JPH09132599A

JPH09132599A - ヒト癌胎児性抗原蛋白質及びその製造方法

Info

Publication number: JPH09132599A
Application number: JP8221770A
Authority: JP
Inventors: Shinzo Oikawa; 信三及川; Hiroshi Nakazato; 紘中里
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1996-08-05
Filing date: 1996-08-05
Publication date: 1997-05-20

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子を提供
し、該遺伝子を用いる蛋白質の製造方法および該方法に
より製造されたＣＥＡ蛋白質を提供する。【解決手段】配列番号１の第１番目から第６６８番目
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断
片を含有するプラスミドで形質転換された微生物または
動物細胞を培養して得られる、ヒト癌胎児性抗原活性を
有する蛋白質の少なくとも特異的抗原性部分を有する蛋
白質、およびその製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒトの癌胎児性抗原
（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅ
ｎ；以下ヒトＣＥＡと略す）蛋白質および該蛋白質をコ
ードする遺伝子を用いる該蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は１９６５年，
ゴールド（Ｇｏｌｄ）およびフリードマン（Ｆｒｅｅｄ
ｍａｎ）により、ヒト結腸癌と２〜６ケ月齡胎児消化器
に共通に存在する抗原として発見され（Ｇｏｌｄ，Ｐ．
およびＦｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｏ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１２１，４３９，１９６５；Ｇｏｌｄ，Ｐ．およ
びＦｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｏ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１２２，４６７，１９６５）、当初は大腸癌に特
異的な抗原として注目された。その後の研究により、血
中のＣＥＡは大腸癌患者で高率に出現する傾向は有る
が、他の癌でも陽性になり、また、良性疾患でも時に陽
性となり、正常人でもごく微量検出されることが知られ
ている。現在ではＣＥＡは広く癌に随伴して出現する物
質と考えられ、腫瘍の早期発見などのために、臨床検査
で最も広く用いられる腫瘍マーカーである。

【０００３】しかしながら、ＣＥＡを腫瘍マーカーとし
て用いる際の重大な問題として、正常組織にも存在する
ＣＥＡ関連抗原の存在がある。ＣＥＡ関連抗原とは、蛋
白化学的にＣＥＡにきわめて類似しており，免疫学的に
も通常の抗ＣＥＡ抗体ではＣＥＡと区別出来ないような
共通の抗原決定基を有していると考えられる抗原の総称
である。代表的なＣＥＡ関連抗原としては、正常人の肺
や脾臓中に見出されている分子量約９万の糖蛋白質であ
る非特異的交差抗原（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓ
ｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ：以下、ＮＣＡ
と略す）が知られている（ｖｏｎＫｌｅｉｓｔ，Ｓ．
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
６９，２４９２，１９７２）。ＮＣＡのアミノ酸組成は
ＣＥＡのそれに類似しているが、ＣＥＡには少ないメチ
オニンをＮＣＡでは比較的多く含んでいる。Ｎ末端アミ
ノ酸配列の比較によれば、２１番目のバリンがアラニン
に置換されていること以外は、２４番目までＣＥＡと同
一である（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２４９２，１９
７２）。その他にも、胎児の便中に見出されたＮＣＡ−
２（Ｂｕｒｔｉｎ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１
１１，１９２６，１９７３）、正常成人便中に発見され
たＮＦＡ（ｎｏｒｍａｌｆｅｃａｌａｎｔｉｇｅ
ｎ）（Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｙ．ら，Ｇａｎｎ，６４，２
０３，１９７３）などがある。ＮＦＡは３つの分子種か
らなり、それぞれＮＦＡ−１、ＮＦＡ−２およびＮＦＣ
Ａ（ｎｏｒｍａｌｆｅｃａｌｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃ
ｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ）と名付けられているが、い
ずれもその構造や物理化学的性質などは明らかにされて
いない（Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．ら，ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．，４１，７１３，１９８１）。

【０００４】従って、現在ＣＥＡの測定のため、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）またはエンザイムイムノアッ
セイ（ＥＩＡ）などの種々の測定キットが報告され、市
販もされているが、これらのキットはＣＥＡだけでな
く、ＣＥＡ関連抗原とも反応を示すという問題がある。
つまり、現在ＣＥＡ測定に使用される抗体は、ＣＥＡと
ＣＥＡ関連抗原の共通の抗原部分を認識するものである
ため、両者を区別して測定出来ないという欠点がある。
さらに、従来のキットで同一ＣＥＡ検体を測定した場
合、キット間でその測定値が異なるという問題も提起さ
れている（Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６０，２２１，１９８３）。

【０００５】上記の問題を解消し、ＣＥＡのみを特異的
に測定する方法を開発するためには、ＣＥＡの構造を解
明し、特異性の高い抗体を製造することが要望される。
しかしながら、ＣＥＡは分子量１８万〜２０万の糖蛋白
質で、重量あたり４０〜６０％の糖を含むとされてい
る。そのため、その糖含量の高さがＣＥＡの構造解析を
困難にしており、アミノ酸配列はＮ末端から２４番目ま
でが明らかにされているにすぎない（Ｇｌａｓｍａｎ，
Ｊ．Ｎ．Ｓ．ら，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，８５，２０９，１
９７８およびＴｅｒｒｙ，Ｗ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．，１３６，２００，１９７２）。また、その糖鎖
構造に関しては、殆ど解明されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＣＥＡにのみ特異的に
反応する抗体を得るためには、ＣＥＡおよびＣＥＡ関連
抗原の構造（アミノ酸配列）を明らかにし、それらの一
次構造の差異を見出す必要がある。そこで、本発明者ら
はヒトＣＥＡ遺伝子をクローニングし、そのＤＮＡ塩基
配列を決定することにより、ヒトＣＥＡの全アミノ酸配
列を明らかにするため、鋭意研究を行った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らはヒトＣＥＡ
遺伝子をクローニングするため、大腸癌患者の大腸組織
より抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを
作製し、そこからＣＥＡの遺伝子を単離・同定し、さら
にその塩基配列を解析・決定した。この解明された塩基
配列をもとに、ヒトＣＥＡの全構造を明らかにし、本発
明を完成するにいたった。

【０００８】本発明のヒトＣＥＡ蛋白質をコードする遺
伝子は次のようにして得ることが出来る。先ず、癌患者
の組織細胞、好ましくはヒト大腸癌患者の大腸組織が産
生するｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを調製
する。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、公知の適当な方
法で行ってよいが、例えばλgt１１ファージベクターを
用いたヤングらの方法（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１
１９４，１９８３）によって行うことが出来る。その概
要を第１図に示す。こうして調製されたｃＤＮＡライブ
ラリー（大腸菌）からの目的とするクローン（ヒトＣＥ
Ａ蛋白質を発現するクローン）のスクリーニングは、既
存（例えば市販品）の抗ＣＥＡ抗体を用いて行うことが
できる。即ち、調製されたｃＤＮＡライブラリーの発現
する蛋白質と該抗ＣＥＡ抗体との反応の有無を調べれば
よい。上記大腸菌でのヒトＣＥＡ蛋白質の発現は、ＣＥ
Ａ蛋白質そのものを発現させてもよいが、ＣＥＡ蛋白質
と他の蛋白質、好ましくは大腸菌β−ガラクトシダーゼ
との融合蛋白質として発現させてもよい。この場合、β
−ガラクトシダーゼの活性を一つの指標として用いるこ
とができる。

【０００９】次に、上記のようにしてスクリーニングさ
れた陽性クローン（大腸菌）から、ファージＤＮＡを常
法により分離し、制限酵素解析により、目的とするｃＤ
ＮＡ（ヒトＣＥＡのｃＤＮＡ）が該ファージＤＮＡ中に
挿入されているかどうかを確認し、その挿入ｃＤＮＡの
塩基配列を常法により決定する。もし、充分な大きさの
ｃＤＮＡが挿入された陽性クローンが得られない場合
は、別々の陽性クローンから得られるｃＤＮＡを結合し
て、目的とする大きさのｃＤＮＡを作製するか、あるい
は新たにｃＤＮＡライブラリーを作製し、上記で得られ
た不充分な大きさのｃＤＮＡをプローブとして、前記の
方法で目的とするクローンをスクリーニングする。後者
の場合のｃＤＮＡライブラリーの調製は、公知の適当な
方法で行ってよいが、例えばヒトの癌患者の組織細胞
（好ましくは大腸癌患者の組織細胞）より抽出したｍＲ
ＮＡを蔗糖密度勾配遠心で調製した約２ｋｂ〜５ｋｂ相
当のｍＲＮＡから岡山−バーク法を用いて作製すること
が出来る。

【００１０】次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡ
の塩基配列を、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの方法で決
定し、既に報告されているＣＥＡのＮ末端から２４番目
のアミノ酸配列に相当する翻訳可能領域（オープンリー
ディング領域）を、その塩基配列から求めることにより
ヒトＣＥＡ遺伝子ならびにヒトＣＥＡ蛋白質の構造（ア
ミノ酸配列）を知ることができる。こうして塩基配列が
判明したヒトＣＥＡ遺伝子は、化学的に合成することに
よっても得ることができる。

【００１１】さらに上記のようにして得られるヒトＣＥ
Ａ遺伝子を用いて、大腸菌や酵母のような微生物あるい
は動物細胞でヒトＣＥＡ蛋白質を製造することが可能で
ある。即ち、上で得られたヒトＣＥＡの構造遺伝子の
５’側に適当なプロモーター領域を付加し、これを適当
なプラスミドに挿入したのち、これを大腸菌や酵母のよ
うな微生物あるいは動物細胞に導入して、培養すればよ
い。このような操作は公知の技術を用いて行うことがで
きる。

【００１２】また、上記のＣＥＡ遺伝子の断片（化学的
に合成してもよい）を用いることにより、不要なペプチ
ド領域、例えばＣＥＡ関連抗原と共通するペプチドを除
いた、特異的な抗原ペプチドを微生物や動物細胞で製造
することも可能である。そして、これらのペプチドを抗
原として、ヒトＣＥＡにのみ特異的に反応するポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗体を常法により作るこ
とができる。

【００１３】

【実施例】以下、本発明を実施例をもってさらに詳しく
説明する。実施例 (1) λgt１１ベクターによるｃＤＮＡライブラリーの作
製大腸癌患者の大腸組織１．３ｇから、シャーグウィン
（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，１８，５２９４，１９７９）に従い、４Ｍグア
ニジウムチオシアネートを用いて、１．３７ｍｇのＲＮ
Ａを抽出した。次に８６０μｇの全ＲＮＡより０．５Ｍ
ＬｉＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを含
む１０ｍＭトリス塩酸（pH７．２）を結合バッフアーと
して用いオリゴｄＴセルロースに結合したポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）７２μｇを分離した（Ｎａｋａｚａ
ｔｏ，Ｈ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２９，４３
１，１９７４）。続いて、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ１０μｇ
と０．２５μｇのオリゴ（ｄＴ）_12-18 をプライマーと
して用いて作製したｃＤＮＡをλgt１１ベクターに組み
込み、ｃＤＮＡライブラリーを作製した（Ｙｏｕｎｇ，
Ｒ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８０，１１９４，１９８３）。ポリ（Ａ）⁺ Ｒ
ＮＡ１μｇあたり、約４８，５００個の組み換えファー
ジプラーク（ｃＤＮＡライブラリー）が得られた。尚、
上記λgt１１ベクターによるｃＤＮＡライブラリーの調
製法の概略を第１図に示す。 (2) 抗体スクリーニングによる陽性クローンの分離と解
析抗体スクリーニングは、バイオラッド社から市販されて
いるキット（Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｂｌｏｔ^TM Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔ）を用いて、次の方法で行った。

【００１４】前記(1) で得られた約３０万個のファージ
プラークのプレート上に、１０ｍＭＩＰＴＧをしみこま
せ、風乾したニトロセルロースフィルターをのせ、挿入
されたｃＤＮＡからの遺伝子産物（即ちβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白質）を誘導した。約２時間後にフィ
ルターをプレートからはがし、ＴＢＳ溶液（２０ｍＭト
リス塩酸，pH７．５，５００ｍＭＮａＣｌ）中で５分
間緩やかに振とうした。次にフィルターをブロッキング
溶液（３％ゼラチンを含むＴＢＳ溶液）中で２０〜３０
分間緩やかに振とうした。次に２回Ｔ−ＴＢＳ溶液
（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ溶液）中で
５分間緩やかに振とうすることによりフィルターを洗浄
した。

【００１５】このフィルターをひき続いて一次抗体溶液
にひたし、終夜ゆるやかに振とうした。なお、一次抗体
溶液とは、抗ＣＥＡ抗体（一次抗体）を１／５００容、
１％大腸菌抽出液（バイオラッド社、カタログＮｏ．１
７０−３２０５）を１／２００容および１％ゼラチン
（バイオラッド社、カタログＮｏ．１７０−６５３７）
を含むＴ−ＴＢＳ溶液をいう。一次抗体としては、ダコ
社のウサギ抗ＣＥＡ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ、デンマ
ーク、コードＡ１１５）を用いた。

【００１６】次にフィルターを２回、Ｔ−ＴＢＳ溶液中
で５分間緩やかに振とうしたのち、二次抗体溶液にひた
し、２時間緩やかに振とうした。二次抗体溶液は、ペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（バイオラッド
社、カタログＮｏ．１７０−６５１３）を１／３０００
容および１％ゼラチンを含むＴ−ＴＢＳ溶液を使用し
た。

【００１７】続いて、フィルターを２回Ｔ−ＴＢＳ溶液
中で５分間緩やかに振とうしたのち、発色溶液にひた
し、１０分間緩やかに振とうした。発色溶液とは、５０
ｍｇのＨＲＰ発色試薬（バイオラッド社、カタログＮ
ｏ．１７０−３２０１）を１６．５mlの冷メタノールに
溶かした液と、３０％Ｈ₂ Ｏ₂ （過酸化水素）５０μl
を含む８３．５mlのＴＢＳ溶液を使用直前に混合した溶
液である。

【００１８】上記の操作で紫色に発色した陽性クローン
が１個得られた。λＫｒ４０と名づけたこのファージＤ
ＮＡを常法に従い分離し、挿入ＤＮＡの両端に付された
制限酵素ＥｃｏＲ１部位で切断して得られるｃＤＮＡ断
片（約２．４ｋｂ）をｐＢＲ３２２にサブクローニング
した。得られたプラスミドｐＢＲＣＥＡ５について、挿
入されたｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。

【００１９】挿入ＤＮＡ領域の塩基配列決定に用いた制
限酵素切断部位と塩基配列決定のストラテジーを第２図
に示す。図中、ＰｖはＰｖｕII、ＰｓはＰｓｔＩ、Ｓは
ＳａｃＩ、ＢはＢａｍＨＩ、ＨｃはＨｉｎｃIIの各制限
酵素を示し、上段の数字は５’末端からの塩基数を示
す。空白の長方形部分は翻訳可能領域のうち成熟ヒトＣ
ＥＡをコードする領域、その左の横線を施した長方形部
分は先導ペプチド（シグナルペプチド）をコードする領
域を示す。図中、塩基配列の決定の方向は矢印で示され
る。塩基配列決定のストラテジーは、デイルらの方法
（Ｒ．Ｍ．Ｋ．Ｄａｌｅら，Ｐｌａｓｍｉｄｓ，１３，
３１，１９８５）およびサンガーらの方法（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６
３，１９７７）を用いた。λＫｒ４０では実線はデイル
らの方法、点線は制限酵素断片をＭ１３に挿入したのち
サンガーの方法により塩基配列を決定した事を示し、後
述するｐＣＥＡ５５−２とｐＣＥＡ８０−１１では、縦
線からの矢印線（│→）は制限酵素断片をｐＵＣ９に挿
入した後サンガーの方法で、四角形からの矢印（□→）
は四角形で示される各位置に対応する合成オリゴヌクレ
オチドをプライマーとしたサンガーの方法により各々塩
基配列を決定したことを示す。

【００２０】λＫｒ４０の挿入ＤＮＡは２３５６塩基よ
りなり、そのＤＮＡ配列には５３１個のアミノ酸をコー
ドしうる長い翻訳可能配列（オープンリーディングフレ
ーム）が存在していた（配列番号１の塩基配列第５００
番から第２８５５番）。しかし、Ｎ末端アミノ酸である
メチオニンのコドンであるＡＴＧが見られず、Ｎ末端側
のアミノ酸がいくつか欠失していることが判明した。 (3) 種々の抗ＣＥＡ抗体を用いた解析前記で得られたｃＤＮＡが、ＣＥＡの遺伝子の主要部分
を含むことを確認するため、該ｃＤＮＡを含むファージ
λＫｒ４０を使って、上記(2) と同じ方法で、種々の市
販の抗ＣＥＡ抗体（一次抗体）との反応性を検討した。
使用した抗ＣＥＡ抗体は、スクリーニングに使用したＤ
ＡＫＯＰＡＴＴＳ社のウサギ抗ＣＥＡ抗体（コードＡ１
１５）の他に、マイルズ社ヒツジ抗ＣＥＡ抗体（ＮＣＡ
II吸収、コードＮｏ．６４７３３１）、セロテック
社ヒツジ抗ＣＥＡ抗体（コードＮｏ．ＡＨＰ１０５Ａ）
およびセロテック社ヒツジ抗ＣＥＡ抗体（ＮＣＡ吸収、
コードＮｏ．ＡＨＰ１０５Ｂ）である。なお、二次抗体
としてはＫＰＬ社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒ
ｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）のペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ヒツジ抗体（カタログＮｏ．０
４２３０６）を用いた。これらの一次抗体および二
次抗体は、いずれも１／５００希釈して使用した。コン
トロールには非免疫ヒツジ抗体（ＮｏｎＩｍｍｕｎｅ
Ｓｅｒｕｍ）を用いた。

【００２１】この抗ＣＥＡ抗体を用いた解析結果を第３
図に示す。図中、１はλＫｒ４０クローン、２はｃＤＮ
Ａが挿入されていないλgt１１を含むクローン（コント
ロール）の各抗体との反応結果を示し、ＡはＤＡＫＯＰ
ＡＴＴＳ社のウサギ抗ＣＥＡ抗体、Ｂはマイルズ社のヒ
ツジ抗ＣＥＡ抗体、ＣおよびＤはセロテック社のヒツジ
抗ＣＥＡ抗体、Ｅは非免疫ヒツジ抗体との反応性を各々
示す。図中、黒く大きな斑点のあるものは反応が陽性で
あったことを意味する。図から明らかなとおり、λＫｒ
４０は抗ＣＥＡ抗体のいずれとも反応を示し、非免疫ヒ
ツジ抗体とは反応しなかった。ｃＤＮＡが挿入されてい
ないファージクローンλgt１１は抗ＣＥＡ抗体とは全く
反応しなかった。このように、λＫｒ４０がＮＣＡIIで
吸収したマイルズ社の抗ＣＥＡ抗体およびＮＣＡで吸収
したセロテック社の抗ＣＥＡ抗体のいずれとも反応する
ことは、λＫｒ４０がＣＥＡ蛋白質を発現していること
を示すものである。しかし、前記のとおりλＫｒ４０に
は完全な大きさのヒトＣＥＡｃＤＮＡ挿入されていない
と考えられたので、下記(4) および(5) に示すように、
完全なｃＤＮＡを得るための検討を行った。 (4) 岡山−バーク法によるｃＤＮＡライブラリーの作製前記(1) と同じ大腸癌患者の大腸組織より抽出して得ら
れた、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ２０μｇに、キャリアーとし
てマウスリボソームＲＮＡ５０μｇを加え、１５％−３
０％の蔗糖密度勾配遠心にかけ、サイズ分画した。続い
て、岡山−バーク法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
２，１６１，１９８２）に従い、分画した２〜５kbのポ
リ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）８．２５μｇと０．５１
μｇのベクタープライマーＤＮＡを用いることにより、
ｃＤＮＡライブラリー（プラスミド）を作製し、大腸菌
ＤＨ１株を形質転換した。形質転換株は、５０γ／mlの
アンピシリンを含むＬＢ−寒天培地にプレーティング
し、約７，０００個のアンピシリン耐性を示す形質転換
株を得た。 (5) ＣＥＡｃＤＮＡクローンの同定前記(4) で得られた約７，０００個のコロニーをニトロ
セルロースフィルターにレプリカし、フィルター上に移
されたコロニーを０．５ＮＮａＯＨで溶菌した後、pH
７．０に中和し、フィルターを１．５ＭＮａＣｌを含
む０．５Ｍトリス塩酸バッファー（pH７．０）と３×Ｓ
ＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナ
トリウム）に各々５分間浸した。最後にペーパータオル
で菌の破片を除き、風乾した後、８０℃で２時間ベーキ
ングした。

【００２２】続いて先に取得したλＫｒ４０クローンの
ＰｖｕII５３４ｂｐフラグメント（配列番号１の５６５
番から１０９８番までのフラグメントと１０９９番目か
ら１６３２番目までのフラグメントの混合物）をα−³²
Ｐ−ｄＣＴＰを用いてラベルし、これをプローブとして
上記フィルターに固定化されたＤＮＡ分子とのハイブリ
ダイゼーションを行った（Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｉ．ら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，
１５８５，１９８５）。用いたプローブの比活性は２．
３×１０⁸ ｃｐｍ／μｇＤＮＡであり、５×１０⁵ ｃｐ
ｍ／mlの濃度でハイブリダイゼーションに用いた。ハイ
ブリダイゼーションは、１×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ）溶液（０．２％ＢＳＡ（アーマー社）、０．
２％フィコール（シグマ社）および０．２％ポリビニル
ピロリドン（和光純薬社）からなる）、０．１％ＳＤＳ
および５０γ／mlのサケ精巣ＤＮＡ（ファルマシアＰＬ
社）を含む３×ＳＳＣ中で、６５℃で１６時間行った。
次にフィルターを０．１％ＳＤＳを含む３×ＳＳＣによ
り、６５℃洗浄し、風乾したのちＸ線フィルムに感光さ
せた。この操作で８個の陽性クローンを得た。８クロー
ンのプラスミドＤＮＡを常法に従い分離し、制限酵素切
断によるＤＮＡ断片の解析を行った。その結果４クロー
ン（ｐＣＥＡ５２、ｐＣＥＡ５５−１１、ｐＣＥＡ５５
−２、ｐＣＥＡ８０−１１）が先に取得したλＫｒ４０
よりも５’側に伸長したクローンであることが判明し
た。また、はじめの３クローン（ｐＣＥＡ５２、ｐＣＥ
Ａ５５−１１、ｐＣＥＡ５５−２）は制限酵素解析の結
果同一クローンであると考えられたので、ｐＣＥＡ５５
−２とｐＣＥＡ８０−１１の二つのクローンについて、
挿入されたｃＤＮＡの５’側伸長領域の塩基配列を決定
した。

【００２３】塩基配列決定に利用した制限酵素切断部位
と塩基配列決定のストラテジーを第２図に示し、配列番
号１にヒトＣＥＡの遺伝子の全配列を含むｐＣＥＡ８０
−１１に挿入されたＤＮＡの塩基配列およびその塩基配
列に対応するアミノ酸配列を示す。第２図中、塩基配列
決定の方向は矢印で示される。塩基配列はサンガーらの
方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，５４６３，１９７７）を用いて決定した。上
記塩基配列決定の結果、両者の５’側伸長領域の塩基配
列は５’末側の長さが異なること以外完全に一致した
（ｐＣＥＡ５５−２はｐＣＥＡ８０−１１より５’末側
が８塩基短い）。また、先に取得したクローンλＫｒ４
０とは、塩基配列を決定した領域（１２１塩基）につい
てはその塩基配列が完全に一致した（配列番号１の４９
９番目から６１９番目まで）。なお、ｐＣＥＡ８０−１
１クローン（ＤＨ１／ｐＣＥＡ８０−１１）はＳＢＭ２
８９と命名され、微工研にＦＥＲＭＰ−９１１９の寄
託番号で寄託されている。

【００２４】決定されたＤＮＡの配列には開始コドンＡ
ＴＧは見られないが、５’末端から開始してＴＡＧ（配
列番号１の２０９５−２０９７）で終わる長い翻訳可能
配列（オープンリーディングフレーム）が存在し、６９
８個のアミノ酸をコードできる配列であることが明らか
になった。

【００２５】配列番号１において、Ｓｅｒ（−３０）か
ら始まり、Ａｌａ（−１）で終わる−３０→−１のアミ
ノ酸配列はその構造からシグナルペプチドの一部に相当
すると考えられる。従って、ヒトＣＥＡの構造遺伝子は
Ｌｙｓ（１）から開始する。事実、Ｌｙｓから２４番目
のＬｅｕ迄の１−２４のアミノ酸配列は既に報告されて
いるＣＥＡのＮ末端のアミノ酸配列（Ｊ．Ｎ．Ｓ．Ｇｌ
ａｓｓｍａｎら，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，８５，２０９，１
９７８）と完全に一致した。但し、同著者らが報告して
いる２５番目から３０番目までのアミノ酸配列はｃＤＮ
Ａから予想されるアミノ酸配列と全く一致していない。
また、ＣＥＡのトリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列
を示した文献（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，３
８，２１９９，１９７８）には、当該ｃＤＮＡから予想
されるアミノ酸配列に該当する配列は見当たらない。

【００２６】以上の解析結果、特にλＫｒ４０クローン
が４種類の抗ＣＥＡ抗体と反応することを考慮して、得
られたｃＤＮＡはヒトＣＥＡをコードするｃＤＮＡであ
ると判断した。

【００２７】これらの結果から、ヒトＣＥＡは少なくと
も６９８個のアミノ酸からなる前駆体として生合成さ
れ、小胞体膜を通過する際、少なくとも３０個のアミノ
酸からなるシグナルペプチドが除かれて６６８個のアミ
ノ酸からなる成熟蛋白質としてＣＥＡが生成されると考
えられる。また、Ｃ末端の２６個のアミノ酸は疎水性に
富んでおり、この領域が細胞膜に埋もれていて、Ｎ末端
側の６４２個のアミノ酸は細胞外に出ていると考えられ
る。従って、Ｃ末端部分のアミノ酸配列を除去したヒト
ＣＥＡを使用して、臨床試験に役立つヒトＣＥＡ特異抗
体を製造することも可能であろう。

【００２８】

【発明の効果】

(1) 本発明の遺伝子を使用してヒトＣＥＡまたは種々の
ＣＥＡフラグメントを細胞（大腸菌、酵母、動物細胞
等）で発現させ、それらに対する抗体を作製することが
出来る。それにより、ヒトＣＥＡにのみ反応し、ＣＥＡ
関連抗原とは反応しない抗体を見つけることが可能であ
る。あるいは、本発明で解明されたヒトＣＥＡのペプチ
ド配列から、合成法で種々のＣＥＡフラグメントを作製
して、同様にヒトＣＥＡ特異的抗体を得ることも可能で
ある。こうして得られる抗体を使用すれば、従来よりも
信頼度の高いヒトＣＥＡ測定キットを作製できる。 (2) 本発明で得られたヒトＣＥＡ遺伝子を用いれば、従
来の抗体を用いた免疫組織化学的手段に代えて、ヒトＣ
ＥＡを産生する腫瘍等の組織を、インスイトゥー（ｉｎ
ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションによって、検出す
ることも可能と考えられる。 (3) 本発明のヒトＣＥＡ遺伝子をプローブとして、ＣＥ
Ａ関連抗原の遺伝子をクローニングすることも可能であ
る。それらの遺伝子がクローニングされ、その結果アミ
ノ酸配列が明らかになれば、ＣＥＡとＣＥＡ関連抗原と
の差異もより明確になると思われる。 (4) 前記のとおり、本発明によりヒトＣＥＡ特異抗体の
作製が可能となったため、癌診断、例えば癌のスクリー
ニング、確定診断、癌進行度判定、治療のモニタリン
グ、標識抗ＣＥＡ抗体による癌の局在診断が可能とな
り、加えてミサイル療法などの治療にも利用することが
期待される。以上のように本発明の利用分野は多岐にわ
たり、その利用価値は大きい。

【配列表】

【００２９】配列番号：1 配列の長さ：2928 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト配列 TCG GCC CCT CCC CAC AGA TGG TGC ATC CCC TGG CAG AGG CTC CTG CTC 48 Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu -30 -25 -20 -15 ACA GCC TCA CTT CTA ACC TTC TGG AAC CCG CCC ACC ACT GCC AAG CTC 96 Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr Thr Ala Lys Leu -10 -5 -1 1 ACT ATT GAA TCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG AAG GAG GTG CTT 144 Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu 5 10 15 CTA CTT GTC CAC AAT CTG CCC CAG CAT CTT TTT GGC TAC AGC TGG TAC 192 Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr 20 25 30 AAA GGT GAA AGA GTG GAT GGC AAC CGT CAA ATT ATA GGA TAT GTA ATA 240 Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr Val Ile 35 40 45 50 GGA ACT CAA CAA GCT ACC CCA GGG CCC GCA TAC AGT GGT CGA GAG ATA 288 Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg Glu Ile 55 60 65 ATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTG ATC CAG AAC ATC ATC CAG AAT GAC 336 Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp 70 75 80 ACA GGA TTC TAC ACC CTA CAC GTC ATA AAG TCA GAT CTT GTG AAT GAA 384 Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu 85 90 95 GAA GCA ACT GGC CAG TTC CGG GTA TAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC 432 Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser 100 105 110 ATC TCC AGC AAC AAC TCC AAA CCC GTG GAG GAC AAG GAT GCT GTG GCC 480 Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala 115 120 125 130 TTC ACC TGT GAA CCT GAG ACT CAG GAC GCA ACC TAC CTG TGG TGG GTA 528 Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val 135 140 145 AAC AAT CAG AGC CTC CCG GTC AGT CCC AGG CTG CAG CTG TCC AAT GGC 576 Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly 150 155 160 AAC AGG ACC CTC ACT CTA TTC AAT GTC ACA AGA AAT GAC ACA GCA AGC 624 Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr Ala Ser 165 170 175 TAC AAA TGT GAA ACC CAG AAC CCA GTG AGT GCC AGG CGC AGT GAT TCA 672 Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser 180 185 190 GTC ATC CTG AAT GTC CTC TAT GGC CCG GAT GCC CCC ACC ATT TCC CCT 720 Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro 195 200 205 210 CTA AAC ACA TCT TAC AGA TCA GGG GAA AAT CTG AAC CTC TCC TGC CAC 768 Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His 215 220 225 GCA GCC TCT AAC CCA CCT GCA CAG TAC TCT TGG TTT GTC AAT GGG ACT 816 Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr 230 235 240 TTC CAG CAA TCC ACC CAA GAG CTC TTT ATC CCC AAC ATC ACT GTG AAT 864 Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn 245 250 255 AAT AGT GGA TCC TAT ACG TGC CAA GCC CAT AAC TCA GAC ACT GGC CTC 912 Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr Gly Leu 260 265 270 AAT AGG ACC ACA GTC ACG ACG ATC ACA GTC TAT GCA GAG CCA CCC AAA 960 Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Glu Pro Pro Lys 275 280 285 290 CCC TTC ATC ACC AGC AAC AAC TCC AAC CCC GTG GAG GAT GAG GAT GCT 1008 Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala 295 300 305 GTA GCC TTA ACC TGT GAA CCT GAG ATT CAG AAC ACA ACC TAC CTG TGG 1056 Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp 310 315 320 TGG GTA AAT AAT CAG AGC CTC CCG GTC AGT CCC AGG CTG CAG CTG TCC 1104 Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 325 330 335 AAT GAC AAC AGG ACC CTC ACT CTA CTC AGT GTC ACA AGG AAT GAT GTA 1152 Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Val 340 345 350 GGA CCC TAT GAG TGT GGA ATC CAG AAC GAA TTA AGT GTT GAC CAC AGC 1200 Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp His Ser 355 360 365 370 GAC CCA GTC ATC CTG AAT GTC CTC TAT GGC CCA GAC GAC CCC ACC ATT 1248 Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro Thr Ile 375 380 385 TCC CCC TCA TAC ACC TAT TAC CGT CCA GGG GTG AAC CTC AGC CTC TCC 1296 Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser 390 395 400 TGC CAT GCA GCC TCT AAC CCA CCT GCA CAG TAT TCT TGG CTG ATT GAT 1344 Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asp 405 410 415 GGG AAC ATC CAG CAA CAC ACA CAA GAG CTC TTT ATC TCC AAC ATC ACT 1392 Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn Ile Thr 420 425 430 GAG AAG AAC AGC GGA CTC TAT ACC TGC CAG GCC AAT AAC TCA GCC AGT 1440 Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser Ala Ser 435 440 445 450 GGC CAC AGC AGG ACT ACA GTC AAG ACA ATC ACA GTC TCT GCG GAG CTG 1488 Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala Glu Leu 455 460 465 CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGC AAC AAC TCC AAA CCC GTG GAG GAC AAG 1536 Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys 470 475 480 GAT GCT GTG GCC TTC ACC TGT GAA CCT GAG GCT CAG AAC ACA ACC TAC 1584 Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr 485 490 495 CTG TGG TGG GTA AAT GGT CAG AGC CTC CCA GTC AGT CCC AGG CTG CAG 1632 Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 500 505 510 CTG TCC AAT GGC AAC AGG ACC CTC ACT CTA TTC AAT GTC ACA AGA AAT 1680 Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn 515 520 525 530 GAC GCA AGA GCC TAT GTA TGT GGA ATC CAG AAC TCA GTG AGT GCA AAC 1728 Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn 535 540 545 CGC AGT GAC CCA GTC ACC CTG GAT GTC CTC TAT GGG CCG GAC ACC CCC 1776 Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp Thr Pro 550 555 560 ATC ATT TCC CCC CCA GAC TCG TCT TAC CTT TCG GGA GCG AAC CTC AAC 1824 Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn 565 570 575 CTC TCC TGC CAC TCG GCC TCT AAC CCA TCC CCG CAG TAT TCT TGG CGT 1872 Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg 580 585 590 ATC AAT GGG ATA CCG CAG CAA CAC ACA CAA GTT CTC TTT ATC GCC AAA 1920 Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys 595 600 605 610 ATC ACG CCA AAT AAT AAC GGG ACC TAT GCC TGT TTT GTC TCT AAC TTG 1968 Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu 615 620 625 GCT ACT GGC CGC AAT AAT TCC ATA GTC AAG AGC ATC ACA GTC TCT GCA 2016 Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala 630 635 640 TCT GGA ACT TCT CCT GGT CTC TCA GCT GGG GCC ACT GTC GGC ATC ATG 2064 Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr Val Gly Ile Met 645 650 655 ATT GGA GTG CTG GTT GGG GTT GCT CTG ATA TAG 2097 Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile *** 660 665 668 CAGCCCTGGT GTAGTTTCTT CATTTCAGGA AGACTGACAG TTGTTTTGCT TCTTCCTTAA 2157 AGCATTTGCA ACAGCTACAG TCTAAAATTG CTTCTTTACC AAGGATATTT ACAGAAAAGA 2217 CTCTGACCAG AGATCGAGAC CATCCTAGCC AACATCGTGA AACCCCATCT CTACTAAAAA 2277 TACAAAAATG AGCTGGGCTT GGTGGCGCGC ACCTGTAGTC CCAGTTACTC GGGAGGCTGA 2337 GGCAGGAGAA TCGCTTGAAC CCGGGAGGTG GAGATTGCAG TGAGCCCAGA TCGCACCACT 2397 GCACTCCAGT CTGGCAACAG AGCAAGACTC CATCTCAAAA AGAAAAGAAA AGAAGACTCT 2457 GACCTGTACT CTTGAATACA AGTTTCTGAT ACCACTGCAC TGTCTGAGAA TTTCCAAAAC 2517 TTTAATGAAC TAACTGACAG CTTCATGAAA CTGTCCACCA AGATCAAGCA GAGAAAATAA 2577 TTAATTTCAT GGGACTAAAT GAACTAATGA GGATAATATT TTCATAATTT TTTATTTGAA 2637 ATTTTGCTGA TTCTTTAAAT GTCTTGTTTC CCAGATTTCA GGAAACTTTT TTTCTTTTAA 2697 GCTATCCACA GCTTACAGCA ATTTGATAAA ATATACTTTT GTGAACAAAA ATTGAGACAT 2757 TTACATTTTC TCCCTATGTG GTCGCTCCAG ACTTGGGAAA CTATTCATGA ATATTTATAT 2817 TGTATGGTAA TATAGTTATT GCACAAGTTC AATAAAAATC TGCTCTTTGT ATGACAGAAT 2877 ACATTTGAAA ACATTGGTTA TATTACCAAG ACTTTGACTA GAATGTCGTA T 2928

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、λgt１１ファージベクターを用いた
ｃＤＮＡライブラリー作製法の概略を示す図である。

【図２】第２図は、ｃＤＮＡの塩基配列決定のストラテ
ジーを示す図である。

【図３】第３図は、抗ＣＥＡ抗体を用いたλＫｒ４０ク
ローンおよびコントロールのＣＥＡ蛋白質産生能の解析
結果を示す写真である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列が次式II： X-Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr 35 40 45 Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125 Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175 Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser 180 185 190 Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220 Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn 225 230 235 240 Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255 Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr 260 265 270 Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Glu Pro 275 280 285 Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu 290 295 300 Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr 305 310 315 320 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 325 330 335 Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn 340 345 350 Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp 355 360 365 His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro 370 375 380 Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser 385 390 395 400 Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu 405 410 415 Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn 420 425 430 Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser 435 440 445 Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala 450 455 460 Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu 465 470 475 480 Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr 485 490 495 Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg 500 505 510 Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr 515 520 525 Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser 530 535 540 Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp 545 550 555 560 Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn 565 570 575 Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser 580 585 590 Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile 595 600 605 Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser 610 615 620 Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val 625 630 635 640 Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr Val Gly 645 650 655 Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile-COOH 660 665 (II) ( 式中、Ｘは水素原子、フォルミルメチオニン残基、ア
セチルメチオニン残基またはメチオニン残基を表す。）
で表されるヒト癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒ
ｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）蛋白質の少なくとも特異
的抗原性部分を有する蛋白質。
【請求項２】次式Ｉ： 5'AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG AAG GAG 48 GTG CTT CTA CTT GTC CAC AAT CTG CCC CAG CAT CTT TTT GGC TAC AGC 96 TGG TAC AAA GGT GAA AGA GTG GAT GGC AAC CGT CAA ATT ATA GGA TAT 144 GTA ATA GGA ACT CAA CAA GCT ACC CCA GGG CCC GCA TAC AGT GGT CGA 192 GAG ATA ATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTG ATC CAG AAC ATC ATC CAG 240 AAT GAC ACA GGA TTC TAC ACC CTA CAC GTC ATA AAG TCA GAT CTT GTG 288 AAT GAA GAA GCA ACT GGC CAG TTC CGG GTA TAC CCG GAG CTG CCC AAG 336 CCC TCC ATC TCC AGC AAC AAC TCC AAA CCC GTG GAG GAC AAG GAT GCT 384 GTG GCC TTC ACC TGT GAA CCT GAG ACT CAG GAC GCA ACC TAC CTG TGG 432 TGG GTA AAC AAT CAG AGC CTC CCG GTC AGT CCC AGG CTG CAG CTG TCC 480 AAT GGC AAC AGG ACC CTC ACT CTA TTC AAT GTC ACA AGA AAT GAC ACA 528 GCA AGC TAC AAA TGT GAA ACC CAG AAC CCA GTG AGT GCC AGG CGC AGT 576 GAT TCA GTC ATC CTG AAT GTC CTC TAT GGC CCG GAT GCC CCC ACC ATT 624 TCC CCT CTA AAC ACA TCT TAC AGA TCA GGG GAA AAT CTG AAC CTC TCC 672 TGC CAC GCA GCC TCT AAC CCA CCT GCA CAG TAC TCT TGG TTT GTC AAT 720 GGG ACT TTC CAG CAA TCC ACC CAA GAG CTC TTT ATC CCC AAC ATC ACT 768 GTG AAT AAT AGT GGA TCC TAT ACG TGC CAA GCC CAT AAC TCA GAC ACT 816 GGC CTC AAT AGG ACC ACA GTC ACG ACG ATC ACA GTC TAT GCA GAG CCA 864 CCC AAA CCC TTC ATC ACC AGC AAC AAC TCC AAC CCC GTG GAG GAT GAG 912 GAT GCT GTA GCC TTA ACC TGT GAA CCT GAG ATT CAG AAC ACA ACC TAC 960 CTG TGG TGG GTA AAT AAT CAG AGC CTC CCG GTC AGT CCC AGG CTG CAG 1008 CTG TCC AAT GAC AAC AGG ACC CTC ACT CTA CTC AGT GTC ACA AGG AAT 1056 GAT GTA GGA CCC TAT GAG TGT GGA ATC CAG AAC GAA TTA AGT GTT GAC 1104 CAC AGC GAC CCA GTC ATC CTG AAT GTC CTC TAT GGC CCA GAC GAC CCC 1152 ACC ATT TCC CCC TCA TAC ACC TAT TAC CGT CCA GGG GTG AAC CTC AGC 1200 CTC TCC TGC CAT GCA GCC TCT AAC CCA CCT GCA CAG TAT TCT TGG CTG 1248 ATT GAT GGG AAC ATC CAG CAA CAC ACA CAA GAG CTC TTT ATC TCC AAC 1296 ATC ACT GAG AAG AAC AGC GGA CTC TAT ACC TGC CAG GCC AAT AAC TCA 1344 GCC AGT GGC CAC AGC AGG ACT ACA GTC AAG ACA ATC ACA GTC TCT GCG 1392 GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGC AAC AAC TCC AAA CCC GTG GAG 1440 GAC AAG GAT GCT GTG GCC TTC ACC TGT GAA CCT GAG GCT CAG AAC ACA 1488 ACC TAC CTG TGG TGG GTA AAT GGT CAG AGC CTC CCA GTC AGT CCC AGG 1536 CTG CAG CTG TCC AAT GGC AAC AGG ACC CTC ACT CTA TTC AAT GTC ACA 1584 AGA AAT GAC GCA AGA GCC TAT GTA TGT GGA ATC CAG AAC TCA GTG AGT 1632 GCA AAC CGC AGT GAC CCA GTC ACC CTG GAT GTC CTC TAT GGG CCG GAC 1680 ACC CCC ATC ATT TCC CCC CCA GAC TCG TCT TAC CTT TCG GGA GCG AAC 1728 CTC AAC CTC TCC TGC CAC TCG GCC TCT AAC CCA TCC CCG CAG TAT TCT 1776 TGG CGT ATC AAT GGG ATA CCG CAG CAA CAC ACA CAA GTT CTC TTT ATC 1824 GCC AAA ATC ACG CCA AAT AAT AAC GGG ACC TAT GCC TGT TTT GTC TCT 1872 AAC TTG GCT ACT GGC CGC AAT AAT TCC ATA GTC AAG AGC ATC ACA GTC 1920 TCT GCA TCT GGA ACT TCT CCT GGT CTC TCA GCT GGG GCC ACT GTC GGC 1968 ATC ATG ATT GGA GTG CTG GTT GGG GTT GCT CTG ATA 3' 2004 (I) で表されるＤＮＡ配列がコードするヒトの癌胎児性抗原
蛋白質の少なくとも特異的抗原性部分をコードするＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ断片を含有するプラスミドで形質転
換された微生物または動物細胞を培養し、ヒト癌胎児性
抗原活性を有する蛋白質またはペプチドを製造する方
法。
【請求項３】プラスミドが、ｐＣＥＡ５５−２または
ｐＣＥＡ８０−１１である請求項２の方法。