JPH09136842A - 抗慢性関節リウマチ剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な抗慢性関節リウマチ剤を提供する。 【解決手段】 抗ヘルペスウイルス剤を有効成分として
用いる。好ましい態様では、抗ヘルペスウイルス剤とし
て、アシクロビル、ビダラビン、ガンシクロビルなどの
ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗慢性関節リウマ
チ剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチは、主に関節の滑膜な
どの結合組織に炎症を起こす全身性疾患である。この疾
患に対して抗炎症剤や免疫調節剤が対症治療的に使用さ
れているが、根本的な治療薬は未だない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な抗慢性関節リウマチ剤を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、慢性関節リウ
マチにエプスタイン・バール(Epstein-Barr)ウイルスが
直接的に関与しているという発見に基づいてなされたも
のであり、その要旨は、抗ヘルペスウイルス剤を有効成
分とする抗慢性関節リウマチ剤に存する。本発明の抗慢
性関節リウマチ剤は、エプスタイン・バールウイルスの
再活性化すなわち増殖を抑えることにより、慢性関節リ
ウマチの予防および治療に効果を発揮すると考えられ
る。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
エプスタイン・バールウイルス（以下、ＥＢＶとい
う。）は、ヘルペスウイルス科に属するウイルスであ
り、初感染後、ホストに潜在化することが知られてい
る。

【０００６】実際、本発明者らが、慢性関節リウマチ
（以下、ＲＡという。）患者および正常者の末梢血から
抽出したＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法によりＥＢＶ ＤＮＡを検出したところ、ＲＡ患
者（９例）および正常者（７例）ともほぼ全例が陽性で
あり、そのコピー数にも差が認められなかった。また、
ＲＡ患者および変形性関節炎（以下、ＯＡという。）患
者から採取した滑膜から抽出したＤＮＡについてＰＣＲ
法によりＥＢＶ ＤＮＡを検出したところ、ＲＡ患者で
７例中６例、ＯＡ患者で３例中２例が陽性であり、両者
の間に有意な差が認められなかった。

【０００７】本発明者らは、滑膜におけるＥＢＶ感染細
胞の特定をするため、その検出方法について鋭意検討し
た結果、ＥＢＶ・コード・スモールＲＮＡ（以下、ＥＢ
ＥＲという。）に対するプローブを用いるin situハイ
ブリダイゼーションを利用することにより、検出に成功
した。そして、この方法により、滑膜について分析した
ところ、ＲＡ患者では、３４例中８例においてＥＢＥＲ
が検出されたのに対し、ＯＡ患者（２０例）では検出さ
れなかった。

【０００８】上記のように、ＥＢＶ ＤＮＡ検出割合
が、ＲＡ患者およびＯＡ患者の間で大きく変わらないの
に対し、ＥＢＥＲの検出は、ＲＡ患者に限られているこ
とから、ＥＢＥＲの検出はＲＡに特異的であり、従っ
て、ＲＡにＥＢＶが直接関与していることが判明した。
この知見から、抗ヘルペスウイルス剤が抗ＲＡ剤として
有効であると判断される。なお、本明細書において「抗
ヘルペスウイルス剤」とは、ヘルペスウイルス群のウイ
ルスに対して活性を示す抗ウイルス剤を意味する。

【０００９】ＥＢＶのＤＮＡポリメラーゼを阻害してウ
イルスの複製を阻害することによりその活性化を防ぐこ
とは、ＲＡの根治的療法となる可能性がある。従って、
抗ヘルペス群ウイルス剤としては、ＤＮＡポリメラーゼ
阻害剤を使用することが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼ
阻害剤は、それ自体がＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有
するものに限られず、それから細胞内で誘導される物質
がＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を発揮するものも含むも
のである。

【００１０】ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の例としては、
アシクロビル（ゾビラックス（商標）、ビダラビン（ア
ラセナＡ（商標））およびガンシクロビル（デノシン
（商標））が挙げられる。

【００１１】本発明の抗慢性関節リウマチ剤の投与経
路、投与量などは、通常、有効成分をウイルス疾患に対
して用いる時と同様であり、当業者が容易に決定できる
ものである。

【００１２】また、上記のように滑膜でのＥＢＥＲの検
出がＲＡ患者に特異的であることから、試料として採取
された滑膜組織において、ＥＢＥＲに特異的なプローブ
を用いるin situハイブリダイゼーションによりＥＢＥ
Ｒを検出することにより、ＲＡを検知することができ
る。

【００１３】

【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
する。

【００１４】

【実施例１】＜ＥＢＶ ＤＮＡの検出＞ 末梢単核球および滑膜の検体はＲＡ患者および正常者か
ら次のようにして得た。末梢単核球は、末梢血をヘパリ
ン加採血し、ＬＳＭリンパ球分離液（オルガノンデュラ
ハム社製）を用いて比重遠沈を行い、得られた末梢単核
球層から分離した。滑膜は、人工関節置換術施行時に得
られた滑膜切片を使用した。

【００１５】このようにして得られた各検体をプロテイ
ナーゼＫ処理した後、フェノール抽出によりＤＮＡを得
た。得られたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。すなわ
ち、１μｇの得られたＤＮＡ、各５０ｐｍｏｌのプライ
マー（5'-GACGAGGGGCCAGGTACAGG（配列番号：１）およ
び5'-GCAGCCAATGCAACTTGGACGTTTTTGG（配列番号：
２）、B95-8ヌクレオチド番号はそれぞれ107956-107975
および108195-108168）、２単位のＴａｑポリメラーゼ
（宝酒造社製）および３５μｍｏｌのｄＮＴＰ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）に蒸留水を加え１００μｌとし
反応を行った。サーモサイクラーはアステック社のもの
を使用し、３７サイクル、熱変性：９５℃ ３０秒、ア
ニーリング：５８℃ ３０秒、合成反応：７２℃ １分
（最終合成反応：７２℃１０分）の条件で行った。プラ
イマーはインターナルリピート（ＩＲ３）のうちの２１
３塩基対の長さのＤＮＡを増幅できるように作成した。

【００１６】次いで、サザンブロット法によりＥＲＶ
ＤＮＡを検出した。すなわち、ＰＣＲ法によって増幅し
たＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロ
セルロース膜にトランスファーし、³²Ｐで標識した、Ｅ
ＢＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ｋ領域に特異的なプローブを
使用して検出した。

【００１７】その結果、末梢単核球については、ＲＡ患
者（９例）および正常者（７例）の全例（１６例）が陽
性であり、そのコピー数にも有意な差が認められなかっ
た。滑膜については、ＲＡ７例中６例、ＯＡ３例中２例
が陽性であった。

【００１８】なお、ＲＡ患者は、アメリカリウマチ学会
（ＡＣＲ、American Colleage of Rheumatology）の診
断基準によりＲＡと診断された。シュタインベルガー(S
teinberger)のＲＡステージ分類については、関節のＸ
線撮影により、ステージIIIまたはIVと判定された。ま
た、ＯＡ患者は、ＡＣＲの診断基準によりＯＡと診断さ
れた。

【００１９】

【実施例２】＜滑膜におけるＥＢＥＲの検出＞ 滑膜組織のパラフィン包埋ブロックを４〜５μｍの厚さ
で切り出し、３−アミノプロピルトリメチルシランをコ
ートしたスライドグラス上に固定しプレパラートを作成
した。症例数は、ＲＡ３４例およびＯＡ２０例であっ
た。in situハイブリダイゼーションは、ヤトロン社の
キットを使用し、アルカリフォスファターゼで標識し
た、ＥＢＥＲに特異的なプローブ（5'-AGCAGAGTCTGGGAA
GCAAACCACAGACACCGTCCTCACC（配列番号：３））を用
い、キット添付のマニュアルに従って行った。すなわ
ち、以下の手順によった。 (1)プレパラートをキシレンおよびエタノールに浸漬
し、ホルマリンで固定する。 (2)０．２Ｎ ＨＣｌで５分間処理し、内因性のアルカ
リフォスファターゼおよびプロテアーゼを失活させ、さ
らにエタノールに浸漬し、乾燥させる。 (3)プローブ溶液をのせ、１２〜１６時間放置する。 (4)４５℃洗浄液で４回洗浄後、発色基質のニトロブル
ーテトラゾリウム４−クロロ−５−ブロモインドリルフ
ォスフェート溶液をのせ暗所で１５時間反応させる。 (5)発色停止液に浸漬し、カバーグラスをのせ、封入剤
で封入する。 (6)４℃で保存し、１週間以内に顕微鏡で観察する。

【００２０】in situハイブリダイゼーションによりＲ
Ａ滑膜３４例中８例（２３．５％）でＥＢＥＲが検出さ
れた。ＯＡ滑膜２０例では全例陰性であった（ｐ＜０．
０５）。検出された組織部位はリンパ濾胞ではなく、絨
毛状増殖を示す滑膜表層細胞(lining cell)の絨毛形成
領域の先端部位に限局していた。組織型ではタイプIIお
よびIIIのリンパ球、形質細胞浸潤の多いタイプにＥＢ
ＥＲ陽性の頻度が高い傾向があった。

【００２１】以上の実施例１および２から明らかなよう
に、ＥＢＶ ＤＮＡはＲＡとＯＡの間で検出割合に有意
な差が認められないが、ＥＰＥＲの存在はＲＡに限られ
ている。従って、ＥＢＶがＲＡに直接関与していると判
断される。

【００２２】

【参考例１】＜滑膜の免疫組織染色＞ 免疫組織染色は、試料の脱パラフィン後、超音波で処理
し、単クローン性の抗ＣＤ２１抗体（Daco社製）、抗Ｅ
ＢＮＡ−２抗体（ＰＥ２）および抗ＬＭＰ−１抗体（Ｃ
Ｓ１−４、Ｓ１２）を用い、ＬＳＡＢキット（Daco社
製）を使用して行った。

【００２３】ＥＢＥＲ陽性８例中３例でＬＭＰ−１が陽
性であった。ＬＭＰ−１の発現はＥＢＥＲが発現してい
た場所に一致し、絨毛状増殖を示す滑膜表層細胞の絨毛
形成領域の先端部位に限局していた。ＣＤ２１およびＥ
ＢＮＡ−２の発現は検討した全ての症例で滑膜表層細胞
には認められなかった。抗ＬＭＰ−１抗体は２種類使用
したが、同じ結果であった。

【００２４】従って、ＥＢＥＲを検出する方法の方が、
ＲＡにおけるＥＢＶの検知方法として優れていると判断
される。また、ＲＡ滑膜炎におけるＥＢＶは、ただ病変
局所の滑膜細胞の増殖が著しい部位に存在するだけでな
く、ＥＢＶ関連特異的タンパク質を同部位に発現してい
ることが本発明で初めて明らかにされた。このことは、
ＲＡ滑膜炎にＥＢＶが直接関与していることを異なった
方法で証明し、その特異性を明らかにしたと共に、この
ＥＢＶ関連タンパク質が繊維芽細胞の腫瘍化を促し、Ｅ
ＢＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞の認識タンパク質でもある
ことから、滑膜細胞の増殖、変性、または、障害に深く
関与している可能性を強く示唆した。

【００２５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
抗ウイルス作用に基づく新規な抗慢性関節リウマチ剤が
提供される。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸．．合成ＤＮＡ 配列 GACGAGGGGC CAGGTACAGG

【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸．．合成ＤＮＡ 配列 GCAGCCAATG CAACTTGGAC GTTTTTGG

【００２８】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸．．合成ＤＮＡ 配列 AGCAGAGTCT GGGAAGCAAA CCACAGACAC CGTCCTCACC

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗ヘルペスウイルス剤を有効成分とする
   抗慢性関節リウマチ剤。
2. 【請求項２】 前記抗ヘルペスウイルス剤がＤＮＡポリ
   メラーゼ阻害剤である請求項１に記載の抗慢性関節リウ
   マチ剤。
3. 【請求項３】 前記ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤が、アシ
   クロビル、ビダラビンおよびガンシクロビルからなる群
   から選択される請求項２に記載の抗慢性関節リウマチ
   剤。