JPH09149799A - 核酸の分析方法又は検査方法、及び核酸の分析装置又は検査装置 - Google Patents

核酸の分析方法又は検査方法、及び核酸の分析装置又は検査装置

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JPH09149799A
JPH09149799A JP7311949A JP31194995A JPH09149799A JP H09149799 A JPH09149799 A JP H09149799A JP 7311949 A JP7311949 A JP 7311949A JP 31194995 A JP31194995 A JP 31194995A JP H09149799 A JPH09149799 A JP H09149799A
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Hideki Kanbara
秀記 神原
Kazunobu Okano
和宣 岡野
Kazumune Uematsu
千宗 植松
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Hitachi Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 多数のｃＤＮＡやＤＮＡ断片の検査、長いＤ
ＮＡの検査に好適なＤＮＡ検査法を提示すること。 【解決手段】 試料１を制限酵素Ｈｈａ Ｉで切断し、
各断片３の３’末端の塩基配列４にポリＡ鎖を付加す
る。ＲＸＹ（Ｘ、Ｙ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）の構造を
持つ１６種類の蛍光標識ＤＮＡプローブ６を用意する。
全断片からなる試料ＤＮＡを含む溶液を、１６個のフラ
クション１５に分割し、各フラクションにそれぞれ異な
るＤＮＡプローブ６を加えて相補鎖合成する。ＤＮＡプ
ローブはＤＮＡ断片にハイブリダイズするが、３’末端
が完全に１１のようにハイブリダイズしたＤＮＡプロー
ブ（＊Ｒ−ＡＡ）だけが相補鎖伸長し、そのＤＮＡ断片
と同じ長さの相補鎖１３を得て、伸長した相補鎖の長さ
を蛍光式ゲル電気泳動装置を用いて知る 【効果】 ゲル電気泳動パターンでは断片長が重ならず
高い長さ分解能が得られ、種々の試料に適用可能であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡを用いた診
断、ＤＮＡの特性評価法、ＤＮＡの分析法、及びＤＮＡ
の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡを病気の診断等に用いることが盛
んになりつつある。これら病気の診断等では、（１）目
的とするＤＮＡと相補的な配列を持ったＤＮＡプローブ
を作り、このＤＮＡプローブが目的とするＤＮＡとハイ
ブリダイズするか否かみるプローブ検査を行なう、
（２）目的とするＤＮＡの塩基配列のある領域を選び、
２つのＤＮＡプローブ（プライマー）を用いてＰＣＲ増
幅で生成したＤＮＡ断片の配列を読んだり、長さを調べ
て得たＤＮＡ断片の情報をもとに検査を行なう、等によ
って得た検査結果を診断等に用いようとするものであ
る。これらの方法では、１種類〜数種類のＤＮＡを調べ
るのには良いが、非常に多数のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ
の検査や長いＤＮＡの総合評価に適していない。
【０００３】しかし、生体内でのＤＮＡあるいは遺伝子
は相互に関連しながら働いているものであり、染色体あ
るいは含まれる全てのＤＮＡを総合して把握し評価した
いという要求が強い。例えば、ゲノム解析プロジェクト
の中で注目されているｃＤＮＡプロジェクトでは、生体
中でＤＮＡが機能する場合、ＤＮＡ情報はまずｍＲＮＡ
に転写され、それをもとに蛋白が合成され生体が機能す
る事に注目し、ｍＲＮＡの相補鎖であるｃＤＮＡの種類
と量を知り、生体を総合的に理解しようとする試みであ
る。この試みでは、生体試料からｃＤＮＡを取ってきて
個々のｃＤＮＡの配列を決め、個々のｃＤＮＡが１つの
組織に現われる頻度を調べる（ボディマップ）ことが行
なわれている。
【０００４】このために、まず、ｍＲＮＡからｃＤＮＡ
を作り（種々のｃＤＮＡが混合した状態）、これをクロ
ーニングする。ｃＤＮＡを含んだ大腸菌を寒天培地に撒
き、培養しコロニーを得る。各コロニーには目的とする
ｃＤＮＡのうちいずれか１つが入っているので、これを
取り出し、配列を決定し、ｃＤＮＡの種類を同定する。
次々に各コロニーからｃＤＮＡを取り出し、配列決定し
ていくと、同じｃＤＮＡに何度か出合う。１つの組織中
に存在する特定のｃＤＮＡに注目した時、この特定のｃ
ＤＮＡの量が多いほど、この特定のｃＤＮＡがその組織
で強く発現している遺伝子に相当するわけで、コロニー
中に入っている頻度も高い。そこでｃＤＮＡの配列解析
を多くのコロニーで行ない、どのｃＤＮＡが何回現われ
るかでその頻度を求めることが行なわれている（Ｋａｔ
ｓｕｊｉ Ｍｕｒａｋａｗａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ，２３，３７９−３８９（１９９４））。
【０００５】一方、ゲノム（全ての染色体中ＤＮＡ）あ
るいは特定の染色体全体に注目して、ＤＮＡ診断を行な
おうとする試みも行なわれている。Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎ
（制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、ＬＧＳ
法）等と呼ばれるフィンガープリント法がある。この方
法では、まずＤＮＡをＮｏｔ Ｉ等の８塩基認識酵素
（４８〜６４ｋ塩基に１回の頻度で切断される）で切断
し、切断部にラジオアイソトープあるいは蛍光標識をし
たヌクレオチドを結合し、アガロースゲル電気泳動す
る。分離後、４塩基認識酵素（４４〜２５６塩基に１回
の頻度で切断される）を用いてゲル中でＤＮＡ断片を切
断し、それをポリアクリルアド平板ゲルの上端に載せ２
次元電気泳動し、得られたパターンをフィンガープリン
トとして利用するもので、これによりＤＮＡ全体の様子
を把握する。正常細胞中のＤＮＡとガン等の異常のある
細胞のＤＮＡとでパターンが異なることを利用して診断
に用いる等の試みがなされている。
【０００６】しかし、大きなＤＮＡのどこに異常がある
か調べる検査等では、なかなか良い方法が見出されてい
ないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来技術では上記した
ように、長い大きなＤＮＡを調べたり、種々のＤＮＡが
含まれる試料の全体像を把握することは、病気を早期に
発見したり、ＤＮＡが細胞中で果している機能を理解す
る上で重要であるが、良い方法がないのが現状である。
上記で説明した現状の方法のでは、非常に多くのクロー
ンの塩基配列を決定する必要があり、手間と時間が大い
にかかり、種々の試料に適用するには現実的な方法では
ない。従来のＤＮＡプローブによる方法では、せいぜい
数種類〜十種類のＤＮＡを一度に調べられるだけで、数
百〜数千にもなるｃＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には不向
きである。更に、上記の従来技術によるｃＤＮＡ解析方
法は、どこに異常がある判らない長いＤＮＡの検査にも
適用できない。
【０００８】一方、Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎ法は、これらの
要求に答え得るものであるが、２度目の制限酵素切断時
に厖大な酵素を消耗すること、２次元電気泳動パターン
は実験により、最初の切断で生じたＤＮＡ断片の長さの
目安となる横軸および最終断片の長さの目安を与える縦
軸が必ずしも定量的でなく、フィンガープリントとして
データベース化しにくい等の難点があった。
【０００９】本発明の目的は、これらの難点を克服し、
種々の試料に適用可能であり、多数のｃＤＮＡやＤＮＡ
断片の検査や長いＤＮＡの検査に好適な、新しいフィン
ガープリント法、即ちＤＮＡ検査法を提示することにあ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明のＤＮＡ分析方
法、ＤＮＡ検査方法は以下の特徴を有する。まず試料中
に含まれるＤＮＡを制限酵素で切断し、その試料に固有
の長さを持ったＤＮＡ断片群を生成する。生成されたＤ
ＮＡ断片の３’末端に既知配列のオリゴマーを結合し、
プライミング領域を設ける。このプライミング領域と制
限酵素配列及び制限酵素配列に続く数塩基の位置にハイ
ブリダイズするＤＮＡプローブを用意する。このＤＮＡ
プローブは、その３’末端の、例えば、２塩基が、実質
全ての塩基の組み合わせから成る１６種類のＤＮＡプロ
ーブであり、これら１６種類のＤＮＡプローブを別々に
試料ＤＮＡにハイブリダイズさせ、相補鎖合成を行な
う。合成鎖は蛍光等で標識されたものにする。相補鎖合
成生成物を、相補鎖合成開始時に用いたＤＮＡプローブ
の種類毎にゲル電気泳動分離し、各成分の長さを測定し
てフィンガープリントを得るプロセスを設けている。以
下に、本発明の構成の概要について説明する。
【００１１】Ａ． 本発明の核酸の分析方法又は検査方
法では、１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、
２） 前記工程１）で得たＤＮＡ断片の３’末端近傍の
塩基の配列の違いを標識ＤＮＡプローブ（相補臭い合成
の際に標識ヌクレオチドを取り込み標識ＤＮＡ鎖として
もよい）が持つ３’末端の配列で識別し、該標識ＤＮＡ
プローブを相補鎖合成反応により末端配列が合致した場
合だけ伸長させて前記ＤＮＡ断片を末端配列に従ってグ
ループに区分する工程と、３） 前記グループに属する
前記ＤＮＡ断片の長さ、又は前記相補鎖合成反応により
相補鎖伸長した前記標識ＤＮＡプローブの長さを計測す
る工程とを有し、前記ＤＮＡ断片の３’末端近傍の塩基
の配列の種類毎に得る前記計測された長さをフィンガー
プリントとして用いる。
【００１２】Ｂ． 本発明の核酸の分析方法又は検査方
法では、１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、
２） 前記工程１）で得たＤＮＡ断片の３’末端にデオ
キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
結合する工程と、３） 前記結合したオリゴマー及び前
記制限酵素の認識配列の一部と相補的であり、３’末端
に１又は２塩基からなる任意の塩基配列を持ち、この末
端配列の異なる４種類又は１６種類の標識ＤＮＡプロー
ブを用いる相補鎖合成反応により前記標識ＤＮＡプロー
ブを相補鎖伸長する工程と、４） 前記の相補鎖合成さ
れた鎖をゲル電気泳動分離してＤＮＡ断片を検出する工
程とを少なくとも含んでいる。
【００１３】上記Ａ、Ｂの方法において、前記標識が、
少なくともビオチン、又は化学発光試薬あるいは、蛍光
体であり、前記ＤＮＡプローブ又は前記ＤＮＡ断片を蛍
光検出により検出すること、前記標識ＤＮＡプローブ
は、少なくとも３’末端の２塩基が実質すべての塩基種
又はそのアナログの組み合わせからなる１６種類の標識
ＤＮＡプローブを含むこと等に特徴がある。
【００１４】Ｃ． 本発明の核酸の分析方法又は検査方
法では、１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、
２） 前記工程１）で得たＤＡＮ断片の３’末端にデオ
キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
結合する工程と、３） 前記工程２）で結合した前記オ
リゴマー及び前記制限酵素が認識した配列の一部と相補
的であり、３’末端に任意の塩基種からなる１塩基から
３塩基のすべての組み合わせを持つ、標識ＤＮＡプロー
ブのそれぞれを用いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成反応
を行ない、前記それぞれの標識ＤＮＡプローブの相補鎖
伸長を行なう工程と、４） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ
鎖を前記の標識ＤＮＡプローブをその末端配列の種類毎
に取り出す工程と、５） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖
の３’末端に第２のオリゴマーを導入する工程と、６）
前記第２のオリゴマーが導入されたＤＮＡ鎖を鋳型と
して、前記工程３）、及び前記工程４）を実行する工程
と、７） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を長さに応じて
分離し検出する工程とを少なくとも含んでいる。
【００１５】Ｃの方法において、前記工程３）及び前記
工程４）を繰り返す工程により、前記ＤＮＡ断片又は合
成された前記ＤＮＡ断片の相補鎖を前記第２のオリゴマ
ート相補鎖を持つ第２の標識ＤＮＡプローブの末端塩基
配列毎に分離して前記ＤＮＡを検出することに特徴があ
る。前記工程３）及び前記工程４）を繰り返すことによ
り、区分数を増やすことができより詳細な分析ができ
る。また、より多くの断片を含む分析に適用することが
できる。
【００１６】Ｄ． 本発明の核酸の分析方法又は検査方
法では、１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、
２） 前記工程１）で得たＤＡＮ断片の３’末端にデオ
キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
結合する工程と、３） 前記工程２）で結合した前記オ
リゴマー及び前記制限酵素が認識した配列の一部と相補
的であり、３’末端に任意の塩基種からなる１塩基から
３塩基のすべての組み合わせを持ち、第１の標識ＤＮＡ
プローブを用いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成反応を行
ない、前記第１の標識ＤＮＡプローブの相補鎖伸長を行
なう工程と、４）前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖に相補的
なＤＮＡ断片を前記第１の標識ＤＮＡプローブの末端塩
基の種類毎に取り出す工程と、５） 前記工程３）を前
記工程３）で用いた前記第１の標識ＤＮＡプローブとは
異なる第２の標識ＤＮＡプローブを用いて再び実行する
工程と、６） 前記工程５）において得る前記第２の標
識プローブから生じた相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を長さに
応じて分離し検出する工程とを少なくとも含んでいる。
【００１７】ＡからＤの方法において用いられる前記制
限酵素が、３’突出端又はブラントエンド型断片を生ず
る制限酵素であることに特徴があり、さらにＡからＤの
方法において用いられる前記制限酵素が、５’突出端を
与える制限酵素であり、前記工程１）に続いて、ＤＮＡ
ポリメラーゼにより前記制限酵素による切断部を２本鎖
とする工程、あるいはライゲーションにより切断部配列
を含むオリゴマーを導入する工程を含んでいることに特
徴がある。
【００１８】Ａの方法において、２塩基の違いで分類さ
れた前記ＤＮＡ断片の相補鎖が、少なくとも蛍光体又は
化学発光試薬により標識され、任意の２塩基の全ての可
能な組み合わせ配列を３’末端に持つ標識ＤＮＡプロー
ブを用いて相補鎖合成により生成されることに特徴があ
る。
【００１９】Ｅ． ＡからＤの方法において使用される
標識ＤＮＡプローブは、Ｎ1、…、Ｎn（５≦ｎ≦２
７）、Ｘ1、…、Ｘm（１≦ｍ≦６）、Ｙ1、Ｙ2をＡ、
Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれかとし、前記相補鎖合成反応に
用いるプライマーである前記標識ＤＮＡプローブは、
５’−Ｎ1…Ｎn、Ｘ1…ＸmＹ1Ｙ2−３’の形を有し、Ｎ
1…Ｎnは前記ＤＮＡ断片に付加されるオリゴマーと実質
的に相補的な配列を持ち、Ｘ1…Ｘmは前記制限酵素によ
り切断された部分の配列の一部と実質的に相補的であ
り、Ｙ1Ｙ2はＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれか２つからな
るすべての組み合わせの１６種類から少なくともなる標
識ＤＮＡプローブである。
【００２０】Ｆ． ＡからＤの方法において使用される
標識ＤＮＡプローブは、Ｎ1、…、Ｎn（５≦ｎ≦２
７）、Ｘ1、…、Ｘm（１≦ｍ≦６）、Ｙ1、Ｙ2を、Ａ、
Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれかとし、Ｚi（１≦ｉ≦３）を
複数種類のヌクレオチドとハイブリダイズし得るヌクレ
オチドアナログとし、前記相補鎖合成反応に用いるプラ
イマーである前記標識ＤＮＡプローブは、５’−Ｎ1…
ＮnＸ1…ＸmＺ1…ＺiＹ1Ｙ2−３’の形を有し、Ｎ1…Ｎ
nはＤＮＡ断片に付加したオリゴマーと実質的に相補的
な配列を持ち、Ｘ1…Ｘmは制限酵素により切断された部
分の配列の一部と実質的に相補であり、Ｙ1Ｙ2はＡ、
Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれか２つからなるすべての組み合
わせの１６種類を少なくとも含むＤＮＡプローブであ
る。
【００２１】Ｅ、ＦのＤＮＡプローブにおいて、Ｎ1、
…、Ｎnのいずれかのヌクレオチドに、少なくともビオ
チン又は蛍光体の標識が付けられていることに特徴があ
る。
【００２２】Ｇ． ＡからＤの方法において、制限酵素
で切断されるＤＮＡは、 １） 組織試料からｍＲＮＡ
を得て、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、
２）前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮＡ
を作成する工程と、から得られるＤＮＡであり、ｍＲＮ
Ａの種類と量に関する情報が得られる。
【００２３】Ｈ． 本発明の分析装置又は検査装置で
は、制限酵素でＤＮＡを切断する反応を行なう第１の反
応容器と、前記切断反応生成物を分取して収納する複数
の第２の反応容器のそれぞれに、３’末端近傍の塩基の
配列が互いに異なり、標識された複数の標識ＤＮＡプロ
ーブのいずれかを混合して、前記切断反応で得たＤＮＡ
断片の３’末端近傍の塩基の配列の違いを前記標識ＤＮ
Ａプローブで識別し、前記標識ＤＮＡプローブの相補鎖
合成反応により伸長させて前記ＤＮＡ断片をグループに
区分するための第２の反応を行なう複数の第２の反応容
器と、前記グループに属する前記ＤＮＡ断片の長さ、又
は前記相補鎖合成反応により相補鎖伸長した前記標識Ｄ
ＮＡプローブを検体として、該検体の長さを計測する電
気泳動装置とを有し、前記ＤＮＡ断片の３’末端近傍の
塩基の配列の種類毎に得る前記計測された前記検体の長
さをフィンガープリントとして得る。
【００２４】Ｉ． 本発明の分析装置又は検査装置で
は、制限酵素でＤＮＡを切断する反応を行ない、該切断
反応で得たＤＮＡ断片の３’末端にデオキシヌクレオチ
ド又はそのアナログを含むオリゴマーを結合する反応を
行なう第１の反応容器と、前記切断反応生成物を分取し
て収納する複数の第２の反応容器のそれぞれに、前記結
合したオリゴマー及び前記制限酵素の認識配列の一部と
相補的であり、３’末端に１又は２塩基からなる任意の
塩基配列を持ち、標識された４種類又は１６種類の標識
ＤＮＡプローブのいずれかを混合して、前記標識ＤＮＡ
プローブを用いる相補鎖合成反応により前記標識ＤＮＡ
プローブの相補鎖伸長反応からなる第２の反応を行なう
複数の第２の反応容器と、前記の相補鎖合成されたＤＮ
Ａ鎖を検体として、該検体の長さを計測する電気泳動装
置とを有し、前記標識ＤＮＡプローブの種類毎に得られ
る前記検体の長さをフィンガープリントとして得る。
【００２５】Ｈ、Ｉの装置において、前記電気泳動装置
のゲル電気泳動路で、前記検体とともに、長さマーカを
電気泳動して、電気泳動分離された検体断片を区画、分
類すること、前記検体及び前記長さマーカが蛍光体でそ
れぞれ標識されており、前記検体と前記長さマーカが蛍
光体の蛍光波長により識別されることに特徴がある。と
する核酸の分析装置又は検査装置。
【００２６】Ｊ． 本発明の分析装置又は検査装置で
は、複数の反応容器、温度を制御して化学反応を行なう
ための化学反応槽とを有し、前記複数の反応容器のそれ
ぞれに、少なくとも１６種類の標識ＤＮＡプローブを別
々に入れて、前記化学反応槽内に前記複数の反応容器を
入れ、前記複数の反応容器のそれぞれの中のＤＮＡ断片
と前記標識ＤＮＡプローブとを同時に反応させる。
【００２７】試料中に測定対象となるＤＮＡ断片が数多
くあっても、それぞれの断片は制限酵素切断部に続く配
列が異なっている場合がほとんどである。そこで制限酵
素切断部に続く配列の違いでまずＤＮＡ断片を分離しグ
ループ化し、各グループにあるＤＮＡ断片の数が、ゲル
電気泳動を用いて行なう各断片成分の分離に支障のない
程度になるまでこの分類（グループ化）を繰り返す。最
後に各グループにあるＤＮＡ断片について、各断片成分
の長さをゲル電気泳動を用いて計測することによりＤＮ
Ａの分析を行なう。
【００２８】試料中に含まれるＤＮＡを制限酵素で切断
して得られたＤＮＡ断片の分類は、３’末端の２塩基が
全ての組み合わせの塩基を持つ１６種類のＤＮＡプロー
ブを用いた相補鎖合成で行なう。相補鎖合成は末端２塩
基が対象ＤＮＡに完全にハイブリダイズしている時は進
行するが、そうではないと進行しない。相補鎖合成され
たＤＮＡ鎖は元のＤＮＡ鎖（制限酵素で切断して得られ
たＤＮＡ断片）と実質的に同じ長さであり、相補鎖合成
されたＤＮＡ鎖に標識が入るようにしておき、他の相補
鎖合成されたＤＮＡ鎖と区別して検出できるようにする
ことにより末端２塩基を識別して元のＤＮＡ鎖の長さを
計測できる。
【００２９】試料中に含まれるＤＮＡを制限酵素で切断
して得られたＤＮＡ断片の分類が、１回の分類では十分
でない場合には、ＤＮＡプローブにビオチンをつけてお
き、合成された相補鎖だけをつり出し、つり出されたＤ
ＮＡ断片（合成された相補鎖）について再度上記と同じ
操作を行なう。この場合、用いるＤＮＡプローブは相補
鎖の３’末端（元のＤＮＡの５’末端に相当）に付着す
るものであり、１回目と異なる分類ができる。即ち、本
発明では、試料中に含まれるＤＮＡを制限酵素で切断し
て得られた多数のＤＮＡ断片の長さ情報をまとめてフィ
ンガープリントとして利用するものでなく、切断酵素に
よって得るＤＮＡ断片の末端塩基配列で区分け（グルー
プ化）をして、各グループ毎にあるＤＮＡ断片につい
て、各断片長をゲル電気泳動を用いて計測し、フィンガ
ープリントとするので、断片長が重ならず高い長さ分解
能が得られる利点がある。
【００３０】
【発明の実施の形態】本発明の適用対象は、ＤＮＡある
いはＲＮＡ等の核酸試料であり、これら試料のフィンガ
ープリント分析法、あるいはフィンガープリント検査法
により、核酸試料の分析あるいは検査を行なう。さら
に、本発明は、これらのＤＮＡ分析法あるいはＤＮＡ検
査法を実行するＤＮＡ分析装置あるいはＤＮＡ検査装置
に関する。 以下、本発明の実施例を、図を参照して詳
細に説明する。
【００３１】（実施例１）第１の実施例では、まず本発
明の原理を説明する。ＤＮＡ診断ではＤＮＡを制限酵素
で切断し、得られた断片をゲル電気泳動で長さ分離し、
その分離パターンから診断する手法が広く用いられてい
るが、制限酵素により生成するＤＮＡ断片の種類が多く
なると各断片が分離せず診断上支障をきたす。これら断
片を特徴づけるものは塩基長と配列である。各断片は固
有の配列を持つが、末端の数塩基の配列も断片毎に一般
には異なる。例えば、４塩基認識酵素の切断部位は平均
２５６塩基長毎に現われるので、約５０Ｋ塩基長の２本
鎖ＤＮＡを切断すると約２００本の２本鎖ＤＮＡ断片
（約４００本の１本鎖ＤＮＡ断片）が生じる。この断片
群をまず３’末端側の制限酵素認識配列に続く２塩基の
配列で区分けすると、この２塩基の配列のとる組み合わ
せ数は４×４＝１６通りの組みであり、各組に属する１
本鎖ＤＮＡ断片の平均数は約２５本である。数塩基から
１Ｋ塩基にわたる種々長さのＤＮＡの２５本程度をゲル
電気泳動で分離することは容易である。元のＤＮＡが長
かったり、より多数のＤＮＡ断片が含まれている試料を
扱う場合には、更に長い塩基配列を用いて区分けをす
る。例えば、末端４塩基の配列で区分けすると、２５６
組に分けられ、各組のＤＮＡ断片を長さにより分離する
と少なくとも１００種の数塩基〜１０００塩基のＤＮＡ
断片は識別できるので、全体で２００００以上のＤＮＡ
断片を分類することができ、これをフィンガープリント
として用いることができる。具体的な操作を、図１を使
用して次に詳細に説明する。
【００３２】試料１としてλＤＮＡを用い、制限酵素に
はＨｈａ Ｉ用いた。Ｈｈａ Ｉは２本鎖ＤＮＡ、 ５’−Ｎ…ＮＧＣＧＣＮ…Ｎ−３’ ３’−Ｎ…ＮＣＧＣＧＮ…Ｎ−５’ を ５’−Ｎ…ＮＧＣＧ ＣＮ…Ｎ−３’ ３’−Ｎ…ＮＣ ＧＣＧＮ…Ｎ−５’ のように切断する。ここでＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれ
か１つである。各切断断片３の３’末端の塩基配列４は
ＧＣＧとなる。また、図１では、各切断断片３の３’末
端の塩基配列４のＧＣＧに続く２塩基１０を一般的にＮ
Ｎと表しており、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかであ
る。
【００３３】切断断片３の３’末端にはライゲーション
を用いてオリゴマーを導入するか、あるいはターミナル
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いポリＡ鎖（Ａ
ＣＧＴいずれか１種の塩基でよい）を付加する。ポリＡ
鎖を付加する場合、３’末端は突出端であるか平滑端で
ある必要がある。図１では、ポリＡ鎖５を付加した場合
について説明する。各切断断片３の３’末端にポリＡ鎖
５を付加すると３’末端配列はＧＣＧＡＡＡＡ…Ａ−
３’となる。ポリＡ鎖を付加する場合、制限酵素認識配
列ｇＣｇの存在は端の位置をはっきりさせる上で重要で
ある（ポリＡ鎖の長さはコントロールできないからであ
る）。そこで配列番号：１に示す ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣ
ＸＹ−３’ （ここでＸ、Ｙ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）の構造を持つ
１６種類（Ｘ及びＹの取り得る全ての組み合わせであ
る。）のＤＮＡプローブ６を用意する。図１では、これ
らのＤＮＡプローブは、 Ｒ＝ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣ とおいて、ＲＸＹ（ここでＸ、Ｙ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、または
Ｔ）と示されている。なお、＊はＤＮＡプローブ６に標
識される蛍光体を表す。配列ＣＧＣがないと、ＸＹがＴ
Ｇ、ＴＣ、ＴＴ、ＴＡなどについては識別の役割を果た
さないことがある（ポリＴとつながってしまうからであ
る）。
【００３４】ＤＮＡプローブの５’末端からＣＧＣまで
の配列は、制限酵素Ｈｈａ Ｉの切断で得た全ての断片
と相補的であり、この全ての断片の共通にハイブリダイ
ズする。例えば、ＸＹがＡＡの場合について説明する。
ＸＹ部分（３’末端の塩基配列４のＧＣＧに続く２塩基
１０）は、相補鎖配列ＴＴを持つ断片にだけハイブリダ
イズし２本鎖１１を形成する。ＸＹ部分１０が相補鎖配
列を持たないときには、１２のようにＸＹ部分がハイブ
リダイズしない。ＸＹが完全にハイブリダイズしたか否
かは、ハイブリダイゼーションの安定性を見るだけで明
確にわからない。それは、ＤＮＡプローブの殆どの部位
が、どの断片ともハイブリダイズする共通部分であり、
末端２塩基部分だけの差では十分大きな差にならないか
らである。
【００３５】しかし、ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補
鎖合成反応を用いることで、末端２塩基が完全にハイブ
リダイズしているか否か見分けることができる。制限酵
素Ｈｈａ Ｉの切断で得た全ての断片からなる試料ＤＮ
Ａを含む溶液を、１５のように１６個のフラクションに
分割する。各フラクションにそれぞれ異なるＤＮＡプロ
ーブ６を加えて相補鎖合成する。ＤＮＡプローブはＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズするが、３’末端が完全に１１
のようにハイブリダイズしたＤＮＡプローブ（＊Ｒ−Ａ
Ａ）だけが相補鎖伸長し、そのＤＮＡ断片と同じ長さの
相補鎖１３を得る。ＤＮＡプローブを蛍光標識しておけ
ば伸長した相補鎖の長さを蛍光式ゲル電気泳動装置を用
いて知ることができる。
【００３６】図２（ａ）、（ｂ）はλＤＮＡを用いて得
た結果の一部である。制限酵素Ｈｈａ Ｉの切断で得た
全てのＤＮＡ断片の長さを同時に測定しようとすると、
図２（ａ）のスペクトル２１に示すように多くのピーク
が重なって分離ができず、分析不可能になる。しかし、
図２（ｂ）に示すように、１６種類のＤＮＡプローブ２
３（図２（ｂ）では、ＤＮＡプローブ、＊ＲＸＹのうち
ＸＹ部分のみを示している。）を用いて、末端塩基配列
により区分けされたＤＮＡ断片グループのスペクトル２
２では、各断片による各ピークが分離しており、区分け
されたＤＮＡ断片グループに含まれるＤＮＡ断片の長さ
を知ることができる。図２（ｂ）に示すＤＮＡ断片のｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡ断片スペクト
ル）は、検査対象である元のＤＮＡの種類により固有の
ものであり、元のＤＮＡの構造が異なると別のパターン
を示すので、フィンガープリントとして利用できＤＮＡ
の診断等に使用できる。なお、図２（ａ）、（ｂ）の横
軸は、塩基長２４を表す。
【００３７】（実施例２）異なるＤＮＡの識別に本発明
を応用した結果例を図３（ａ）、（ｂ）に示す。操作の
手順は実施例１と同様である。試料として若干塩基配列
の異なる２種類のｐＵＣを用い、試料はｐＵＣ１９とｐ
ＵＣ１１８を用いた。ｐＵＣ１９は２６８６塩基、ｐＵ
Ｃ１１９は３１６２塩基からなるＤＮＡであり、約２６
３０塩基は共通の同じ配列からなるＤＮＡである。制限
酵素Ｈｈａ Ｉで切断した後、切断断片の末端に既知配
列をもつオリゴマーをライゲーションで付加する。次い
で、実施例１と同様にして、１６種類のプライマー（Ｄ
ＮＡプローブ）を用いて、切断断片の末端塩基配列によ
り区分け（グループ化）されたＤＮＡ断片グループのス
ペクトルを得た。
【００３８】図３（ａ）に示すスペクトル３１はｐＵＣ
１９、図３（ｂ）に示すスペクトル３２はｐＵＣ１１８
由来のスペクトルである。図３（ａ）、（ｂ）の横軸
は、塩基長２４を表す。ｐＵＣ１９のスペクトルになく
てｐＵＣ１１８由来のスペクトルだけに検出された断片
として、約７５塩基（ＣＴ、ＧＴプライマー）、約４５
０塩基（ＣＣ、ＧＴプライマー）、ｐＵＣ１９だけに検
出された断片として約１３０塩基（ＣＴ、ＧＴプライマ
ー）の断片が検出された。
【００３９】このように本発明の方法を用いれば、わず
かに異なる種々のＤＮＡの比較識別を簡単に行なうこと
ができる。もちろん、種々のゲノムＤＮＡにも適用でき
る。制限酵素Ｈｈａ ＩでＤＮＡを切断すると、Ｈｈａ
Ｉは４塩基認識酵素であり、平均２５０塩基に１回切
断部が現われる。ゲノムでは１Ｍ塩基当たり平均１００
０余りの２本鎖ＤＮＡ断片が生じる。１００Ｍ塩基程度
のゲノムを分析する場合には、Ｎｏｔ Ｉ等の８塩基認
識酵素を用いるとほぼ同じオーダーの断片となるので、
ここで説明する方法をそのまま用いることができる。
【００４０】このような多数のＤＮＡ断片（１本鎖にな
おすと２０００断片〜３０００断片）をゲル電気泳動で
分離し、その分離パターンの微妙な違いを見い出すこと
は非常に困難である。そこで、まず制限酵素により切断
された各ＤＮＡ断片の３’末端の配列により１６のグル
ープに分ける。１つのグループ当り平均１５０程度のＤ
ＮＡ断片が含まれることになる。この数は実施例１で示
した数より少なく、第１の実施例１と同様にして分析で
きる。
【００４１】生成したＤＮＡ断片を１６のグループに分
けるために、ＤＮＡプローブの３’末端の２塩基がター
ゲットＤＮＡ（ＤＮＡ断片）に完全に相補的か否かで、
相補鎖合成が大きく左右されることを利用する。ＤＮＡ
断片を、 ５’−Ｃ’1…Ｃ’iＸn…Ｘ1Ｃi…Ｃ1−３’ と表す。ここで、Ｘn…Ｘ1は各断片に固有の配列であ
り、Ｃi…Ｃ1及びＣ’1…Ｃ’iは制限酵素認識配列ある
いはその一部であり、既知である。このＤＮＡ断片の
５’末端及び３’末端に、ライゲーションにより既知配
列の１８マーのオリゴマー、Ａ’1…Ａ’18、Ａ18…Ａ1
をそれぞれ結合する。この結果、各ＤＮＡ断片は、 ５’−Ａ’1…Ａ’18Ｃ’1…Ｃ’iＸn…Ｘ1Ｃi…Ｃ1Ａ
18…Ａ1−３’ の構造を持つことになる。Ａ18…Ａ1及びＡ’1…Ａ’18
は既知配列オリゴマーである。各ＤＮＡ断片のＣi…Ｃ1
Ａ18…Ａ1の配列は既知であり、これに隣接するＸn…Ｘ
1のうちの３’側の数塩基を、ＤＮＡ断片のグループ分
けに利用する。
【００４２】このＤＮＡ断片にハイブリダイズするＤＮ
Ａプローブを用意する。ＤＮＡプローブとして、ＤＮＡ
断片のＡ1…Ａ18Ｃ1…Ｃiに相補的でかつＸ1Ｘ2の特定
配列に完全にハイブリダイズするプローブを用意する。
Ｘ1Ｘ2の取り得る組み合わせは１６通りなので、ＤＮＡ
プローブも１６通り用意する。このＤＮＡプローブを ５’−Ａ’1…Ａ’18Ｃ’1…Ｃ’iＹ1Ｙ2−３’ と表示する。Ｃ’iとＹ1の間にあるいはＣi’の代わり
に、イノシンのようなＤＮＡ類似体を挿入したプローブ
を用いても良い。このＤＮＡプローブはビオチン（Ｂ）
標識されており、必要に応じてストレプトアビジンを付
着したタイタープレートあるいは磁気ビーズ等で分離し
得るようにする。なお、以上の説明で、Ｃ1、…、Ｃi：
Ｃ’1、…、Ｃ’i：Ｘ1、…、Ｘn：Ｙ1、Ｙ2：Ａ1、
…、Ａ18：Ａ’1、…、Ａ’18は、Ａ、Ｃ、Ｇ、または
Ｔのいずれかを表わし、配列Ｃ1…Ｃiと配列Ｃ’1…
Ｃ’i、配列Ａ1…Ａ18と配列Ａ’1、…、Ａ’18、配列
Ｘ1Ｘ2と配列Ｙ1Ｙ2、はそれぞれ後で図４に示すように
相補対を形成する。
【００４３】図４を用いて、さらに詳細に説明する。Ｄ
ＮＡ試料３８（Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより得たＤＮＡ断片
群の各ＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端に、ライゲー
ションにより既知配列の１８マーのオリゴマー、Ａ’1
…Ａ’18、Ａ18…Ａ1をそれぞれ結合させたもの）を１
６等分してそれぞれ別の容器に分取し、各フラクション
に１種のビオチン化ＤＮＡプローブ３９（Ｂはビオチン
を表す）、 ５’−Ｂ−Ａ’1…Ａ’18Ｃ’1…Ｃ’iＹ1Ｙ2−３’ をそれぞれ加え、ＤＮＡポリメラーゼと相補鎖合成基質
（デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ；ｄｅｏｘ
ｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ））を加えて相補鎖合成（伸長反応）を行なう。
【００４４】ＤＮＡポリメラーゼには耐熱性のＴａｑあ
るいはｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ
を用いた。反応は熱サイクル条件下で行ない、ＤＮＡプ
ローブの末端配列と完全に相補なＤＮＡ断片の相補鎖を
合成する。相補鎖の合成後、アビジン（Ａｖ）を表面に
持つ磁気ビーズ４２を加えてビオチンを持つ合成ＤＮＡ
鎖４０を捕獲する。磁気ビーズに代えてプラスチックビ
ーズあるいはフィルターにアビジンがついたものを用い
てもよい。捕獲されたＤＮＡ鎖以外の非反応物を除去す
る。このように特定の末端配列 Ｘ2Ｘ1Ｃi…Ｃ1Ａ18…Ａ1 を持つＤＮＡ断片毎に１６のグループを作る。この例で
は、各ＤＮＡ断片の相補鎖を用いてグループを作るの
で、ＤＮＡ断片を含む液を昇温してハイブリダイズして
いる元のＤＮＡ断片を遊離し除去する。図４に示すよう
に磁気ビーズにより、回収した各断片の相補鎖（ＤＮＡ
鎖）４６のグループは５’末端に（相補鎖合成後はＤＮ
Ａプローブ配列は合成鎖の５’末端に位置する）に共通
のプローブ配列を持ち、それに隣接する２塩基の違いで
１６通りに分類されたものであり、平均１５０種のＤＮ
Ａ鎖を含んでいる。
【００４５】各グループ内のＤＮＡを更に今度は３’末
端側の配列の差を用いて分類する（この３’末端側の配
列は、相補鎖合成の鋳型となった元のＤＮＡ断片の５’
末端側の配列に相当する）。ビーズに捕獲されたＤＮＡ
鎖４６の３’末端にはライゲーション時に結合したオリ
ゴマー配列、Ａ1…Ａ18があり、ＤＮＡプローブがハイ
ブリダイズできる。上記と同様の配列を持つ１６種類の
蛍光標識プローブ４４、 ５’−＊・Ａ1’…Ａ’18Ｃ’1…Ｃ’iＹ3Ｙ4−３’ を用意する。＊は蛍光標識であり、Ｙ3、Ｙ4は、Ａ、
Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれかを表わす。ビーズに捕獲さ
れたＤＮＡ断片を含む液を１６等分する。
【００４６】各フラクションに上記と同様にＤＮＡプロ
ーブを１種ずつ入れ相補鎖合成（伸長反応）を行なう。
全体で１６×１６＝２５６グループについて反応を行な
い、伸長生成物４５の電気泳動パターンを計測する。上
記の蛍光標識をプローブ毎に変えておき、色の異なる蛍
光体でラベルされたプローブを一括して反応させ、伸長
生成物４５を多色検出型ＤＮＡアナライザーで計測して
もよい。４色の蛍光体を用いれば、反応は、各ＤＮＡグ
ループ毎に４回、合計４×１６＝６４回で済むし、泳動
路も６４あれば済むので便利である。個の例では末端に
結合したオリゴマーは同じとして扱ったが、制限酵素を
両端で変えたりして両端で異なる配列を結合して行なう
こともできる。
【００４７】ゲノムに若干の違いのある大腸菌ＪＭ１０
９とＣ６００のパターンを比較した結果、大部分は同じ
であるが、図３と同様に一部に違いがあることがわかっ
た。これらはグループ分けせずに電気泳動したのでは区
別できないものである。
【００４８】このように、大きなＤＮＡを制限酵素で切
断し、断片の両末端近傍の配列でＤＮＡ断片を区分け
（グループ化）し、更に電気泳動で長さ分離パターンを
得ることで、各ゲノムに固有のパターンを得ることがで
きる。このパターンはゲノムの違いを調べるのに有効
で、特に末端塩基種で行なう区分け（グループ化）はデ
ータベース構築にも有効である。何故なら、２次元電気
泳動等だけからなるパターンデータでは、アナログ（ａ
ｎａｌｏｇ）情報のＤＮＡの長さに不確定さがあり、デ
ータベース化しにくいが、末端塩基種による区分けでは
デジタル（ｄｅｇｉｔａｌ）情報と組み合わすことで、
ａｎａｌｏｇ情報の長さ分離精度があまり高くなくても
ＤＮＡ分類を正確に行えるからである。
【００４９】以上の説明では、ＤＮＡ断片を含む液を昇
温してハイブリダイズしている元のＤＮＡ断片を遊離し
除去したが、相補鎖合成したＤＮＡプローブにハイブリ
ダイズした元のＤＮＡ断片を分取して用いることもでき
る。この場合は、まず溶液を８０〜８５℃に昇温し、相
補鎖合成していないプローブにハイブリダイズしたＤＮ
Ａ断片を遊離し除去する。次いで、９５〜１００℃に昇
温し、相補鎖合成したプローブにハイブリダイズしたＤ
ＮＡ断片を遊離させ回収すればよい。
【００５０】（実施例３）本実施例はｍＲＮＡの種類の
個数分布発現頻度情報に関する情報を得るためのもので
ある。人の遺伝子の数は５〜１０万種と言われており、
これに応じてｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の種類
も５〜１０万存在する。このうち常時働いているのは３
０００前後と推定されており、これらが種々の組織にお
いてどのように働いているか知ることは重要である。こ
れを調べるために現状の技術では、まずｍＲＮＡを採取
し、クローニングして、各クローン中にあるｍＲＮＡの
配列を調べ、その出現頻度を調べることが行われてい
る。しかし、これは大変手間のいる操作であり、簡便な
方法が望まれている。ｍＲＮＡの相補鎖であるｃＤＮＡ
の解析が進み、各ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズす
るＤＮＡプローブを作り、検査することも可能である
が、実質的にはプローブ数は数十〜１００程度が使用限
界である。しかし、有限の種類のプローブを用いたので
はプローブで検出できないｃＤＮＡの検出があると実用
にならない。そこで、どのようなｃＤＮＡであろうと検
出できるシステムが望まれている。本実施例は、このよ
うな状況に鑑み、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の分布解析に利
用した例である。
【００５１】生体組織からｍＲＮＡライブラリー（ｃＤ
ＮＡライブラリー）を作製する。この作製は、文献（Ｎ
ａｔｕｒｅ）に記載の技術に従って、ビオチン標識ポリ
Ｔを用いてｃＤＮＡを作製し、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイ
ブリッドを作り、Ｏｋｕｂｏらによる方法に基づいて２
本鎖ＤＮＡを作る（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５，１７−３３（１９
９５））。制限酵素Ｓａｕ ＩＩＩ Ａ１で２本鎖ＤＮ
Ａを切断し、切断部に既知配列を持つオリゴマーを連結
する。制限酵素としてＨｈａ Ｉ（ＧＣＧ↓Ｃ）、Ｎｌ
ａ ＩＩＩ（ＣＡＴＧ↓）他を用いても良い。
【００５２】この一連の操作で５’末端側にビオチン標
識ポリＴ配列を持ち、３’末端側に制限酵素標識配列と
既知オリゴマーを持つＤＮＡ断片が生成する。これにア
ビジンを固定した磁気ビーズ等を加えて、ビオチンーア
ビジン結合を形成して、上記ＤＮＡ断片及びその相補鎖
を採取してくる。ＤＮＡ断片を保持した磁気ビーズを含
む容器にバッファー液を加え、昇温して、相補ＤＮＡ断
片を遊離して試料として用いる。以下の取り扱いは実施
例２と同じであり、ＤＮＡ断片のポリＡに続く３’末端
側の配列によりＤＮＡ断片を分類する。この場合、実施
例２と異なりポリＴに続く選別用配列は１２通りであ
る。ビオチン付ＤＮＡプローブを分けた後、１６種類の
蛍光標識プローブを用いて相補鎖合成を行ない、生成Ｄ
ＮＡの長さをゲル電気泳動により計測し、フィンガープ
リント（ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｉｎｔ）を得る。
【００５３】（実施例４）実施例１から実施例３で説明
した方法を実行するため装置は、１６種類又は２５６種
類のＤＡＮプローブを同時に反応させ、相補鎖伸長物を
得る反応容器と、それぞれのプローブを自動的に各容器
に注入するためのオートピペットと、電気泳動装置とを
備えている。相補鎖伸長反応は６５°Ｃ以上で行なうの
が末端塩基の配列の一致、不一致により、反応が進む、
進まないが明確に区別できるので望ましい。また、相補
鎖伸長反応生成物はＤＡＮプローブの末端塩基の種類毎
に同時に電気泳動するか、長さマーカ（ｒｅｆｅｒｅｎ
ｃｅ）を同時にＤＡＮプローブの末端塩基の種類毎に電
気泳動し、相補鎖伸長反応生成物の相対長さを比較でき
るようにすることが必要である。そために各相補鎖伸長
反応生成物と共に長さマーカーを電気泳動して、電気泳
動分離された相補鎖伸長反応生成物のフラグメントとマ
ーカーとの相対的位置関係を利用して、フラグメント長
を測定する装置がとくに有効である。この場合、ＤＮＡ
フラグメントの長さ長さの異なる複数のマーカーで区別
して、ＤＮＡフラグメントがどの区分に属するかという
型でデータ整理すると扱いやすい。ＤＮＡフラグメント
長というアナログ情報をディジタル的に扱えるからであ
る。仮りに、５塩基毎に現われるマーカーで１Ｋ塩基ま
でを２００に区分するとＤＮＡ断片は、２５６×２００
≒５００００にも区分けできる。この数はｍＲＮＡ他の
診断あるいはフインガープリント分析に十分な区分けの
細かさである。
【００５４】さらに、塩基長１０〜５００塩基までは電
気泳動における計測精度が高いので２塩基毎に区分けす
ると一層詳細に区分けしたデータが得られる。このよう
な計測ではマーカーは目的ＤＮＡ断片に標識される蛍光
体の発光波長とは、かなり発光波長が離れた蛍光体で標
識しておき、目的ＤＮＡ断片と用意に区別できることが
望ましい。蛍光体は超波長側に発光帯がすそ野を引くの
でマーカーからの蛍光信号が超波長側になるように、目
的ＤＮＡ断片に標識される蛍光体の種類を選択して、Ｄ
ＮＡ断片の計測を邪魔しないようにすることが重要であ
る。ＤＮＡ断片配列長さにより異なる構造をもつことが
あり、同じ塩基長をもつ場合でもゲル中で異なる泳動速
度をもつことがある。しかし、このような場合にも、マ
ーカーを基準としてどの区画にＤＮＡ断片が現われるか
がわかれば分類することができる。即ち、ＤＮＡ断片が
同じ長さを持つ場合でも配列が異なるために異なる区画
に分類される場合が生じるが、分類の再現性が良ければ
分析上の問題はない。
【００５５】（配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ、蛍光標識 配列：ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣ
ＸＹ （Ｘ、Ｙ：任意のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）
【００５６】
【発明の効果】本発明によれば、手間と時間を要せず
に、種々の試料に適用可能であり、多数のｃＤＮＡやＤ
ＮＡ断片の検査や長いＤＮＡの分析あるいあは検査に好
適なフィンガープリント法を提示できる。本発明では、
試料中に含まれるＤＮＡを制限酵素で切断して得られた
多数のＤＮＡ断片の長さ情報をまとめてフィンガープリ
ントとして利用するものでなく、切断酵素によって得る
ＤＮＡ断片の末端塩基配列で区分け（グループ化）をし
て、各グループ毎にあるＤＮＡ断片について、各断片長
をゲル電気泳動を用いて計測し、フィンガープリントと
するので、断片長が重ならず高い長さ分解能が得られる
利点がある。本発明では、ｍＲＮＡの分布解析におい
て、従来技術のように長時間を必要とするクローニン
グ、培養の工程を必要としないので、ｍＲＮＡの分布解
析が従来技術の十分の一以下の時間で可能となる。ま
た、得られたデータをディジタル情報化して扱うことが
できるのでデータベースとして有用な型でデータ取得が
できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１における操作手順を説明する
図。
【図２】本発明の実施例１における操作手順を試料λＤ
ＮＡに適用して得られる、（ａ）全ＤＮＡ断片の長さを
同時に測定して得たスペクトル、（ｂ）１６種類のＤＮ
Ａプローブを用いて、末端塩基配列により区分けされた
ＤＮＡ断片グループから得たスペクトル。
【図３】本発明の実施例２において得られた、（ａ）ｐ
ＵＣ１９由来のスペクトル、（ｂ）ｐＵＣ１１８由来の
スペクトル。
【図４】本発明の実施例２における操作手順を説明する
図。
【符号の説明】
１…試料ＤＮＡ、３…ＤＮＡ切断断片、４…Ｈｈａ Ｉ
切断末端、５…ポリＡ、６…ＤＮＡプローブ、１０…
Ｘ、Ｙ部分、１１…ＸＹ部分が充分にハイブリダイズし
た状態、１２…ＸＹ部分がハイブリダイズしていない状
態、１３…伸長した相補鎖、１５…フラクション、２１
…全てのＤＮＡを分けないで同時に測定した場合のスペ
クトル、２２…区分けされたＤＮＡ断片スペクトル、２
３…使用したプローブのＸＹ部位の配列、２４…塩基
長、３１…ｐＵＣ１９由来のスペクトル、３２…ｐＵＣ
１１８由来のスペクトル、３８…既知オリゴマーを結合
したＤＮＡ断片群、３９…ビオチン化ＤＮＡプローブ、
４０…伸長された合成ＤＮＡ鎖、４２…アビジンを持つ
磁気ビーズ、４３…ビーズに捕獲されたＤＮＡ鎖、４４
…蛍光標識プローブ、４５…伸長生成物、４６…回収し
た断片の相補鎖。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｇ０１Ｎ 27/447 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ａ ３２５Ｅ

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程
    と、 ２） 前記工程１）で得たＤＮＡ断片の３’末端近傍の
    塩基の配列の違いをＤＮＡプローブで識別し、該ＤＮＡ
    プローブを相補鎖合成反応により伸長させて前記ＤＮＡ
    断片をグループに区分する工程と、 ３） 前記グループに属する前記ＤＮＡ断片の長さ、又
    は前記相補鎖合成反応により相補鎖伸長した前記ＤＮＡ
    プローブの長さを計測する工程とを有し、前記ＤＮＡ断
    片の３’末端近傍の塩基の配列の種類毎に得る前記計測
    された長さをフィンガープリントとして用いることを特
    徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の方法において、前記ＤＮ
    Ａプローブから合成された相補鎖が標識されていること
    を特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  3. 【請求項３】１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程
    と、 ２） 前記工程１）で得たＤＮＡ断片の３’末端にデオ
    キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
    結合する工程と、 ３） 前記結合したオリゴマー及び前記制限酵素の認識
    配列の一部と相補的であり、３’末端に１又は２塩基か
    らなる任意の塩基配列を持ち、標識された４種類又は１
    ６種類の標識ＤＮＡプローブを用いる相補鎖合成反応に
    より前記標識ＤＮＡプローブを相補鎖伸長する工程と、 ４） 前記の相補鎖合成された鎖をゲル電気泳動分離し
    てＤＮＡ断片を検出する工程とを少なくとも含むことを
    特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  4. 【請求項４】請求項１から請求項３のいずれかに記載の
    方法において、前記標識が、少なくともビオチン、又は
    化学発光試薬のいずれかであることを特徴とする核酸の
    分析方法又は検査方法。
  5. 【請求項５】請求項１から請求項３のいずれかに記載の
    方法において、前記標識が蛍光体であり、前記ＤＮＡプ
    ローブ又は前記ＤＮＡ断片を蛍光検出により検出するこ
    とを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  6. 【請求項６】請求項１から請求項３のいずれかに記載の
    方法において、前記標識ＤＮＡプローブは、少なくとも
    ３’末端の２塩基が実質すべての塩基種又はそのアナロ
    グの組み合わせからなる１６種類の標識ＤＮＡプローブ
    を含むことを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  7. 【請求項７】１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程
    と、 ２） 前記工程１）で得たＤＡＮ断片の３’末端にデオ
    キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
    結合する工程と、 ３） 前記工程２）で結合した前記オリゴマー及び前記
    制限酵素が認識した配列の一部と相補的であり、３’末
    端に任意の塩基種からなる１塩基から３塩基のすべての
    組み合わせを持ち、標識された標識ＤＮＡプローブ又は
    標識ヌクレオチドフォスフェートを用いて前記ＤＮＡ断
    片の相補鎖合成反応を行ない、前記ＤＮＡプローブの相
    補鎖伸長を行なう工程と、 ４） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を前記ＤＮＡプロー
    ブの種類毎に取り出す工程と、 ５） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖の３’末端にオリゴ
    マーを導入する工程と、 ６） 前記オリゴマーが導入されたＤＮＡ鎖を鋳型とし
    て、前記工程３）、及び前記工程４）を実行する工程
    と、 ７） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を長さに応じて分離
    し検出する工程とを少なくとも含むことを特徴とする核
    酸の分析方法又は検査方法。
  8. 【請求項８】請求項７に記載の方法において、前記工程
    ３）及び前記工程４）を繰り返す工程により、前記ＤＮ
    Ａ断片又は合成された前記ＤＮＡ断片の相補鎖を前記標
    識ＤＮＡプローブの種類毎に分離して前記ＤＮＡを検出
    することを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  9. 【請求項９】１） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程
    と、 ２）前記工程１）で得たＤＡＮ断片の３’末端にデオキ
    シヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを結
    合する工程と、 ３） 前記工程２）で結合した前記オリゴマー及び前記
    制限酵素が認識した配列の一部と相補的であり、３’末
    端に任意の塩基種からなる１塩基から３塩基のすべての
    組み合わせを持ち、標識された標識ＤＮＡプローブを用
    いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成反応を行ない、前記標
    識ＤＮＡプローブの相補鎖伸長を行なう工程と、 ４） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ断
    片を前記標識ＤＮＡプローブの種類毎に取り出す工程
    と、 ５） 前記工程３）を前記工程３）で用いた前記標識Ｄ
    ＮＡプローブとは異なる標識ＤＮＡプローブを用いて再
    び実行する工程と、 ６） 前記工程５）において得る前記相補鎖伸張したＤ
    ＮＡ鎖を長さに応じて分離し検出する工程とを少なくと
    も含むことを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  10. 【請求項１０】請求項１から請求項９のいずれかに記載
    の方法において用いられる前記制限酵素が、３’突出端
    を与える制限酵素であることを特徴とする核酸の分析方
    法又は検査方法。
  11. 【請求項１１】請求項１から請求項９のいずれかに記載
    の方法において用いられる前記制限酵素が、ブラントエ
    ンド型断片を生ずる制限酵素であることを特徴とするを
    特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  12. 【請求項１２】請求項１から請求項９のいずれかに記載
    の方法において用いられる前記制限酵素が、５’突出端
    を与える制限酵素であり、前記工程１）に続いて、ＤＮ
    Ａポリメラーゼにより前記制限酵素による切断部を２本
    鎖とする工程を含むことを特徴とする核酸の分析方法又
    は検査方法。
  13. 【請求項１３】請求項１に記載の方法において、２塩基
    の違いで分類された前記ＤＮＡ断片の相補鎖が、少なく
    とも蛍光体又は化学発光試薬により標識され、任意の２
    塩基の全ての可能な組み合わせ配列を３’末端に持つ標
    識ＤＮＡプローブを用いて相補鎖合成により生成される
    ことを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  14. 【請求項１４】１） ＤＮＡ断片群をそれぞれのＤＮＡ
    断片の３’末端近傍の２塩基の違いでグループに分類す
    る工程と、 ２） 前記グループのそれぞれに含まれる前記ＤＮＡ断
    片又は前記ＤＮＡ断片の相補鎖をゲル電気泳動により長
    さ分離する工程とを有し、前記ゲル電気泳動により得た
    泳動パターンを用いることを特徴とする核酸の分析方法
    又は検査方法。
  15. 【請求項１５】請求項１４に記載の方法において、前記
    ２塩基の違いで分類された前記ＤＮＡ断片の相補鎖が、
    少なくとも蛍光体又は化学発光試薬により標識され、任
    意の２塩基の全ての可能な組み合わせ配列を３’末端に
    持つ標識ＤＮＡプローブを用いて相補鎖合成により生成
    されることを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  16. 【請求項１６】１） ＤＮＡを切断する工程と、 ２） 前記工程１）で得たＤＮＡ断片の３’末端近傍の
    塩基の配列の違いを標識された標識ＤＮＡプローブで識
    別し、該標識ＤＮＡプローブを相補鎖合成反応により伸
    長させて前記ＤＮＡ断片をグループに区分する工程と、 ３） 前記グループに属する前記ＤＮＡ断片の長さ、又
    は前記相補鎖合成反応により相補鎖伸長した前記標識Ｄ
    ＮＡプローブの長さを計測する工程とを有し、前記ＤＮ
    Ａ断片の３’末端近傍の塩基の配列の種類毎に得る前記
    計測された長さに基づいて前記ＤＮＡを分析又は検査す
    ることを特徴とする核酸の分析方法又は検査方法。
  17. 【請求項１７】請求項１から請求項１６のいずれかに記
    載の方法において使用されるＤＮＡプローブであり、Ｎ
    1、…、Ｎn（５≦ｎ≦２７）、Ｘ1、…、Ｘm（１≦ｍ≦
    ６）、Ｙ1、Ｙ2をＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれかとし、
    前記相補鎖合成反応に用いるプライマーである前記標識
    ＤＮＡプローブは、５’−Ｎ1…ＮnＸ1…ＸmＹ1Ｙ2−
    ３’の形を有し、Ｎ1…Ｎnは前記ＤＮＡ断片に付加され
    るオリゴマーと実質的に相補的な配列を持ち、Ｘ1…Ｘm
    は前記制限酵素により切断された部分の配列の一部と実
    質的に相補的であり、Ｙ1Ｙ2はＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴのい
    ずれか２つからなるすべての組み合わせの１６種類から
    少なくともなることを特徴とするＤＮＡプローブ。
  18. 【請求項１８】請求項１から請求項１６のいずれかに記
    載の方法において使用される標識ＤＮＡプローブであ
    り、Ｎ1、…、Ｎn（５≦ｎ≦２７）、Ｘ1、…、Ｘm（１
    ≦ｍ≦６）、Ｙ1、Ｙ2を、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれ
    かとし、Ｚi（１≦ｉ≦３）を複数種類のヌクレオチド
    とハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログとし、前
    記相補鎖合成反応に用いるプライマーである前記標識Ｄ
    ＮＡプローブは、５’−Ｎ1…ＮnＸ1…ＸmＺ1…ＺiＹ1
    Ｙ2−３’の形を有し、Ｎ1…ＮnはＤＮＡ断片に付加し
    たオリゴマーと実質的に相補的な配列を持ち、Ｘ1…Ｘm
    は制限酵素により切断された部分の配列の一部と実質的
    に相補であり、Ｙ1Ｙ2はＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれか
    ２つからなるすべての組み合わせの１６種類を少なくと
    も含むことを特徴とするＤＮＡプローブ。
  19. 【請求項１９】請求項１７項又は請求項１８のいずれか
    に記載のＤＮＡプローブにおいて、Ｎ1、…、Ｎnのいず
    れかのヌクレオチドに、少なくともビオチン又は蛍光体
    の標識が付けられていることを特徴とするＤＮＡプロー
    ブ。
  20. 【請求項２０】１） 組織試料からｍＲＮＡを得て、ｍ
    ＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、 ２） 前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮ
    Ａを作成する工程と、 ３） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、 ４） 前記工程３）で得たＤＮＡ断片の３’末端近傍の
    塩基の配列の違いを標識された標識ＤＮＡプローブで識
    別し、該標識ＤＮＡプローブを相補鎖合成反応により伸
    長させて前記ＤＮＡ断片をグループに区分する工程と、 ５） 前記グループに属する前記ＤＮＡ断片の長さ、又
    は前記相補鎖合成反応により相補鎖伸長した前記標識Ｄ
    ＮＡプローブの長さを計測する工程とを有し、前記ＤＮ
    Ａ断片の３’末端近傍の塩基の配列の種類毎に得る前記
    計測された長さをフィンガープリントとして用い、前記
    ｍＲＮＡの種類と量に関する情報を得ることを特徴とす
    る核酸の分析法又は検査方法。
  21. 【請求項２１】１） 組織試料からｍＲＮＡを得て、ｍ
    ＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、 ２） 前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮ
    Ａを作成する工程と、 ３） 制限酵素で前記２本鎖ＤＮＡを切断する工程と、 ４） 前記工程３）で得たＤＮＡ断片の３’末端にデオ
    キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
    結合する工程と、 ５） 前記結合したオリゴマー及び前記制限酵素の認識
    配列の一部と相補的であり、３’末端に１又は２塩基か
    らなる任意の塩基配列を持ち、標識された４種類又は１
    ６種類の標識ＤＮＡプローブを用いる相補鎖合成反応に
    より前記標識ＤＮＡプローブを相補鎖伸長する工程と、 ６） 前記の相補鎖合成された鎖をゲル電気泳動分離し
    てＤＮＡ断片を検出する工程とを少なくとも含み、前記
    ｍＲＮＡの種類と量に関する情報を得ることを特徴とす
    る核酸の分析法又は検査方法。
  22. 【請求項２２】１） 組織試料からｍＲＮＡを得て、ｍ
    ＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、 ２） 前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮ
    Ａを作成する工程と、 ３） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、 ４） 前記工程３）で得たＤＡＮ断片の３’末端にデオ
    キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
    結合する工程と、 ５） 前記工程４）で結合した前記オリゴマー及び前記
    制限酵素が認識した配列の一部と相補的であり、３’末
    端に任意の塩基種からなる１塩基から３塩基のすべての
    組み合わせを持ち、標識された標識ＤＮＡプローブを用
    いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成反応を行ない、前記標
    識ＤＮＡプローブの相補鎖伸長を行なう工程と、 ６） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を前記標識ＤＮＡプ
    ローブの種類毎に取り出す工程と、 ７） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖の３’末端にオリゴ
    マーを導入する工程と、 ８） 前記オリゴマーが導入されたＤＮＡ鎖を鋳型とし
    て、前記工程５）、及び前記工程６）を実行する工程
    と、 ９） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を長さに応じて分離
    し検出する工程とを少なくとも含み、前記ｍＲＮＡの種
    類と量に関する情報を得ることを特徴とする核酸の分析
    法又は検査方法。
  23. 【請求項２３】１） 組織試料からｍＲＮＡを得て、ｍ
    ＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、 ２） 前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮ
    Ａを作成する工程と、 ３） 制限酵素でＤＮＡを切断する工程と、 ４） 前記工程３）で得たＤＡＮ断片の３’末端にデオ
    キシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを
    結合する工程と、 ５） 前記工程４）で結合した前記オリゴマー及び前記
    制限酵素が認識した配列の一部と相補的であり、３’末
    端に任意の塩基種からなる１塩基から３塩基のすべての
    組み合わせを持ち、標識された標識ＤＮＡプローブを用
    いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成反応を行ない、前記標
    識ＤＮＡプローブの相補鎖伸長を行なう工程と、 ６） 前記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ断
    片を前記標識ＤＮＡプローブの種類毎に取り出す工程
    と、 ７） 前記工程５）を前記工程５）で用いた前記標識Ｄ
    ＮＡプローブとは異なる標識ＤＮＡプローブを用いて再
    び実行する工程と、８） 前記工程７）において得る前
    記相補鎖伸張したＤＮＡ鎖を長さに応じて 分離し検出する工程とを少なくとも含み、前記ｍＲＮＡ
    の種類と量に関する情報を得ることを特徴とする核酸の
    分析法又は検査方法。
  24. 【請求項２４】１） 組織試料からｍＲＮＡを得て、ｍ
    ＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、 ２） 前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮ
    Ａを作成する工程と、 ３） 前記２本鎖ＤＮＡから得るＤＮＡ断片群をそれぞ
    れのＤＮＡ断片の３’末端近傍の２塩基の違いでグルー
    プに分類する工程と、 ４） 前記グループのそれぞれに含まれる前記ＤＮＡ断
    片又は前記ＤＮＡ断片の相補鎖をゲル電気泳動により長
    さ分離する工程とを有し、前記ゲル電気泳動により得た
    泳動パターンを用いることにより、前記ｍＲＮＡの種類
    と量に関する情報を得ることを特徴とする核酸の分析法
    又は検査方法。
  25. 【請求項２５】１） 組織試料からｍＲＮＡを得て、ｍ
    ＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対を作成する工程と、 ２） 前記ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ相補対から、２本鎖ＤＮ
    Ａを作成する工程と、 ３） 前記２本鎖ＤＮＡを切断する工程と、 ４） 前記工程３）で得たＤＮＡ断片の３’末端近傍の
    塩基の配列の違いを標識された標識ＤＮＡプローブで識
    別し、該標識ＤＮＡプローブを相補鎖合成反応により伸
    長させて前記ＤＮＡ断片をグループに区分する工程と、 ５） 前記グループに属する前記ＤＮＡ断片の長さ、又
    は前記相補鎖合成反応により相補鎖伸長した前記標識Ｄ
    ＮＡプローブの長さを計測する工程とを有し、前記ＤＮ
    Ａ断片の３’末端近傍の塩基の配列の種類毎に得る前記
    計測された長さに基づいて、前記ＤＮＡを分析又は検査
    することにより、前記ｍＲＮＡの種類と量に関する情報
    を得ることを特徴とする核酸の分析法又は検査方法。
  26. 【請求項２６】請求項１から請求項２５のいずれかに記
    載の方法を用いることを特徴とする核酸の分析装置又は
    検査装置。
  27. 【請求項２７】制限酵素でＤＮＡを切断する反応を行な
    う第１の反応容器と、前記切断反応生成物を分取して収
    納する複数の第２の反応容器のそれぞれに、３’末端近
    傍の塩基の配列が互いに異なり、標識された複数の標識
    ＤＮＡプローブのいずれかを混合して、前記切断反応で
    得たＤＮＡ断片の３’末端近傍の塩基の配列の違いを前
    記標識ＤＮＡプローブで識別し、前記標識ＤＮＡプロー
    ブの相補鎖合成反応により伸長させて前記ＤＮＡ断片を
    グループに区分するための第２の反応を行なう複数の第
    ２の反応容器と、前記グループに属する前記ＤＮＡ断片
    の長さ、又は前記相補鎖合成反応により相補鎖伸長した
    前記標識ＤＮＡプローブを検体として、該検体の長さを
    計測する電気泳動装置とを有し、前記ＤＮＡ断片の３’
    末端近傍の塩基の配列の種類毎に得る前記計測された前
    記検体の長さをフィンガープリントとして得ることを特
    徴とする核酸の分析装置又は検査装置。
  28. 【請求項２８】制限酵素でＤＮＡを切断する反応を行な
    い、該切断反応で得たＤＮＡ断片の３’末端にデオキシ
    ヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴマーを結合
    する反応を行なう第１の反応容器と、前記切断反応生成
    物を分取して収納する複数の第２の反応容器のそれぞれ
    に、前記結合したオリゴマー及び前記制限酵素の認識配
    列の一部と相補的であり、３’末端に１又は２塩基から
    なる任意の塩基配列を持ち、標識された４種類又は１６
    種類の標識ＤＮＡプローブのいずれかを混合して、前記
    標識ＤＮＡプローブを用いる相補鎖合成反応により前記
    標識ＤＮＡプローブの相補鎖伸長反応からなる第２の反
    応を行なう複数の第２の反応容器と、前記の相補鎖合成
    されたＤＮＡ鎖を検体として、該検体の長さを計測する
    電気泳動装置とを有し、前記標識ＤＮＡプローブの種類
    毎に得られる前記検体の長さをフィンガープリントとし
    て得ることを特徴とする核酸の分析装置又は検査装置。
  29. 【請求項２９】請求項２７又は請求項２８に記載の装置
    において、前記電気泳動装置のゲル電気泳動路で、前記
    検体とともに、長さマーカを電気泳動して、電気泳動分
    離された検体断片を区画、分類することを特徴とする核
    酸の分析装置又は検査装置。
  30. 【請求項３０】請求項２９に記載の装置において、前記
    検体及び前記長さマーカが蛍光体でそれぞれ標識されて
    おり、前記検体と前記長さマーカが蛍光体の蛍光波長に
    より識別されることを特徴とする核酸の分析装置又は検
    査装置。
  31. 【請求項３１】請求項２７に記載の装置において、前記
    複数の第２の反応容器のそれぞれに、前記複数の標識Ｄ
    ＮＡプローブを別々に入れて、前記第２の反応を同時に
    行なうことを特徴とする核酸の分析装置又は検査装置。
  32. 【請求項３２】請求項２８に記載の装置において、前記
    複数の第２の反応容器のそれぞれに、少なくとも前記の
    １６種類の標識ＤＮＡプローブを別々に入れて、前記第
    ２の反応を同時に行なうことを特徴とする核酸の分析装
    置又は検査装置。
  33. 【請求項３３】複数のＤＮＡ断片を含む検体を長さマー
    カとともに分離する分離手段を有し、前記検体を前記Ｄ
    ＮＡ断片の長さにより区画、分類することを特徴とする
    核酸の分析装置又は検査装置。
  34. 【請求項３４】請求項３３に記載の装置において、前記
    分離手段がゲル電気泳動装置であり、前記検体及び前記
    長さマーカが蛍光体でそれぞれ標識されており、前記検
    体と前記長さマーカが蛍光体の蛍光波長により識別され
    ることを特徴とする核酸の分析装置又は検査装置。
  35. 【請求項３５】複数の反応容器、温度を制御して化学反
    応を行なうための化学反応槽とを有し、前記複数の反応
    容器のそれぞれに、少なくとも１６種類の標識ＤＮＡプ
    ローブを別々に入れて、前記化学反応槽内に前記複数の
    反応容器を入れ、前記複数の反応容器のそれぞれの中の
    ＤＮＡ断片と前記標識ＤＮＡプローブとを同時に反応さ
    せることを特徴とする核酸の分析装置又は検査装置。
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