JPH09131192A - 組織型及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター及びそれを使用する固相分析方法 - Google Patents

組織型及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター及びそれを使用する固相分析方法

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JPH09131192A
JPH09131192A JP8260469A JP26046996A JPH09131192A JP H09131192 A JPH09131192 A JP H09131192A JP 8260469 A JP8260469 A JP 8260469A JP 26046996 A JP26046996 A JP 26046996A JP H09131192 A JPH09131192 A JP H09131192A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 組織型又はウロキナーゼ型のプラスミノーゲ
ン活性化因子インヒビターを検出するのに有用なヒト内
皮細胞プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを提供
する。 【解決手段】 ヒト内皮細胞プラスミノーゲン活性化因
子インヒビターは、以下のアミノ酸配列を有し、かつグ
リコシル化されていない。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】本出願は１９８４年６月２２日に登録され
た、出願番号623,357 号の継続出願であり、その公開は
参考文献として、本出願に組込まれている。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は、特に、血液又はそ
の他の生物学的試料における、ベータ移動性内皮細胞プ
ラスミノーゲン活性化因子インヒビターの検出及び定量
のために好適な、実質的に純粋な形のヒトのベータ移動
性内皮細胞プラスミノーゲン活性化因子インヒビターに
関する。
【０００３】
【背景技術】内皮細胞は、血管のルミノール面に配列
し、局所的に存在するフィブリンの特異的タンパク質分
解に活発な役割を果すと考えられている、トッド（Tod
d) 、ジャーナル・オブ・パソロジカル・バクテリオロ
ジー（J. Pathol. Bacteriol.)、７８巻、２８１頁（１
９５９年）、アストラップ（Astrap.)プログレス・イン
・ケミカル・フィブリノリシス アンド スロムボリシ
ス（Progress in ChemicalFibrinolysis and Thromboly
sis) 、ダビッドソン（Davidson) 等編、３巻、１〜５
７頁、レーベン・プレス（Raven Press)、ニューヨーヨ
（１９７８年）。このプロセスを開始し、そして制御す
る、内皮細胞の能力とは、プラスミノーゲン活性化因子
（ＰＡ）を合成し、そしてこれを放出する能力で代表さ
れ（ロスコトフ（Loskutoff)等、プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro.
Natl. Acad. Sci) ＵＳＡ、７４巻、３９０３頁（１９
７７年）；シェプロ（Shepro) 、等、スロンボ・リサー
チ（Thromb. Res.) １８巻、６０９頁（１９８０年）；
モスカテリ（Moscatelli) 等、セル（Cell) 、２０巻、
３４３頁（１９８０年）；ラウグ（Laug) 、スロンボ・
ヘモスタシス（Thromb.Hamostasis) 、４５巻、２１９
頁（１９８１年）；ボーイス（Booyse) 等、スロンボ・
リサーチ（Thromb. Res.) 、２４巻、４９５頁（１９８
１年））、組織型及びウロキナーゼ型の分子が含まれて
いる（レビン（Levin)等、ジャーナル・オブ・セル・バ
イオロジー（J. Cell Biol.)、９４巻、６３１頁（１９
８２年）；ロスクトフ（Loskutoff)等、ブラッド（Bloo
d)、６２巻、６２頁（１９８３年）。また内皮細胞は、
繊維素溶解のインヒビターを産生する（ロスクトフ（Lo
skutoff)等、プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci)
ＵＳＡ、７４巻、３９０３頁（１９７７年）；レビン
（Levin)等、スロンブ、リサーチ（Thromb. Res.) 、１
５巻、８６９頁（１９７９年）；ロスクトフ（Loskutof
f)等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J. Biol. Chem.) 、２５６巻、４１４２頁（１９８
１年）；ドスネ（Dosne)等、スロンブ、リサーチ（Thro
mb. Reシ.) 、１２巻、３７７頁（１９７８年）；エミイ
ス（Emeis)等、パイオケム・バイオフィズ・レズ・コミ
ュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.) 、
１１０巻、３９２頁（１９８３年）；ロスクトフ（Losk
utoff) 等、プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci)
ＵＳＡ、８０巻、２９５６頁（１９８３年）；レビン
（Levin) プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci)Ｕ
ＳＡ、８０巻、６８０４頁（１９８３年）。
【０００４】これらインヒビターは、おそらく、血管壁
の繊維素溶解システムの制御において、重要な制御的役
割を果たしているのであろうが、それらの特異性、作用
モード、又は生化学的性質はほとんど知られていない。
これらのインヒビターが内皮細胞によって、実際に合成
されるという結論は、培養細胞が血清含有培養地由来の
プロテアーゼ・インヒビターと結合でき、かつインター
ナリゼーションを起こすという最近の報告により、いく
ぶん不明瞭なものになった（コーエン（Cohen)、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーション（J. C
hin. Invest.)５２巻、２７９３頁（１９７３年）；パ
スタン（Pastan) 等、セル（Cell) 、１２巻、６０９頁
（１９７７年）；ローリッチ（Rohrlich) 等、ジャーナ
ル・オブ・セル・フィジオロジー（J. Cell Physiol.）
１０９巻、１頁（１９８１年）；マクファーソン（Mcph
erson)等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J. Biol. Chem.) ２５６巻、１１３３０頁（１
９８１年）。
【０００５】１９８３年１１月２３日公開された英国特
許出願ＧＢ2,119,804 号で報告されている、組換えＤＮ
Ａ技術による組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−
ＰＡ）を比較的に無制限量産生する可能性は、臨床的に
も商業的にも興味深い。相対的に不活性な分子を、フィ
ブリン自体により、非常に有効な血栓崩壊剤への転換
は、フィブリン−血小板血栓それ自体に局在化するとき
のみ、ｔ−ＰＡが活性酵素として存在しうることを示し
ている。このようにｔ−ＰＡは、ウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子及びストレプトキナーゼよりも、
より特異性の高い血栓崩壊剤であると考えられている。
ｔ−ＰＡ及びフィブリンの相互作用は、ｔ−ＰＡの天然
のインヒビターがこのシステムを制御するのに必要な
い、すなわち、その制御は、フィブリンの生成／分解を
通して行なわれ、ｔ−ＰＡは存在しないという議論を引
き起こした。ヒトの血液中に、そのようなインヒビター
が存在することは、天然の及び遺伝子工学的に作ったｔ
−ＰＡに基づく、特異的で、有効かつ安全な血栓崩壊プ
ログラムを設計する試みを複雑なものにしている。最小
限の、これらの投与量、治療時間及び治療の効果を、予
想しかつ／またはモニターするのが困難となる。この問
題は、そのインヒビターレベルが個人個人で異なる場合
には、特に著しいものとなる。
【０００６】血漿中にｔ−ＰＡの特異的インヒビターが
存在するということについては、議論の余地がある（コ
レン（Collen) 、スロンボ、ヘモスタス（Thromb. Haem
ostas.) ４３巻、７７頁（１９８０年））。事実血漿に
入れたｔ−ＰＡの活性の寿命は、生体中での寿命２分間
に対し（コーニンガー（Koninger) 等、スロムボ、ヘモ
スタス（Thromb. Haemostas.) 、４６巻、６５８頁（１
９８１年））、９０分間であることが報告されている
（コーニンガー（Korninger)等、スロンボ、ヘモスタス
（Thromb. Haemostas.) 、４６巻、６６２頁（１９８１
年）。これらの観察に基づいて、これらの著者等は、血
漿によるｔ−ＰＡの阻害は、生理学的に重要なものでは
ないと結論づけた。この結論は最近、クルイソフ（Krui
thof) 等（プログレス・イン・フィブリノリシス（Pro
g. in Fibrinolysis)６巻、３６２頁（１９８３年））
によって反論された。クミエレウスカ（Chmielewska)等
（スロムボ、リサーチ（Thromb. Res.）３１巻、４２７
頁（１９８３年））の報告において、血漿におけるｔ−
ＰＡの迅速なインヒビターの存在を直接的に示す証拠が
報告された。全ての場合において、この抗−ｔ−ＰＡ活
性は、血栓症の問題を有する又はその問題が拡大する危
険のある患者、すなわち、まさにｔ−ＰＡ治療を受ける
べき患者の血漿中に検出される。この知見は、コーニン
ガー等が、“正常な”個体の細胞質のみを試験したの
で、そのような活性を検出できなかったことを説明して
いる（コーニンガー（Korninger)等、スロンボ、ヘモス
タス（Thromb. Haemostas.) 、４６巻、６６２頁（１９
８１年）。ｔ−ＰＡインヒビターに関するこれらの報告
は、何人かの個体の血液中に検出される“活性”の定性
的記述に過ぎない。
【０００７】最近、培養したウシの内皮細胞における、
抗繊維素溶解剤が検出された（ロスクトフ（Loskutoff)
等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci)ＵＳＡ、
８０巻、２９５６頁（１９８３年）。このインヒビター
は主要な内皮細胞産物であり、それがフィブリン・独立
（ウロキナーゼ型）及びフィブリン依存（組織型）の両
方のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）を中和できる
ことから、プラスミノーゲン活性化因子のインヒビター
である。ヒトの血小板は、生理学的に関連した刺激、例
えば、トロンビンに応答して、それらから、他の血小板
タンパク質、（例えば、血小板ファクター４）と平行し
て放出される免疫学的に同じインヒビターを含む（エリ
クソン（Erickson) 等、へモスタシス（Haemostasi) 、
１４巻（１）、６５頁（１９８４年）及びジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスチゲーション（J. Chin. I
nyest.) ７４巻、１４６５頁（１９８４年）という観察
は、ヒトの生物学におけるこのインヒビターの潜在的な
重要性を強調している。ウシの大動脈の内皮細胞（ＢＡ
Ｅ）由来のプラスミノーゲン活性化因子インヒビター
（ＰＡＩ）に対する抗血清は、ヒトの内皮ＰＡＩが、細
胞質、血清、血小板由来のものと同様、免疫学的に同じ
であることを示すのに用いられてきた（エリクソン（Er
ickson) 等、プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci)
ＵＳＡ、８２巻、８７１０頁（１９８５年）。
【０００８】ロスクトフ（Loskutoff)等（プロシーディ
ング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci)ＵＳＡ、８０巻、２９５６
頁（１９８３年））により発見されたインヒビターは、
コンカナバリンＡアフィニティークロマトグラフィー
と、分取ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を組合せることによ
り、ウシの大動脈内皮細胞培養培地から精製し、等電点
4.５〜５の、分子量５0,０００ダルトンを有する一本鎖
のグリコプロテインであることが示された（ヴァン・モ
ウリク（Van Mourik) 等、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.)２５９巻、１
４９１４頁（１９８４年））。最近、三種の免疫学的に
異なるプラスミノーゲン活性化因子インヒビターが存在
することが証明された。第１のものは、内皮細胞から始
めて誘導された、先に議論したものである。第２のもの
は、アステッド（Astedt) 等（スロンボ、ヘモスタシス
（Thromb. Haemostasis.) ５３巻、１２２頁（１９８５
年）により報告された、胎盤から単離したものである。
第３のものは、スコット（Scott)等（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２
６０巻、７０２９頁（１９８５年））により報告された
プロテアーゼネキシンである。
【０００９】内皮細胞型のＰＡＩは、免疫学的なものに
加え、これが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化
因子（ｕ−ＰＡ）と同様、１本鎖及び２本鎖の組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子も阻害し、一方、プロテアー
ゼネキシン及び胎盤ＰＡＩは、生理学的濃度で実質的な
ｔ−ＰＡ阻害を示さない点で、胎盤ＰＡＩ及びプロテア
ーゼネキシンと異なる。後者の二つのインヒビターは、
生理学的濃度では、ｕ−ＰＡ活性を阻害しない。さら
に、アガロース・ゾーン電気泳動で分析すると、内皮Ｐ
ＡＩはベーター移動を示すが、他の２つのＰＡＩは示さ
ない。加えて、内皮細胞ＰＡＩが、低pH値（例えばpH
３）及びＳＤＳ（0.１％）に対し安定である一方、他の
２つのインヒビターは、これらいずれの処理において
も、すみやかに失活する（ヴァン・モウリク（Van Mour
ik) 等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.) ２５９巻、１４９１４頁（１９
８４年））。これまでに議論してきた結果は、ベータ移
動を示す内皮細胞型ＰＡＩは、アステッド（Astedt) 等
（スロンボ、ヘモスタシス（Thromb. Haemostasis.) 、
５３巻、１２２頁（１９８５年））により報告された胎
盤ＰＡＩと同様、ヒトの胎盤抽出物中にも存在する。２
つの型のＰＡＩが、胎盤から入手できるので、内皮細胞
ＰＡＩとこれまで呼んできたヒトのＰＡＩは、通常、ベ
ータ−ＰＡＩ、又は、内皮ＰＡＩ、又は内皮細胞型ＰＡ
Ｉと呼び、一方、胎盤から初めに単離されたＰＡＩは、
胎盤型ＰＡＩ又は胎盤ＰＡＩと呼ぶ。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトの内皮
細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと免疫
学的に類似し、ヒトのベータ移動内皮細胞プラスミノー
ゲン活性化因子インヒビターへ結合し、その活性を阻害
する、実質的に純粋な組換えタンパク質性分子及びその
使用方法を企図する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、以下の
発明に関する。 1. 以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
かつグリコシル化されていないことを特徴とする、実質
的に純粋なヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビター、及び
【００１２】
【化２】
【００１３】2. 被分析試料における内皮プラスミノー
ゲン活性化因子インヒビターの存在を検出するための固
相分析方法であって、以下の工程： (1) プロテアーゼネキシン及び胎盤プラスミノーゲン活
性化因子と免疫的に異なる組織型プラスミノーゲン活性
化因子及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
の両方の活性を阻害する実質的に純粋な組換えヒト内皮
プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを固定化した
固体マトリックスを含む固相サポートを準備する工程、
(2) 分析すべき被分析試料の部分標本を、前記固相サポ
ートの前記組換えヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子
インヒビター及び分析すべき被分析インヒビターの両方
に結合する所定量の結合試薬と混合し、混合物を形成す
る工程、(3) 前記結合試薬が被分析試料中に存在する被
分析インヒビターと結合するのに十分な時間、生物学的
検定条件下で前記混合物を維持する工程、(4) 前記混合
物を前記固相サポートと混合し、固液相混合物を調製す
る工程、(5) 前記被分析インヒビターと結合しなかった
前記混合物中の前記結合試薬が前記固相サポートの前記
組換えヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒビタ
ーと結合するのに十分な所定の時間、生物学的検定条件
下で、前記固液相混合物を維持する工程、(6) 固相及び
液相を分離する工程、及び(7) 前記固相サポートの前記
組換えヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒビタ
ーに結合した前記結合試薬の量を測定する工程、を含む
ことを特徴とする方法。
【００１４】本発明においては、（ａ）動物宿主におい
て、内皮細胞プラスミノーゲン活性化因子インヒビター
に対して生じる抗体のようなレセプター、すなわち、抗
プラスミノーゲン活性化因子インヒビター及び（ｂ）指
示手段が使用される。本発明の一面において、（ａ）動
物宿主において生ずる。ポリクロナール抗体となりうる
レセプター及び（ｂ）指示手段が使用される。その指示
手段及びレセプターは単一の分子でもよく、また、個々
の分子がたくさん集ったものから成っていてもよい。そ
のレセプターは、それ自身組織型又はウロキナーゼ型プ
ラスミノーゲン活性化因子に結合し、かつ阻害する内皮
細胞（ベータ移動）プラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビターに結合する。その指示手段は、そのレセプターを
標識し、血栓症の患者の血清等の検定する試料中にイン
ヒビターが存在するかどうかを知らせる。本発明におけ
るレセプターは、選択的に、組織型（ｔ−ＰＡ）又はウ
ロキナーゼ型（ｕ−ＰＡ）のプラスミノーゲン活性化因
子と結合する内皮細胞プラスミノーゲン活性化因子イン
ヒビターと結合する。
【００１５】本発明では、ポリクローナルレセプターを
使用してもよい。そのようなポリクローナルレセプター
は、例えば、（ａ）動物宿主に、そのインヒビターのレ
セプターとなる、抗体の産生を誘導するのに十分な量の
内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター
（ＰＡＩ）を投与し、（ｂ）その免疫化した動物から、
その抗体を含む抗血清を採集し、（ｃ）その抗血清から
そのレセプターを回収することによって得られる。ま
た、本発明では更に、上述の（ａ）〜（ｃ）のポリクロ
ーナルレセプターの生成ステップに加え、そのレセプタ
ーを指示手段と合せるステップ（ｄ）を使用してもよ
い。上述の両方法とも、ステップ（ａ）及び宿主の十分
なインキュベーション、例えば、１〜２週間後で、しか
も、ステップ（ｂ）前に抗体の産生を誘導するための、
同インヒビターの二次接種を宿主に与えることも可能で
ある。
【００１６】本発明では、検定試料中の内皮細胞プラス
ミノーゲン活性化因子インヒビターの存否及び存在量を
検出する固相検定法が企図される。この方法は、（ａ）
試料をその上で検定する固体マトリックスを準備する、
（ｂ）ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ又は上述のポリクローナル
レセプターを含む群から選ばれたプラスミノーゲン活性
化因子であり、そのインヒビターと結合（複合体形成）
する結合試薬をその固体マトリックスに固定し、固相サ
ポートを作る、（ｃ）その固相サポートに、検定する液
体試料の部分標本を加え、固液相混合物を作る、（ｄ）
その結合試薬が、試料中のプラスミノーゲン活性化因子
インヒビターと結合するきに十分な所定時間、その混合
物を維持する、（ｅ）固相と液相を分離する、（ｆ）そ
の結合試薬に結合（と複合体形成）したインヒビターの
存在を測定する、ステップから成り立っている。
【００１７】好ましい態様においては、その結合試薬に
結合したインヒビターの量は、（ｉ）上述のステップ
（ｅ）の後に得られる固相に、インヒビターと複合体を
作り、固相サポート上に結合したインヒビターと結合す
る第２の結合試薬の水溶液を混合する、（ii) その第２
の結合試薬がインヒビターと結合（複合体を形成）する
のに十分な、予め決められた時間（典型的には約２〜約
４時間）、その第２の固液混合物を維持する、（iii)そ
の第２の固−液相混合物を固相と液相に分離する、（i
v) 、そのインヒビターに結合した第２の結合試薬の量
を測定し、それにより、インヒビターの量を決定する、
ことにより測定する。本発明では、キットとしての哺乳
類検出装置が使用される。そのキットは、活性成分とし
て、生化学的試薬装置及びｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡを含む
少なくとも１つの容器を含む。その生化学的試薬装置
は、指示手段及び検定試料と混合したとき、試料中に存
在する内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒビター
（ＰＡＩ）と選択的に結合し、そのインヒビターの存在
及び存在量を指示する、乾燥、溶液、分散形のポリクロ
ーナルレセプターを含んでいる。この装置に含まれうる
指示グループには、放射性元素、生物学的に活性な酵素
又は、ＮＭＲ活性元素が含まれる。
【００１８】また、検定装置は、一列に１２ウェルある
マイクロタイターストリップの固体マトリックスも含ま
れる。存在するｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡも、その固体マ
トリックスに選択的に結合する。更に、その検定装置
は、ウェル洗浄用、試料希釈用、又は標識試薬希釈用の
乾燥又は液体型の種々のバッファと同様に、その検定結
果を比較するための標準物質も含んでいる。生化学的試
薬装置の使用には、組織型又は、ウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子のようなプラスミノーゲン活性化
因子と結合（複合体形成）する特異的なプラスミノーゲ
ン活性化因子インヒビターの検出及び定量が含まれてい
る。このような試薬システムの特に好ましい使用は、イ
ン・ビトロ（in vitro) での操作法におけるプラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビターの検出に関連している。
【００１９】また、本発明のもう１つの特徴としては、
実質的に純粋な組換えタンパク質性分子である、ヒトの
内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターが
企図される。更に、好ましくは、その組換え分子も、少
なくともｔ−ＰＡに結合し、その活性を阻害し、最も好
ましくは、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの両方に結合し、それ
らの活性を阻害する。その組換え分子はプロテアーゼ・
ネキシン及び胎盤ＰＡＩと免疫学的に異なる。１つの態
様においては、その組換え分子は、実質的に、ポリペプ
チド結合のグリコシル基を含まず、別の態様において
は、そのインヒビターは、ポリペプチド結合のグリコシ
ル基を含む。１つの非グリコシル化した態様において
は、その組換え分子は、融合ポリペプチドとして、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＣＥ分析により、約１８０キロダルトン（kda)
の見かけ上の相対分子量（Ｍｒ）を示し、一方、他の非
グリコシル化した態様においては、そのＭｒは約４０kd
a であった。
【００２０】上述の議論から、その組換え分子は、天然
のヒトの内皮細胞型ＰＡＩの生物学的全活性を有する必
要ではないことが分る。その分子は、天然相同体の生物
学的活性を有し、少なくともｔ−ＰＡに結合し、その活
性を阻害することが望まれる一方、その組換え分子は、
天然のタンパク質と免疫学的類似性を有し、及び天然の
タンパク質と交叉反応を起こすレセプター分子の分泌を
誘導すの能力（以後議論する）があるので、有用であ
る。本発明の別の一面としては、約１１４０〜約３００
０ヌクレオチドから成り、そして、ヌクレオチド部位１
３から約１１５３の、図２２の式で表わした配列に対応
する、左から右へ、５′末端から３′末端の方向に示し
たヌクレオチド配列を、ヒトの内皮細胞型プラスミノー
ゲン活性化因子インヒビターをコードする読み枠と一致
して含んでいる、生物学的に純粋なＤＮＡ分子がある。
別の態様においては、そのＤＮＡ分子配列は、部位１か
ら約１９６０のものに対応している。また別の態様にお
いては、そのＤＮＡ分子配列は、部位１から約１１５３
までのものに対応している。また他の態様においては、
そのＤＮＡ配列は、図２２に示されている、全ＤＮＡ配
列に対応している。
【００２１】複製／発現媒体中でＤＮＡをクローニング
するための非染色体ベクターは、その培地に適合し(com
patible)かつそのベクターが、そのＤＮＡ分子を増殖す
ることができるように前述のＤＮＡ分子を含むレプリコ
ンを含み、更に、好ましいことにそのベクターは、その
ＤＮＡ分子の５′末端に隣接して、そのＤＮＡと機能し
得るように（又は機能的に）結合し、かつ、組換え、ヒ
ト内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター
を含むＤＮＡ分子によりコードされる産物を発現するた
めの複製／発現媒体に適合する転写プロモーターを含
む。さらに好ましくは、そのベクターは、各々含まれる
ＤＮＡ分子配列に隣接して５′末端及び３′末端に機能
的に結合し、そのＤＮＡ分子によりコードされる産物を
発現するための複製／発現媒体に適合する翻訳開始コド
ン及び翻訳終止コドンを含む。
【００２２】検定試料中の、内皮細胞型ヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビターの存否及び存在量を検出
する固相検定法は、本発明のもう１つの特徴を構成して
いる。ここで、固相サポートは、実質的に純粋な組換え
タンパク質性分子（前述）を固定化した固体マトリック
スを含むよう作る。検定する液体試料の部分標本を、固
体サポートの組換え分子及び検定されるインヒビターの
両方と結合（複合体形成）する、予め決められた量の結
合試薬と混合する。その混合物を、生物学的検定条件
下、その結合試薬が、試料中に存在するインヒビターと
結合するのに十分な、予め決められた時間維持する。そ
して、その混合物を、固相サポートと混ぜ、固液相混合
物を作る。その後、固相及び液相を分離し、固相サポー
トの組換えインヒビターに結合した結合試薬量を測定す
る。ある態様においては、その結合試薬は、組換えタン
パク質性分子及びヒトの内皮細胞型ＰＡＩの両方と免疫
反応を起こすレセプター分子である。他の態様において
は、その結合試薬はｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡである。
【００２３】本発明は、いくつかの利点及び長所を提供
している。本発明の利点の１つは、本発明の生化学的試
薬システム及び診断システムは、非常に特異性が高いこ
とである。生物学的試料はしばしば多くの繊維素溶解イ
ンヒビターを含む。一般にこれらの検定は、その試料
の、プラスミノーゲン活性化因子又はプラスミンの活性
を減少する能力を測定するものなので、既存の検定法で
それらを区別することは困難である。これに対し、本発
明の好ましい診断システムは、特別なプラスミノーゲン
活性化因子に結合するインヒビターのみを検出し、そし
て、さらに、使用した特異的抗血清により認識されるも
ののみを検出する。本発明のもう１つの利点としては、
本発明の試薬装置は、ＰＡに結合した機能的に活性のあ
るインヒビター量を測定するもので、インヒビター活性
を測定するものではない、１つの態様が提供されている
ように、定量的であるということである。それゆえ、そ
の試薬装置は、例えば、酵素的検定のように、塩濃度又
はpHの変化で影響を受けにくい。種々の病気において変
化しやすいのは、機能的に活性のある型である。
【００２４】内皮細胞及び胎盤から放出されるインヒビ
ターには、２つの型、１つは活性型、もう１つは不活性
型である。不活性型は、ＳＤＳ及びグアニジンのような
変性剤による処理により活性化することが出来る。この
ように、本発明の試薬及び検定装置の長所には、それら
が、種々の試料中の活性及び不活性型インヒビターの相
対量を測定するのに用いることができることがある。ま
た、本発明の利点として、それが、活性又は不活性の、
存在する内皮細胞型プラスミノーゲンインヒビターの全
量を検定する手段を提供することがある。また、本発明
の長所には、本発明の検定装置は、マイクロプレートの
ウェルに結合した組織型プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−ＰＡ）又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性
化因子（ｔ−ＰＡ）を用いることができ、そして、これ
により、迅速で再現性のある、多数の試料をスクリーニ
ングすることを容易にすることがある。
【００２５】本発明の他の長所及び利点は、本発明のひ
きつづく記述、図式及び特許請求の範囲から、当業者に
とって明白なものであろう。 （定義）ここで用いている“プラスミノーゲン活性化因
子インヒビター（ＰＡＩ）”という言葉は、プラスミノ
ーゲン活性化因子の作用を阻害もしくはチェックするタ
ンパク質を意味している。ここで有効なＰＡＩは、ウシ
の大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）、内皮細胞、胎盤抽出物、
血小板、血漿及び血清のようなヒト起源のもの、形質転
換又は、腫瘍細胞系列（例えばＨＧ１０８０）、もしく
は、ここで述べている融合ポリペプチドなどのような組
換え技術によって調製したものなど、多種多様のものに
由来する。用いるＰＡＩは、少なくとも、組織型プラス
ミノーゲン活性化因子に結合し、その活性を阻害するこ
とが望ましく、それゆえ、ここで述べる内皮もしくはベ
ータＰＡＩは、主として、ｕ−ＰＡを阻害する、いわゆ
る胎盤ＰＡＩ又はプロテアーゼネキシンに比較して、特
に興味深く、秀れているＰＡＩである。さらに好ましく
は、その有効なインヒビターは、ここでも述べているよ
うに、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡのいずれにも結合し、これ
を阻害する。
【００２６】“プラスミノーゲン活性化因子”は、プラ
スミノーゲン、特に血漿中のものを活性化し、それを血
液、細胞、組織及び体液の繊維素溶解システムにおい
て、プラスミンに転換するタンパク質である。本発明で
有効なプラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラス
ミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）及びウロキナーゼ型
プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）が含まれる。
ここで用いているように、“ウロキナーゼ型”という言
葉はヒト以外の哺乳類でみられるようなウロキナーゼ及
びその相同タンパク質を意味している。ここで用いてい
る“免疫学的に異なる”という語句は、ある分子で生じ
る抗体が別の分子と免疫反応（交差反応）を起こさない
ことを意味する。例えば、ここで議論している組換えタ
ンパク質性分子は、プロテアーゼ・ネキシンもしくは、
胎盤プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと交差反
応を起こさない。
【００２７】逆に、“免疫学的に同じ”という語句は、
他の分子と交差反応を起こす抗体の分泌を誘導すること
ができる分子を指して用いられ、それゆえ、２つの分子
は免疫学的に同じであるという。例えば、ここで議論し
ている組換えタンパク質性分子で生じる抗体は、ヒト及
びウシの内皮細胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビターと交差反応を起こし、結果として、この三つの分
子は免疫学的に同じであるという。“タンパク質性分
子”という語句は、相対的な見かけの分子量が少なくと
も４0,０００ダルトンの、比較的大きいポリペプチドを
指して用いられる。この語句は、ベクター由来のベータ
ガラクトシダーゼタンパク質の部分的融合体のような、
ここで議論されている組換え分子や、図２２の配列のよ
うに、命名したゲノム配列から翻訳した分子も、含むと
考えている。
【００２８】“結合試薬”という語句は、他の分子と結
合又は複合体形成する生物学的に活性のある分子を意味
して用いられている。それゆえ、結合試薬は、その各々
のリガンド（抗原）又はレセプター（抗体）と免疫反応
を起こす抗原又は抗体のようなレセプター及びそのリガ
ンドでありうる。ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡを伴うベータ−
ＰＡＩも、スタフィロコッカス（Ｓ）・オーレウス（au
reus) コワン株タンパク質Ａと抗体Ｆｃ領域がそうであ
るように、互いに、結合試薬を構成しうる。特異的な結
合試薬と、それらが結合にあずかる領域は、後に示され
る。しかし、このセクションで使われているレセプター
は、結合試薬に関して定義されたほとんどの言葉を示し
ている。ここで用いられている“レセプター”という言
葉は、抗原リガンドに結合する、生物学的に活性な分子
を示している。本発明のレセプター分子もしくはレセプ
ターは、抗体、免疫化した動物の腹水又は血清中にみら
れるような、実質的に精製された形の、実質的に本来の
抗体、もしくは、後に述べるようなＦab及びＦ（ab′)2
抗体領域のような、抗体のイディオタイプ含有ポリペプ
チド領域である。
【００２９】レセプター分子又は他の結合試薬の生物学
的活性は、水溶液中での混合及び、免疫反応物形成に十
分な約１０分から約１６〜２０時間の予め決められた時
間、生物学的検定条件に維持して、そのレセプターを、
その抗原リガンドに結合させることにより示される。生
物学的検定条件とは、リガンド及びレセプター分子、も
しくは、結合しつつある、及び結合した物体の生物学的
活性を維持するものである。そのような検定条件には、
約４℃〜約４５℃の温度範囲、生理的pH値及びイオン強
度が含まれる。そのレセプター及び他の結合試薬も、約
５〜約９のpH値範囲でかつ、蒸留水から、約１モル濃度
の塩化ナトリウムのイオン強度範囲でその抗原リガンド
に結合することが望ましい。そのような条件を至適化す
る方法は、当業者にはよく知られているところである。
【００３０】抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド領
域（抗体結合部位）とは、そのイディオタイプを含み、
そのリガンドに結合する抗体分子であり、その抗体のＦ
ab、Ｆab′及びＦ（ab′)2領域を含む。抗体のＦab及び
Ｆ（ab′)2領域は当業者には、よく知られているもの
で、従来の方法により、実質的に本来の抗体に、パパイ
ン及びペプシンを各々作用させることにより調製する。
例えば、セオフィロポラス及びジクソンの米国特許第4,
342,566 号明細書を参照せよ。抗体のＦab′についても
よく知られており、メルカプトエタノールによるよう
な、Ｆ（ab′)2のジスルフィド結合の還元とひきつづ
く、そのようにしてできた還元されたシステイン残基
の、ヨードアセトアミドのような試薬によるアルキル化
により調製する。本来の抗体は好ましいレセプターであ
り、本発明のレセプター分子を説明するにも使用されて
いる。
【００３１】抗体及びレセプター分子は、特別な免疫原
に対して“生じる”ものとして、ここで議論されてい
る。イディオタイプ含有抗体領域は、抗体に関するヒト
の作用の結果の産物であり、そのように“生じる”とい
うことにはならないが、“生じる”という言葉は、表現
の便宜上そのようなレセプターと共に使用される。本発
明を説明するために用いているレセプターは、ポリクロ
ーナルレセプターである。“ポリクローナルレセプタ
ー”（Pab)とは、免疫分子の多数のエビトープに対し
て、抗体を産生（分泌）する多くの異なる抗体産生（分
泌）細胞のクローンにより作られるレセプターである。
１種の抗体分子しか分泌しないハイブリドーマ細胞のク
ローンにより分泌されるようなモノクローナル抗体のこ
とも考えている。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生（分
泌）細胞と、ミエローマ又は他の自己存続細胞系列の融
合により作る。全抗体としてのそのようなレセプター
は、参考文献にも掲げている、コラー（Kohler) 及びミ
ルスタイン（Milstein）により最初に報告された（ネイ
チャー（Nature) 、２５６巻、４９５−４９７頁（１９
７５年））。
【００３２】ポリクローナルレセプターを生じさせるの
に使う宿主としての、本発明に使用できるヒト以外の温
血動物には、家畜（ニワトリやハト）、扁胸、鳥類の一
部（エミュ、ダチョウ、火喰鳥、モア）、及び哺乳類
（犬、猫、猿、ヤギ、豚、牛、馬、ウサギ、モルモッ
ト、ネズミ、ハムスター、マウス）が含まれる。好まし
い宿主動物はウサギである。レセプター及び他の結合試
薬は、インジケータ標識手段、又は“標示グループ”又
は“標識”と供に用いる。指示グループ及び標識は、特
異的インヒビターがレセプターに結合したことを知せる
手段として、レセプターと共に用いられる。“インジケ
ータ標識手段”、“指示グループ”又は“標識”という
言葉は、レセプターに結合して、もしくは単独で用いら
れる原子又は分子を意味して用いられ、それらの原子又
は分子は、単独又は他の試薬とともに用いられる。それ
らの指示グループ又は標識は、免疫化学において、よく
知られているものであり、他で、新しいレセプター、方
法、そして、または、装置でそれらが用いられているよ
うに、本発明の一部を構成するものである。
【００３３】使用されている信号提供標識は、一般に、
後に議論されているように、他の分子もしくは、ある分
子の一部に結合している。このように、標識は、レセプ
ターのような別の分子又は分子の一部に機能的に結合し
ており、その標識が結合している分子の結合は、その標
識により実質的な妨害をおこさず、また、その標識によ
り与えられる、必要とされる信号も妨害をうけない。イ
ンジケータ標識手段には、抗体又は抗原にそれらを、変
性することなしに化学的に結合し、有用な免疫蛍光トレ
ーサとなる蛍光発色団（色素）を形成する、反応性の蛍
光標識試薬がある。適当な反応性蛍光標識試薬として
は、フルオレセイン・イソシアネート（ＦＩＣ）、フル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジメチル
アミノ−ナフタレン−Ｓ−スルホニルクロライド（ＤＡ
ＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
（ＴＲＩＴＣ）、リサミン・ローダミンＢ２００スルホ
ニルクロライド（ＲＢ２００ＳＣ）及びそれに類する蛍
光色素がある。参考文献にも掲げているように、免疫蛍
光分析技術の記述は、デルカ（DeLuca) の“免疫蛍光分
析”（１９８２年、ジョン・ウィリー・アンドサンズ社
版（John Wiley & Sons Ltd.) マーカロニス（Marchalo
nis)等編、“道具としての抗体”、ｐ１８９〜２３１
頁）。
【００３４】インジケータ標識手段は、本発明のレセプ
ター、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡのような結合試薬又は有用
な抗原に直接結合させることができ、また単独の分子を
含むこともある。特に、そのインジケータ手段が本発明
のレセプターへ結合する抗体のような単独の分子である
方が望ましい。ここでしばしばタンパク質Ａと呼ぶ、ス
タフィロコッカス、オウレウス（Staphylococcus aureu
s)のコワン株のタンパク質Ａも、本来の、又は本発明の
実質的に本来のものである抗体レセプターを用いる場合
の、分離した分子インジケータ又は標識手段として使用
することができる。そのような使用の場合、タンパク質
Ａ自身は、以後に述べるように、放射性元素又は蛍光性
色素のような標識物を含む。
【００３５】指示グループとして、ホースラディッシュ
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はグルコースオキシダー
ゼ又はその類のもののような、生物学的に活性な酵素も
使用される。原則的指示グループがＨＲＰ又はグルコー
スオキシダーゼのような酵素である場合、レセプター−
リガンド複合体が形成したことを視覚化するのに付加的
試薬が必要である。ＨＲＰ1 に対する付加的試薬には、
過酸化水素及び、ジアミノベンシジンのような酸化色素
前駆体が含まれる。グルコース・オキシダーゼに有用な
付加的試薬は、２，２′−アジド−ジ−（３−エチルベ
ンズチアゾリン−６−スルホニック・アシッド）（ＡＢ
ＴＳ）。である。放射性元素はもう１つの標識を提供
し、典型的に有用な標識としてここで用いられている。
本発明で使用されうる典型的な放射性標識試薬が、ガン
マ線発生を起こす放射性元素である。 124Ｉ、 125Ｉ、
126Ｉ、 131Ｉ、 132Ｉ及び51Ｃｒのような、それ自身
ガンマ線を発する元素は１つのガンマ線発生放射性元素
指示グループの代表となっている。特に 125Ｉが望まし
い。もう１つの有用な指示グループは、それ自身が陽電
子を発生する11Ｃ、18Ｆ、15Ｏ及び13Ｎのような元素で
ある。そのように発生した陽電子は、分析培地中に存在
する電子と衝突してガンマ線を作る。 111インジウムの
ようなベータ線発生物も有用である。
【００３６】よく知られているように、放射性モノクロ
ーナルレセプターは、放射性アミノ酸を含む培地中で、
適当なハイブリドーマを培養することにより作ることが
できる。モノクローナル及びポリクローナルレセプター
は両方とも、そのレセプターを単離し、それらを、先に
述べた放射性元素の１つで標識することにより調製し
た。タンパク質の放射性標識は、この分野では、よく知
られているものであり、ここではこれ以上議論しない。
次に挙げる略記及び記号を用いる。 ｂｐ −塩基対 ｋｂ −１０００塩基対 ｋｄａ −キロダルトン Ｍｒ −見かけの相対分子量 ＤＮＡ −デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ −相補的ＤＮＡ ＲＢＳ −リボゾーム結合部位（シャイン・ダルガ
ル／配列） ＲＮＡ −リボ核酸 レプリコン −複製の個々の作用をコントロールする単
位；それには、複製を開始するオリジンが含まれ、ま
た、複製を停止する終止部位も含まれることがある。
【００３７】ヌクレオチドコドン配列に関して、種々の
文法型で用いられる“対応する”という言葉は、タンパ
ク質の配列の特別なアミノ酸残基をコードする、保存的
コドン置換のみを含むヌクレオチドコドン配列を意味し
ている。上で用いた“保存的コドン置換”という言葉
は、アミノ酸残基が、他の、生物学的に同じ残基に置き
換る、タンパク質の翻訳に導く、コドンの他のコドンへ
の置換を意味する。アミノ酸残基（翻訳又は発現）レベ
ルでの保存的置換の例には、Ｉle、Ｖal、Ｌeu又はＭet
のような、疏水的残基間の置換、又は、ＡrgとＬys、Ｇ
lnとＡap又はＧlnとＡsnの間でのような極性残基間の置
換、及びそれに類するものが含まれる。いくつかの例に
おいては、ＡspとＬysのような、あるイオン性残基の反
対の電荷のイオン性残基への置換が、それらのイオン性
のグループが単に、溶解性を生むということを考慮し、
この分野では“保存的”という言葉で表わされている。
しかし、一般に、イオン性残基の、反対電荷のイオン性
残基への置換、Ｐhe、Ｔyr又はＴrpのような大きい残基
及びＧly、Ｉle及びＶalのような、より小さい残基への
置換と同様に“ラジカルな置換”と考えられる。
【００３８】通常の意味で、“非イオン性”及び“イオ
ン性”残基という言葉は、生理学的pH値において、それ
ぞれ電荷をもたない、又は電荷をもつアミノ酸残基を意
味して用いられている。代表的な非イオン性残基にはＴ
hr及びＧlnがあり、一方代表的イオン性残基には、Ａrg
及びＡspが含まれる。ヌクレオチドレベルで、“対応す
る”という言葉は、コドンの第三ヌクレオチドが他のヌ
クレオチドと置換し、その置換が、未置換コドンと同じ
アミノ酸をコードすることを意味して用いられる。同じ
アミノ酸残基に翻訳される、異なるコドンの縮退は、こ
の分野では、よく知られているものである。ここで用い
られている“実質的に純粋である”という言葉は、全て
の異質の又は外来の物質を実質的に含まない生物学的物
質を指して使用されている。
【００３９】ヌクレオチド配列を記述するのに用いる場
合、ヌクレオチド配列をなすプリン又はピリミジン塩基
は次のように記述される。 Ａ−デオキシアデニル Ｇ−デオキシグアニル Ｃ−デオキシシトシル Ｔ−デオキシチミジル ヌクレオチド配列を記述する上で、先に示した塩基で構
成される各三文字トリプレットは、左に５′末端及び右
に３′末端をもつＤＮＡのトリヌクレオチド（コドン）
を示している。ここで述べられるアミノ酸残基及びタン
パク質のアミノ酸残基配列は、以下の対応表で示され、
関係づけられている三文字又は一文字記号で記述され
る。
【００４０】 対 応 表 アミノ酸の記号 三文字 一文字 アラニン Ａla Ａ アルギニン Ａrg Ｒ アスパラギン Ａsn Ｎ アスパラギン酸 Ａsp Ｄ システイン Ｃys Ｃ グルタミン酸 Ｇlu Ｅ グルタミン Ｇln Ｑ グリシン Ｇly Ｇ ヒスチジン Ｈis Ｈ イソロイシン Ｉle Ｉ ロイシン Ｌeu Ｌ リジン Ｌys Ｋ メチオニン Ｍet Ｍ フェニルアラニン Ｐhe Ｆ プロリン Ｐro Ｐ セリン Ｓer Ｓ スレオニン Ｔhr Ｔ トリプトファン Ｔrp Ｗ チロシン Ｔyr Ｙ バリン Ｖal Ｖ タンパク質及びポリペプチドのアミノ酸は、天然のＬ型
である。 Ｉ．一般的説明 本発明は、生化学的検定方法並びにその方法に使用され
るインヒビターに関する。試薬装置は、（ａ）内皮細胞
型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター又は、後に
述べる実質的に純粋な組換え分子に対して、動物宿主内
で生ずるレセプター及び（ｂ）指示手段を含む。
【００４１】本発明で使用される生化学的試薬装置に使
用されるポリクローナルレセプターを生成する方法は、
動物宿主、好ましくは哺乳類（例えば、ウサギ、ヤギ又
は馬）に、内皮（ベータ）プラスミノーゲン活性化因子
インヒビター（ＰＡＩ）又は、ここで述べている実質的
に純粋な、組換え分子をそのインヒビターに対する抗体
の産生を誘導するのに十分な量投与することを含んでい
る。生じた抗体は、そのインヒビターに対するレセプタ
ー分子を構成する。その抗体を含む抗血清を、免疫化し
た宿主から採取し、そのようにしてできたレセプターを
回収する。本発明の生化学的試薬システムは、先に述べ
たようにしてできたレセプター分子を、指示手段と合せ
ることにより作る。適当な指示手段は、先にここで述べ
られたものである。その指示手段は、単独分子であるこ
とが特に望ましい。
【００４２】本発明の態様には、検定試料中の内皮細胞
プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの存在、望ま
れる場合には、その量を、直接検出する固相検定法があ
る。その方法の１つの特徴には、（ａ）その上で試料の
検定を行う固体マトリックスを提供する；（ｂ）インヒ
ビターと結合（複合体形成）する結合試薬をその固体マ
トリックスに固定し、固相サポートを形成する；（ｃ）
検定する液体試料の部分標本を、その固相サポートと混
合し、固液相混合物を形成する；（ｄ）その混合物を、
その試料中に存在する内皮細胞プラスミノーゲン活性化
因子インヒビターと、その結合試薬が結合（複合体形
成）するのに十分な、予め決めた時間（典型的には約２
〜４時間）、生物学的検定条件下に維持すること；
（ｅ）その固相と液相を分離すること；及び（ｆ）その
結合試薬と結合（複合体形成）したインヒビターの存在
を測定すること、のステップが含まれている。
【００４３】その結合試薬と複合体を作るインヒビター
の存在は、用いられる検定法のタイプに依存するいくつ
かの方法で、直接的に、又は間接／競争的（後述）に測
定する。直接法の１つの好ましい態様において、その測
定は、（ｉ）上記ステップ（ｅ）の後に得られる固相
と、固相サポート上で結合した試料のインヒビターに結
合して、インヒビターと複合体を作る第２の結合試薬の
水溶液とを混合する；(ii)その第２の結合試薬がインヒ
ビターと結合（複合体形成）するのに十分な時間（典型
的には約２〜４時間）、生物学的検定条件に、その第２
の固液混合物を維持する；(iii) その第２の固液相混合
物を固相と液相に分離する；そして（iv) そのインヒビ
ターに結合して第２の結合試薬の量を測定し、それによ
り、インヒビターの量を決定する、これらのステップか
らなる。
【００４４】そのインヒビターと結合又は複合体形成す
る第２の結合試薬の量は、典型的には、先に述べた、指
示手段で測定する。その指示手段は、第２の結合試薬に
結合させることができるので、第２の結合試薬及びその
指示手段は１つの分子である。その第２の結合試薬と、
指示手段は、単独分子である方がより好ましい。このよ
うに、その指示手段が、第２の結合試薬に結合している
場合は、第１の結合試薬と複合体を形成するインヒビタ
ーの存在を測定する上記の方法は、（ｉ）上述のステッ
プ（ｅ）の後に得られる固相と、結合して、そのインヒ
ビターに結合した第２の結合試薬の量を測定する手段を
提供する指示手段を含む、そのインジケーターと結合
（複合体形成）する第２の結合試薬の水溶液を混ぜ、第
２の固液相混合物を作る；（ii) その混合物を、第２の
結合試薬がそのインヒビターと結合（複合体形成）する
のに十分な予め決められた時間、生物学的検定条件下に
維持する；（iii)その固液相混合物を、固相と液相に分
離する；そして（iv)インヒビターに結合した第２の結
合試薬の量を測定する、これらのステップを用いて行
う。
【００４５】その指示手段は、特に好ましい態様におい
ては、単独分子である。そのような状態では、結合（複
合体形成）したインヒビターは、（ｉ）上述のステップ
（ｅ）の後で得られた固相と、そのインヒビターと結合
（複合体形成）する第２の結合試薬の溶液を混合する；
（ii) そのようにしてできた混合物を、その第２の結合
試薬がインヒビターと結合（複合体形成）するのに十分
な、予め決められた時間生物学的検定条件に維持する；
（iii)その第２の固液相混合物を、固相と液相に分離す
る；（iv) 単独の分子のインジケータ標識手段（後に議
論する）を混合し、第３の固液相混合物を作る；（ｖ）
その第２の結合試薬とインジケータ標識手段が結合する
のに十分な予め決められた時間（典型的には約２〜４時
間）、その第３の固液相混合物を、生物学的検定条件に
維持する；（vi) 第３の固液相混合物を、固相と液相に
分離する；そして（vii)その第２の結合試薬に結合した
単独分子のインジケータ標識手段の量を測定する、これ
らのステップにより測定する、これらのステップにより
測定する。
【００４６】上述の態様の詳細は、以後に述べるが、そ
こでは、第１結合試薬はｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡ、第２結
合試薬はウサギ抗インヒビター抗体及び単独分子インジ
ケータ手段はヤギの抗ウサギIgＧ抗体を用いた。また、
他の方法では、第１の結合試薬と反応又は複合体形成し
たインヒビター量は、第２の結合試薬を使用せず測定す
ることができる。前述の、ステップの固相及び液相の分
離後、未結合の放射性標識したタンパク質を、その混合
物から除去し、結合した、放射性標識インヒビターを、
固体サポート上に残した。それから、その結合した放射
性標識したインヒビターの存在及びその量を、ガンマ線
計数器をつかって測定した。放射性元素の代りに、検定
試料中の成分と反応する、フルオレセイン、イソシアネ
ートのような、インジケーター標識手段としての反応性
蛍光分子を用いても、同様の結果が得られた。
【００４７】好ましい第１及び第２結合試薬には、組織
型及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又
は、先に述べた本発明のレセプターがある。もし第１の
結合試薬として、組織型又はウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子を用いたならば、第２結合試薬は、そ
のレセプターである。別に、もし、第１結合試薬にレセ
プターを使ったならば、第２結合試薬は、上記プラスミ
ノーゲン活性化因子の１つを用いる。このように、第１
結合試薬が（ａ）ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡからなる群から
選ばれたプラスミノーゲン活性化因子又は（ｂ）そのイ
ンヒビターに結合する本発明のレセプターであり、そし
て、第２結合試薬は（ａ）ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡからな
る群から選ばれたプラスミノーゲン活性化因子又は
（ｂ）本発明のレセプター、である。しかし、第１及び
第２結合試薬は異なる。このように、第２結合試薬は、
第１結合試薬で用いなかった（ａ）及び（ｂ）の一方と
言うことができる。
【００４８】インヒビターに結合する本来の、又は、実
質的に本来のものと同じ、本発明の抗体レセプターを第
２結合試薬とする場合は、単独分子インジケーター標識
手段を用いるのが好ましい。そのように、単独分子イン
ジケータ標識手段としては、放射性同位元素、酵素又は
蛍光色素のような、結合指示グループを有する、ヤギ抗
ウサギIgＧ又は、タンパク質Ａのような抗体であること
が好ましい。本発明の別の面では、競争検定法が用いら
れる。ここでは、実質的に純粋な組換え、タンパク質性
分子（後述）を固定化した固体マトリックスを含む固相
サポートが提供される。天然の（本来の）、内皮細胞Ｐ
ＡＩの検定のための液体試料の部分標本を、（１）、そ
の固相サポートの一部をなす、マトリックスに固定され
た組換えインヒビター及び（２）検定するインヒビター
に両方に結合する、予め決められた量の結合試薬と混合
する。そのような結合試薬の例としては、先に述べたレ
セプター分子及びｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡがある。そのよ
うにしてできた混合物を、その結合試薬が、試料中に存
在するインヒビターと結合し、複合体を作るのに十分
な、予め決められた時間、生物学的検定条件下に維持す
る。
【００４９】それから、その混合物を、先に述べた固相
サポートと混合し、固液相混合物を作る。その固液相混
合物を、その試料のインヒビター分子に結合しなかっ
た、混合物の全ての結合試薬が、固相サポートの組換え
インヒビター分子に結合するのに十分な、予め決められ
た時間生物学的検定条件に維持する。さらに、その固液
相を、デカンテーション及び洗浄により分離する。液相
及びその内容物を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はリバー
ス・フィブリン・オートグラフィーにより検定し、ベー
ターＰＡＩの存在を直接測定する。さらに、試料中のヒ
トの内皮ＰＡＩの存在（量）を、組換えヒト内皮ＰＡＩ
と複合体形成した結合試薬量を検定し、既知標準試料に
おけるものと、定性的、望ましくは定量的にその差異を
比較することにより測定する間接的測定を行うことが望
ましい。
【００５０】固相に結合する結合試薬量の測定は、第二
の結合試薬が、先に使用したものと異なる分子を用いる
こと以外、以前に議論した一般的方法を用いて行った。
このように、第１の結合試薬が、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡ
であるなら、第２の結合試薬は、一般に、適当なタンパ
ク質に対して生じた標識結合した抗体である。また第１
の結合試薬がレセプターである場合は、一般に、第１の
結合試薬は、ウサギの抗ベータＰＡＩ抗体が第１の結合
試薬であるときのヤギの抗ウサギ抗体のような、第１結
合試薬レセプター分子が生じたものと異なる、宿主動物
中で生じた標識結合抗体である。標識したタンパク質Ａ
も、この間接競争検定法に有用である。標識化したレセ
プター分子も、第１結合試薬として用いることができ、
これにより、第２結合試薬を使う必要がなくなることに
注目すべきである。
【００５１】特に、先に述べた固相検定法は好ましい。
しかし、液相（均一）検定法も考慮していることを理解
してほしい。このような装置も、当分野ではよく知られ
ており、詳しく述べることはしない。しかし、簡単に言
うと、液体システムでは、検定法の第１結合試薬とし
て、レセプター、ｕ−ＰＡ又はｔ−ＰＡを利用すること
もできる。一般的に、そのようなシステムの指示手段
は、形成した複合体において、その基質に抗体が結合
し、このことがその結合酵素の活性を阻害し、それによ
り、抗体が結合する複合体成分の存在を指示するとい
う、信号酵素に結合した抗体である。そのような検定法
のための典型的標識手段は、米国特許第3,817,837 号、
第3,996,345 号各明細書に示されている。ｔ−ＰＡのよ
うなプラスミノーゲン活性化因子も、ｔ−ＰＡ／ヒト・
ベーターＰＡＩ複合体の形成により示される活性をもつ
酵素に結合したとき、標識化第１結合試薬として用いる
こともできる。このように、そのような標識系には、米
国特許第3a,875,011号明細書に述べられている酵素ハプ
テン系に類似のいくつかの方法がある。
【００５２】更に、本発明は、試料中のベータ移動ヒト
プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの存在及び量
を検出するための、キットの形をした、検出装置を企図
する。そのキットは、（１）活性成分として、乾燥形、
溶液形又は分散形で、効果的量の、本発明の生化学的試
薬系、及び（２）ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡを含む少なくと
も１つの容器（パッケージ）を含む。また、その検出装
置は、マイクロタイター・ストリップ又は多くのウェル
があるマイクロプレートの固体マトリックスを含む。存
在するｔ−ＰＡ又はウロキナーゼは、その固体マトリッ
クスに結合している方が望ましい。その診断システム及
び、先に述べた方法において適切な固体マトリックスに
は、ファルコン・マイクロテストIII フレキシブルアッ
セイプレート（ＣＡ州、オックスナード（Oxnard) 、フ
ァルコンプラスチック社）という名で市販されている９
６穴マイクロプレート及び、イムロンＩ及びII（ＶＡ
州、アレキサンドリア・ダイナテク社）という名で市販
されているマイクロタイター・ストリップなどがある。
マイクロタイター・ストリップ又はプレートは、透明な
プラスチック、できれば、ポリ塩化ビニル又は、ポリス
チレンでできていることが望ましい。診断システム及び
この方法で用いる、別の固体マトリックスには、ＩＬ
州、北シカゴ・アボット・ラボラトリーズ（Abbott Lab
oratories)社製の、直径約１ミクロン〜約５ミリメート
ルのポリスチレンビーズ、使いやすい大きさのポリスチ
レンチューブ、棒又は、へら、及びポリスチレン粒子の
大きさが約１ミクロンで、遠心により、ラテックスと分
離できる、ポリスチレンラテックスなどがある。
【００５３】固体マトリックスも、ニュージャージー
州、ビスカタウェイ（Piscataway) のファルマシシア・
ファイン・ケミカル社製の、セファデックスＧ−２５、
−５０、−１００、−２００及びこれに類するもののよ
うな、網状デキストラン、及びファルマシア・ファイン
・ケミカル社製の、セファロース６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４
Ｂ、ＣＬ４Ｂ及びこれに類するもののような、アガロー
ス及び網状アガロースなどが含まれる。アガロース及び
セファロース・マトリックスは、一般的に、臭化シアン
を用いた結合で活性化される。それから、その活性化し
たマトリックスを、１モル濃度のグリシンで洗い、その
活性化マトリックスを乾かさずに、本発明の生化学的試
薬システム、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡを結合する。マトリ
ックスに結合した試薬システム、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡ
を洗い、使用する準備が整う。これら固体マトリックス
の使用に対する細かいことは、セクションIII 、Ａ２に
示した。
【００５４】さらに、この検出系は、検定結果を比較す
るための標準物質及び、乾燥形又は液状の種々のバッフ
ァを含む。先に述べた指示手段は、本発明の生化学的試
薬系中のレセプターと共に供給されるきが好ましく、レ
セプターに結合しているものは、その中に、またより好
ましくは、単独分子指示手段を用いた場合は、別々に、
包装されることになる。過酸化水素及びジアミノベンジ
ジンなどの付加的試薬も、ＨＰＰなどの指示グループが
用いられるときは、その系中に組込まれる。それらの物
質は、多くの指示手段と同様に、市販されており、容易
に入手でき、この検出系と共に供給されなくともよい。
さらに、過酸化水素のような、いくつかの試薬は、保存
するうちに分解が起こり、いくつかの放射性元素と同様
に寿命が短かく、使用者が直接入手する方が望ましい。
【００５５】以後議論されているいくつかの研究からの
データは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター及
び本発明の生化学的試薬診断システムが、ヒト血清中の
プラスミノーゲン活性化因子に結合した、プラスミノー
ゲン活性化因子インヒビターを検出及び定量する能力を
検定して得られた。本発明の検出系は、内皮細胞形ＰＡ
Ｉがプラスチック製マイクロタイターウェル上に固定し
た、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡに結合する能力に基づいてい
る。洗浄後、その結合の程度は、はじめに、インヒビタ
ーに対するウサギの抗血清と混合し、その複合体を維持
（インキュベート）し、さらに、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギ
IgＧと混合し、複合体を形成させる。本発明の検出装置
及び検定方法を用いて、ｔ−ＰＡ及びそのインヒビター
との反応は、迅速で（１時間以内に７８パーセント以上
結合）、時間及び濃度依存で、広いインヒビター濃度に
渡り〔ミリリットル当り１〜１００ナノグラム（ng／m
l）〕感度をもつことがわかった。外部から与えたｔ−
ＰＡ及びｕ−ＰＡは、インヒビターに対する固定化ｔ−
ＰＡの結合能を、ｔ−ＰＡ、１２ng／ml及びｕ−ＰＡ、
６ng／mlの場合、５０パーセント減少させるよう競争す
ることが分った。
【００５６】以後議論される結果は、本発明の生化学的
試薬装置及び検出装置を用いた態様を示すもので、本発
明の制限を意図するものではないことを理解しなければ
ならない。ヒトの内皮細胞型ＰＡＩ又は、そのＰＡＩを
含む融合ポリペプチド、すなわち、そのＰＡＩと免疫学
的に同等なタンパク質性分子をコードする、生物学的に
純粋なＤＮＡ分子も、本発明の一面をなしている。その
ＤＮＡ分子は、約１１４０〜約３０００ヌクレオチド又
はヌクレオチド塩基対を含み、そして、基本的に、左か
ら右に、５′末端から３′末端への方向で、図２２の式
で示されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配
列からなるヌクレオチド配列を含んでいる。もちろん、
本発明のヌクレオチド配列の読み枠は、ヒトの内皮細胞
型ＰＡＩ又は、内皮細胞ＰＡＩを含む融合ポリペプチド
のものと一致していなければならない。このように読み
枠はシフトしてはならず、図２２で示した部位１３のヌ
クレオチド残基がトリプレットコドンの第１ヌクレオチ
ドとなるものと一致していなければならない。
【００５７】適当なＤＮＡ分子は、ヌクレオチド部位１
３から約１１５３までの記述された配列に対応するヌク
レオチド配列を含む。その他の適当なＤＮＡ分子は、ヌ
クレオチド部位１からヌクレオチド部位約１１５３、ヌ
クレオチド部位１から約１９６０、及び、図２２に示し
たヌクレオチド部位１から、約２９９５までの全配列に
対応するＤＮＡ配列を含む。本発明のヌクレオチド配列
は、基本的に、先に述べた配列の１つを含んでいる。こ
のように、本発明のヌクレオチド配列は、ヒトの内皮Ｐ
ＡＩをコードするヌクレオチド配列の基本的及び新しい
特性に影響する付加的配列は除外する。本発明のヌクレ
オチド配列は、その配列の５′末端側に機能的に結合し
た１つ以上の転写プロモーター配列を含みうる。そのＤ
ＮＡの翻訳及びタンパク質の発現が望まれる場合は、そ
のＤＮＡには、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び翻訳終止
コドン（ＴＡＡ又はＴＡＧ又はＴＧＡ）が、それぞれ、
その配列の５′末端及び３′末端にプロモーター配列
と、５′末端との間に翻訳開始コドンが位置するような
形で機能的に結合して含まれることもある。
【００５８】その他の分子の全部又はその１部をコード
するＤＮＡ配列がそのＤＮＡ中に含まれ、その結果翻訳
（発現）されたタンパク質性分子が、発現した、ヒト内
皮ＰＡＩに融合（ペプチド結合で結合）した他の分子の
全部又は一部のアミノ酸残基配列を含む融合ポリペプチ
ドであることもある。典型的融合ポリペプチドには、ヒ
トの内皮細胞ＰＡＩのアミノ末端に融合したベータガラ
クトシダーゼ分子の一部を含む、後に議論されるタンパ
ク質性分子がある。その分子は、ベータガラクトシダー
ゼ領域と、ＰＡＩ配列の間に、ペプチド結合で融合した
ＰＡＩリーダーペプチドの４個のアミノ酸残基をも含
む。上述の全てのヌクレオチド配列は、複製のみが望ま
しい場合、列挙したＤＮＡ分子が複製可能なだけの長さ
で存在しうる。複製及び翻訳（タンパク質性分子の発
現）が望まれるなら、それらのヌクレオチド配列は、そ
のＤＮＡ分子が複製可能なだけの長さをもち、そして、
発現した、ヒト内皮細胞ＰＡＩのアミノ酸配列を含むタ
ンパク質性分子は、ここで述べる、天然のウシ及びヒト
の内皮ＰＡＩと免疫学的な交差反応を起こす。好ましく
は、その発現したタンパク質性分子も、ｔ−ＰＡに結合
し、そして、ここで議論されているように、リバース・
フィブリン・オートグラフィーにおいて、少なくともｔ
−ＰＡへの阻害を示す。さらに好ましくは、その発現し
た分子は、リバース・フィブリン・オートグラフィー検
定法において、ｕ−ＰＡ活性に結合し、これを阻害す
る。
【００５９】本発明のヌクレオチド配列は、図２２に示
した配列に対応するヌクレオチド配列を含むので、保存
的ヌクレオチド置換同様、保存的コドン置換も、ここで
その語句を定義しているとおり、考慮している。図２２
に示すように、本発明のヌクレオチド配列は一本鎖であ
る。しかし、あるＤＮＡ配列は、水素結合により、その
ヌクレオチド配列と相補的な第２のＤＮＡ分子と、第１
のＤＮＡ配列と逆平行に結合していることが望ましい。
そこで、さらに本発明のＤＮＡは、二本鎖で、しかも、
相補的配列とともに、図２２に示した配列の全て、又は
列挙した領域に対応する、先に述べたＤＮＡ配列を含ん
でいる。複製／発現媒体、例えば大腸菌、スタフィロコ
ッカス・セレヴィシアエのような単細胞生物又はそれに
類するもの、又は、ＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞、
における上述の望ましいＤＮＡヌクレオチド配列の増殖
及び発現のための、非染色体ベクターも考えている。そ
のベクターは、複製／発現媒体と両立し、その中に、そ
のベクターが、そのＤＮＡ配列を増殖できる形で複製さ
れるＤＮＡ分子を含むレプリコンを含んでいる。
【００６０】加えて、その非染色体ベクターは、転写及
び翻訳に使用される配列要素も含んでいる。最後に、転
写プロモーターがすでに記述したように、その５′末端
に機能的に結合していることもある。その転写プロモー
ターは、そのベクター由来のものでも、外来のものでも
よい。ここで用いている、ｌacＺプロモーター・オペレ
ータのようなベクター由来の転写プロモーターが好まし
い。また翻訳ターミネーターも、図２２の式で示されて
いるヌクレオチド配列に、ターミネーター配列を含んで
いるように、いくつかの例でそのＤＮＡ分子の３′末端
に機能的に結合している。先に述べた、図２２のＤＮＡ
分子は、複製／発現媒体において翻訳を開始する、その
配列の５′末端に隣接する開始コドン（ＡＴＧ）を欠い
ている。そのようなコドンは先に述べたように、読み枠
を同じくして、定義されたＤＮＡ分子に連結しているこ
ともあるし、また、ここで例示しているように、そのベ
クターヌクレオチド配列の一部でもありうる。
【００６１】ヒトの内皮ＰＡＩは、分泌されるタンパク
質であり、それゆえ、天然に発現されるように、細胞質
膜を通してタンパク質を移動するのを助け、そして、翻
訳後切り捨てられる、いわゆるポリペプチド・リーダー
又はシグナル配列を含む。ヒトの内皮ＰＡＩのコード化
ポリペプチド・リーダー配列の一部のみが、先に定義さ
れたＤＮＡ分子配列中に含まれる。ここで示される典型
的ＤＮＡ分子は、細胞周辺膣と比べ、大腸菌のような複
製／発現媒体の細胞質内で発現される。大腸菌の細胞質
内での発現は、それら複製／発現媒体にとって通常のこ
とである。先に議論した、転写プロモーター、翻訳開始
及び翻訳終止コドン及び、用いられる場合には、ポリペ
プチドリーダー配列をコードする配列は、通常、本発明
のＤＮＡ分子に比較されるように、非染色体ベクターの
一部となる。タンパク質性分子の発現に用いるために、
通常そのベクターは、よく知られているように、そのＤ
ＮＡ配列の５′端に隣接し、開始コドンの上流に、リボ
ゾーム結合部位（シャイン・ダルガルノ配列）をも含ん
でいる。ここで典型的に用いられているｌacＺプロモー
ターのようなベクタープロモーターは、リボゾーム結合
部位を含んでいる。
【００６２】このように、複製及び一般的ベクター機能
に必要なこれらヌクレオチドとは別に、そのベクターの
ヌクレオチド配列は、読み枠をともにして、５′末端か
ら３′末端へと、転写プロモーターの５′端に隣接し
て、機能的に結合したリボゾーム結合部位、翻訳開始コ
ドン５′端に機能的に結合した転写プロモーター、
（ａ）真核生物での発現のためのリーダー配列、又は、
（ｂ）望ましいヒト内皮ＰＡＩとの融合ポリペプチドと
して発現される他の分子の一部の配列、又は、本発明の
ＤＮＡ分子、の５′端に機能的に結合した翻訳開始コド
ン、（ａ）又は（ｂ）が存在する場合には、本発明のＤ
ＮＡの５′端に機能的に結合した、（ａ）又は（ｂ）の
配列、及び本発明のＤＮＡ配列を含んでいる。その５′
端に隣接して結合をもつ本発明のＤＮＡ配列は、その
３′端に隣接して、翻訳終止コドンを結合している。図
２２に試しに示してあるものから明らかなように、望ま
しい事象である転写そして、または、翻訳を、付加的配
列が妨害、または、ヒト、又はウシの内皮ＰＡＩに対す
る、発現したタンパク質分子の免疫学的同一性を妨害し
ないかぎり、付加的配列が、終止コドンの３′端に機能
的に結合して存在することも可能である。いかなる付加
的ヌクレオチドも、発現したタンパク質性分子により示
されるプラスミノーゲン活性化因子に対する生物学的活
性を妨害しないことが望ましい。
【００６３】そのベクターの全てのＤＮＡ配列は、その
ＤＮＡを複製するのに用いる複製／発現媒体と両立し、
より望ましくは、本発明のＤＮＡ分子によりコードされ
る、産物を発現することと両立しなければならないこと
を理解されなければならない。本発明のベクターは、本
発明のＤＮＡ分子を少なくとも複製（増殖）できる。さ
らにそのベクターは、ＤＮＡ分子を複製できるだけでは
なく、ここで定義したように、ヒトの内皮ＰＡＩと免疫
学的に同じ、組換えタンパク質性分子へ、そのＤＮＡの
遺伝情報を、発現もしくは翻訳できることが望ましい。
本発明の非染色体ベクターを、宿主複製／発現媒体とし
ての大腸菌における複製及び翻訳（発現）に有用なこれ
らのベクターに制限する必要はない。ＤＮＡ配列を実質
的に複製（増殖）のに用いられるどのベクターも、例え
ば、哺乳動物又は眞核細胞において、そのＤＮＡの複製
に用いることができる。
【００６４】そのような広い範囲のベクターは、適切な
宿主複製媒体と同様に市販されている。プラスミド及び
バクテリオファージの両方の代表的ベクター及び宿主
は、ＭＤ州ロックビル（Rockville)、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションで入手でき、１９８５
年、第１６編の“細菌、ファージ及びｒＤＮＡベクター
のカタログ”にリストされている。加えて、ＩＮ州、イ
ンジアナポリス（Indianapolis) のベーリンガー・マン
ハイム・バイオケミカル社、ＭＤ州ゲデルスブルグ（Ga
ethersbrg)のベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社、及
びＭＡ州ビバリー（Beverly)のニューイングランド・バ
イオラボ社から入手できるように、プラスミド、コスミ
ド及びクローニングベクターもリストされている。本発
明のもう１つの面に、ヒトの内皮細胞型プラスミノーゲ
ン活性化因子インヒビターは免疫学的に同一な、実質的
に純粋な、組換えタンパク質性分子がある。すなわちそ
の組換え分子により生じた抗体は、本来のヒトの内皮細
胞型プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと免疫反
応を起こす。すでに述べたように、その組換え分子は、
検定において有用な、交差反応抗体の分泌を誘導するの
に有用な、本来の分子のアミノ酸残基配列をもつことの
みが必要である。そのように、この分子は、すでにのべ
てきたように、適当な翻訳開始及び好ましくは終止コド
ンを有するベクターを含む、複製／発現媒体から翻訳さ
れうる。先に述べた免疫学的同一性は、ウサギ中での抗
体の誘導と、それにつづく、セクションIII Ａ３で後に
述べられるウシ内皮ＰＡＩに対する操作により示すこと
ができる。
【００６５】実質的に純粋な組換えタンパク質性分子
も、ヒトの内皮細胞型ＰＡＩの生物学的活性を、全部で
はないにしろ、いくらか所有していることが望ましい。
そのよう分子は、本発明のこの面でのもう１つの態様を
構成している。このように、ここでは、実質的に純粋
な、組換えヒト内皮細胞型ＰＡＩも考えられている。そ
の組換え分子は、ここで述べられてきているように、リ
バース・フィブリン・オートグラフィーにより測定さ
れ、ヒトのｔ−ＰＡに結合し、その活性を阻害すること
が分った。またその分子は、ｕ−ＰＡにも結合し、その
活性を阻害することが望ましい。その組換え分子は、ブ
ロテアーゼネキシン及びヒトの胎盤ＰＡＩとは免疫学的
に異なる。分子間の免疫学的差異は、いくつかの方法
で、抗原的又は、免疫原的観点から検定される。しか
し、もっとも簡単には、三つの分子の免疫学的差異は、
その組換え分子に結合するポリクローナル抗体を用いた
特異的結合研究で示される。これらの抗体は、実質的
に、プロテアーゼネキシン又は、ヒトの胎盤ＰＡＩの特
異的結合を持たない。その組換えヒト内皮細胞型ＰＡＩ
は、ウシのＰＡＩに対して生じたポリクローナル抗体
が、その組換え及び天然のＰＡＩと免疫学的に特異的反
応を起こすという事実から証明されるように、ウシの内
皮細胞型ＰＡＩ及び天然のヒト内皮細胞型ＰＡＩと関連
しており、同様のものである。
【００６６】加えて、天然のヒト内皮ＰＡＩに対して生
ずるポリクローナル抗体又は他のレセプターは、ウシ及
びその発現された組換えＰＡＩ分子と免疫反応を起こ
す。同様に、その組換え分子に対して生じたポリクロー
ナル抗体又は他のレセプターは、天然のウシ及びヒト内
皮細胞型ＰＡＩ分子に特異的に、免疫学的結合を起こ
す。このように、発現された、組換えヒト内皮細胞型Ｐ
ＡＩは、天然のウシ及びヒト内皮ＰＡＩ分子と免疫学的
な交差反応を示す。実質的に純粋な組換えヒト内皮細胞
型ＰＡＩは、実質的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と、コマ
ージ・ブリリアント・ブルー染色によって確認されるよ
うな無縁のタンパク質やポリペプチドを含まない。例え
ば、その望ましい純度は、アフィニティー・カラム又は
吸着体として、ウシ内皮ＰＡＩに固定化したポリクロー
ナル抗体を含む他の吸着体を用い、一般的な溶出及びタ
ンパク質精製手段を使うことにより達成される。
【００６７】特別な態様において、その組換えヒト内皮
細胞型ＰＡＩは、ここで述べている典型的融合ポリペプ
チドのような、ポリペプチド結合グリコシル基を実質的
に含まない。そのような分子は典型的には、大腸菌のよ
うな、眞核性複製／発現媒体を用いて発現される。組換
えヒト内皮細胞型ＰＡＩは、ポリペプチド結合グリコシ
ル基も含むことがある。そのグリコシル化分子は、一般
に、よく知られているように、例えば、ＳＶ４０誘導ベ
クター又は他のベクターを用い、哺乳類のチャイニーズ
・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞のような
眞核性細胞から発現される。ＣＨＯ細胞及びＳＶ４０誘
導ベクター又は、スタフィロコッカス・セレビシアエの
ようなイース複製／発現媒体及びｐＴＤＴ１由来のベク
ターのような適当なベクターのような眞核性複製／発現
媒体及び適当なベクターも、その発現組換え分子が、そ
の培養培地中に分泌される場合は、特に有用である。リ
ーダー又はシグナルペプチド配列をコードする核酸配列
は、培養培地への組換え分子の発現に対し用いる。
【００６８】先に議論したように、その細胞外及び培養
培地へＰＡＩを分泌させるために、他の遺伝的信号をそ
の構築物中に含ませることもある。これは、その精製操
作を改善する。原核性及び眞核性システムにおいて、そ
のタンパク質のアミノ末端の“リーダーペプチド”は、
分泌の信号として働く。このリーダーペプチドは、宿主
の細胞性プロテアーゼにより切断され、成熟タンパク質
を作る。リーダー配列を含むそのようなタンパク質を作
るために、“融合”ポリペプチドが、発現及び分泌され
るべきＰＡＩのコード領域の５′端に、読み枠を同じと
して、既知の分泌タンパク質のリーダーぺプチドのヌク
レオチドコード領域を連結するやり方で構築される。そ
の切断信号は、リーダーペプチド上に存在し、その切断
依存プロテアーゼは、宿主中にあるので、正常な分泌が
起こる。
【００６９】この融合タンパク質戦略は、イースト及び
ＣＨＯ細胞でうまく行なわれている。例えば、フィルホ
（Filho)等は（１９８６年、バイオテクノロジー（Biot
echnology)、４巻、３１１頁）は、プロテアーゼ切断信
号を含む、イーストのアルファ因子由来のリーダーペプ
チドを、眞核性タンパク質マウスアルファーアミラーゼ
に融合したイーストでの発現のための構築物が、アルフ
ァ因子プロモーターから始まり、そして培地中に成熟タ
ンパク質として分泌されたことを報告した。他の、アル
ファ因子遺伝子プロモーターを用いた同様の構築物がイ
ースト中で、外来タンパク質を発現したことが報告され
ている（ビター（Bitter) 等、プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.
Natl. Acad. Sci)、ＵＳＡ、８１巻、５５３０頁（１９
８４年）、ブレーク（Brake)等、プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl. Acad. Sci.) 、ＵＳＡ、８１巻、４６４２頁
（１９８４年）；及びサイン（Singh)等、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.) 、１２
巻、８９２７頁（１９８４年））。
【００７０】哺乳類細胞発現系において、ヘルペス・シ
ンプレックス・ウィルスグリコプロテインＤ由来のリー
ダーペプチドを、ＨＴＬＶ III 由来の外被グリコプロ
テインの一部に融合した。融合ポリペプチドをＣＨＯ細
胞中で分泌した（ラスキー（Lasley) 等、サイエンス
（Science)、２３３巻、２０９頁（１９８０年））。生
産量を高める方法として、トランスフェクトしたプラス
ミドのコピー数を、細胞当り高く維持することが報告さ
れている。このことは、発現プラスミドに、ジハイドロ
フォレート・リダクターゼ（dhfr) のような選択マーカ
ーを含め、そして、繁殖のために、高いレベルのdhfrを
必要とする培地の存在下、dhfrを欠損したトランスフォ
ームした細胞を培養することにより成し遂げられた（シ
モンセン（simonsen) 等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat
l. Acad. Sci.) 、ＵＳＡ、８０巻、２４９５頁（１９
８３年））。同様に、ＳＶ４０の複製オリジンをもつ、
ｐＫＳＶ−１０のようなＳＶ４０を基本とするベクター
を、ＣＯＳ細胞中、高いコビー数で維持することができ
た。これは、ＣＯＳ細胞が、宿主細胞の細胞質中に、自
発的に複製するよう、発現ベクターのＳＶ４０オリジン
を選択的に刺激する、不完全なＳＶ４０ウィルス遺伝子
を含むからである（グルズマン（Gluzman)、セル（Cel
l) 、２３巻、１７５頁（１９８１年））。
【００７１】加えて、すでに述べたように、組換えタン
パク質は、いくつかの形で発現される。１つの態様にお
いては、そのアミノ酸配列が図２２に示した、アミノ酸
残基部位、約１（ＤＮＡヌクレオチド番号１３〜１５）
から、アミノ酸残基３７９（ＤＮＡヌクレオチド番号１
１５４〜１１５７）まで、に示されるものであるタンパ
ク質として発現される。そのように発現し、実質的に、
ポリペプチド結合グリコシル基を含まない場合、その組
換えタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による測定に
より、約４0,０００ダルトン〔４０キロダルトン（kd
a)〕の見かけの相対的分子量（Ｍｒ）を示した。別の態
様において、ＰＡＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、
約１８０kda のＭｒをもち、図２２において、アミノ酸
残基部位−４（ヌクレオチド部位１−３）で示される式
のアミノ末端アミノ酸残基に、ペプチド結合を通して機
能的に結合したベータ・ガラクトシダーゼ分子の一部を
含む、融合ポリペプチドの一部として発現した。これら
の典型的分子は双方とも、それらが、後に議論され、ま
た図２１に示したように、リバース・フィブリン・オー
トグラフィーにおいて、ｕ−ＰＡに結合でき、その活性
を阻害するという意味で、ヒトの内皮細胞型プラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビターと同じ生物学的活性を示
した。また、その組換えタンパク質は、すでに述べたよ
うにアミノ末端リーダーポリペプチド配列を伴って発現
することもできる。
【００７２】先に議論から明らかなように、固相サポー
トの一部として、固体マトリックスに固定したとき、固
相競争検定系において、実質的に純粋な、組換えヒト内
皮細胞型ＰＡＩは有用である。またその組換えＰＡＩ
は、他の検定系におけるレセプター分子として使用する
抗体を生じさせるのに用いる免疫原として有用でもあ
る。後者の使用は、生物学的活性を必要としない、実質
的に純粋な組換え、タンパク質性分子の使用と同様であ
る。そのようにして用いる場合、及び検定法において、
固相サポートの一部として固体マトリックスに固定して
用いる場合は特に、そのタンパク質又は、融合ポリペプ
チドが、組換え技術により調製したタンパク質性物質を
しばしば汚染していることが知られているような細菌の
糖脂質（ＬＰＳ）、又は、他の細胞生産物を実質的に含
まないということは、あまり重要なことではない。しか
し、ＬＰＳを実質的に含まないことが望まれる、その物
質を 原として用いるような場合は、実質的に、細菌
性ＬＰＳや、他の細菌細胞破壊物を含まない、ＰＡＩを
調製するのに、既知の方法を用いることができる。例え
ば、イセクツ（Issekutz) （１９８３年）ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Method
s.) ６１巻、２７１〜２８１頁及びソファー（Sofer)、
バイオ／テクーノロジー（BIO/TEC-NOLOGY) 、１９８４
年１２月、１０３５−１０３８頁及びその中の引用文献
を参照せよ。複製／発現媒体は、既知の適当なベクター
とともに、発現媒体として、先に議論てされている、イ
ーストＳ．セレビシアエ又は、哺乳類細胞を用いること
により調製することができる。
【００７３】II．結 果 Ａ．ウシ内皮細胞（ＢＡＥ）インヒビターの精製 ＢＡＥのＣＭ（後のセクションIII Ａ１及び２及び次に
掲げる報告の中で述べられているように）は、繊維素溶
解インヒビターと同様（ロスクトフ（Loskutoff)等、プ
ロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）、ＵＳＡ、８
０巻、２９５６頁（１９８３年））、組織型（ｔ−Ｐ
Ａ）及びウロキナーゼ型（ｕ−ＰＡ）プラスミノーゲン
活性化因子の両方を含んでいることが以前に示された
（レビン（Levin)等、ジャーナル・オブ・セル・バイオ
ロジー（J. Cell. Biol.) 、９４巻、６３１頁（１９８
２年））。コイカナバリンＡ−セファロースでのアフィ
ニティー・クロマトグラフィーによる、このＣＭの分画
で、ｕ−ＰＡとｔ−ＰＡが互いに分離されることが明ら
かになり（ロスクトフ（Loskutoff)等、ブラッド（Bloo
d)、６２巻、６２頁（１９８３年））、そして、この方
法も、そのインヒビターの精製に有効であろうことを示
唆した。
【００７４】ＣＭ１リットルを、コンカナバリンＡ−セ
ファロースカラムにかけ、そのカラムを、後のセクショ
ンIII で述べるように処理した。ピーク画分を集め、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、コマージ・ブリアント・ブル
ーにより染色を行ってタンパク質を分析し、また、リバ
ース・フィブリン・オートグラフィーにより、繊維素溶
解活性化因子及びそのインヒビターの分析を行った。図
１に示されているように、カラムにかけたタンパク質の
８５％以上は、透過液(run-through effluent)から回収
された（プールＩ）。この画分は、アルブミン及びｕ−
ＰＡの両方を含んでいたが、インヒビターは含んでいな
かった。いくらかのインヒビターは、回収ｔ−ＰＡ活性
の大部分を含む画分であるプールIII に検出されたが
（ロスクトス（Loskutuff)等、ブラッド（Blood)６２
巻、６２頁（１９８３年））、溶解耐性ゾーンの相対的
大きさによる判定だと、全インヒビターの２０パーセン
ト以下しか示さなかった（エリクソン（Brickson）等、
アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Bioche
m.) １３７巻、４５４頁（１９８４年））。検出可能な
インヒビター活性の大部分は、全タンパク質のわずか５
％を含むフラクションである（図２の挿入図で示したよ
うに）コンカナバリンＡ、プールII画分に回収された。
それは、主要な染色されたタンパク質の１つと、共に移
動しているようである。
【００７５】また、コンカナバリンＡプールIIを、チュ
ーブゲルによりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その結果を
図２に示した。電気泳動後、そのゲルをスライスし、そ
のスライスは、 125Ｉ−フィブリンのｕ−ＰＡ仲介の溶
解を阻害する能力をテストするため抽出を行った。再
度、そのゲルの単一領域にインヒビター活性が見い出さ
れ、それは、図２の挿入図に示した溶解耐性のものと区
別できない相対移動度（すなわち、Ｒf ＝0.６）で移動
した。このゲルのこの領域には、他のタンパク質がほと
んど検出されず、このことは、その精製がそのゲルから
のインヒビターの抽出により完全であることを示してい
る。最も高いインヒビター活性をもつ抽出物（図２、ス
ライス４９〜５２）を集め、7.５〜２０パーセント勾配
ゲルで再び分析し、その結果を図３に示した。そのゲル
をコマージ・ブリアント・ブルー（図３、レーン１）又
は、過ヨウ素酸・シッフ試薬（図３、レーン２）で染色
したとき、単一のタンパク質が検出され、それは、リバ
ース・フィブリン・オートグラフィーで明らかにされた
インヒビターと同じ移動度を示した（図３、レーン
３）。出発ＣＭ及び種々の採集プール中に存在するイン
ヒビターの量を、精製インヒビターに対して作った抗血
清を作って、ローレル（Lanrell)のロケット技術により
測定した（スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・ラボラトリー・インベスチゲーション（Scand.
J.Clin. Lab. Invest.) ２９巻、２１頁（１９７７
年））。
【００７６】このようなスクリーニングは、ＣＭがミリ
リットル当り、0.６マイクログラムのインヒビターを含
み、６００マイクログラムのインヒビターをカラムにか
け、そして、最終的なゲル抽出物から９０マイクログラ
ム回収したことを示した（図２、図３）。このように、
この精製手順は、出発抗原の約１５パーセントの回収率
を得ることができる。精製インヒビターは、Ｍｒ標準物
質を直接比較した、還元及び非還元条件下で、約５0,０
００±2,５００ダルトンの見かけ上の相対分子量（Ｍ
ｒ）をもっていた。
【００７７】Ｂ．精製インヒビターの予備的特性化 ＰＡは、単一のアルギニンーバリン結合の解裂により、
単鎖プラスミノーゲンを２本鎖のプラスミンに転換する
（スマリア（Summaria）等、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.) ２４２巻、
４２７９頁（１９６７年））。このプロセスは、還元剤
の存在下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニターできる（ムソニ
（Mussoni)等、スロンボ・リサーチ（Thromb. Res.) ３
４巻、２４１頁（１９８４年）；スマリア（Summaria)
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J. Biol. Chem.) ２４２巻、４２７９頁（１９６７
年）；ダノ（Dano）等、バイオケム・バイオフィズ・ア
クタ（Biochim. Bioplys.Acta）５６６巻、１３８頁
（１９７９年））。そのインヒビターが抗・活性化因子
であるかどうかを決めるため、この切断を阻害するその
能力を検定し、その結果を図４に示した。精製したイン
ヒビターは、ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ両方の、125Ｉ−プ
ラスミノーゲンを、特徴的な重鎖及び軽鎖へ切断する能
力を阻害し、及びそれは、投与量依存の結果を示した。
ｔ−ＰＡの阻害は、図５で示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後で
もなお明らかな酵素−インヒビター複合体の形成と関連
している。
【００７８】集密的ＢＡＥから採集したＣＭ中に検出さ
れるように、（ロスクトス（Loskutoff)等、プロシーデ
ィング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) 、ＵＳＡ、８０巻、２
９５６頁（１９８３年））、精製分子のインヒビター活
性は、３７℃、６０分間、pH2.７のインキュベーション
でも、又ＳＤＳにさらしても破壊しなかった（図６）。
逆に、精製したプロテアーゼネキシンのインヒビター活
性は、これらの処理で破壊した。これらのタンパク質の
インヒビター活性は、５％２−メルカプトエタノールの
存在下、３７℃、３０分間のインキュベーションでは影
響を受けなかった。Ｃ．Ｌ〔３，４，５− 3Ｈ〕ロイシ
ン存在下で培養したＢＡＥからのインヒビタ
【００７９】ーの精製 血漿及び血清は双方とも、繊維素溶解のインヒビターを
含んでいる（ロスクトフ（Loskutoff)、ジャーナル・オ
ブ・セル・フィジオロジー（J. Cell Physiol.) ９６
巻、３６１頁（１９７８年）；ムレルツ（Mullertz) 、
プログレス・イン・ケミカル・フィブリノリシス及びト
ロンボリシス（Progress in Chemical Filrinolysis an
d Thrombolysis) 、ダビッドソン（Davidson) 等編、３
巻、２１３〜２３７頁、レーベン・プレス・ニューヨー
ク（１９７８年）；コレン（Collen) 、トロンボ・ヘモ
スタス（Thromb. Haemostas.) ４３巻、７７頁（１９８
０年））。培養した内皮細胞は、これら血清タンパク質
をインターナライズ又は結合し、ひきつづき、それら
を、血清を含まない媒体に、ＣＭ調製時に、逆放出する
（コーヘン（Coken)、ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスチゲーション（J.Clin. Invest.)５２巻、２７
９３頁、（１９７３年）；パスタン（Pastan) 等、セル
（Cell) 、１２巻、６０９頁（１９７７年）；ローリッ
ヒ（Rohrich)等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロ
ジー（J. Cell Physiol.) 、１０９巻、１頁（１９８１
年）；マクファーソン（Mc Pherson）等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.) ２５６巻、１１３３０頁（１９８１年）。インヒビ
ターが実際にＢＡＥにより合成されるのか、単に、混入
している血清インヒビターなのかを決定するため、非標
識ＣＭから、そのインヒビターを精製するために開発さ
れたのと同様の手順を用い、Ｌ〔３，４，５− 3Ｈ〕ロ
イシン存在下で培養した細胞のＣＭからインヒビターを
精製した。低及び高塩存在下コンカナバリＡ−セファロ
ース・カラムをアルファ・メチル・マンノシドで溶出す
ると、２つの放射性標識されたピークが回収された。そ
のインヒビターを含むピークII画分を集め、それを、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その結果を図７に示した。イ
ンヒビター活性及び大部分の放射活性は同じ画分から回
収された。ピーク・インヒビター画分（図７の画分５
２、５３）を集め、透析し、ひきつづく、アルカリＰＡ
ＧＥにかけても（図８）、これら２つの活性は、同じ移
動度を示した。総合すると、これらのデータは、インヒ
ビターが、その細胞の生合成産物であり、混入した血清
タンパク質でないことを示している。
【００８０】上記の結果を確かめ、クローン化したＢＡ
Ｅによるインヒビター合成量を定量するため、免疫沈澱
スクリーニングを行った。その結果を以下の図９及び表
Ｉに示す。
【００８１】
【表１】 表 １ ＢＡＥによるインヒビターの合成 回収ＣＰＭa 単離細胞 b ＣＭ プールII ゲル抽出物 免疫沈殿 ＢＡＥ26 9.3 ×１０6 2.9 ×１０6 1.2 ×１０6 ─── (１００％） （３０％） （１２％） クローンＡ 3.2 ×１０7 ─── ─── 8.2 ×１０5 (１００％） （2.5 ％） クローンＢ 4.5 ×１０7 ─── ─── 1.5 ×１０6 (１００％） （3.4 ％）
【００８２】ａ． 種々の画分及び免疫沈殿中の総ＴＣ
Ａ沈殿放射活性は、この分野でよく知られている標準的
方法により、測定した。各データは各ステップにおける
出発物質中（ＣＭ）のcpm に対するパーセント（カッコ
で示されている）に標準化している。 ｂ． 各々の場合において、後のセクションIII で述べ
るように、およそ、1.5×１０7 個の細胞を、Ｌ（３，
４，５− 3Ｈ）ロイシンを用い（２０Ｃｉ／ｍl）、２
４時間で標識化した。血清を含まないＣＭ（１５ｍl ）
を集め、示されているように、分画した。このような、
免疫学的スクリーニングにおいて、クローン化したＢＡ
Ｅから集めた放射性標識したＣＭを、精製したインヒビ
ターに対する抗体と混合してインキュベート（生物学的
検定条件に維持）した。結合物質を、抗体タンパク質Ａ
−セファロースビーズから抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分画し、そしてオートラジオグラフィーで分析した（図
９）。およそ、５0,０００ダルトンのＭr 値をもつ、単
一の放射性標識されたポリペプチドが明らかにされ、そ
して、リバース・フィブリン・オートグラフィーで分析
してみると、それは、インヒビター活性を有していた。
このタンパク質は、前免疫血清で調製したタンパク質Ａ
−セファロースビーズには吸着しない。これら免疫沈殿
スクリーニングで分析した種々のＣＭから回収された全
放射能活性、及び精製の各ステップでの放射能標識され
たタンパク質回収物（図７−８、表Ｉ）は、そのインヒ
ビターが合成され、２４時間に細胞により分泌された全
タンパク質の2.５〜１２パーセントであることを示した
（表Ｉ）。
【００８３】Ｄ． インヒビターの機能検定法の開発と
評価（インヒビター結合検定法）ポリ塩化ビニル（ＰＶ
Ｃ）プラスチックウェルを、種々の濃度のｔ−ＰＡと、
４℃で一晩コートし、ポリ塩化ビニルマトリックスにｔ
−ＰＡを固定し、図１０で示したように本発明の検定法
のための至適ｔ−ＰＡ濃度を測定した。そのウェルを洗
浄し、ＢＳＡでブロックして、非特異的タンパク質結合
部位を除き、そして、３種類の濃度の精製インヒビター
（２０、５０及び１００ｎg ／ｍl ）と、３７℃で２時
間、維持（インキュベート）し、複合体を形成させた。
洗浄後、そのように形成した複合体を、ウサギ抗−イン
ヒビターレセプター（１００分の１希釈）を加えてこれ
とインキュベートし、ついで、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩ
gG（1.５×１０5 cpm ／ウェル）を加えることにより、
その結合量を定量した。ＰＶＣウェルをコートするのに
用いたｔ−ＰＡ濃度が、0.１から1.０マイクログラム／
ｍlと増加するにつれ、すべての三つの濃度において、
結合インヒビターの検出量は増加した（図１０）。ｔ−
ＰＡコート濃度を、１マイクログラム／ｍl 以上に増加
することは、結合インヒビターの検出量の増加にはつな
がらなかった。従って、今後行うスクリーニングには、
ｔ−ＰＡを固定するＰＶＣウェルのコーティングに、１
マイクログラム／ｍl のｔ−ＰＡ濃度を採用する。
【００８４】インヒビターと、固定化したｔ−ＰＡとの
相互作用の速度論をインヒビター含有溶液の至適維持
（インキュベーション）時間を決めるために測定した。
精製したインヒビター（１００ｎg ／ｍl ）を、種々の
時間、ｔ−ＰＡ又はＢＳＡコートしたウェル中、３７℃
でインキュベートした。その後、結合インヒビターを、
ウサギ抗インヒビターレセプター（１：１００）とひき
つづく、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgG（1.5 ×１０5 cpm
／ウェル）により定量化した。インヒビターと固定ｔ−
ＰＡとの反応は、３０分以内に７５パーセント以上起こ
るという速い反応であった（図１１）。この時間内に、
インヒビターは、コントロールの、ＢＳＡでコートした
ウェルに結合しなかった。便宜上、以後のスクリーニン
グには、インヒビター含有溶液のインキュベーション時
間は１時間を採用した。
【００８５】ポリクローナルレセプターの維持（インキ
ュベーション）時間及び、指示手段結合時間も同様に至
適化した。ｔ−ＰＡ又は、ＢＳＡでコートしたウェル
を、インヒビター（５０ｎg ／ｍl ）と３７℃で１時間
インキュベートし、さらに、種々の時間、ウサギの抗イ
ンヒビターレセプターとインキュベートした。結合した
レセプターを、インジケータ（ 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩ
gG）と２時間インキュベーションすることにより検出し
た。その検定において、レセプター及びインジケーター
共、その各々の抗原と、1.５〜２時間後、８０パーセン
ト以上の結合を生じるという速い会合を示した（図１
２）。従って、以後のスクリーニングには、レセプター
及びインジケーターに対するインキュベーション時間と
して２時間を採用した。
【００８６】インヒビターの検出に関する、ウサギ抗イ
ンヒビターレセプターの希釈の影響を測定し、検定感度
を至適化した。ｔ−ＰＡコートしたウェルを、種々の濃
度のインヒビター（１−１００ｎg ／ｍl ）と、３７℃
で１時間インキュベートした。洗浄後、そのウェルを、
種々に希釈した（１：５０〜１：５００）ウサギ抗イン
ヒビターレセプターとインキュベートし、結合した抗体
を、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（1.５×１０5 cpm ／
ｍl ）で検出した。インヒビターの至適検出は、その抗
血清の１：５０〜１：７５希釈のときであった（図１
３）。以後のスクリーニングには、１：７５希釈の抗血
清を採用する。 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgGの濃度変化
（2.５×１０4 〜３×１０5 cpm ／ウェル）の効果も、
この検定法の感度を至適化するため、スクリーニングし
た。インヒビターの至適検出は、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギ
Ｉg Ｇ2.５〜５×１０4 cpm ／ウェルのときであった
（図１４）。
【００８７】本検定法で検出されるように、精製したイ
ンヒビターの典型的標準投与−応答曲線を、図１５に示
した。この検出は、１ｎg ／ｍl の感度があり、１０か
ら１００ｎg ／ｍl のインヒビターに対し、線型な応答
を示し、２５０ｎg ／ｍl 以上のインヒビター濃度で飽
和する。ウシの大動脈内皮細胞ならし培地を用いた投与
−応答も図１５に示した。標準曲線とこの曲線との比較
は、このＣＭ試料は、約１００ｎg ／ｍl の機能的活性
をもつインヒビターを含んでいることを示している。便
宜上、未知試料中のインヒビター濃度を計算する目的
で、両対数プロットをした（図１６）。このようなプロ
ットでは直線となることがわかる。 Ｅ．インヒビター結合検定法と、リバース・フィブリン
・オートグラフィーとの比較本発明の機能検定法（イン
ヒビター結合検定法）の感度を、ＰＡインヒビターの検
定及び定量に一般的に使われる別法であり、リバース・
フィブリン・オートグラフィーの感度と比較した。種々
の濃度（0.5 ｎg ／１０ｎg ／レーン）のインヒビター
を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、リバース・フィブリン
・オートグラフィーで分析した。その結果を図１７に示
す。この技術においては、洗浄したポリアクリルアミド
ゲルをフィブリン、プラスミノーゲン及びＰＡを含む、
インジケータゲル上に置く。インヒビターが相当するゲ
ルに存在する領域以外では、プラスミンが徐々に形成
し、ゲルの全般的溶解が起こる。リバース・フィブリン
・オートグラフィーの感度は2.５ｎg ／レーン（図１
７）であり、0.１ｍl を各レーンにかけるので、その感
度は、２５ｎg ／ｍl であるので、インヒビター結合検
定法よりも２５倍も感度が低い。 Ｆ．インヒビター結合検定法の応用 本発明のインヒビター結合検定法を、精製酵素と、イン
ヒビターの相互作用の研究に用いた。三つの精製ＰＡ
（ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ及びストレプトキナーゼ）を、精
製インヒビター（５０ｎg ／ｍl ）と３７℃１時間イン
キュベートし、そのインヒビターがひきつづき、ｔ−Ｐ
Ａに結合する能力を有するかどうか、インヒビター結合
検定法で定量した。外から加えたｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ
は、インヒビターへの結合に関し、固定化ｔ−ＰＡと競
争することが分り、図１８に示したようにｔ−ＰＡ１２
ｎg ／ｍl 又はｕ−ＰＡ６ｎg ／ｍl の場合に得られる
結合の５０％減少をもたらした。ストレプトキナーゼ
も、ＤＦＰ−不活性化ｔ−ＰＡ（データ示さず）も、固
定化ｔ−ＰＡに対するインヒビターの結合に影響を与え
なかった。
【００８８】本発明のインヒビター結合検定法は、ヒト
の血漿及び血清中のインヒビターを検出するのにも用い
た。血漿及び血清を１６名の健康な提供者からの血液か
ら調製し、各試料中のインヒビター活性を、インヒビタ
ー結合検定法で測定した。正常なヒト血漿は、図１９に
示したように、低く、又は、検出不能なレベルのインヒ
ビターしか含んでいない。一方、これら提供者からの血
清は、図１９に示したとおり、高いレベルのインヒビタ
ー活性を含んでいた。最後に、この検定法を、正常な提
供者及び、ヘモスタチック システムに異常をもつ提供
者由来の血漿中のインヒビターレベルを測定及び比較す
るのに用いた。結果を下の表IIに示した。
【００８９】 表 II 正常人及び患者血漿中のインヒビターの検出 試料 希 釈 結合cpm インヒビター（ｎg ／ｍl ） 正常血漿 １：５ １５００ Ｎ．Ｄ．1 １：１０ ７００ Ｎ．Ｄ． 患者血漿 １：５ ４７００ ２５ １：１０ ２３００ ２５ “Ｎ．Ｄ．”インジケータ検出されず（２ nｇ／ｍl 以下） これらの試料は、Ｂ．ワイマン (Wiman)博士に提供して
いただいた。このスクリーニングにより、正常人の血漿
中には、インヒビターは検出されず、一方、患者血漿中
のそれは、およそ、２５ｎg ／ｍl であったことが分か
る。この同じ患者は、ワイマン (Wiman)の（トロンボシ
ス・リサーチ (Thrombosis Research)３１巻、４２７頁
（１９８３年））異なる検定法で研究すると、さらに高
いインヒビター値を有することが示された。
【００９０】Ｇ． 胎盤中の内皮細胞型ベーターＰＡＩ
活性の同定 ヒトの胎盤粗抽出物２０マイクロリットルを、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（レムリ (Laemmli)（１９７０年）、ネイチャ
ー（Nature）（ロンドン）、２２７巻、６８０〜６８５
頁）及びリバース・フィブリン・オートグラフィー（Ｒ
ＦＡ）（エリクソン (Erickson) 等、１９８４年）、ア
ナリティカル・バイオケミストリー (Anal. Biochem.)
１３７巻、４５４〜４６３頁）で、ＰＡＩ活性を分析し
てみると、約５０〜５５kda のＭr 値を有する２つのイ
ンヒビターゾーンが明らかになった。免疫沈殿による研
究は、その２つのインヒビターゾーンは、胎盤型ＰＡＩ
〔アステット(Astedt)等、（１９８５年）トロンボ・ヘ
モスタシス (Thromb. Haemostasis)、５３巻、１２２〜
１２５頁）及び内皮細胞型ＰＡＩ〔ロスクトフ (Loskut
off)等、（１９８９年）プロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl.
Acad. Sci.) ＵＳＡ８０巻、２９５６〜２９６０頁；エ
メイス (Emeis)等（１９８３年）、バイオケム・バイオ
フィズ・レス・コム（Biochem. Biophys. Res. Commu
n.) １１０巻、３９２〜３９８頁；ソーセン (Thorsen)
等（１９８４年）、バイオヒム・バイオフィズ・アクタ
（Biochem. Biophys. Acta）、８０２巻、１１１〜１１
８頁；バンモリク (Van Mourik)等、（１９８４年）、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (J.
Biol. Chem.) ２５９巻、１４９１４−１４９２１頁）
の両方の存在から生ずることを示した。放射性免疫検定
法を用いた定量化では〔シュリーフ(Schleef) 等（１９
８５年）、ジャーナル・オブ・ラボラトリー−クリニカ
ル・メディシン (J.Lab. Clin. Med.）１０６巻、４０
８−４１５頁）、その抽出物が、内皮（ベータ）ＰＡＩ
をミリリットル当り２７０ナノグラム含むことを示し
た。
【００９１】胎盤組織は、抽出前に十分洗浄しているの
で、このベータＰＡＩは、胎盤中に含まれる細胞により
合成されたものであり、血清混入物ではないと考えてよ
いであろう。それゆえ、胎盤を、ベータＰＡＩの cＤＮ
Ａ単離源として採用した。 Ｈ． ヒト・ベータＰＡＩ cＤＮＡの単離 ヒトの胎盤 mＲＮＡから調製した cＤＮＡ挿入物を含む
λｇt11 発現ライブラリーからの、およそ７×１０5 個
の組換えファージを、ＣＡ州、ラ・ジョラ (LaJolla)
、ラ・ジョラ・キャンサー・リサーチ・ファンデーシ
ョン (La Jolla Cancer Research Foundation)、キャン
サー・リサーチ・センター (Cancer Research Center)
のジョセ・ミラン (Jose Millan)博士から入手した。そ
の発現ライブラリーは、ミラン (Millan) （１９８６
年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー (J. Biol. Chem.) 、２６１巻、３１１２−３１１５
頁に公開されており、ここで参考文献として掲げている
が、そこには、１×１０6 個の独立した組換えファージ
が含まれている。
【００９２】そのファージ感染した大腸菌由来の細胞質
抽出物をベータＰＡＩ又は、λｇt1 1 ベクターによりコ
ードされているベータ・ガラクトシダーゼ分子の一部に
そのアミノ末端を介して、融合したＰＡＩを含む融合ポ
リペプチドを発現する、クローン化 cＤＮＡを含む、そ
れらファージを同定するため、免疫学的にスクリーニン
グした。３４個の陽性ファージが得られ、そのうちの半
分は、第２スクリーニングを通じて、陽性を維持した。
３個の陽性クローンを任意に選択し、そのプラークを精
製し、そのファージＤＮＡを精製した。λ1.2 、λ3 及
びλ3.2 と命名した３個のクローン由来のファージＤＮ
Ａを、ＥcoＲＩで消化し、その cＤＮＡ挿入物の長さ
は、各々1.9、 3.0及び1.９キロ塩基対（ｋb ）であっ
た。λ3 由来の、ＥcoＲI 3.０ｋb cＤＮＡ挿入物を、
ｐＢＲ３２２誘導プラスミドベクターｐＧＥＭ−３にサ
ブクローンし、ボリバー(Bolivar）等（（１９７７
年）、ジーン (Gene) 、２巻、９５−１１３）により報
告されている、単細胞複製／発現媒体として、大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１を用いて、組換えプラスミドｐＰＡＩ3 を作
った。サブクローンした cＤＮＡ挿入物をＥcoＲＩで消
化し、アガロースゲルを用いて、精製した。その cＤＮ
Ａ挿入物をニック・トランスレーションし、高張条件
下、λ1.2 及びλ3.2 にハイブリダイズすることが示さ
れ、このことは、３個のクローン中のＤＮＡ挿入物が互
いに関連していることを明らかにした。
【００９３】３系統と証拠が、その三種の単離クローン
がヒト内皮細胞型（ベータ移動）ＰＡＩである又は、こ
れを含むタンパク質性分子をコードするという結論を支
持している。 （ｉ） 高頻度溶原性株（Ｙ１０８９：ＡＴＣＣ３７１
９６）にλ3.2 を感染させることにより調製した大腸菌
の溶原性株の誘導により、精製したＢＡＥベーターＰＡ
Ｉに対して生じた抗血清から、アフィニティー精製した
ＩｇＧにより確認された、約１８0,０００ダルトンの見
かけ上の相対分子量（Ｍr ＝１８０kda )を有する、組
換え融合ポリペプチドの発現が起った( 図２０、レーン
Ｂ）。λｇt11 で溶原化した、もしくは、その cＤＮＡ
挿入物を含まない大腸菌は、そのような免疫反応性のタ
ンパク質は生産しなかった( 図２０、レーンＣ）。 （ii) 組換え融合ポリペプチド上での、ＢＡＥベータ
ＰＡＩに対する抗血清のアフィニティー精製は、ウエス
ターンブロットにおいて、精製ＢＡＥベータＰＡＩを確
認する抗体を生じたので、その１８０kda の組換え融合
ポリペプチド及びＢＡＥベータＰＡＩは、抗原エピトー
プを共有している（図２０、レーンＤ）。 （iii) ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてＲＦＡによる大腸菌
の分析はその1.９kda 挿入物を含む、λ3.2 溶原体はＰ
ＡＩ活性を発現するが、λｇt11 溶原体は発現しない
（図２１、レーンＢ）。
【００９４】驚くべきことに、それぞれＭrs１８０kda
及び４０kda の、２つの組換えタンパク質性ＰＡＩがλ
3.2 抽出物の中に存在した。これらのＰＡＩの関係を研
究するため、溶原体由来のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分画し、再度、ウエスタンブロットで分析した
が、今回は、オートラジオグラムを、より長い露光の後
に現像した（図２１、レーンＥ，Ｆ）。２個のポリペプ
チドが検出され、これらはインヒビター活性と同じ移動
度をもつ（レーンＢ、Ｅと比較せよ）。λ3.2 溶原体に
よりつくられる最大のベータＰＡＩ抗原は、およそ１８
０kda のＭr 位置に検出されたが、Ｍr ４０kda の位置
にも少量の抗原が検出された（図２１、レーンＥ）。２
つのＰＡＩは免疫学的及び生物学的性質を共有している
ので、小さい方は、ベータガラクトシダーゼ−ＰＡＩ融
合ポリペプチドのタンパク質分解プロセッシングによ
り、大きい方のものから誘導されたものであろう。放出
された４０kda のタンパク質の特異的活性は、それが、
もはや、融合ポリペプチド断片により立体障害をうけて
いないため、より大きい融合タンパク質のものより高い
値を示した。しかし、おそらく立体障害により、特異性
活性が低くても、１８０kda の融合ポリペプチドは、プ
ラスミノーゲン活性化因子インヒビター活性を示し、そ
して、ＢＡＥ・ＰＡＩとの免疫学的関連（同じ）性を示
した。ｔ−ＰＡに結合し、これを阻害するという、観察
された生物学的活性は、その複製／発現媒体が原核性細
胞であり、そして、そのタンパク質性分子が哺乳類由来
のものであることから、驚くべきことである。加えて、
その本来の分子はグリコシル化され、一方、発現した融
合ポリペプチド及び小さい４０kda タンパク質は、実質
的にグリコシル化を含まない。従って、その発現したタ
ンパク質性分子が、本来の分子とは異なる折りたたみ方
であることが予想され、そして、グリコシル化を含ま
ず、一方では、本来の分子はグリコシル化されているに
もかかわらず、その発現したタンパク質性分子は、本来
の、哺乳類タンパク質と同じ生物学的活性を示した。
【００９５】宿主大腸菌ＭＣ１０６１株中に含まれる組
換えプラスミドｐＰＡＩ3 は、メリーランド (Marylan
d) 、ロックビル (Rockville)のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に登録した。そ
れは、１９８６年８月１９日に受理され、ＡＴＣＣ
号と命名された。本登録は、登録期間が、その保管
場所における保管に対する最新の要請から５年間に対す
る保管期日から３０年間か、又は、その出願が満了す
る、米国特許の有効期限のいずれか長い方であるとい
う、ブタペスト協約に準じて行なわれる。その組換えプ
ラスミド含有細胞が、その保管所で死滅したならば、再
び補給される。
【００９６】Ｉ． ヒト・ベータＰＡＩをコードするＤ
ＮＡ配列と、タンパク質配列決定 クローンλ3 の3.０ｋb − cＤＮＡ挿入物の両方の鎖の
ＤＮＡ配列は、デール(Dale) 等の方法（（１９８５
年）、プラスミド (Plasmid)、１３巻、３１〜４０）に
より、構築されたデリーションサブクローンの配列決定
を行うことにより確かなものにした。図２２に推論され
るアミノ酸配列とともに、そのＤＮＡ配列を示した。未
翻訳領域・開始コドン及び全んどのシグナルペプチド
は、その分子の５′端かあ欠除しているので、これは全
長のＤＮＡではない。アミノ末端又は成熟タンパク質を
コードするコドンを同定するために、誘導したアミノ酸
残基配列を、我々の研究室で、他の手段で単離した、部
分的に配列決定したヒト内皮ＰＡＩ及びウシベータＰＡ
Ｉと並べてみた。成熟ヒト内皮細胞型ＰＡＩのアミノ末
端残基は、バリン (Val. V) であることが分かった。そ
の整列化に基づき、図２２で１番に割当てたバリンは、
ヒト内皮（ベータ）ＰＡＩのアミノ末端残基である。
【００９７】２つの始めに得られたクローンは、−４番
のアミノ酸残基部位のコドンが異なっていた。そのコド
ンのうちの１つは、セリン（Ｓer，Ｓ）残基をコードし
（λ 3 ）、一方、もう１つは（λ3.2 ）は、グルタミン
酸残基（Ｇlu，Ｅ）をコードしていた。グルタミン酸が
その部位の正しい残基であることがわかり、図２２には
そう示しておいた。天然のヒト・ベータＰＡＩは分泌さ
れ、それゆえ、シグナルペプチドを含むようである（ブ
ロベル (Blobel) 等、（１９７５年）ジャーナル・オブ
・セル・バイオロジー（J. Cell. Biol.）６７巻、８５
２−８６２頁）。通常、シグナルペプチダーゼは、グリ
シン・アラニン及びセリンのような小さい中性側鎖残基
のカルボキシル側を切断する（ウォン・ヘイン (Von He
ijne）（１９８４年）ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー (J. Mol. Biol.)１７３巻、２４３−２
５１頁）。したがって、１番のバリンのアミノ末端側の
アラニン（Ａla）は、シグナルペプチドの末端残基であ
ろう。
【００９８】図２２に示した読み枠は、多数の終止コド
ンをもたない唯一のものであり、そして、３８３残基と
それにつづくＴＧＡ終止コドンをコードしている。−１
番のアラニンと、１番のバリンの間での切断による、推
定シグナルペプチドの除去は、３７９残基長で、４２７
７０ダルトンの炭水化物を含まない分子量をもつ成熟ベ
ータ・ＰＡＩを生ずる。この計算は、その mＲＮＡの、
イン・ビトロ (in vitro) での翻訳により測定したＢＡ
ＥベータＰＡＩの非グリコシル化型の分子量とよく一致
する（ソーデイ (Sawdey) 等、（１９８６年）、トロン
ボ・リサーチ (Thromb. Res.）４１巻、１５１−１６０
頁）。ヒトのベータ・ＰＡＩはグリコシル化されており
（バン・モウリク (Van Mourik) 等、（１９８４年）ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (J.Bi
ol. Chem.) 、２５９巻、１４９１４〜１４９２１
頁）、図２２のアミノ酸残基配列は、部位２０９−２１
１、２６５−２６７、及び３２９〜３３１に、正規のas
n-Ｘ−ser/thr 配列を満たす、３個の推定されるグリコ
シル化部位を含む（マーシャル (Marshall）（１９７４
年）バイオケミカル・ソサイアティー・シンポジウム
（Biochem. Soc. Symp.)４０巻、１７〜２６頁）。
【００９９】3.０ｋb cＤＮＡの３′側の非翻訳領域
は、ポリ（Ａ）領域を除いて、１７８８塩基対である。
共通のポリアデニレーション配列ＡＡＴＡＡＡは、ポリ
（Ａ）結合部位の上流１６塩基のところにみられ、この
ことは、この配列が一般的に、ポリアデニレーション部
位の上流１５〜２５塩基のところに存在するという従来
の報告と一致している（プラウドフット (Proudfoot)、
（１９７６年）、ネイチャー（Nature）（ロンドン）２
６３巻、２１１〜２１４頁）。1.９ｋb の cＤＮＡ挿入
物をもつ２つのクローンを部分的に配列決定した結果、
これらは同一のものであるようだ。またこれらのクロー
ンは、それらが、短縮化され、そして多くの３′側非翻
訳領域を欠いている（すなわち、ヌクレオチド１９６０
番から３′側を欠いている）こと以外、3.０ｋb cＤＮ
Ａと同じである。プローブとして、3.０ｋb cＤＮＡを
用い、ヒトのフィブロザルコーマ細胞系列ＨＴ１０８０
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１）由来の全ＲＮＡのノーザ
ン・ブロッド分析は、3.０及び2.２ｋb 長の２つの異な
る転写物の存在を示した（図２３）。この観察は、1.９
ｋb cＤＮＡが、より短いＲＮＡ転写物からコピーされ
たものであることを示している。 mＲＮＡの３′端の同
じ大きさの異種性が他のシステムでも観測されている。
これは、別のスプライシング事象、多くのポリアデニレ
ーションシグナルの使用又は１つ以上の遺伝子の発現に
起因しているのかもしれない〔クラブトリー (Crabtre
e) 等（１９８２年）セル (Cell) ，３１巻、１５９−
１６６、キング (King) 等（１９８３年）セル (Cell)
、３２巻、７０７−７１２頁；ヒコック (Hickok)
等、（１９８６年）プロシーディング・イン・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Aca
d. Sci.）ＵＳＡ、８３巻、５９４−５９８頁）。この
場合のメカニズムは明らかになっていない。
【０１００】この cＤＮＡ配列中にみられる唯一のポリ
アデニレーション・コンセンサス・シグナル（ＡＡＴＡ
ＡＡ）が、3.０ｋb cＤＮＡの３′端に存在するが（図
２２）、同様であるが若干修正している配列（ＡＡＴＡ
ＡＴ）がヌクレオチド部位１９９８−２００３に存在す
る。この配列が、ポリ（Ａ）付加のシグナルとして用い
られているなら、より短い転写物の存在を説明すること
ができる。他のシステムにおいて、ポリアデニレーショ
ンは、ＡＡＴＡＡＡ配列の不在下でも起こることが知ら
れている（オークボ (Ohkubo) 等、（１９８３年）プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、８０
巻、２１９６−２２００頁）。ファースト・プロテイン
・分析ホモロジープログラム（リップマン (Lipman)等
（１９８５年）サイエンス (Science)、２２７巻、１４
３５−１４４１頁）を用いた、誘導したアミノ酸配列
と、他のタンパク質との比較で、ベータ・ＰＡＩは、ア
ンチトロンビンIII （ＡＴIII)、アルファ1 −アンチト
リプシン（アルファ1 ＡＴ）、アルファ1 −アンチキモ
トリプシン及びオバルブミンと２５〜３０％のホモロジ
ーをもっており、したがって、セリン・プロテナーゼ・
インヒビター・スーパーファミリーのタンパク質（セル
ピン）の一員である。セルピンは、５００万年にわたっ
て祖先の分子から分岐してきたもので（カレル (Carrel
l)等（１９８５年）、トレンズ・イン・バイオケミカル
・サイエンス (Trends Biochem. Sci.) １０巻、２０〜
２４頁）、現在では、身体の主要なタンパク質分解カス
ケードをコントロールする多くのグループの関連タンパ
ク質を示している（たとえば、凝析、補体、繊維素溶解
及び炎症カスケード）。
【０１０１】セルピンの阻害的特異性は、反応中心にお
ける単一アミノ酸、いわゆるＰ1 残基により、基本的に
限定されているようだ（カレル (Carrell)等（１９８５
年）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス
(Trends Biochem. Sci.) １０巻、２０〜２４頁）。一
般に、このアミノ酸残基は、目標プロテナーゼの既知の
特異性を反映している。セルピンの反応中心は、カルボ
キシ末端近くに存在し、それが、その分子の他の部分か
ら突き出ているため（カレル (Carrell)等（１９８５
年）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス
(Trends Biochem. Sci.) １０巻、２０〜２４頁）、プ
ロテアーゼに対する理想的基質又は“餌”を提供してい
る。プロテアーゼ阻害は、インヒビターと酵素の１：１
の複合体形成に関連している。そのベータＰＡＩ、アル
ファ1 ＡＴ及びＡＴIII の反応中心のアミノ酸残基配列
を、１文字アミノ酸残基命名法を用い、図２４に並列し
て示した。
【０１０２】この整列化において、部位３４６のＲ（ar
g)残基がＰＡＩのＰ1 残基である。プラスミノーゲン活
性化因子は、単一の arg−val 結合の切断により、プラ
スミノーゲンをプラスミンに転換する（コレン(Collen)
（１９８０年）、トロンボ、ヘマトスタシス (Thromb H
aematostasis) 、４３巻、７７〜８９頁）。従って、こ
の整列化は、既知のＰＡのａrg特異性との一致を示して
いる。Ｐ17残基がグルタミン酸（Ｅ）であるという知見
も、このグルタミン酸がセルピン中の“蝶番”の役割を
はたし、今日まで配列決定されてきている全てのセルピ
ンにおいて保存されていることから、この整列化を支持
するものである（カレル (Carrell)等（１９８５年）、
トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス (Trends
Biochem. Sci.) １０巻、２０〜２４頁）。
【０１０３】ヒトのベータＰＡＩは、異常にも酸化剤に
対し、感受性があり、低濃度のクロラミンＴの存在下
で、迅速にその活性を失う。誘導されたタンパク質配列
中にシステインがないことから（図２２）、及び酸化的
に不活性化したベータＰＡＩが、メチオニン・スルホキ
シド・ペプチド・リダクターゼによる処理で回復するこ
とから、その活性の消失は重要なメチオニンの酸化を反
映しているようだ。ベータＰＡＩの反応中心のメチオニ
ン（すなわち、部位３４７、Ｐ1 部位）は、アルファ1
ＡＴも、酸化に対し、感受性があり、その消失がＰ1 メ
チオニンの酸化に関連していることから（カレル (Carr
ell)等（１９８５年）、トレンズ・イン・バイオケミカ
ル・サイエンス (Trends Biochem. Sci.) １０巻、２０
〜２４頁）、その候補者であろう。両方の場合におい
て、生じたメチオニンスルホキシドは、かさ高い残基で
あり、その基質プロテナーゼのポケットに容易に納まら
ないであろう。
【０１０４】その活性化部位の酸化により、選択的にア
ルファ1 ＡＴを失活させる能力は、このシステムの重要
で独特な制御の特徴である。炎症箇所で、活性化した好
中球は、酸素フリーラジカルの分泌により、インヒビタ
ーを中和することができる（カレル (Carrell)等、（１
９８５年）、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエ
ンス) 、１０巻、２０〜２４頁）。この付加的レベルの
制御は、基本的組織の破壊が、通常好中球エラスターゼ
存在下を阻害するインヒビターの存在下でさえ、発生す
る手段を提供している。増加するＰＡ活性は組織破壊、
組織改造及び新しい器官の形成と相関がある（レヴュー
として、ダノ(Dano)等、（１９８５年）アドバーンス・
キャンサー・リサーチ (Adv. Cancer Res.）４４巻、１
３９−２６６頁）。これら組織中に存在するベータＰＡ
Ｉを酸化的に失活させる能力も、ＰＡを、それらインヒ
ビターの存在下で機能させる、これらシステムの重要な
制御の特徴である。従って、酸化剤の局所的発生は、ア
ルファ1 ＡＴ及びベータＰＡＩの双方を失活させ、そし
て、そのプロセスにおいて、エラスターゼ、プラスミン
及びコラゲナーゼを含むタンパク質分解酵素のカスケー
ドを解放する（モスカテリ (Moscatelli) 等（１９８０
年）、プロテアーゼ及び腫瘍侵入“Ｐ．ストルリ (Stru
li) 編（レーベン・プレス・ニューヨーク）１４３〜１
５２頁）。
【０１０５】III. 材料と方法 Ａ．検定法関係 １． プラスミノーゲン活性化因子 組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を、リ
ケン (Rijken) 等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー (J. Biol. Chem.) 、２５６巻、７０３
５頁（１９８１年））により報告されている、ヒトのメ
ラノーマ細胞調整培地から単離した。簡単にいうと、ヒ
トのメラノーマ細胞を、６パーセントのＣＯ2 を補った
雰囲気中、３７℃で、プラスチック製培養フラスコ（フ
ァルコンオクスナード (Oxnard) 、ＣＡ州）中で集密化
単層に生育させる。生育培地は、炭酸水素ナトリウム
（培地１リットル当り、7.５パーセント溶液１６ｍl ）
及び、Ｌ．グルタミン（培地１リットル当り、２００ m
Ｍ溶液１０ｍl ）及び熱不活性化新生ウシ血清（最終濃
度、１０パーセント）を補った修正型、イーグル基本培
地１００ｍl を含んでいる。その細胞を仔ウシ血清を含
まない培地で洗い、２５ｍl の血清を含まない培地中で
インキュベートした。生じたならし培地（ＣＭ）で収穫
及び置換を３日間連続してくり返し、７０００ｘｇ、３
０分間の遠心を行ない、使用するまで−２０℃で保存し
た。指示した時にはアプロチニン（カルバイオケム−ベ
ーリング、ラジョラ（LA. Jolla)ＣＡ州）、を血清含有
及び血清を含まない培地に加えた（最終濃度、２０KIU
／ｍl ) 。
【０１０６】市販されているウロキナーゼ（ＮＹ州，レ
ンセリア (Rensselaer) スターリン−ウンスロップ (St
erling-Winthrop)、５×１０5 ＣＴＡユニットのウイン
キナーゼ）を、ホルムバーグ (Holmberg) 等( バイオヒ
ム・バイオフィズ・アクタ(Biohim. Biophys. Acta) 、
４４５巻、２１５頁（１９７６年））により報告されて
いるように、アフィニティー・クロマトグラフィーでさ
らに精製した。 ２． プラスミノーゲン活性化因子インヒビター インヒビターの精製に用いた、ウシ大動脈内皮細胞（Ｂ
ＡＥs ）を、ボイス (Booyse) 等、( トロンボ、ダイア
セス、ヘモ (Thromb. Diathes. Haemorrh.) ３４巻、８
２５頁、（１９７５年））の方法により、ウシの大動脈
から単離し（その教えを参考文献に掲げた）、レビン
(Levin)等( トロンボ、リサーチ (Thromb. Res.）、１
５巻、８６９頁（１９７９年））により報告されている
ように、１０％のウシ胎児血清（ＣＡ州、サンタナ (Sa
nta Ana)、アービン、サイエンティフィック社 (Irvine
Scientific.))を補った修正イーグル培地１５ｍl を入
れた、１５０cm3 フラスコ（ＣＡ州、オクスナード (Ox
nard) 、ファルコンプラスチック社）で培養した。スク
リーニングのための細胞を、１：５の比率で、１６〜２
２回通過させ、そして一般に、以下に述べられているよ
うに、ならし培地（ＣＭ）調製前に少なくとも１週間集
密化させた。
【０１０７】いくつかの代謝標識スクリーニングに、ク
ローン化したＢＡＥを用いた。こっらのクローンは、最
初の細胞調製から生育した単一細胞に由来する。簡単に
言うと、新しく単離した細胞を、６０mm培養皿に植えつ
け、一晩付着させる。その細胞を、予め温めた培地で洗
い、トリプシンでその培養皿から解放し（ＮＹ州、ロン
グアイランド (Long Island)、ギブコ) 、ピペットで穏
やかに分散させ、そして、生育培地中、ミリリットル当
り約２０個の細胞にまで希釈する。その希釈細胞４〜５
個の部分標本（各５０マイクロリットル）を、クーパー
皿の蓋の逆さにした無菌的な下側に置き（ＣＡ州、オク
スナード (Oxnard) 、ファルコン (Falcon) 製) 、室温
で６０分間インキュベートして付着させた。各細胞液滴
の位置をペンで印をつけた後、その蓋を6.７ｍl の生育
培地中の集密化ＢＡＥを含むクーパー皿の底にかぶせ
た。その集密化ＢＡＥを、この培地中で２４時間維持
し、成長因子を作らせた（ガドセク (Gajdnsek) 等ジャ
ーナル・オブ・セル・バイオロジー (J. Cell Biol.)８
５巻、４６７頁（１９８７年））。その印をした領域を
顕微鏡で観察し、単一細胞を含むこれらの領域で細胞の
生育を、何日間か連続してモニターした。これらのクロ
ーンが数千個の細胞に増殖したとき、その細胞を、トリ
プシンの存在下、リング・クローニングで取り出し、１
００マイクロリットルの生育培地を入れた0.５cmマイク
ロプレートのウェルに分配（ファルコン（Falcon））、
集密化するまで増殖させた。空の蓋も、この方法のコン
トロールとして、ＢＡＥを含むクーパー皿の底にかぶせ
ておいた。これらの蓋は、インキュベーション時間を通
して、細胞はみられず、このことは、底の細胞が離れ、
蓋の方に再び付着することはないことを示している。こ
の操作で作ったクローンは、因子関連抗原に対し陽性
で、このことは、それらが内皮細胞からなることを示し
ている（ジャフ (Jaffe)等、ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスチゲーション (J. Chin. Invest.）５２
巻、２７５７頁（１９７３年）。
【０１０８】それからその集密化単層を、１５ｍl のＰ
ＢＳで２度洗い、つづいて、１５ｍl の血清を含まない
培地とインキュベートした。２４時間後、生じたＣＭを
集め、４００ｘｇ、５分間の遠心を行ない、アジ化ナト
リウム及びトウィーン８０（ＭＯ州、セントルイス (S
t.Louis) シグマ (Sigma)社製) を各々、0.０２パーセ
ント及び0.０１パーセントの濃度になるように加えた
後、使用するまで、−３０℃で保存した。ＣＭ約１リッ
トルを、予め、0.０２パーセントのアジ化ナトリウム及
び0.０１パーセントのトウィーン８０（ポリオキシエチ
レン（８０）ソルビタン・モノオレート〕を含むリン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡化しておいた、１０ｍl の
コニカナバリンＡ−セファロース（ＭＯ州、セントルイ
ス、シグマ・ケミカル (Sigma Chemnical)社製) カラム
に、４℃で１０ｍl ／ｈの流速で通した。
【０１０９】透過物質を採集した後、そのカラムを、少
なくともカラム容積の１０倍の１MNaCl、0.０１パーセ
ントトウィーン８０及び0.０２パーセントのアジ化ナト
リウムを含むＰＢＳ（ pＨ7.４）で洗浄し、非特異的に
吸着しているタンパク質を除いた。そのカラムを、およ
そ同体積の、NaClを含まない同バッファで洗い、その後
２ステップで溶出を行った。まず、0.５Ｍアルファメチ
ル−Ｄ−マンノシド（ＭＯ州、セントルイス、シグマ・
ケミカル社製）0.０２パーセントアジ化ナトリウム及び
0.０１パーセントトウィーン８０を含む0.０１Ｍリン酸
ナトリウム（ pＨ7.２）を、2.５ｍl ／ｈの流速で、タ
ンパク質を溶出した。２度目は、カラムを、１M NaClを
含まない同バッファで溶出した。精製の第２ステップ
は、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。インヒビターを含む
画分（スラブゲル電気泳動及びリバース・フィブリン・
オートグラフィーで同定したもの）を集め、そしてその
部分標本（２２５マイクロリットル）を、チューブゲル
のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。マーカー色素がゲルの底
に到達したとき、そのゲルを凍結し、１mm厚にスライス
した。２枚のスライスを合わせ、0.０１パーセントのト
ウィーンを含むＰＢＳ２ｍl で、４℃、２４時間の抽出
を行った。その後、各抽出物について、 125Ｉ−フィブ
リン・プレート・検定法（以下に述べる）により、イン
ヒビター活性をテストした。インヒビター活性のピーク
を含む画分を集め、使用するまで、−７０℃で保存し
た。
【０１１０】また、インヒビターは、Ｌ〔３，４，５−
3Ｈ〕ロイシンの存在下で培養した細胞から採集したＣ
Ｍからも精製した。この場合その培養物を、１５ｍl の
ロイシンを含まないＭＥＭ（ＮＹ州、ロングアイランド
・ギブコ (GIBCO)）で２度洗浄し、その後、Ｌ〔３，
４，５− 3Ｈ〕ロイシン（ＭＡ州・ボストン・ニュー・
イングランド・ニュークリア (New England Nuclear)、
１５８ ci/m mol)、２０マイクロ ci/ｍl を含む、ロイ
シン・フリーＭＥＭ１５ｍl の存在下でインキュベート
した。２４時間後、その培地を上述のごとく採集し、非
標識ＣＭ５５ｍlと合わせ、２１ｍl のコンカナバリン
Ａ−セファロースカラム（0.６×3.５ｍl）に４ｍl ／
ｈの流速で流した。カラムを洗浄し、１ｍl ／ｈの流速
で溶出した。再び、インヒビター含有画分を集め、そし
て、分取用チューブゲル電気泳動にかけた。生成したイ
ンヒビター含有ゲル抽出物を、使用するまで−７０℃で
保存した。
【０１１１】以後詳しく述べるように、精製インヒビタ
ーに対するポリクローナルレセプターをウサギ中で作
る。プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ＮＪ州、
ピスカタウェイ (Piscataway) 、ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルス社製）を、0.０２パーセントのアジ化ナ
トリウム、0.０５パーセントのトウィーン２０〔ポリオ
キシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕及び
0.１パーセントのウシ血清アルブミン、を含むＰＢＳで
再水和し、１０倍過剰のこのバッファで３回洗浄した。
この抗血清のＩg G 画分を、製造業者の説明書に従が
い、抗インヒビター試薬又は、免疫前血清４０マイクロ
リットル当り、およそ８０マイクログラムのプロテイン
Ａ−セファロースの割合で洗浄したビーズに結合した。
そのＩg G コートしたビーズを、〔３，４，５− 3Ｈ〕
ロイシンの存在下で培養したクローン化ＢＡＥから採集
したＣＭ１ｍl に加えた。その試料を、室温で１時間イ
ンキュベートし、そのビーズを、遠心で洗った後（１ｍ
l のＰＢＳ−トウィーンバッファで３回）、0.０２５パ
ーセントＳＤＳ、２０パーセントグリセリン、0.０２５
パーセントブロモフェノール・ブルー及び2.５パーセン
ト（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含む、0.２５
Ｍトリス−塩酸（ pＨ、6.８）を用い、３７℃、１時間
で抽出した。生じた上清を、スラブゲルのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ又は液体シンチレーション計数で分析した。
【０１１２】それから、スラブゲル（１５×１０×0.１
５cm）又は、チューブゲル（１０×0.５cm）でのＳＤＳ
−ＰＡＧＥを、ここで参考文献として掲げているレムリ
(Laemmli)（ネイチャー（Nature）、（ロンドン）、２
２７巻、６８０頁（１９７０年））の方法に従って行っ
た。スタッキング・ゲルは、４パーセントのポリアクリ
ルアミドゲルからなり、そして、分離ゲルは、９パーセ
ントのポリアクリルアミドゲルからある（両ゲルとも３
％の架橋を有する）。分離ゲルにおいて7.５〜２０％の
ポリアクリルアミドの勾配からなるスラブゲルも調製し
た。電気泳動後、そのゲルを固定し、１パーセントのコ
マージ・ブリリアント・ブルー（ＣＡ州、リッチモンド
バイオラド社）を含む５０％トリクロロ酢酸、又は、ギ
ンスバーグ (Ginsburg) 等、( メソッド・イン・ヘマト
ロジー (Methods in Haematology) 、ハーカー(Harker)
等編、８巻、１５８〜１７６頁、チャーチヒル・リビン
グストン (Churchhill Livingstone) 、ニューヨーク
（１９８３年））の方法に従い、過ヨウ素酸・シッフ試
薬で染色した。
【０１１３】精製インヒビターの見かけ上の分子量を測
定するために用いた分子量標準物質には、ホスホリラー
ゼＢ（９2,５００）、ヒトのプラスミノーゲン（９0,０
００）、トランスフェリン（７7,０００）、ウシ血清ア
ルブミン（６6,２００）、ヒト血清アルブミン（６6,０
００）、オバルブミン（４3,５００）、カルボニック・
アンハイドラーゼ（３1,０００）、ソイビーン・トリプ
シン・インヒビター（２1,５００）、リゾチーム（１4,
４００）及びヒトのフィブリノーゲンの６6,０００、５
2,３００及び４6,５００サブユニットが含まれる。放射
性標識したタンパク質の位置を決めるため、染色したス
ラブゲルを、ボンナー (Bonner) 等（ヨーロピアン・ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー (Eur. J. Bioche
m.) ，４６巻、８３頁（１９７４年））により報告され
ているように、オートラジオグラフィーのため乾燥し、
処理した。チューブゲル中の放射性標識したタンパク質
の位置は、そのゲルを１mm片にスライスし、上述のよう
に、そのゲルスライスをバッファで抽出し、そして、各
フラクション中の放射活性を測定した。
【０１１４】アルカリ（ＳＤＳなし）連続ＰＡＧＥは、
ゲル及びランニングバッファとして0.３７Ｍトリス・グ
リシン（ pＨ9.５）を用い、ハーテン (Hjerten)等( ア
ナリティカル・バイオケミストリ (Anal. Biochem.）、
１１巻、２１９頁（１９６５年）の方法に従って行っ
た。チューブゲルは、2.５パーセントの架橋を含む、１
０パーセントポリアクリルアミドである。試料を４０パ
ーセントスクロースにし、ゲルに乗せ、最初は、2.５ m
Ａ／cm3 、0.５時間、ついで、５ mＡ／cm3 で１〜1.５
時間の電気泳動を行った。アイソエレクトリック・フォ
ーカシング・ゲルは、オファーレル（O' Farrell)(ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (J. Bio
l. Chem.) 、２５０巻、４００７頁（１９７５年）の方
法に従がい、ガラスチューブ（2.５mm）中に作った。形
成した pＨ勾配は、そのゲルを１mmスライスに切断して
測定した。各２個のスライスを合わせ、0.２ｍl の水
へ、４℃、１８時間で抽出し、各抽出物の pＨ及び放射
活性を測定した。また、平行ゲルからのスライスを、0.
２ｍlのＰＢＳ／トウィーンで抽出し、インヒビター活
性及び放射活性を検定した。ポリアクリルアミドゲル中
のインヒビター活性は、そのゲル抽出物の、 125Ｉ−フ
ィブリンのｕ−ＰＡ仲介の溶解を阻止する能力を直接測
定するか（ロスクトフ（Loskutoff)等のフィブリン−プ
レート法、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci.）
ＵＳＡ，７４巻３９０３頁（１９７７年））、又は、エ
リクソン (Erickson) 等（アナリティカル・バイオケミ
ストリー (Anal. Biochem.）、１３７巻、４５４頁（１
９８４年））による、リバース・フィブリン・オートグ
ラフィーにより、その位置決めを行った。後者の技術に
おいて、そのインジケータフィルムにおける白色の溶解
耐性ゾーンは、そのスラブゲル中にインヒビターが存在
することによる。
【０１１５】変性条件Ｔでの、そのインヒビターの安定
性を測定するため、精製分子（２０マイクログラム／ｍ
l ）を、ヒトの血清アルブミン、２５マイクログラム／
ｍlを含む、0.０２Ｍのグリシン（ pＨ2.７）中、３７
℃、１時間インキュベートした。その試料を、３倍容の
同バッファ（ pＨ8.１）を加えて中和し、ひきつづき、
同バッファで種々に希釈したものを、 125Ｉ−フィブリ
ン・プレート・検定法により、残存する活性をテストし
た。またインヒビター（２０マイクログラム／ｍl ）を
0.０２５パーセントＳＤＳ及びアルブミン（２５マイク
ログラム／ｍl）を含むＰＢＳ中、３７℃、１時間イン
キュベートした。そのＳＤＳを、0.１８パーセントのト
リトンＸ−１００〔ポリオキシエチレン（９）オクチル
・フェニル・エーテル〕を含む同バッファ、３倍容を加
えることにより中和し、残存するインヒビター活性を測
定した。グリシン及びＳＤＳの代わりにＰＢＳで処理し
た試料を、これらスクリーニングのためのコントロール
として用いた。精製プロテアーゼネキシン（１６０マイ
クログラム／ｍl ）のインヒビター活性に関する、酸グ
リシン及びＳＤＳの効果を同方法で測定した。
【０１１６】３． ポリクローナルレセプターの形成 そのインヒビターに対する血清を、１ｍl の食塩水に溶
かし、１ｍl の、フロイント完全アジュバント（ＩＬ
州、ネイパービル (Naperville) 、マイルス ラボラト
リーズ(Miles Laboratories)でエマルジョン化した精製
インヒビター２０マイクログラムを、ニュージーランド
ウサギに皮下注射することにより作った。食塩水0.５ｍ
l に溶解し、同量の不完全フロイント・アジュバント
（ＩＬ、ネイパービル、マイルス ラボラトリーズ）で
エマルジョン化した１０マイクログラムの精製インヒビ
ターを用いた二次注射を２週間後に行った。そのインヒ
ビターに対するポリクローナルレセプターを含む血清を
第３及び第４免疫化の１０日後に採集した。
【０１１７】４． ｔ−ＰＡに対するインヒビターの結
合検定法 リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の精製ｔ−ＰＡ（５０マ
イクロリットル／ウェル、１マイクログラム／ｍl ）
を、Ｕ底マイクロプレート（ＣＡ州、オクスナード (Ox
nard) 、ファルコン、ＰＶＣ、プラスチック、ファルコ
ン３９１１、マイクロテスト III) 中、４℃で１晩イン
キュベートした。この、そして、全てのこれに続くステ
ップで、そのプレートを、ＳＰＲＩＡバッファ（0.１パ
ーセントＢＳＡ、0.０５パーセント NaN3 及び0.０５パ
ーセントトウィーン２０を補ったＰＢＳ）で洗浄した。
そのプラスチック上の残存する部位を“ブロック”する
ため、ウェル中、３パーセントＢＳＡ（２００マイクロ
リットル／ウェル）を、３７℃、１時間インキュベート
した。試験試料及び、精製インヒビターの標準曲線を希
釈バッファを用いて作り（３パーセントＢＳＡ、５ mＭ
ＥＤＴＡ、0.１パーセントトウィーン８０及び0.０２パ
ーセント NaN3 ）、５０マイクロリットル／ウェルで３
７℃、１時間インキュベートした。結合したインヒビタ
ーを、ウサギの抗インヒビターレセプター（希釈バッフ
ァでの１：７５希釈、５０マイクロリットル／ウェル）
と、３７℃、２時間インキュベートすることにより、検
出した。その後、結合抗体−インヒビター−ｔ−ＰＡ複
合体を、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgG（５×１０4 cpm ／
ウェル、ＰＡ州、コクランビル (Cockranville) カッペ
ル・ラボラトリーズ(Cappel Laboratories) と、３７
℃、２時間インキュベートすることにより定量化した。
そのウェルを個々に切り、そして、各ウェル中の放射活
性を、ガンマ計数器で測定した（ＷＩ州、ミルウォーキ
ー (Milwaukee)、ゼネラル・エレクトリック (General
Electric) 、ＣＴ（８０−８００）ＣＴ／Ｔ）。
【０１１８】５．雑 プラスミノーゲンを、デューシュ (Deutsch)等( サイエ
ンス (Science)、１７０巻、１０９５頁（１９７０
年））の方法に従がい、リジン−セファロースを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより、古いヒトの
血漿から精製した。タンパク質は、ウシ血清アルブミン
を標準物質とした、ブラッドフォード（Bradford) の方
法( アナリティカル・バオケミストリー (Anal. Bioche
m.）１２巻、２４８頁（１９７６年））により測定し
た。ＰＡ活性は、ロストコフ (Lostkoff) 等の方法（プ
ロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci.) ＵＳＡ、７４
巻、３９０３頁（１９７７年））に従がい、 125Ｉ−フ
ィブリンをコートした多穴組織培養皿で検定した。タン
パク質は、固体ラクトパーオキシダーゼ／グルコースオ
キシダーゼ試薬（ＣＡ州、リッチモンド (Richmond) 、
バイオ・ラド・ラボラトリーズ (Bio-Rad Laboratorie
s) ）と、キャリヤーを含まない Na125Ｉ（ＩＬ州、ア
ーリントン・ハイツ (Arlington Heights)、アマーシャ
ム (Amersham) を用いるか、又は、その標識間隔をわず
か５分間とし、温度を４℃に修正した、フレーカー (Fr
aker) 等 (バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミ
ュニケーション(Bio chem. Biophys. Res. Comm.) ８０
巻、８４９頁（１９７８年））のヨード・ジェン操作に
より、 1 25Ｉによる酵素的標識を行った。最終産物の典
型的比活性は、タンパク質マイクログラム当り、１〜４
×１０5 cpm であった。ウシフィブリノーゲン（ＣＡ
州、ラ・ジョラ（La Jolla)、カルバイオケム−ベーリ
ング (Calbiochem-Behring)、フラクションII) を、モ
セソン(Mosesson)（バイオヒム・バイオフィズ・アクタ
(Biochim. Biophys. Acta)５７巻、２０４頁（１９６２
年））により示された方法により精製し、プラスミノー
ゲンを除いた。プロテアーゼ・ネキシンは、スコット
(Scott)等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー (J. Biochem. Chem.)２５８巻、１０４３９頁
（１９８３年））の方法により精製し、また、ＫＳ州、
ローレンス（Lawrence）、カンサス大学のＪ．ベーカー
(Baker)博士により提供していただいた。 125Ｉ−プラ
スミノーゲン切断検定法は、ロスクトフ (Loskutoff)等
( ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J. Biol. Chem.) ２５６巻、４１４２頁（１９８１
年））及び、ムソニ (Mussoni)等（トロンボ・リサーチ
(Thromb. Res.）、３４巻、２４１頁（１９８４年））
の方法により行った。
【０１１９】Ｂ． ベータＰＡＩ関係 １．試薬 制限酵素、アルカリホスファターゼ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノーフラグメント及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
は、ベーリンガー・マンハイムＧmbＨから購入した。ア
ルファ32ＰｄＧＴＰ（３０００ ci/m mol)及び35ＳｄＡ
ＴＰ−アルファ・Ｓ（６００ ci/m mol ；1 ci＝３７Ｇ
Ｂｑ）は、アマーシャム (Amersham) から購入した。ヒ
トのアルファ・トロンビンはＪ．フェントン (Fenton)
（ＮＹ州、ニューヨーク、アルバニー (Albany) ）氏か
ら提供していただき、フィブリノーゲンは、ＣＡ州、ラ
・ジラ（La Jolla)、カルバイオケム−ベーリング (Ca
lbiochem-Behring) から購入した。精製ヒト・ウロキナ
ーゼ〔Ｗ．Ｈ．Ｏ．ウロキナーゼ・スタンダード（プレ
パレーション６６〜４６）〕はナショナルインスチチュ
ート・フォー・バイオロジカル・スタンダード・アンド
・コントロール（National Institute for Biological
Standard and Control) （英国、ロンドン、ハンプステ
ッド(Hanpstead) 、ホリヒル (Hollyhill)）から入手し
た。ヒト・プラスミノーゲンは、デューシュ (Deutsh)
等（（１９７０年）、サイエンス (Science)１７０巻、
１０９５〜１０９６頁）の操作法に従い、入手及び精製
した。ＢＡＥベータＰＡＩの精製及びそれに対する抗体
の生成は、バン・モリク (Van Mourik) 等((１９８４
年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー (J. Biol. Chem.) ２５９巻、１４９１４〜１４９２
１頁）の方法により行った。胎盤ＰＡＩの抗血清は、Ｎ
Ｙ州、ニューヨーク、ロックフェラー大学のジェームス
・ワン (James Wun)博士からいただいた。ファージλｇ
t11 は、ＡＴＣＣから、ＡＴＣＣ３７１９４として入手
した。
【０１２０】２．粗胎盤抽出物の調製及び分析 凍結したヒトの胎盤（3.５ｇ）をＰＢＳで洗浄し、４℃
で、0.５％トリトンＸ−１００〔ポリオキシエチレン
（９）オクチルフェニルエーテル〕を含むＰＢＳ１５ｍ
l で抽出した。その組織を、ダウンス・ホモジナイザー
でホモジナイズし、細胞破壊物を、１0,０００ｘｇ、１
０分間の遠心でとり除いた。その抽出物について、リバ
ース・フィブリン・オートグラフィー〔エリクソン(Eri
ckson)等、（１９８４年）、アナリティカル・バオケミ
トリー (Analytical Biochemistry) 、１３７巻、４５
４〜４６９頁〕により、そのインヒビター活性を検定し
た。ヒト胎盤型ＰＡＩ及びウシ・ベータＰＡＩに対する
単一特異性抗血清を、プロテインＡ−セファロースに結
合し〔スウェーデン、ウプサラ(Uppsala) 、ファルマシ
ア (Pharmacia)〕、先に報告されているように用い〔ヴ
ァン・モウリク（VanMourik) 等、（１９８４年）、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (J. B
iol. Chem.) ２５９巻、１４９１４〜１４９２１頁、ソ
ーディー (Sawdey）等、（１９８６年）、トロンボ・リ
サーチ (Thromb, Res.) 、４１巻、１５１〜１６０
頁〕、抽出物中に存在するＰＡＩを免疫沈殿化させた。
【０１２１】３．λｇt11 cＤＮＡライブラリーの免疫
学的スクリーニング 未熟（３４週間）ヒト胎盤から誘導し、１×１０6 個の
独立した組換えファージを含む、ヒトλｇt11 cＤＮＡ
ライブラリーを〔ミラン (Millan）、（１９８６年）、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (J.
Biol. Chem.)、２６１巻、３１１２〜３１１５頁〕
を、抗体プローブとして、精製したＢＡＥベータＰＡＩ
に対する抗体〔ヴァン・モウリク（Van Mourik) 等、
（１９８４年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー (J. Biol. Chem.) ２５９巻、１４９１４
〜１４９２１頁〕のアフィニティー精製したＩg G フラ
クション〔クアトレカサス (Cuatrecasas)、（１９６９
年）、バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミュニ
ケーション(Biochem. Biophys. Res. Comm.)３５巻、５
３１〜５３７頁〕を用い、ベータＰＡＩに対して、免疫
学的なスクリーニングを行った〔ヤング(Young) 等、
（１９８３年）、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.
Sci.）ＵＳＡ、８０巻、１１９４〜１１９８頁；〔ヤン
グ(Young) 等、（１９８３年）、サイエンス(Scienc
e)、２２２巻、７７８〜７８２頁；ハイン (Huynh)等、
（１９８４年）、“ＤＮＡクローニング技術”実際的ア
プローチ、Ｄ．グロバー (Glover) 編、( オックスフォ
ード、ＩＲＬプレス）〕。抗体の結合を視覚化するた
め、 125Ｉ標識したプロテインＡ〔５５ミリキューリー
／ミリグラム (mci ／mg）〕を用いた。オートラジオグ
ラフィーは、そのフィルターで、−８０℃において増感
スクリーンを用いて、コダックＸＡＲ５フィルムを感光
させることにより行った。
【０１２２】４．大腸菌分解物のウエスタン・ブロット
分析 λｇt11 及び組換え溶原体の誘導、及び、感染大腸菌の
粗抽出物の調製を先に報告されているように行った〔ハ
イン (Huynh)等、（１９８４年）、“ＤＮＡクローニン
グ技術”実際的アプローチ、Ｄ．グロバー (Glover)
編、( オックスフォード、ＩＲＬプレス）〕。発現した
ＰＡＩのウエスタン・ブロット分析のために、粗抽出物
５０マイクロリットル（μl ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分画した〔リムリ (Laemmli)（１９７０年）、ネイチャ
ー（Nature）、（ロンドン）２２７巻、６８０−６８５
頁〕。そのタンパク質を、電気泳動的にニトロセルロー
ス紙に移行させ、ベータＰＡＩアフィニティーカラム
（上述）又は、単離した実質的に純粋な融合ポリペプチ
ドで精製した抗血清の免疫グロブリン画分を用い、先に
報告されているように〔ラムレ (Lammle) 等、（１９８
６年）、トロンボ・リサーチ (Thromb, Res.) 、４１
巻、７４７〜７５９頁；ジョンソン (Johnson)等（１９
８４年）、ジーン・アナリティカル・テクニック (Gene
Anal. Tech.）１巻、３〜８頁〕、免疫ブロッティング
を行った。
【０１２３】単離した、実質的に純粋な融合ポリペプチ
ドでの抗血清のアフィニティー精製のため、誘導した大
腸菌溶原体の粗抽出物９００μl 〔ハイン (Huynh)等、
（１９８４年）、“ＤＮＡクローニング技術”実際的ア
プローチ、Ｄ．グロバー (Glover) 編、( オックスフォ
ード、ＩＲＬプレス）〕を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画
し、ニトロセルロース紙に移行させた。Ｍr １５０〜２
００キロダルトン（kda)のタンパク質物質を含むストリ
ップを、ニトロセルロースシートから切り出し、抗血清
のアフィニティー精製に用いた。ニトロセルロースフィ
ルターストリップのブロッキング、特異的抗体の結合、
及び洗浄は、抗体プローブを用いた、λｇt11 ライブラ
リーのスクリーニングで述べたように行った〔ハイン
(Huynh)等、（１９８４年）、“ＤＮＡクローニング技
術”実際的アプローチ、Ｄ．グロバー(Glover) 編、(
オックスフォード、ＩＲＬプレス）〕。結合した抗体を
溶出させるため、そのフィルターストリップを、0.０２
％ウシ胎児血清を含む0.１Ｍグリシン−ＨＣl バッファ
ー（ pＨ2.５）、２００μl と、３分間、２回インキュ
ベートした。溶出してきた物質を、0.５Ｍトリス−塩酸
（ pＨ8.０）１４０μlを加えて、中和し、１晩、透析
し、そして、ウエスタン・ブロッティング分析での一次
抗体として用いた。
【０１２４】５．核酸法 （ａ）ＰＡＩ遺伝子のクローニング及び配列決定 プレート・ライセート法により調製し、 CsCl 平衡遠心
により精製したファージ粒子を、ファージＤＮＡの精製
に用いた〔マニアチス（Maniatis) 等、（１９８２
年）、“モレキュラー・クローニング”、ラボラトリー
マニュアル、ＮＹ州、コールド・スプリング・ハーバー
・コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー〕。
プラスミドＤＮＡを、バーンボイム (Birnboim) 等
（（１９７９年）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
(Nucleic Acids Res.) 、７巻、１５１３〜１５２２
頁）の方法、及び、つづく、２回の連続したエチジウム
ブロマイド／CsCl 平衡遠心により単離した。酵素反応
は、業者により示されている条件を用いて行った。全Ｒ
ＮＡは、培養したＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１
２１）から、バーガー (Berger）等（（１９７９年）、
バイオケミストリー（Biochemistry) 、１８巻、５１４
３〜５１４９頁）の方法に従がい調製し、ホルムアルデ
ヒドの存在下でのアガロースゲル電気泳動により分画し
〔フェラス (Fellous)等、（１９８２年）、プロシーデ
ィング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）、ＵＳＡ、７９巻、３
０８２〜３０８６頁〕、そして、ノーザン・ブロット分
析にかけた〔トーマス (Thomas) （１９８０年）、プロ
シーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）、ＵＳＡ、７７
巻、５２０１〜５２０３頁〕。
【０１２５】λｇt11 ・クローンからのＤＮＡを、Ｅco
ＲＩエンドヌクレアーゼで消化し、切断した cＤＮＡ挿
入物を、バクテリオ・ファージＭ１３クローニングベク
ターｍｐ９〔メッシング (Messing)，（１９８２年）、
ジーン (Gene) 、１９巻、２６９〜２７６頁〕又は、プ
ラスミドベクターｐＧＥＭ−３（ＷＩ州、マジソン(Mad
ison）、プロメガ・バイオテク(Promega Biotech））に
サブクローンした。両方向性をもつ、 cＤＮＡ挿入物を
含むＭ１３クローンを単離し、デール (Dale)等（（１
９８５年）、プラスミド (Plasmid)、１３巻、３１〜４
０頁）の一本鎖Ｍ１３法を用いて、両鎖のデリーション
・ライブラリーを作った。配列決定の前に、Ｍ１３テン
プレートの大きさを、0.７％アガロースゲル電気泳動で
測定し、選択したテンプレートを、ダイデオキシ・チェ
ーン・ターミネーション法〔サンガー (Sanger) 等、
（１９７７年）、プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.
Sci.）、ＵＳＡ、７４巻、５４６３〜５４８７頁〕で配
列決定した。両方のＤＮＡ鎖を配列決定し、各鎖の８０
％以上が、２回以上の配列決定を行なわれた。
【０１２６】ＤＮＡ配列データの処理は、スティデン(S
taden)〔スティデン(Staden)、（１１９８２年）、ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ (Nucleic Acids Res.)
、１０巻、４７３１〜４７５１頁〕を用いて行った。
ホモロジーサーチは、パーソン・ファースト・プロテイ
ンホモロジー・プログラム〔リップマン (Lipman) 等、
（１９８５年）、サイエンス (Science)、２２７巻、１
４３５〜１４４１頁〕を用いて行った。
【０１２７】（ｂ）真核生物での発現 （ｉ）哺乳類細胞での組換えＤＮＡの発現による、ＰＡ
Ｉの産生 哺乳類のチャイニスハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でＰ
ＡＩ遺伝子を発現できる組換えＤＮＡベクターを、本分
野でよく知られており、マニアチス（Maniatis) 等（モ
レキュラー・クローニング；ラボラトリーマニュアル、
コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８
２年））により詳細に述べられている方法を用いて構築
した。λ３クローンＤＮＡ又はプラスミド pＰＡＩ3 Ｄ
ＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩによる制限エ
ンドヌクレアーゼ消化にかけ、ついで、生じた３キロ塩
基対断片を、サイス分別により精製した。その３ｋb の
制限エンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡの３′粘着末端を、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを用いて
充填した。次の配列ＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＣ
を有する合成オリゴヌクレオチド断片を、カルザース
(Caruthers)等（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミ
カル・ソサイアティー (J. Am. Chem. Soc. ）１０３
巻、３１８５頁（１９８１年））及びゲイト (Gait) 等
（コールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・オ
ブ・クオンティタティブ・バイオロジー（Cold Spring
HarborSymp. Quant. Biol.)４７巻、３９３頁（１９８
３））の方法に従って作り、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
い、充填した３ｋb 断片に、連結した。生じた、３ｋb
断片と合成オリゴヌクレオチドを含む連結断片をさら
に、ＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化にかけた。
【０１２８】シミアンビールス（ＳＶ４０）を基本にし
た発現ベクター pＫＳＶ−１０（ＮＪ州、ピスカタウェ
イ (Piscatawaiy)、ファルマシア・ファイン・ケミカル
ス(Pharmacia Fine Chemicals)を、Ｂgl II 制限エンド
ヌクレアーゼで消化した。上述のＢamＨＩで消化してで
きた、ＰＡＩコード配列を含む断片を、Ｂgl II で消化
したベクターと合わせ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、ｐＳＶ−ＰＡＩと命名した環状組換え発現プラス
ミドを形成させた。発現プラスミドｐＳＶ−ＰＡＩは、
本来の大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。ｐ
ＳＶ−ＰＡＩでトランスフォームしたとき、大腸菌ＲＲ
１０１（ＭＤ州、ゲイサースバーグ (Gaithersburg) 、
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ (Bethesda Resea
rch Laboratories) を、そのプラスミドを含む細菌を、
アンピシリン耐性に基づいて選択できる。プラスミドを
含む細菌をクローン化し、つづいて、そのクローンを、
その発現ベクターに正しい方向でＰＡＩコード遺伝子が
挿入しているものを選択した。
【０１２９】方向性に対するスクリーニングは、挿入し
た遺伝子と、発現ベクターの両方にあるＰstＩ制限エン
ドヌクレアーゼ部位の位置を考慮して行った。ｐＳＶ−
ＰＡＩのＰstＩによる消化で、図２２に示されているよ
うに、左から右に読んで、ＳＶ４０転写プロモーターの
３′側に、ＰＡＩ含有挿入物があるときは、約3.９、3.
1、 3.０及び0.５ｋb の断片が生じ、また、その挿入物
が反対方向に入っているときは、約 3.9、 3.５、2.６及
び0.５ｋb の断片が生じる。従って、適正な方向性をも
つｐＳＶ−ＰＡＩ構築物の同定には、ＰstＩ制限エンド
ヌクレアーゼ消化後に生ずる断片のサイズ分析を必要と
し、そして、その断片が 3.9、3.1 、3.0 及び0.５ｋb
であるものの選択を要する。適当な、先に述べた方向で
の挿入物を含む構築物を、発現に使用するため選択し、
以後、ｐＳＶ−ＰＡＩと呼ぶ。
【０１３０】上で得られた、ＰＡＩをコードする遺伝子
を含むｐＳＶ−ＰＡＩプラスミドを、このプラスミドを
含む大腸菌を培養することにより増やした。このプラス
ミドのＤＮＡを、大腸菌培養物から、マニアチス（Mani
atis) 等（モレキュラー・クローニング；ラボラトリー
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（１９８２年））のアルカリ分解法により単離し
た。ＰＡＩの発現は、グラハム (Graham) 等( ビロロジ
ー (Virol.) ５２巻、４５６頁（１９７３年））のリン
酸カルシウムによるトランスフェクション法を用いた、
哺乳類細胞系列、ＣＨＯへのｐＳＶ−ＰＡＩの導入によ
り行った。培養物中の全てのＣＨＯ細胞へのｐＳＶ−Ｐ
ＡＩの導入における最高の効率を保証するため、トラン
スフェクションを、サウザーン(Southern)等によって報
告されているように、第２のプラスミド、ｐＳＶ２ＮＥ
Ｏ（ＡＴＣＣ ＃３７１４９）及び細胞毒薬剤Ｇ４１８
（ＮＹ州、グランド・アイランド (Grand Island）、ギ
ブコ・ラボラトリーズ (GIBCO Laboratories) の存在下
で行った。( ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド
・アプライド・ジェネティクス (J. Mol. Appl. Gene
t.) １巻３２７頁（１９８２年））。Ｇ４１８に対し
て、耐性な、これらＣＨＯ細胞を培養し、そして、これ
らは、その中に、プラスミドｐＳＶ２ＮＥＯ及びｐＳＶ
−ＰＡＩの両方を獲得しており、ＣＨＯ／ｐＳＶ−ＰＡ
Ｉ細胞と命名した。ｐＳＶ−ＰＡＩ発現ベクターの遺伝
子的構築学により、ＰＡＩは、生成したＣＨＯ／ｐＳＶ
−ＰＡＩで発現され、これら細胞の細胞質中に検出さ
れ、それから精製する。
【０１３１】発現したＰＡＩは先に述べたリバース・フ
ィブリン・オートグラフィー（ＲＦＡ）検定法により簡
便に検定される。最後に、ＣＨＯ／ｐＳＶ−ＰＡＩ細胞
を培養し、ひきつづいて、レムリ (Laemmli)により報告
されたように（ネイチャー（Nature）、２２７巻、６８
０頁（１９７０年））、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファ
中で分解した。その細胞タンパク質を含む溶液を、１5,
０００rpm 、１０分間遠心し、そして、その上清を収穫
した。生じた上清物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、ＲＦＡにより、生物学的に活性なＰＡ
Ｉを分析した。
【０１３２】（ii) イーストにおける、組換えＤＮＡ発
現によるＰＡＩの産生 イースト、サッカロミセス・セレビシアエ (Saccharomy
ces cerevisiae) (S.cerevisiae) において、ＰＡＩ遺
伝子を発現できる。組換えベクターは、セクション III
Ｂ５（ｂ）（ｉ）で述べた操作を用いた次の方法で構築
した。多くのステップは、イースト適合する発現ベクタ
ーへのＰＡＩ遺伝子の挿入と、イースト細胞の取り扱い
に適応するのに必要なもの以外は、先に述べたものと同
様である。λ3 クローン又はｐＰＡＩ3 由来の３ｋb 断
片の単離及びその３′粘着末端の充填の後、配列； ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ を有する、同様に調製した合成オリゴヌクレオチドを、
その生じた断片に、連結した。そのイースト発現ベクタ
ー、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ＃３１２５５）、及びオリゴ
ヌクレオチドを連結した断片を、両方とも、Ｃｌa Ｉ制
限エンドヌクレアーゼで消化し、合わせて、それらを、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＹ−ＰＡＩと命名した
環状組換え発現プラスミドを作った。そのように調製し
たプラスミドで大腸菌をトランスフォームした後、アン
ピシリン耐性プラスミドを含む細菌を、ｐＹ−ＰＡＩに
依存するアンピシリン耐性遺伝子に基づいて選択した。
【０１３３】プラスミド含有細菌をクローン化し、そし
て、基本的に、先に述べた方法に従がい、挿入したＰＡ
Ｉ遺伝子の適正な方向性に対し、スクリーニングを行っ
た。ｐＹ−ＰＡＩにおいて、図２２で示されているよう
に左から右に読んで、ｐＴＤＴ１のＴＲＰ１イーストプ
ロモーターの３′側に、ＰＡＩ含有挿入物があるとき、
ＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により、約7.４及
び3.３ｋb の断片を生じた。先に述べた適正な方向での
挿入物を含む構築物を、さらに、発現への使用により選
択し、以後、ｐＹ−ＰＡＩと呼ぶ。イーストにおけるＰ
ＡＩの発現は、先に述べたように増殖し、精製したｐＹ
−ＰＡＩプラスミドＤＮＡを用い、Ｓ．セレビシアエ
（cerevisiae) ＳＨＹ３株（ＡＴＣＣ＃４４７７１）を
トランスフォームすることにより行った。ハイネン (Hi
nnen) 等（プロシーディングス・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.）ＵＳＡ、７５巻、１９２９頁（１９７８年））のス
フェロプラスト操作法によるトランスフォーメーション
後、ＳＨＹＵ３細胞を、アミノ酸を含まない、0.６７パ
ーセントのイースト・ナイトロジェン・ベース（ＭＩ
州、デトロイド (Detroit)、ディフコ・ラボラトリース
(DIFCO Laboratories) 、2 パーセント・グルコース及
びアデニン・ロイシン及びウラシルを各、ミリリットル
当り５０マイクログラムを含む栄養選択培地中で、ミヤ
ジマ (Miyajima) 等（モレキュラー・セル・バイオロジ
ー (Mol. Cell Biol. ）、４巻、４０７頁（１９８４
年））により報告されたように、培養した。ｐＹ−ＰＡ
Ｉ発現ベクターの遺伝子構築学により、生成したｐＹ−
ＰＡＩでトランスフォームしたＳＨＹ３細胞、以後、Ｓ
ＨＹ３／ｐＹ−ＰＡＩ細胞と呼ぶ、でＰＡＩを発現し、
そしてそのＰＡＩは、これら細胞の細胞質中で検出さ
れ、そこから精製した。
【０１３４】発現したＰＡＩは、先に述べた、ＰＦＡ検
定法により簡便に検出できる。最後に、ＳＨＹ３／ｐＹ
−ＰＡＩ細胞を、６００ナノメーターでの光学密度（Ｏ
Ｄ６００）が１になるまで、対数増殖させ、それからそ
のイースト細胞を水で洗浄し、３倍容の、５０ mＭリン
酸カリウム（ pＨ7.０）、１ mＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）、５ mＭ２−メルカプトエタノール、0.
５ mＭフェニルメチルスルホニルフルオライド及びロイ
ペプチン及びペプスタチンを各々、ミリリットル当り１
マイクログラムを含む溶液に懸濁した。その後、イース
ト細胞をガラスビーズとともに手で振ることにより破壊
し、ソーバルＳＳ３４ローターを用い、１２０００rpm
、３０分間の遠心をした。遠心からの上清を、２倍濃
縮したイースト細胞タンパク質を含む、先に述べたＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料バッファで１：１に希釈した。この溶
液を遠心し、先に述べたようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｒ
ＦＡで分析した。
【０１３５】先に述べた各説明において、生じた発現Ｐ
ＡＩは、全アミノ酸残基配列を含み、さらに、配列 Ｍet−Ｇln−Ｐhe−Ｇly−Ｇlu−Ｇly−Ｓer−Ａla を、成熟ＰＡＩのアミノ末端に含んでいる。前記のもの
は、本発明を説明するもので、これを制限を意図するも
のではない。多くの変化や修正が本発明の真の意図及び
範囲を逸脱することなしに行なうことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】調整培地（ＣＭ）のコンカナバリンＡ−セファ
ロースによるアフィニティークロマトグラフィーによる
分画を示したグラフである。合わせたウシの大動脈内皮
細胞（ＢＡＥ）由来のＣＭ１リットルを１０ミリリット
ル（ｍl ）のコンカナバリンＡ−セファロースカラム
に、以後に詳しく述べるように通す。そのカラムを、
（ａ）１モル（Ｍ）NaCl、（ｂ）0.００１Ｍリン酸ナト
リウム、（ｃ）0.５Ｍアルファ・メチル・Ｄ・マンノシ
ドを含む0.０１Ｍリン酸ナトリウム及び（ｄ）0.５Ｍ・
アルファ・メチル・Ｄ・マンノンド及び１Ｍ NaCl を含
む0.０１Ｍリン酸ナトリウムの順で洗浄した。挿入図
は、貯留しておいた流出液（Ｉ）、アルファ・メチル・
マンノシド低 (II) 及び高(III) 塩画分とともに、出発
物質( ＣＭ) のタンパク質プロフィールを示したもの
で、全て、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動( ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) 及びコマージ・ブ
リリアント・ブルー( バイオラド (BioRad) 、リッチモ
ンド、ＣＡ州）での染色の後、明らかになったものであ
る。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のコンカナバリンＡ画分 I
I （上述）のインヒビター活性の検出を示したグラフで
ある。コンカナバリンＡピークII物質（図１）を集め、
そして、以後に詳しく述べるチューブゲル中のＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分画した。そのゲルをスライスし、各スライ
スを、バッファ中で溶出させ、その溶出物について、
125Ｉ−フィブリンプレート法（後述）を用いて、ｕ−
ＰＡ仲介繊維素溶解活性の阻害能をテストした。挿入図
は、スラブゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、コマージ
ブリリアントブルーによる染色による分析、及びリバー
ス・フィブリン・オートグラフィーにより各々解析し
た、同試料のタンパク質プロフィール（レーン１）及び
インヒビター活性を示している。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製したインヒビター
の分析を示すリバース・フィブリン・オートグラムのフ
ォトコピーである。インヒビター活性の大部分（図２に
示されているように画分４９〜５２）を含むゲル抽出物
を集め、そして、以後詳しく述べるように、7.５−２０
パーセントの勾配スラブゲルで分析した。電気泳動後、
そのゲルを、コマージ・ブリリアント・ブルー（レーン
１）及び過ヨウ素酸−シッフ試薬（レーン２）で染色
し、もしくは、リバース・フィブリン・オートグラフィ
ーによりそのインヒビター活性を調べた（レーン３）。
【図４】ＢＡＥインヒビターによるＰＡ−活性の阻害を
示すグラフである。精製したインヒビターを増やしなが
ら、ヒトのｕ−ＰＡ（○）又はｔ−ＰＡ（●）ミリリッ
トル当り2.５ユニットと、３７℃、５分間プレインキュ
ベートする。 125Ｉ−プラスミノーゲンを加え、そし
て、さらに６０分間インキュベートを続ける。その反応
は、３パーセントＳＤＳ及び５パーセントの２−メルカ
プトエタノール存在下、その試料を１００℃、３分間加
熱することで停止する。 125Ｉ−プラスミノーゲンを、
特徴的な重鎖及び軽鎖に切断する種々の試料の能力を、
ムソニ（Mussoni)等（トロンボ・リサーチ (Thromb, Re
s.) ３４巻、２４１頁（１９８４年））の方法と同様
に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで検
定した。定量は、乾燥ゲルから 125Ｉ−プラスミノーゲ
ン及びプラスミン鎖を切り出し、それらをガンマ計数器
で計数することにより行った。データは、インヒビター
存否条件での、プラスミノーゲン切断率で表わした。
【図５】125Ｉ標識したｔ−ＰＡのＢＡＥインヒビター
への結合を示すオートラジオグラムのフォトコピーであ
る。 125Ｉ標識したｔ−ＰＡを精製したインヒビター
（１マイクログラム／ミリリットル）の非存在下（レー
ン１）又は存在下（レーン２）で３７℃、３０分間イン
キュベートした。反応は、試料バッファを加えることで
停止し、そしてその試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオー
トラジオグラフィーで分析した。
【図６】ＢＡＥインヒビターと、プロテアーゼネキシン
の相対的安定性を示すグラフである。精製したインヒビ
ター（２０マイクログラム／ミリリットル）及び精製し
たプロテアーゼネキシン（１６０マイクログラム／ミリ
リットル）を、後で詳しく述べるように、（Ａ） pＨ2.
７、又は（Ｂ）0.０２５パーセントのＳＤＳ検定バッフ
ァ存在下で、３７℃６０分間インキュベートする。その
試料を、３倍容の検定バッファを加えることにより中和
し、検定バッファで希釈し、 125Ｉ−フィブリンプレー
ト検定法（後述）により、残存するインヒビター活性を
調べた。コントロール実験として、ＰＢＳをグリシン及
びＳＤＳと各々交換して行った。データは、インヒビタ
ーを欠くｕ−ＰＡコントロールの割合として表わしてあ
る。テストした試料は、未処理（○）及び処理済（●）
プロテアーゼネキシン及び未処理（△）及び処理済
（▲）ＢＡＥインヒビターを含んでいる。
【図７】Ｌ〔３，４，５− 3Ｈ〕ロイシン標識コンカナ
バリンＡ分画IIのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示すグラフであ
る。そのコンカナバリンＡピークIIの部分標本（２２５
マイクロリットル）を、チューブゲルのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけた。電気泳動後、そのゲルをスライスし、各ス
ライスは、後に詳しく述べるように、バッファ中で抽出
を行った。そのゲル抽出物について、 125Ｉ−フィブリ
ン・プレート法によるインヒビター活性（●）及びシン
チレーション計数による放射性活性（○）について（後
述）、テストを行った。
【図８】ＳＤＳゲルから抽出したＬ〔１，２，３−
3Ｈ〕ロイシン標識インヒビターのアルカリＰＡＧＥを
示したグラフである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後（図７に示し
たように、スライス抽出物５１〜５４）のインヒビター
画分を集め、アルブミンを最終濃度１００マイクログラ
ム／ミリリットルとなるように加え、そして、0.５パー
セントのトリトンＸ−１００を含むＰＢＳに対して透析
した。それから、その試料をチューブゲルを用いたアル
カリＰＡＧＥで分画し、図７で述べたように放射性活性
（○）及びインヒビター活性（●）の測定のための処理
を行った。
【図９】ＣＭ由来のインヒビターの免疫沈殿を示すオー
トラジオグラムのフォトコピーである。クローン化した
ＢＡＥ由来のＬ〔１，２，３− 3Ｈ〕ロイシン標識ＣＮ
を、後で詳しく述べられているように、精製したインヒ
ビターに対する抗血清を含むプロテインＡ−セファロー
スビーズとインキュベートする。固定化した複合体を、
0.２５Ｍトリス、2.２パーセントＳＤＳ，2.５パーセン
ト（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、及び２０パー
セントグリセリン（ pＨ6.５）を用い、３７℃、１時間
インキュベーションして、そのビーズから抽出した。そ
の抽出物を、スラブゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
画し、オートラジオグラフィーで調べた。レーン１は、
出発物質（ＣＭ）、レーン２は免疫反応上清、レーン３
は、免疫沈殿を示している。矢印は、リバース・フィブ
リン・オートグラフィーで明らかにされた、インヒビタ
ー活性の位置を示している。
【図１０】種々の濃度のｔ−ＰＡでコートしたマイクロ
プレートウェルへの精製したインヒビターの結合を示し
たグラフである。ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）製プラスチ
ックウェルをミリリットル当りマイクログラム単位で表
わした、指示された濃度のｔ−ＰＡのリン酸バッファ食
塩水（ＰＢＳ）溶液（ウェル当り５０マイクロリット
ル）と、４℃で約１８時間インキュベートする、ウェル
を洗浄し、子ウシ胸腺アルブミン（ＢＳＡ）でブロック
した後、希釈バッファ中の精製インヒビターと２時間イ
ンキュベートする；２０ナノグラム（ｎg ）／ｍl 、●
……●；５０ｎg ／ｍl 、○……○；１００ｎg ／ｍl
、△……△。ウェルを洗浄した後、結合したインヒビ
ターを、ウサギの抗インヒビターレセプター（１：１０
０希釈）と３７℃で２時間インキュベートし、ついで、
125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgG（1.５×１０5 cpm ／ウェ
ル）と、２時間インキュベートすることにより検出し
た。個々のウェル中の結合した放射活性を、ガンマ線計
数器で測定し、結合したものの割合として示した。
【図１１】ｔ−ＰＡでコートしたウェルに結合するイン
ヒビター速度論を示したものである。ＰＶＣプラスチッ
クウェルを、５０マイクロリットルのｔ−ＰＡ（１ｎg
／ｍl ＰＢＳ、●……●）又はＢＳＡ（１ｎg ／ｍl Ｐ
ＢＳ、○……○）と、４℃で１晩インキュベートした。
そのウェルを洗浄し、ＢＳＡでブロックし、そして希釈
バッファ中、精製したインヒビター（１００ｎg ／ｍl
）と、示した時間、３７℃でインキュベートした。ウ
ェル洗浄後、結合したインヒビターは、図１０に示した
ように検出した。
【図１２】精製したインヒビターの検出に関する。第１
もしくは、第２抗体のインキュベーション時間の影響を
示したグラフである。ＰＶＣプラスチックウェルを、ｔ
−ＰＡ（黒）又はＢＳＡ（白）でコートし、洗浄、ブロ
ック後、図１０に述べたように、精製インヒビター（５
０ｎg ／ｍl ）と１時間インキュベートした。そのウェ
ルを、指示した時間、ウサギ抗インヒビターレセプター
（Ｒd αＩn ）（１：１００希釈、○、●）とインキュ
ベーションし、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgG（ 125Ｇt α
Ｒb Ｉg Ｇ）（1.５×１０5 cpm ／ウェル）と、２時
間インキュベーションした。別に、そのウェルを、ウサ
ギ抗インヒビターレセプターと２時間インキュベート
し、そして、 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgG（△、▲）のイ
ンキュベーション時間を変化させた。
【図１３】精製インヒビターの検出に関する、ウサギ抗
インヒビターレセプターの量変化の影響を示すグラフで
ある。ＰＶＣプラスチックウェルを、ｔ−ＰＡでコート
し、洗浄、ブロック後、図１０で述べたような量のイン
ヒビター（５０ｎg ／ｍl）とインキュベートした。そ
れから、ウェルを、種々に希釈した（１：５０、●、
１：７５、△；１：１００、■；１：２００、□；１：
５００、○）ウサギ抗インヒビターレセプターと、３７
℃で２時間インキュベートした。結合した抗体−インヒ
ビター−ｔ−ＰＡ複合体を、図１０で述べたように検出
した。
【図１４】精製したインヒビターの検出に関する、 125
Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgGの量変化の影響を示すグラフであ
る。ＰＶＣプラスチックウェルをｔ−ＰＡでコートし、
洗浄、ブロック後、図１０で述べたように、インヒビタ
ー（５０ｎg ／ｍl ）とインキュベートした。そのウェ
ルを、３７℃で、ウサギ抗インヒビターレセプター
（１：７５）と、２時間インキュベートした。洗浄後、
そのウェルを、2.５×１０4 （△）、５×１０
4 （○）、１×１０5 （□）、1.５×１０5 （■）、２
×１０5 （▲）、３×１０5 （●）cpm の 125Ｉ−ヤギ
抗ウサギＩgGと３７℃で２時間インキュベートした。
【図１５】図１０〜１４で確立した特に好ましい条件下
で、インヒビター結合検定法を用い、精製したインヒビ
ター及びＢＡＥならし培地中に存在するインヒビターを
検出するための投与−応答曲線を示すグラフである。ｔ
−ＰＡでコートしたウェルを、指示した濃度の精製イン
ヒビター（●）、もしくは連続的に希釈したウシの大動
脈内皮細胞（ＢＡＥ）ならし培地（○）と、３７℃で１
時間インキュベートした。結合したインヒビターは、図
１０で述べたように、ウサギ抗インヒビターレセプター
（１：７５）、ついで 125Ｉ−ヤギ抗ウサギＩgG（2.５
×１０4 cpm）を用いて定量した。
【図１６】図１５の精製インヒビターに対する標準投与
・応答曲線の両対数グラフである。図１５で示した精製
インヒビターに対する結合データを用いた。
【図１７】リバース・フィブリン・オートグラフィーに
より検出した、インヒビターの投与・応答曲線を示すオ
ートグラムのコピーである。種々の濃度の精製インヒビ
ターを、後に詳しく述べる、リバース・フィブリン・オ
ートグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
レーン１、0.５ｎg ；レーン２、１ｎg ；レーン３、2.
５ｎg ；レーン４、５ｎg ；レーン５、１０ｎg 。分子
量マーカーを示した。
【図１８】固定化したｔ−ＰＡへのインヒビターの結合
に関する外来ＰＡの影響を示すグラフである。精製イン
ヒビター（５０ｎg ／ｍl ）を指示した濃度のｔ−ＰＡ
（●）、ｕ−ＰＡ（ＵＫ，▲）又は、ストレプトキナー
ゼ（ＳＫ，■）と、３７で１時間インキュベートした。
ｔ−ＰＡに対するインヒビターの結合は、後に述べるイ
ンヒビター結合検定法で定量した。
【図１９】正常なヒトの血清及び血清のミリリットル当
りのインヒビター活性（ｎg ／ｍl ）を示すグラフであ
る。健康な提供者から静脈穿刺により収集した血液試料
を酸−サイトレートデキストロース（ＡＣＤ）中に入れ
た。血漿及び血清は、各血液試料から調製し、そして、
そのインヒビター活性を、後に詳しく述べるインヒビタ
ー結合検定法で測定した。
【図２０】大腸菌の粗抽出物のウエスタンブロット分析
の写真である。誘導された溶原性株大腸菌株から調製し
た抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、後の述べる
ウエスタンブロッティングにより分析した。レーンＡ、
Ｄ及びＦは、精製したウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）ベ
ーターＰＡＩ３００ナノグラム（ｎg ）を含んでいる。
レーンＢ及びＥは、ヒトの内皮細胞型・ＰＡＩのｃＤＮ
Ａ配列を挿入した組換えラムダ（λ）ファージであるλ
9.２で溶原化した大腸菌Ｙ１０８９株由来の抽出物５０
マイクロリットル（μl ）を含む。レーンＣは、その挿
入物を欠く、ベータλｇt11 で溶原化したＹ１０８９株
由来の抽出物５０μl を含む。レーンＡ−Ｃで示したウ
エスタンブロッティング実験のために、ＢＡＥ−ベータ
ＰＡＩに対するアフィニティー精製したＩg G を一次抗
体として用いた。レーンＤ−Ｆのウエスタンブロッティ
ングに対しては、用いた抗血清は、ニトロセルロース紙
に結合した種々のタンパク質について、アフィニティー
精製を行った。レーンＤに対しては、λ9.２由来の融合
ポリペプチドでアフィニティー精製した抗血清を用い
た；レーンＥ、ＢＡＥベーターＰＡＩでアフィニティー
精製した抗血清；及びレーンＦ、λｇt11 溶原体由来の
Ｍr １５０〜２００キロダルトンのタンパク質でアフィ
ニティー精製した抗血清、でそれぞれ行った。オートラ
ジオグラムは、１６時間露光で行った。
【図２１】誘導した大腸菌溶原体由来の抽出物中のイン
ヒビター活性の分析を示す写真である。溶原性大腸菌株
由来の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、そしてｕ−
ＰＡ（レーンＡ〜Ｃ）を用いたリバース・フィブリン・
オートグラフィー（ＲＦＡ）及びウエスタン・ブロッテ
ィングと、ひきつづくオートラジオグラフィー（レーン
Ｄ〜Ｆ）により分析した。レーンＡ及びＤは、精製した
ウシ・ベーターＰＡＩ３００ｎg を含む。レーンＢ及び
Ｅは、λ9.２による溶原性株由来の抽出物５０μl を含
む。レーンＣ及びＦは、λｇt11 による溶原性株由来の
抽出物５０μl を含む。レーンＤのオートラジオグラム
は１６時間露光、一方、レーンＥ及びＦのものは、２週
間露光で行った。
【図２２】λ３のｃＤＮＡ挿入物の完全なヌクレオチド
配列を示している。コード鎖のヌクレオチド配列及び、
それに対応する予想されるアミノ酸配列を示した。左に
示した数字はヌクレオチドの位置を示し、右の数字はア
ミノ酸残基の位置を示す。番号１のバリンは、コードさ
れたベーターＰＡＩタンパク質のアミノ末端であり、成
熟したタンパク質に対応するアミノ酸残基は、１〜３７
９番である。シグナルペプチド領域に対応するアミノ酸
残基配列は、逆方向のマイナス番号で表わしてある。
【図２３】ベーターＰＡＩ mＲＮＡの検出を示すオート
ラジオグラフの写真である。フィブロザルコーマ細胞系
列ＨＴ１０８０由来の全ＲＮＡを単離し、ホルムアミド
存在下アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロー
スへのブロッティングの後、32Ｐ標識したλ３ｃＤＮＡ
をハイブリダイズした。左側のマーカーとして、Ｈind
III 消化したλＤＮＡを用いた。真核性２８Ｓ及び１８
ＳリボゾームＲＮＡの相対移動度を示した。
【図２４】ベーターＰＡＩ、アルファーアンチトリプシ
ン（アルファ1 ＡＴ）、及びアンチトロンビン III（Ａ
Ｔ III) の比較のため、提唱されているアミノ酸残基配
列の一部を提供している。反応中心付近の、ベーターＰ
ＡＩ、アルファ1 ＡＴ及びＡＴ IIIの配列は、一文字ア
ミノ酸残基記号を用い、“ファースト・プロテイン・ホ
モロジー・プログラム”（リップマン (Lipman) 等（１
９８５）、サイエンス (Science)、２２７巻、１４３５
−１４４１頁）に従って整列させた。反応部位のペプチ
ドボンドを縦線で示し、Ｐ1 −Ｐ′1 反応部位残基の用
語は、トラビス (Travis) 及びサルベセン (Salresen)
（（１９８３）アニュアル・レヴュー・オブ・バイオケ
ミストリー (Ann. Rev. Biochem.) ５２巻、６５５−７
０９頁）のものを採用した。反応部位のメチオニンを下
線で示し、ベーターＰＡＩのものと相同的なアルファ1
−ＡＴ及びＡＴ IIIのアミノ酸残基をボックスで示し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ニュー トール スウェーデン国 エス−90187 ウメア ルードユールスヴァーゲン 11 (72)発明者 ソーデイ マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037ラ ジョラ リージェンツ ロード 9232シー

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドであり、かつグリコシル化されていないことを特徴と
    する、実質的に純粋なヒト内皮プラスミノーゲン活性化
    因子インヒビター。 【化１】
  2. 【請求項２】 SDS-PAGE分析において、１８０キロダル
    トンの見かけ相対分子量を示す融合ポリペプチドであ
    る、請求項１記載のインヒビター。
  3. 【請求項３】 SDS-PAGE分析において、４０キロダルト
    ンの見かけ相対分子量を示す、請求項１記載のインヒビ
    ター。
  4. 【請求項４】 被分析試料における内皮プラスミノーゲ
    ン活性化因子インヒビターの存在を検出するための固相
    分析方法であって、以下の工程： (1) プロテアーゼネキシン及び胎盤プラスミノーゲン活
    性化因子と免疫的に異なる組織型プラスミノーゲン活性
    化因子及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
    の両方の活性を阻害する実質的に純粋な組換えヒト内皮
    プラスミノーゲン活性化因子インヒビターを固定化した
    固体マトリックスを含む固相サポートを準備する工程、 (2) 分析すべき被分析試料の部分標本を、前記固相サポ
    ートの前記組換えヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子
    インヒビター及び分析すべき被分析インヒビターの両方
    に結合する所定量の結合試薬と混合し、混合物を形成す
    る工程、 (3) 前記結合試薬が被分析試料中に存在する被分析イン
    ヒビターと結合するのに十分な時間、生物学的検定条件
    下で前記混合物を維持する工程、 (4) 前記混合物を前記固相サポートと混合し、固液相混
    合物を調製する工程、 (5) 前記被分析インヒビターと結合しなかった前記混合
    物中の前記結合試薬が前記固相サポートの前記組換えヒ
    ト内皮プラスミノーゲン活性化因子インヒビターと結合
    するのに十分な所定の時間、生物学的検定条件下で、前
    記固液相混合物を維持する工程、 (6) 固相及び液相を分離する工程、及び (7) 前記固相サポートの前記組換えヒト内皮プラスミノ
    ーゲン活性化因子インヒビターに結合した前記結合試薬
    の量を測定する工程、を含むことを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 前記結合試薬が抗体である請求項４記載
    の方法。
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