエンドトキシン検出用試薬としては、例
えばリムルス属（Limulus）,タキプレウス属(Tachypleu
s),或はカルシノスコルピウス属(Calcinoscorpius)に属
するカブトガニの血球成分を含んでいるような試薬、所
謂リムルス試薬であってβ−グルカンとは反応しない性
質を有する試薬等が挙げられる。尚、本発明に於いて
は、目視によりエンドトキシンを検出するため、このよ
うな試薬は、エンドトキシンの存在により着色するよう
な合成基質法用試薬が好ましい。また、このような条件
を満たす市販の試薬、例えばバイオウイタカ−社（Biow
hittaker Inc.）、エンドセイフ社(Endosafe. Inc.)、生
化学工業（株）及び和光純薬工業（株）等から市販され
ているものであって、エンドトキシンに特異的な試薬
は、当然のことながら本発明の目的のために使用可能で
ある。

【００２１】β−グルカン検出用試薬としては、例えば
昆虫の体液成分から調製されたβ−グルカンと特異的に
反応する試薬や、例えばリムルス属（Limulus）,タキプ
レウス属(Tachypleus),或はカルシノスコルピウス属(Ca
lcinoscorpius)に属するカブトガニの血球成分を含みβ
−グルカンとは反応するがエンドトキシンとは反応しな
い性質を有する試薬であって、目視にてβ−グルカンの
存在を確認できる試薬（例えば合成基質を用いる試薬な
ど）が挙げられる。これら試薬は、市販されているもの
を適宜使用しても良いし、また公知の方法により自製し
たものを使用しても良い。

【００２２】ペプチドグリカン検出用試薬としては、例
えば昆虫の体液成分から調製されたペプチドグリカンに
対して特異的な試薬などが挙げられ、市販されているも
のを適宜使用しても良いし、また公知の方法により自製
したものを使用しても良い。

【００２３】昆虫の体液成分からβ−グルカン検出用試
薬又はペプチドグリカン検出用試薬を調製する方法とし
ては、例えば、β−グルカン検出用試薬については、特
開昭６３−１４１５９８号公報、ペプチドグリカン検出
用試薬については、特開昭６３−１４１５９９号公報に
示されているような方法が挙げられる。

【００２４】次に、本発明の微生物の検出用プレ−トを
使用して、微生物の存否の判定を行った例を示す。検体
（１）〜（６）について、微生物の存否とその種類の判
定を行った。使用した本発明の微生物検出用プレ−ト
は、図２に示す形態のものであり、以下の操作により判
定を行った。

【００２５】即ち、微生物検出用プレ−トの検体用ウエ
ル１−１、１−２、１−３には、所定の検体を、また、
ポジテイブコントロ−ル用ウエル２−１、２−２、２−３
及びネガテイブコントロ−ル用ウエル３−１、３−２、３
−３には、所定のコントロ−ル液を夫々一定量滴下し、
反応開始後所定時間経過後に、夫々のウエルに於ける発
色状況を目視により判定して、微生物の存否とその種類
を判定した。

【００２６】各ウエルにおける発色状況からの判定は、
ポジテイブコントロ−ルが陰性の場合と、ネガテイブコン
トロ−ルが陽性の場合を除いて、次のようにして行っ
た。尚、ポジテイブコントロ−ルが陰性の場合とネガテイ
ブコントロ−ルが陽性の場合は、無効と判断する。 ・エンドトキシン、β−グルカン及びペプチドグリカン
のいずれもが陰性の場合：微生物が存在しないと判定。 ・β−グルカンのみ陽性の場合：真菌が存在すると判
定。 ・ペプチドグリカンのみ陽性の場合：グラム陽性菌が存
在すると判定。

【００２７】・エンドトキシンとペプチドグリカンの両
方が陽性の場合：グラム陰性菌のみ、あるいはグラム陰
性菌とグラム陽性菌の両方が存在すると判定。 ・β−グルカンとペプチドグリカンの両方が陽性の場
合：グラム陽性菌と真菌の両方が存在すると判定。 ・エンドトキシン、β−グルカン及びペプチドグリカン
の三者が陽性の場合：グラム陰性菌と真菌の両方が存在
する、あるいはグラム陰性菌とグラム陽性菌と真菌の三
者が存在すると判定。

【００２８】次表１〜２に、検体（１）〜（６）の各ウ
エルにおける発色状況からの判定結果を示した。尚、表
１〜２中、＋は発色していることを示し、−は発色して
いないことを示す。また略号は、それぞれ以下の意味を
表す。 Ｓ：検体 ＰＣ：ポジテイブコントロ−ル ＮＣ：ネガテイブコントロ−ル ＥＴ：エンドトキシン ＧＬ：β−グルカン ＰＧ：ペプチドグリカン

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】次に、本発明のプレ−トを用いた微生物の
検出結果を無効と判断すべき場合の例を次表３に示す。
尚、表３中の各記号は、表１〜２と同じ意味を表す。

【００３２】

【表３】

【００３３】表３に示したような検出結果が得られた場
合は、その結果は信頼性に欠けるので、その検体につい
て再検討を行う必要がある。

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、研究室等で、検体中の
真菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌等の微生物の存否と
その種類の判定を、一次スクリ−ニング的に定性的に行
うことができると共に、検体についての陽性または陰性
の判別と同時に、検出用試薬の劣化の有無又は検体希釈
液による検出反応への影響の有無を確認し、判定の有効
性を確認できるので、目視判定の精度を著しく高めるこ
とができる。

【００３５】また、実験操作は、各ウエルに所定溶液を
一定量添加するだけであるので、簡単であるほか、各ウ
エルは、隔壁により隔てられているので、他のウエルに添
加される溶液により汚染されることなく正確に測定でき
る。

【００３６】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例を示す斜視図である。

【図２】本発明の他の実施例を示す斜視図である。

【符号の説明】

１，１−１，１−２，１−３ 検体測定用ウエル ２，２−１，２−２，２−３ ポジテイブコントロ
−ル用ウエル ３，３−１，３−２，３−３ ネガテイブコントロ
−ル用ウエル ４ 板状プレ−ト ５，５ａ，５ｂ，５Ｃ 微生物由来成分検出
用試薬シ−ト

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物由来成分検出用試薬を底部に位置さ
   せた検体測定用ウエルと、前記微生物由来成分検出用試
   薬を底部に位置させたポジテイブコントロ−ル用ウエル
   及び／又は前記微生物由来成分検出用試薬を底部に位置
   させたネガテイブコントロ−ル用ウエルとを１組とし、
   これをプレ−ト上に１組若しくは前記微生物由来成分の
   種類毎に複数組形成させてなることを特徴とする目視に
   て微生物の有無を判別する微生物検出用プレ−ト。
2. 【請求項２】前記微生物由来成分検出用試薬を底部に保
   持させてなる請求項１に記載のプレ−ト。
3. 【請求項３】前記微生物由来成分の種類が、エンドトキ
   シン、（１→３）β−Ｄ−グルカン及びペプチドグリカ
   ンの１種以上である請求項１または２に記載のプレ−
   ト。
4. 【請求項４】前記ウエルの組を、前記微生物由来成分と
   してエンドトキシン、（１→３）β−Ｄ−グルカン又は
   ペプチドグリカン毎に、別々に形成してなる請求項３に
   記載のプレ−ト。
5. 【請求項５】前記検体測定用ウエルと、前記ポジテイブ
   コントロ−ル用及び／又はネガテイブコントロ−ル用の
   ウエルとを、前記微生物由来成分毎に同一列となるよう
   に形成し、且つ検体測定用、ポジテイブコントロ−ル用
   及び／又はネガテイブコントロ−ル用の用途毎に同一列
   となるように形成してなる請求項４に記載のプレ−ト。
6. 【請求項６】前記ポジテイブコントロ−ル用ウエルがポ
   ジテイブコントロ−ル液を添加するウエルであり、該ポ
   ジテイブコントロ−ル液は、前記微生物由来成分を含有
   する溶液である請求項１または５に記載のプレ−ト。
7. 【請求項７】前記ネガテイブコントロ−ル用ウエルがネ
   ガテイブコントロ−ル液を添加するウエルであり、該ネ
   ガテイブコントロ−ル液は、前記微生物由来成分を含有
   しない水若しくは検体希釈液である請求項１または５に
   記載のプレ−ト。
8. 【請求項８】前記微生物由来成分検出用試薬を担持させ
   たシ−ト状の吸収性担体又は前記微生物由来成分検出用
   試薬を含有させた水溶性高分子化合物のシ−ト状物を、
   前記各々のウエル底部に保持した請求項２〜７のいずれ
   かに記載のプレ−ト。
9. 【請求項９】前記吸収性担体が、織布、不織布、濾紙若
   しくはスポンジ状の高分子化合物である請求項８に記載
   のプレ−ト。