JPH09173065A - 核酸増幅反応の阻害を減少する方法 - Google Patents
核酸増幅反応の阻害を減少する方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生物学的サンプル中の核酸増幅の阻害を減少
または排除するための物質および方法を提供する。 【解決手段】 以下の工程： ａ）核酸増幅阻害剤がアニオン性固相と結合するように
サンプルをアニオン性固相と接触させ； ｂ）アニオン性固相とこれに結合した核酸増幅阻害剤を
サンプルから分離し、そして； ｃ）サンプル中に含まれる核酸を増幅する、からなる核
酸増幅阻害剤を含むサンプル中の核酸を増幅する方法。
または排除するための物質および方法を提供する。 【解決手段】 以下の工程： ａ）核酸増幅阻害剤がアニオン性固相と結合するように
サンプルをアニオン性固相と接触させ； ｂ）アニオン性固相とこれに結合した核酸増幅阻害剤を
サンプルから分離し、そして； ｃ）サンプル中に含まれる核酸を増幅する、からなる核
酸増幅阻害剤を含むサンプル中の核酸を増幅する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的サンプル
中の核酸増幅の阻害を減少または排除するための物質お
よび方法に関する。
中の核酸増幅の阻害を減少または排除するための物質お
よび方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸増幅法は少量の核酸を検出、分析す
るための強力な手段を提供してきた。この方法は極めて
感度がよいために、感染病や遺伝病の早期診断、分析用
遺伝子の単離、および法医学での特定核酸の検出に用い
るための開発の試みがなされてきた。核酸増幅法はその
方法に必要な温度によって区別される。ポリメラーゼ・
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）、リガーゼ・チェイ
ン・リアクション（ＬＣＲ）および転写に基づく増幅で
は、高温（８５℃−１００℃）と低温（３０℃−４０
℃）との間の反応サイクルを繰り返して、次の増幅サイ
クルのための一本鎖標的分子を生成する必要がある。こ
れとは対照的に、鎖置換増幅（Strand Displacement Am
plification：ＳＤＡ）、自己支持配列複製（self-sust
ained sequence replication：３ＳＲ）およびＱβレプ
リカーゼ系は一定温度で実施できる恒温反応である。従
来のＳＤＡ（低温、通常は約３５−４５℃で実施する）
は G.T. Walkerら(1992a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89, 392-396 および 1992b.Nuc. Acids. Res. 20, 169
1-1696）が記載している。好熱タイプのＳＤＡ反応（ｔ
ＳＤＡ、以下に記載する）が最近開発され、これは熱安
定性ポリメラーゼと制限酵素を用いて、高温であるが一
定温度で実施される。好熱性ＳＤＡは本質的には従来の
ＳＤＡと同様に実施するが、熱安定性ポリメラーゼと熱
安定性制限酵素に置き換えて行う。反応温度は選択した
好熱性酵素に適したより高温に調整し、従来の制限酵素
認識／開裂部位は選択した熱安定性制限酵素のために適
した制限酵素認識／開裂部位に置き換える。
るための強力な手段を提供してきた。この方法は極めて
感度がよいために、感染病や遺伝病の早期診断、分析用
遺伝子の単離、および法医学での特定核酸の検出に用い
るための開発の試みがなされてきた。核酸増幅法はその
方法に必要な温度によって区別される。ポリメラーゼ・
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）、リガーゼ・チェイ
ン・リアクション（ＬＣＲ）および転写に基づく増幅で
は、高温（８５℃−１００℃）と低温（３０℃−４０
℃）との間の反応サイクルを繰り返して、次の増幅サイ
クルのための一本鎖標的分子を生成する必要がある。こ
れとは対照的に、鎖置換増幅（Strand Displacement Am
plification：ＳＤＡ）、自己支持配列複製（self-sust
ained sequence replication：３ＳＲ）およびＱβレプ
リカーゼ系は一定温度で実施できる恒温反応である。従
来のＳＤＡ（低温、通常は約３５−４５℃で実施する）
は G.T. Walkerら(1992a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89, 392-396 および 1992b.Nuc. Acids. Res. 20, 169
1-1696）が記載している。好熱タイプのＳＤＡ反応（ｔ
ＳＤＡ、以下に記載する）が最近開発され、これは熱安
定性ポリメラーゼと制限酵素を用いて、高温であるが一
定温度で実施される。好熱性ＳＤＡは本質的には従来の
ＳＤＡと同様に実施するが、熱安定性ポリメラーゼと熱
安定性制限酵素に置き換えて行う。反応温度は選択した
好熱性酵素に適したより高温に調整し、従来の制限酵素
認識／開裂部位は選択した熱安定性制限酵素のために適
した制限酵素認識／開裂部位に置き換える。
【０００３】核酸増幅反応は、増幅すべき標的配列が適
合性バッファー中にあり、かつ実質的に非核酸分子を含
まない”きれいな”系では非常に再現性がよく効率が高
い。しかしながら、臨床の場では、標的配列は一般に生
物学的サンプル中にあり、種々の非核酸分子（例えばタ
ンパク質、炭水化物、脂質など）をも含む。生物学的サ
ンプル中の核酸増幅は、存在するその他の生物学的分子
が増幅反応を部分的または全体的に妨害するために、し
ばしば一致せず、バラツキが大きくなる。このため誤っ
た陰性の結果が出たり、存在する標的配列の量を正確に
定量できない。さらに、増幅が阻害されるサンプルでは
強い陽性サンプルが弱い陽性となるかも知れない。これ
らの問題は、核酸増幅に基づく試験結果に基づいて患者
を正確に診断したり有効に治療したりすることを困難に
する。
合性バッファー中にあり、かつ実質的に非核酸分子を含
まない”きれいな”系では非常に再現性がよく効率が高
い。しかしながら、臨床の場では、標的配列は一般に生
物学的サンプル中にあり、種々の非核酸分子（例えばタ
ンパク質、炭水化物、脂質など）をも含む。生物学的サ
ンプル中の核酸増幅は、存在するその他の生物学的分子
が増幅反応を部分的または全体的に妨害するために、し
ばしば一致せず、バラツキが大きくなる。このため誤っ
た陰性の結果が出たり、存在する標的配列の量を正確に
定量できない。さらに、増幅が阻害されるサンプルでは
強い陽性サンプルが弱い陽性となるかも知れない。これ
らの問題は、核酸増幅に基づく試験結果に基づいて患者
を正確に診断したり有効に治療したりすることを困難に
する。
【０００４】しかしながら、特定の阻害分子や阻害メカ
ニズムについては知られていない。このため、生物学的
サンプル中での核酸増幅の阻害を減少または排除するた
めの従来の方法は、比較的非特異的であり、サンプル中
のタンパク質の一般的除去または分解に向けられてき
た。例えば、疎水性タンパク質を除去する一般的方法と
して生物学的サンプルのフェノール抽出が用いられてき
た。サンプルからの分離のためにヒドロキシル化表面が
タンパク質結合に用いられており、非特異的タンパク質
の分解にはプロテアーゼ処理が用いられてきた。多くの
場合、増幅前にサンプルを希釈することによって阻害剤
の効果を克服することも可能である。しかしながら、こ
のアプローチでは増幅すべき標的をも希釈することにな
り、そのためアッセイ感度を減少する。別のアプローチ
は、例えばシリカに結合することによって非核酸分子か
ら核酸を単離することであった。核酸の単離は増幅阻害
剤を首尾よく排除することが多いが、この方法は時間が
かかり、標的の回収が一般に定量的でなく、そのためア
ッセイ感度で妥協することになる。このような一般的方
法の成功はまちまちであり、これは部分的には種々の生
物学的サンプル中の阻害剤分子の量とタイプが異なるた
めである。
ニズムについては知られていない。このため、生物学的
サンプル中での核酸増幅の阻害を減少または排除するた
めの従来の方法は、比較的非特異的であり、サンプル中
のタンパク質の一般的除去または分解に向けられてき
た。例えば、疎水性タンパク質を除去する一般的方法と
して生物学的サンプルのフェノール抽出が用いられてき
た。サンプルからの分離のためにヒドロキシル化表面が
タンパク質結合に用いられており、非特異的タンパク質
の分解にはプロテアーゼ処理が用いられてきた。多くの
場合、増幅前にサンプルを希釈することによって阻害剤
の効果を克服することも可能である。しかしながら、こ
のアプローチでは増幅すべき標的をも希釈することにな
り、そのためアッセイ感度を減少する。別のアプローチ
は、例えばシリカに結合することによって非核酸分子か
ら核酸を単離することであった。核酸の単離は増幅阻害
剤を首尾よく排除することが多いが、この方法は時間が
かかり、標的の回収が一般に定量的でなく、そのためア
ッセイ感度で妥協することになる。このような一般的方
法の成功はまちまちであり、これは部分的には種々の生
物学的サンプル中の阻害剤分子の量とタイプが異なるた
めである。
【０００５】
【発明が解決すべき課題】唾液サンプル中の一定した核
酸増幅を得ることは特に困難であった。なぜならこの種
の生物学的サンプルは増幅反応において特に阻害性であ
るからである。しかしながら、唾液は結核などの肺疾患
の診断で非常に重要な標本である。唾液は一般に非常に
粘性であるので（特に肺疾患がある場合には）唾液サン
プルは分析前に液化することが多い。唾液中のマイコバ
クテリウム属（Mycobacteia）の分析に一般に用いるサ
ンプル処理法は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン／水酸
化ナトリウム法である。この方法はＮａＯＨ、クエン酸
ナトリウムおよびＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡ
ＬＣ）を用いてサンプルを液化し、遠心によってマイコ
バクテリウムを回収する。次いでペレットを少量中に再
懸濁し、培養またはその他の診断試験に用いる。水酸化
ナトリウムを単独で用いる類似の方法も開発されてお
り、この場合には再懸濁と分析の前にペレットを中和す
る。唾液サンプルの処理にラウリル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＬＳ）と一緒にＮａＯＨを用いることもあり、この場合
にも培養またはその他の試験前に酸を加えてペレットを
中和する。多くの場合、増幅阻害剤は分析すべきマイコ
バクテリウムとともに、遠心工程後のペレット中に見い
だされる。有意な数のサンプルの上清も阻害性である。
結果が一致せず、まちまちであり解釈が困難となるの
で、これが核酸増幅で最も困難を示すサンプルである。
酸増幅を得ることは特に困難であった。なぜならこの種
の生物学的サンプルは増幅反応において特に阻害性であ
るからである。しかしながら、唾液は結核などの肺疾患
の診断で非常に重要な標本である。唾液は一般に非常に
粘性であるので（特に肺疾患がある場合には）唾液サン
プルは分析前に液化することが多い。唾液中のマイコバ
クテリウム属（Mycobacteia）の分析に一般に用いるサ
ンプル処理法は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン／水酸
化ナトリウム法である。この方法はＮａＯＨ、クエン酸
ナトリウムおよびＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡ
ＬＣ）を用いてサンプルを液化し、遠心によってマイコ
バクテリウムを回収する。次いでペレットを少量中に再
懸濁し、培養またはその他の診断試験に用いる。水酸化
ナトリウムを単独で用いる類似の方法も開発されてお
り、この場合には再懸濁と分析の前にペレットを中和す
る。唾液サンプルの処理にラウリル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＬＳ）と一緒にＮａＯＨを用いることもあり、この場合
にも培養またはその他の試験前に酸を加えてペレットを
中和する。多くの場合、増幅阻害剤は分析すべきマイコ
バクテリウムとともに、遠心工程後のペレット中に見い
だされる。有意な数のサンプルの上清も阻害性である。
結果が一致せず、まちまちであり解釈が困難となるの
で、これが核酸増幅で最も困難を示すサンプルである。
【０００６】ある種の糖タンパク質、特にムチンが核酸
増幅の有意な阻害剤であることが今回発見された。糖タ
ンパク質は炭水化物部分との共有結合を含むタンパク質
である。これらは特に哺乳動物組織で阻害性である。糖
タンパク質の炭水化物鎖は主として次の７つの糖からな
る：Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ
ミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−グルコース、Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、
およびシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＧＮ
Ａ）。ムチンはＮ−アセチルノイラミニル−（２→６）
−Ｎ−アセチルガラクトサミンの二糖類を含む複雑な炭
水化物構造をもつ糖タンパク質である。ムコ多糖（アミ
ノ糖またはその誘導体を含む多糖）もまたタンパク質と
共有結合していることがしばしば見られる。多くのムコ
多糖のアミノ糖は糖タンパク質に見られるものと同じで
あるが、ムコ多糖−タンパク質構造は多くの糖タンパク
質よりもはるかに炭水化物に富むので、一般には別の分
子群であると考えられている。高濃度のムチンをしばし
ば含む唾液サンプルの場合、液化などの従来のサンプル
処理法は糖タンパク質の阻害効果を増加するように思わ
れる。これらの増幅阻害メカニズムの発見により、糖タ
ンパク質を標的とするその阻害効果の減少法の開発が可
能となった。
増幅の有意な阻害剤であることが今回発見された。糖タ
ンパク質は炭水化物部分との共有結合を含むタンパク質
である。これらは特に哺乳動物組織で阻害性である。糖
タンパク質の炭水化物鎖は主として次の７つの糖からな
る：Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ
ミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−グルコース、Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、
およびシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＧＮ
Ａ）。ムチンはＮ−アセチルノイラミニル−（２→６）
−Ｎ−アセチルガラクトサミンの二糖類を含む複雑な炭
水化物構造をもつ糖タンパク質である。ムコ多糖（アミ
ノ糖またはその誘導体を含む多糖）もまたタンパク質と
共有結合していることがしばしば見られる。多くのムコ
多糖のアミノ糖は糖タンパク質に見られるものと同じで
あるが、ムコ多糖−タンパク質構造は多くの糖タンパク
質よりもはるかに炭水化物に富むので、一般には別の分
子群であると考えられている。高濃度のムチンをしばし
ば含む唾液サンプルの場合、液化などの従来のサンプル
処理法は糖タンパク質の阻害効果を増加するように思わ
れる。これらの増幅阻害メカニズムの発見により、糖タ
ンパク質を標的とするその阻害効果の減少法の開発が可
能となった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】ある種の糖タンパク質、
特にムチンは核酸増幅反応の阻害剤であることが見いだ
された。阻害性糖タンパク質に見られるある種のアミノ
糖からなるある種のムコ多糖（グリコサミノグリカン）
も阻害性である。増幅反応の阻害は炭水化物鎖の部分分
解と関連することがさらに見いだされた。すなわち、非
阻害性の糖タンパク質の炭水化物の部分分解が阻害性を
付与し、やや阻害性の糖タンパク質の炭水化物の部分分
解がより一層阻害性にする。増幅前のサンプル処理は、
存在する糖タンパク質の炭水化物鎖の部分分解によって
非阻害性標本を阻害性にするかも知れない。対照的に、
炭水化物の完全除去は阻害効果を減少または排除する。
同様に、炭水化物鎖が野生型の糖タンパク質構造のよう
に完全である場合には、一般に分子は阻害性ではない。
しかしながら、野生型糖タンパク質でも例外がある。例
えば、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）は完全な野生型炭水化
物構造をもっていても増幅に対して阻害性である。炭水
化物鎖の部分分解に関連する増幅の阻害は、１）糖タン
パク質またはムコ多糖を除去または希釈する、２）炭水
化物鎖を完全に分解する（例えば酵素的に）、あるいは
３）最初は阻害性でないサンプル中の炭水化物鎖の野生
型構造を維持するサンプル処理方法を行う、ことによっ
て減少または排除できる。
特にムチンは核酸増幅反応の阻害剤であることが見いだ
された。阻害性糖タンパク質に見られるある種のアミノ
糖からなるある種のムコ多糖（グリコサミノグリカン）
も阻害性である。増幅反応の阻害は炭水化物鎖の部分分
解と関連することがさらに見いだされた。すなわち、非
阻害性の糖タンパク質の炭水化物の部分分解が阻害性を
付与し、やや阻害性の糖タンパク質の炭水化物の部分分
解がより一層阻害性にする。増幅前のサンプル処理は、
存在する糖タンパク質の炭水化物鎖の部分分解によって
非阻害性標本を阻害性にするかも知れない。対照的に、
炭水化物の完全除去は阻害効果を減少または排除する。
同様に、炭水化物鎖が野生型の糖タンパク質構造のよう
に完全である場合には、一般に分子は阻害性ではない。
しかしながら、野生型糖タンパク質でも例外がある。例
えば、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）は完全な野生型炭水化
物構造をもっていても増幅に対して阻害性である。炭水
化物鎖の部分分解に関連する増幅の阻害は、１）糖タン
パク質またはムコ多糖を除去または希釈する、２）炭水
化物鎖を完全に分解する（例えば酵素的に）、あるいは
３）最初は阻害性でないサンプル中の炭水化物鎖の野生
型構造を維持するサンプル処理方法を行う、ことによっ
て減少または排除できる。
【０００８】グリコサミノグリカンおよび糖タンパク質
の核酸増幅効率に及ぼす影響を、増幅不能な唾液サンプ
ル中の阻害源を同定する試みの中で研究した。増幅に及
ぼす影響を見るために、Walkerら（上述）が記載するよ
うな従来の低温ＳＤＡモデル系で種々のグリコサミノグ
リカンおよび糖タンパク質（ムチンを含む）を試験し
た。これらの化合物は２重のＳＤＡ反応中に、５μｇ／
μＬおよび０．５μｇ／μＬで試験し、C. A. Spargoら
(1993、 Molec. Cell. Probes 7, 395-404)の記載する化
学発光アッセイで検出した。ウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）
Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓは従来のＳＤＡで最も阻害性であり、
０．５μｇ／μＬで完全に増幅を阻害した。２番目に阻
害性である化合物はウシムチンＴｙｐｅ ＩＩであっ
た。ヒト血液からのアシアログリコフォリンおよびウシ
下顎ムチン（ＢＳＭ）Ｔｙｐｅ Ｉは中程度に阻害性で
あり、陽性対照と比較して低レベルで増幅を許容した。
ウシ下顎腺由来のアシアロムチンおよびコーンフラクシ
ョン（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＶＩ由来の糖タン
パク質α1−酸は陽性対照と同レベルの増幅で示される
ように、増幅に対してほとんどまたは全く陰性効果をも
っていなかった。ＢＳＭＴｙｐｅ ＩＩは５μｇ／μＬ
でＳＤＡを完全に阻害し、０．５μｇ／μＬで約７５％
増幅を減少した。レクチン（植物糖タンパク質）も５μ
ｇ／μＬ、４μｇ／μＬ、３μｇ／μＬおよび２μｇ／
μＬで従来のＳＤＡに対して阻害性であることが見いだ
された。１μｇ／μＬではレクチンの存在下で増幅は検
出可能となり始めた。グリコサミノグリカンのうち、ヘ
パリンのみが従来のＳＤＡを阻害し、この阻害性はヘパ
リナーゼ処理によって克服された。試験したその他のグ
リコサミノグリカン（キチン、コンドロイチン硫酸Ｂ、
ケラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａおよび
コンドロイチン硫酸Ｃ）は有意な阻害効果をもっていな
かった。この実験から、一般にムチンは従来のＳＤＡ反
応にスパイクするときにはヒト血液糖タンパク質よりも
阻害性であるように思われる。いくつかのムチンおよび
レクチンの阻害効果は希釈によって減少するので、濃度
効果も証明した。
の核酸増幅効率に及ぼす影響を、増幅不能な唾液サンプ
ル中の阻害源を同定する試みの中で研究した。増幅に及
ぼす影響を見るために、Walkerら（上述）が記載するよ
うな従来の低温ＳＤＡモデル系で種々のグリコサミノグ
リカンおよび糖タンパク質（ムチンを含む）を試験し
た。これらの化合物は２重のＳＤＡ反応中に、５μｇ／
μＬおよび０．５μｇ／μＬで試験し、C. A. Spargoら
(1993、 Molec. Cell. Probes 7, 395-404)の記載する化
学発光アッセイで検出した。ウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）
Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓは従来のＳＤＡで最も阻害性であり、
０．５μｇ／μＬで完全に増幅を阻害した。２番目に阻
害性である化合物はウシムチンＴｙｐｅ ＩＩであっ
た。ヒト血液からのアシアログリコフォリンおよびウシ
下顎ムチン（ＢＳＭ）Ｔｙｐｅ Ｉは中程度に阻害性で
あり、陽性対照と比較して低レベルで増幅を許容した。
ウシ下顎腺由来のアシアロムチンおよびコーンフラクシ
ョン（Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＶＩ由来の糖タン
パク質α1−酸は陽性対照と同レベルの増幅で示される
ように、増幅に対してほとんどまたは全く陰性効果をも
っていなかった。ＢＳＭＴｙｐｅ ＩＩは５μｇ／μＬ
でＳＤＡを完全に阻害し、０．５μｇ／μＬで約７５％
増幅を減少した。レクチン（植物糖タンパク質）も５μ
ｇ／μＬ、４μｇ／μＬ、３μｇ／μＬおよび２μｇ／
μＬで従来のＳＤＡに対して阻害性であることが見いだ
された。１μｇ／μＬではレクチンの存在下で増幅は検
出可能となり始めた。グリコサミノグリカンのうち、ヘ
パリンのみが従来のＳＤＡを阻害し、この阻害性はヘパ
リナーゼ処理によって克服された。試験したその他のグ
リコサミノグリカン（キチン、コンドロイチン硫酸Ｂ、
ケラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａおよび
コンドロイチン硫酸Ｃ）は有意な阻害効果をもっていな
かった。この実験から、一般にムチンは従来のＳＤＡ反
応にスパイクするときにはヒト血液糖タンパク質よりも
阻害性であるように思われる。いくつかのムチンおよび
レクチンの阻害効果は希釈によって減少するので、濃度
効果も証明した。
【０００９】好熱性ＳＤＡは一般に従来のＳＤＡよりも
試験した化合物による阻害に対して感受性であり、これ
は好熱性ＳＤＡの高温では阻害性化合物の阻害性相互作
用が増加するか、あるいはその溶解度が増加するためで
あると思われる。野生型ウシ下顎ムチンは従来のＳＤＡ
と同様に好熱性ＳＤＡも完全に阻害したが、従来のＳＤ
Ａに対してほとんど効果のなかったアシアロＢＳＭは好
熱性ＳＤＡを約７６％減少した。同様に、従来のＳＤＡ
に対して最小の阻害効果を示したアシアロおよび野生型
のヒト血液糖タンパク質は好熱性ＳＤＡを約６６％減少
した。グリコサミノグリカンのうち、キチン、ヘパリン
およびコンドロイチン硫酸Ｂが好熱性ＳＤＡを阻害し
た。従来のＳＤＡと同様に、試験したその他のグリコサ
ミノグリカン（ケラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチ
ン硫酸Ａおよびコンドロイチン硫酸Ｃ）は阻害性ではな
かった。
試験した化合物による阻害に対して感受性であり、これ
は好熱性ＳＤＡの高温では阻害性化合物の阻害性相互作
用が増加するか、あるいはその溶解度が増加するためで
あると思われる。野生型ウシ下顎ムチンは従来のＳＤＡ
と同様に好熱性ＳＤＡも完全に阻害したが、従来のＳＤ
Ａに対してほとんど効果のなかったアシアロＢＳＭは好
熱性ＳＤＡを約７６％減少した。同様に、従来のＳＤＡ
に対して最小の阻害効果を示したアシアロおよび野生型
のヒト血液糖タンパク質は好熱性ＳＤＡを約６６％減少
した。グリコサミノグリカンのうち、キチン、ヘパリン
およびコンドロイチン硫酸Ｂが好熱性ＳＤＡを阻害し
た。従来のＳＤＡと同様に、試験したその他のグリコサ
ミノグリカン（ケラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチ
ン硫酸Ａおよびコンドロイチン硫酸Ｃ）は阻害性ではな
かった。
【００１０】これらの結果は、糖タンパク質のシアル酸
含量が増幅の阻害度と関連することを示唆する。なぜな
ら、より阻害性の糖タンパク質（例えばＢＳＭ Ｔｙｐ
ｅＩ−Ｓ）は一般に、約９０％のシアル酸を除去したよ
り阻害性の低い糖タンパク質（例えばウシ下顎アシアロ
ムチン）よりも高いシアル酸含量をもっているからであ
る。従って、ブタ下顎ムチンＡ-（ＰＳＭ Ａ-、シアル
酸が存在）およびアシアロＰＳＭ（シアル酸を酵素的に
除去）を従来のＳＤＡにおいて４つの異なる濃度で試験
して糖タンパク質のシアル酸濃度の効果を試験した。Ａ
-ＰＳＭ（４．１μｇ／μＬ）およびアシアロＰＳＭ
（５．０μｇ／μＬ）のストック溶液（２０μＬまたは
１０μＬと水１０μＬ）の少量を従来のＳＤＡ反応５０
μＬに加えた。試験した最高濃度で、アシアロＰＳＭは
約７５％で増幅を減少し、一方Ａ-ＰＳＭは約５０％で
増幅を減少し、これはシアル酸の濃度のみが増幅阻害度
における有意な因子ではないことを示唆する。
含量が増幅の阻害度と関連することを示唆する。なぜな
ら、より阻害性の糖タンパク質（例えばＢＳＭ Ｔｙｐ
ｅＩ−Ｓ）は一般に、約９０％のシアル酸を除去したよ
り阻害性の低い糖タンパク質（例えばウシ下顎アシアロ
ムチン）よりも高いシアル酸含量をもっているからであ
る。従って、ブタ下顎ムチンＡ-（ＰＳＭ Ａ-、シアル
酸が存在）およびアシアロＰＳＭ（シアル酸を酵素的に
除去）を従来のＳＤＡにおいて４つの異なる濃度で試験
して糖タンパク質のシアル酸濃度の効果を試験した。Ａ
-ＰＳＭ（４．１μｇ／μＬ）およびアシアロＰＳＭ
（５．０μｇ／μＬ）のストック溶液（２０μＬまたは
１０μＬと水１０μＬ）の少量を従来のＳＤＡ反応５０
μＬに加えた。試験した最高濃度で、アシアロＰＳＭは
約７５％で増幅を減少し、一方Ａ-ＰＳＭは約５０％で
増幅を減少し、これはシアル酸の濃度のみが増幅阻害度
における有意な因子ではないことを示唆する。
【００１１】同様の試験で、炭水化物構造の組成と複雑
さにおいてのみ異なる６つのムチンの阻害効果を比較し
た。これらの分子は以下の表に示すように、種々のグリ
コシダーゼを用いて関連する炭水化物鎖を選択的に酵素
分解することによりＰＳＭから調製した。Ａｐｏ ＰＳ
Ｍの生成に用いた酵素処理は、糖タンパク質分子の９９
％からすべての炭水化物を完全に除去するのに有効であ
った。約１％はタンパク質と結合した残渣のＧａｌＮＡ
ｃ残基をもっていた。
さにおいてのみ異なる６つのムチンの阻害効果を比較し
た。これらの分子は以下の表に示すように、種々のグリ
コシダーゼを用いて関連する炭水化物鎖を選択的に酵素
分解することによりＰＳＭから調製した。Ａｐｏ ＰＳ
Ｍの生成に用いた酵素処理は、糖タンパク質分子の９９
％からすべての炭水化物を完全に除去するのに有効であ
った。約１％はタンパク質と結合した残渣のＧａｌＮＡ
ｃ残基をもっていた。
【００１２】 ムチン ＣＨＯ構造 Ａ+ＰＳＭ(4.1μg/μL) 完全なCHO、 最も複雑 Ａ-ＰＳＭ(4.1μg/μL) 末端GalNAcをヘキソサミニダーゼで除去 Asialo ＰＳＭ(5.0μg/μL) シアル酸(NGNA)をノイラミニダーゼで除去 Afuco ＰＳＭ(1.0μg/μL) フコースを1,2α-フコシダーゼで除去 Apo ＰＳＭ(2.08μg/μL) すべてのCHOをo-グリカナーゼ、ノイラミニダー ゼ、ヘキソサミニダーゼおよび1,2α-フコシダ ーゼで除去 ＢＳＭ(5.0μg/μL) 完全なCHO、 最も複雑
【００１３】２０μＬ、１０μＬまたは１μＬを上述し
たようにＳＤＡ反応物５０μＬ中にスパイクし、化学発
光アッセイで検出した。ＳＤＡ陽性対照サンプルは２６
４８１ＲＬＵ（相対光単位）の結果を与えた。ＢＳＭは
前の実験では阻害性であると思われたが、Ａ+ＰＳＭお
よびＢＳＭ（野生型ムチン）はこの実験では阻害性では
なかった。この実験のＢＳＭは市販のもの（Sigma Chem
ical Company, St. Louis, MO）を購入したが、前に試
験した阻害性ＢＳＭは実験室で製造したものである。製
造法の違いが異なる炭水化物構造をもつＢＳＭとなり、
それによって糖タンパク質の阻害性に影響した可能性が
ある。Ａｐｏ ＰＳＭも増幅に対して阻害性ではなかっ
た。Ａ-ＰＳＭ、Ａｆｕｃｏ ＰＳＭおよびＡｓｉａｌ
ｏ ＰＳＭはすべて阻害性であり、Ａ-ＰＳＭが最大効
果をもっていた。Ａｆｕｃｏ ＰＳＭは両方の濃度でい
くらか阻害効果を示し、Ａｓｉａｌｏ ＰＳＭの阻害性
が最も小さかった。結果を以下に示す： ムチン ＲＬＵ（２０μＬ） ＲＬＵ（１０μＬ） Ａ-ＰＳＭ １８２．４ １０５０９．０ Ａｆｕｃｏ ＰＳＭ ２１１９．０ ４２５７．０ Ａｓｉａｌｏ ＰＳＭ ２７２８．０ ６１０９
たようにＳＤＡ反応物５０μＬ中にスパイクし、化学発
光アッセイで検出した。ＳＤＡ陽性対照サンプルは２６
４８１ＲＬＵ（相対光単位）の結果を与えた。ＢＳＭは
前の実験では阻害性であると思われたが、Ａ+ＰＳＭお
よびＢＳＭ（野生型ムチン）はこの実験では阻害性では
なかった。この実験のＢＳＭは市販のもの（Sigma Chem
ical Company, St. Louis, MO）を購入したが、前に試
験した阻害性ＢＳＭは実験室で製造したものである。製
造法の違いが異なる炭水化物構造をもつＢＳＭとなり、
それによって糖タンパク質の阻害性に影響した可能性が
ある。Ａｐｏ ＰＳＭも増幅に対して阻害性ではなかっ
た。Ａ-ＰＳＭ、Ａｆｕｃｏ ＰＳＭおよびＡｓｉａｌ
ｏ ＰＳＭはすべて阻害性であり、Ａ-ＰＳＭが最大効
果をもっていた。Ａｆｕｃｏ ＰＳＭは両方の濃度でい
くらか阻害効果を示し、Ａｓｉａｌｏ ＰＳＭの阻害性
が最も小さかった。結果を以下に示す： ムチン ＲＬＵ（２０μＬ） ＲＬＵ（１０μＬ） Ａ-ＰＳＭ １８２．４ １０５０９．０ Ａｆｕｃｏ ＰＳＭ ２１１９．０ ４２５７．０ Ａｓｉａｌｏ ＰＳＭ ２７２８．０ ６１０９
【００１４】これらの結果は、ムチンと関連する増幅阻
害レベルは炭水化物鎖の構造と関係しており、部分的に
分解された炭水化物鎖が阻害効果と関連することを示唆
する。従来のＳＤＡ反応では、完全（野生型）炭水化物
構造または炭水化物の完全欠如が阻害効果を克服するよ
うに思われる。糖タンパク質から実質的にすべての炭水
化物を除去することにより阻害効果がなくなることは、
実験で用いた特定の酵素処理に関連するとは信じられな
い。糖タンパク質から実質的に炭水化物をなくするその
他のグリコシダーゼまたはその他の炭水化物開裂酵素も
阻害効果を克服することが期待される。
害レベルは炭水化物鎖の構造と関係しており、部分的に
分解された炭水化物鎖が阻害効果と関連することを示唆
する。従来のＳＤＡ反応では、完全（野生型）炭水化物
構造または炭水化物の完全欠如が阻害効果を克服するよ
うに思われる。糖タンパク質から実質的にすべての炭水
化物を除去することにより阻害効果がなくなることは、
実験で用いた特定の酵素処理に関連するとは信じられな
い。糖タンパク質から実質的に炭水化物をなくするその
他のグリコシダーゼまたはその他の炭水化物開裂酵素も
阻害効果を克服することが期待される。
【００１５】これらの結果はまた、増幅前に生物学的サ
ンプルを処理する方法が観察される増幅阻害度に影響す
ることも示唆する。しばしば高濃度のムチンが観察され
る唾液はサンプル処理の効果に特に感受性であるという
仮説をたてた。唾液はほとんどの診断試験の前に典型的
にはＮＡＬＣおよびプロテイナーゼＫで処理されるの
で、ムチンの阻害特性に及ぼすこれらの処理の効果を評
価した。各種量のＢＳＭＴｙｐｅ Ｉ−ＳおよびＢＳＭ
Ｔｙｐｅ ＩＩを等量のＮＡＬＣとインキュベート
し、中和し、遠心した。上清を除去して捨てた。ペレッ
トを次に再中和、遠心し、ＫＰＤＧバッファー中のプロ
テイナーゼＫで５５℃、３０分処理した。プロテイナー
ゼＫを１００℃で５分インキュベートした後、サンプル
をＳＤＡ反応に用いた。この処理は典型的な唾液サンプ
ル処理を二重にした（duplicate）ものである。処理サ
ンプルは未処理サンプルと比較して以下に示す通り、増
幅阻害レベルが有意に増加した。陽性対照は１０７２４
ＲＬＵで、バックグランド化学発光は約１０−１４ＲＬ
Ｕであった。
ンプルを処理する方法が観察される増幅阻害度に影響す
ることも示唆する。しばしば高濃度のムチンが観察され
る唾液はサンプル処理の効果に特に感受性であるという
仮説をたてた。唾液はほとんどの診断試験の前に典型的
にはＮＡＬＣおよびプロテイナーゼＫで処理されるの
で、ムチンの阻害特性に及ぼすこれらの処理の効果を評
価した。各種量のＢＳＭＴｙｐｅ Ｉ−ＳおよびＢＳＭ
Ｔｙｐｅ ＩＩを等量のＮＡＬＣとインキュベート
し、中和し、遠心した。上清を除去して捨てた。ペレッ
トを次に再中和、遠心し、ＫＰＤＧバッファー中のプロ
テイナーゼＫで５５℃、３０分処理した。プロテイナー
ゼＫを１００℃で５分インキュベートした後、サンプル
をＳＤＡ反応に用いた。この処理は典型的な唾液サンプ
ル処理を二重にした（duplicate）ものである。処理サ
ンプルは未処理サンプルと比較して以下に示す通り、増
幅阻害レベルが有意に増加した。陽性対照は１０７２４
ＲＬＵで、バックグランド化学発光は約１０−１４ＲＬ
Ｕであった。
【００１６】 加えたムチンの量 ２５μＬ １５μＬ ５μＬ ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓ １０．７ ５．８ ９．０ ＢＳＭ Ｔｙｐｅ ＩＩ １８．８ １９．１ ２６１．２
【００１７】この実験でサンプル処理法が生物学的サン
プル中の増幅阻害を増加しうることを確認した。阻害性
糖タンパク質はＮＡＬＣ処理を行っても残り、このよう
な処理を行わないときよりももっと阻害性である。ＮＡ
ＬＣおよび／またはプロテイナーゼＫ処理は従ってサン
プル処理中の糖タンパク質の炭水化物の部分分解に寄与
し、その阻害効果を増加する。
プル中の増幅阻害を増加しうることを確認した。阻害性
糖タンパク質はＮＡＬＣ処理を行っても残り、このよう
な処理を行わないときよりももっと阻害性である。ＮＡ
ＬＣおよび／またはプロテイナーゼＫ処理は従ってサン
プル処理中の糖タンパク質の炭水化物の部分分解に寄与
し、その阻害効果を増加する。
【００１８】糖タンパク質が核酸増幅反応を阻害するメ
カニズムを評価するためにさらに実験を行った。種々の
炭水化物構造をもつムチンへの標的ＤＮＡの結合を試験
するためにフィルター結合アッセイを用いた。簡単に述
べると、種々のレベルのムチンを含むバッファー中でリ
ン酸化されたＤＮＡをニトロセルロースを通して濾過し
た。もしもムチンがＤＮＡに結合しないときは、ＤＮＡ
はフィルター上に保持されなかった。ＤＮＡにムチンが
結合すると、ムチンのＤＮＡに対するアフィニティーを
示唆する量でフィルター上に保持された。フィルターに
保持された放射能活性の量を検出することにより定量的
結果を得た。実験を行うには、標的ＤＮＡをリン酸化
し、以下の糖タンパク質のうちの１つと溶液中で混合し
た：ヒト血液糖タンパク質（非阻害性）、Ａ-ＰＳＭ
（高濃度でのみ阻害性）、ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓ
（高い阻害性）、Ａ+ＰＳＭ（非阻害性）およびＢＳＭ
（非阻害性）。有意に増幅を阻害する臨床的唾液サンプ
ルも試験した。ＢＳＭ ＴｙｐｅＩ−ＳはＤＮＡの約３
７．４５％と結合したが、ヒト血液糖タンパク質は標的
と検出しうる程度には結合しなかった。Ａ-ＰＳＭ（増
幅の弱い阻害剤）、Ａ+ＰＳＭおよびＢＳＭは低いレベ
ルでＤＮＡと結合した。阻害性唾液サンプルはＤＮＡ標
的の約１２％と結合した。これらの実験は炭水化物の分
解が糖タンパク質の核酸に対するアフィニティーを増加
すること、ならびに標的への結合は増幅の酵素プロセス
を妨害するかも知れないことを示唆した。
カニズムを評価するためにさらに実験を行った。種々の
炭水化物構造をもつムチンへの標的ＤＮＡの結合を試験
するためにフィルター結合アッセイを用いた。簡単に述
べると、種々のレベルのムチンを含むバッファー中でリ
ン酸化されたＤＮＡをニトロセルロースを通して濾過し
た。もしもムチンがＤＮＡに結合しないときは、ＤＮＡ
はフィルター上に保持されなかった。ＤＮＡにムチンが
結合すると、ムチンのＤＮＡに対するアフィニティーを
示唆する量でフィルター上に保持された。フィルターに
保持された放射能活性の量を検出することにより定量的
結果を得た。実験を行うには、標的ＤＮＡをリン酸化
し、以下の糖タンパク質のうちの１つと溶液中で混合し
た：ヒト血液糖タンパク質（非阻害性）、Ａ-ＰＳＭ
（高濃度でのみ阻害性）、ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓ
（高い阻害性）、Ａ+ＰＳＭ（非阻害性）およびＢＳＭ
（非阻害性）。有意に増幅を阻害する臨床的唾液サンプ
ルも試験した。ＢＳＭ ＴｙｐｅＩ−ＳはＤＮＡの約３
７．４５％と結合したが、ヒト血液糖タンパク質は標的
と検出しうる程度には結合しなかった。Ａ-ＰＳＭ（増
幅の弱い阻害剤）、Ａ+ＰＳＭおよびＢＳＭは低いレベ
ルでＤＮＡと結合した。阻害性唾液サンプルはＤＮＡ標
的の約１２％と結合した。これらの実験は炭水化物の分
解が糖タンパク質の核酸に対するアフィニティーを増加
すること、ならびに標的への結合は増幅の酵素プロセス
を妨害するかも知れないことを示唆した。
【００１９】デオキシヌクレオシド三リン酸の導入効率
を決定することにより、糖タンパク質の存在下における
ポリメラーゼ活性も評価した。ポリメラーゼ１ユニット
は３０分間にデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）１０ｎｍｏｌｅを導入する量として定義される。ｅ
ｘｏ-クレノウポリメラーゼの活性は増幅に対して完全
に阻害性である唾液サンプル（サンプル７６８８）およ
び増幅に対して阻害性でない２つの唾液サンプル（サン
プル７６８９および１２１２２）を用いるポリメラーゼ
伸長アッセイで試験した。放射能活性標識したｄＮＴＰ
（４ｘ１０-6ｎｍｏｌｅ／ｃｐｍ）を活性化ウシ胸腺Ｄ
ＮＡ（すなわちＤＮａｓｅで処理したもの）とともにポ
リメラーゼの鋳型として作用させるためにサンプルに加
えた。各唾液サンプルの増幅反応物および阻害されない
陽性対照反応物（バッファー中で増幅した単離ＤＮＡ）
にあらかじめ定めたユニット数のポリメラーゼを加え
た。各サンプルおよび陽性対照における増幅中のポリメ
ラーゼ活性の見かけ活性は時間の関数として導入された
放射能活性の数に基づいて決定した。陽性対照のｃｐｍ
での実測値を臨床サンプルのｃｐｍでの実測値と比較し
て、唾液サンプルによってｅｘｏ-クレノウ活性が影響
されたかを決定した。結果を以下に示す： サンプル ｃｐｍ 対照活性の％ １０μＬサンプル７６８８ １６５４ ４９．３％ ５０μＬサンプル７６８８ ４６９ ８５．６％ １０μＬサンプル７６８９ ３６１９ 阻害しなかった ５０μＬサンプル７６８９ ４２０７ 阻害しなかった １０μＬサンプル１２１２２ ４３７２ 阻害しなかった ５０μＬサンプル１２１２２ ４２１０ 阻害しなかった 陽性対照 ３２６７
を決定することにより、糖タンパク質の存在下における
ポリメラーゼ活性も評価した。ポリメラーゼ１ユニット
は３０分間にデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）１０ｎｍｏｌｅを導入する量として定義される。ｅ
ｘｏ-クレノウポリメラーゼの活性は増幅に対して完全
に阻害性である唾液サンプル（サンプル７６８８）およ
び増幅に対して阻害性でない２つの唾液サンプル（サン
プル７６８９および１２１２２）を用いるポリメラーゼ
伸長アッセイで試験した。放射能活性標識したｄＮＴＰ
（４ｘ１０-6ｎｍｏｌｅ／ｃｐｍ）を活性化ウシ胸腺Ｄ
ＮＡ（すなわちＤＮａｓｅで処理したもの）とともにポ
リメラーゼの鋳型として作用させるためにサンプルに加
えた。各唾液サンプルの増幅反応物および阻害されない
陽性対照反応物（バッファー中で増幅した単離ＤＮＡ）
にあらかじめ定めたユニット数のポリメラーゼを加え
た。各サンプルおよび陽性対照における増幅中のポリメ
ラーゼ活性の見かけ活性は時間の関数として導入された
放射能活性の数に基づいて決定した。陽性対照のｃｐｍ
での実測値を臨床サンプルのｃｐｍでの実測値と比較し
て、唾液サンプルによってｅｘｏ-クレノウ活性が影響
されたかを決定した。結果を以下に示す： サンプル ｃｐｍ 対照活性の％ １０μＬサンプル７６８８ １６５４ ４９．３％ ５０μＬサンプル７６８８ ４６９ ８５．６％ １０μＬサンプル７６８９ ３６１９ 阻害しなかった ５０μＬサンプル７６８９ ４２０７ 阻害しなかった １０μＬサンプル１２１２２ ４３７２ 阻害しなかった ５０μＬサンプル１２１２２ ４２１０ 阻害しなかった 陽性対照 ３２６７
【００２０】阻害性臨床サンプルは濃度依存的にポリメ
ラーゼの活性を有意に減少した。阻害性サンプルを希釈
するとポリメラーゼ活性が増加し、これは阻害剤濃度の
減少がポリメラーゼ活性の増加と関連することを示唆す
る。ポリメラーゼ活性は非阻害性唾液サンプルでは正常
（すなわち阻害されない陽性対照と同等）であった。こ
れらの実験の結果は阻害のメカニズムが増幅中のポリメ
ラーゼのＤＮＡ合成活性の妨害と関連することを示唆し
た。しかしながら、別の阻害メカニズムも否定できない
ので、これは部分分解した糖タンパク質の効果だけでは
ないかも知れない。
ラーゼの活性を有意に減少した。阻害性サンプルを希釈
するとポリメラーゼ活性が増加し、これは阻害剤濃度の
減少がポリメラーゼ活性の増加と関連することを示唆す
る。ポリメラーゼ活性は非阻害性唾液サンプルでは正常
（すなわち阻害されない陽性対照と同等）であった。こ
れらの実験の結果は阻害のメカニズムが増幅中のポリメ
ラーゼのＤＮＡ合成活性の妨害と関連することを示唆し
た。しかしながら、別の阻害メカニズムも否定できない
ので、これは部分分解した糖タンパク質の効果だけでは
ないかも知れない。
【００２１】臨床サンプル中の増幅阻害源を特定する前
に、増幅阻害剤を除去するためのいくつかの従来法をサ
ンプル７６８８に適用した。これには、プロテアーゼＫ
処理、リパーゼ番号７とプロテアーゼＫによる処理、リ
パーゼ番号６とプロテアーゼＫによる処理、エタノール
によるＮＡＬＣペレットの洗浄、プロテアーゼＫ処理と
エタノールによるＮＡＬＣペレットの洗浄、ＥＧＴＡと
ＥＤＴＡによるＮＡＬＣペレットの洗浄、およびプロテ
アーゼＫ処理後のＥＧＴＡ／ＥＤＴＡ洗浄、を含む。臨
床サンプル中の増幅阻害を減少または排除するために慣
用なこれらのサンプル処理（例えばプロテアーゼＫ）
が、糖タンパク質がサンプル中に存在している場合には
増幅阻害を増加するかも知れないことは知られていなか
った。しかしながら、糖タンパク質一般、そして特にム
チンの阻害効果を減少または排除する新規な方法が今や
発見された。
に、増幅阻害剤を除去するためのいくつかの従来法をサ
ンプル７６８８に適用した。これには、プロテアーゼＫ
処理、リパーゼ番号７とプロテアーゼＫによる処理、リ
パーゼ番号６とプロテアーゼＫによる処理、エタノール
によるＮＡＬＣペレットの洗浄、プロテアーゼＫ処理と
エタノールによるＮＡＬＣペレットの洗浄、ＥＧＴＡと
ＥＤＴＡによるＮＡＬＣペレットの洗浄、およびプロテ
アーゼＫ処理後のＥＧＴＡ／ＥＤＴＡ洗浄、を含む。臨
床サンプル中の増幅阻害を減少または排除するために慣
用なこれらのサンプル処理（例えばプロテアーゼＫ）
が、糖タンパク質がサンプル中に存在している場合には
増幅阻害を増加するかも知れないことは知られていなか
った。しかしながら、糖タンパク質一般、そして特にム
チンの阻害効果を減少または排除する新規な方法が今や
発見された。
【００２２】まず、糖タンパク質含有サンプルをアニオ
ン性固相で処理することによって増幅阻害が減少または
排除でき、正常なレベルの増幅を回復できることが発見
された。阻害性糖タンパク質は明らかにアニオン性表面
に結合して核酸増幅の前にサンプルから物理的に分離さ
れる。カチオン性交換樹脂（例えばカルボキシメチル、
ホスホまたはスルホプロピル誘導体化イオン交換マトリ
ックス）またはその他のあらゆる陰性に荷電した表面を
この目的に使用できる。カチオン性交換樹脂またはその
他の陰性に荷電した表面にカチオン性分子を結合させる
方法、ならびにサンプルの残り部分からこれを分離する
方法は当業界で公知である。これには、カラムクロマト
グラフィーおよびバッチ法（例えばサンプルを固相と混
合し、遠心、静置、磁気分離または同様の手段によって
結合阻害剤とともに固相を沈降させる）を含む。これら
の方法は一般に増幅前にサンプルから阻害性の糖タンパ
ク質を分離して、カチオン交換カラムからのフロースル
ーまたはバッチ法の上清を核酸増幅反応に使用するのに
適用できる。
ン性固相で処理することによって増幅阻害が減少または
排除でき、正常なレベルの増幅を回復できることが発見
された。阻害性糖タンパク質は明らかにアニオン性表面
に結合して核酸増幅の前にサンプルから物理的に分離さ
れる。カチオン性交換樹脂（例えばカルボキシメチル、
ホスホまたはスルホプロピル誘導体化イオン交換マトリ
ックス）またはその他のあらゆる陰性に荷電した表面を
この目的に使用できる。カチオン性交換樹脂またはその
他の陰性に荷電した表面にカチオン性分子を結合させる
方法、ならびにサンプルの残り部分からこれを分離する
方法は当業界で公知である。これには、カラムクロマト
グラフィーおよびバッチ法（例えばサンプルを固相と混
合し、遠心、静置、磁気分離または同様の手段によって
結合阻害剤とともに固相を沈降させる）を含む。これら
の方法は一般に増幅前にサンプルから阻害性の糖タンパ
ク質を分離して、カチオン交換カラムからのフロースル
ーまたはバッチ法の上清を核酸増幅反応に使用するのに
適用できる。
【００２３】陰性に荷電したシリカ物質もサンプルから
阻害性糖タンパク質を結合させて物理的に分離するのに
使用できる。１つの態様では、有用なアニオン性シリカ
物質は米国特許第５，３４２，９３１号に記載の方法で
製造できる。これらのアニオン性シリカは、シリカ物質
（例えばＳｉＯ2または珪藻（diatom）の形でのＳｉＯ2
誘導体、ガラスビーズまたはガラス繊維膜）にアルカリ
溶液を加えて加熱することによって製造される。この方
法は特定のシリカ形または特定のアルカリ溶液に限定さ
れない。アルカリ溶液は水溶液中で水酸化物イオンを生
じるＮａＯＨ、ＫＯＨ、水素化ナトリウムまたは類似の
試薬を含む。アルカリのシリカ物質に対するモル比は約
０．１：１から１０：１、好ましくは２：１から１０：
１である。しかし、シリカ物質の溶解はアルカリの増加
に比例して増加する。アルカリ：ＳｉＯ2の比が１０：
１以上になると、シリカ粒子の最初のサイズ、アルカリ
濃度、反応温度および反応時間の長さにより、粒子が完
全に溶解するか、有効に結合して阻害性糖タンパク質を
分離するには小さすぎる粒子を生じることになる。これ
らの反応パラメーターは所望の粒子サイズをもつアニオ
ン性シリカ物質を得るために日常的に調整しうる。
阻害性糖タンパク質を結合させて物理的に分離するのに
使用できる。１つの態様では、有用なアニオン性シリカ
物質は米国特許第５，３４２，９３１号に記載の方法で
製造できる。これらのアニオン性シリカは、シリカ物質
（例えばＳｉＯ2または珪藻（diatom）の形でのＳｉＯ2
誘導体、ガラスビーズまたはガラス繊維膜）にアルカリ
溶液を加えて加熱することによって製造される。この方
法は特定のシリカ形または特定のアルカリ溶液に限定さ
れない。アルカリ溶液は水溶液中で水酸化物イオンを生
じるＮａＯＨ、ＫＯＨ、水素化ナトリウムまたは類似の
試薬を含む。アルカリのシリカ物質に対するモル比は約
０．１：１から１０：１、好ましくは２：１から１０：
１である。しかし、シリカ物質の溶解はアルカリの増加
に比例して増加する。アルカリ：ＳｉＯ2の比が１０：
１以上になると、シリカ粒子の最初のサイズ、アルカリ
濃度、反応温度および反応時間の長さにより、粒子が完
全に溶解するか、有効に結合して阻害性糖タンパク質を
分離するには小さすぎる粒子を生じることになる。これ
らの反応パラメーターは所望の粒子サイズをもつアニオ
ン性シリカ物質を得るために日常的に調整しうる。
【００２４】シリカ物質はアルカリ溶液中で、好ましく
は還流により、ＳｉＯ2格子に水酸化物イオンを付加す
るのに十分な時間加熱する。反応に必要な時間はアルカ
リ溶液中の水酸化物イオン濃度および反応温度により変
化する。低い水酸化物イオン濃度および／または低い温
度を用いると長い反応時間を要し、一方高い水酸化物イ
オン濃度および／または高い温度を用いると反応時間が
短くなる。一般に、広範な水酸化物イオン濃度で、アル
カリ懸濁液を４８時間還流すれば十分である。最終生成
物を濾過により回収し、洗浄して乾燥する。洗浄試薬と
しては水、アセトン、核酸反応バッファーなどが適して
いる。次にアニオン性シリカ物質を用いて阻害性糖タン
パク質の結合と分離を行う。好ましくは、ＤＮＡの結合
に好適なアニオン性表面のプロトン化を避けるために阻
害剤の結合はおよそ中性ないしはアルカリ性ｐＨで行
う。唾液サンプルのＮＡＬＣ処理は高いアルカリ環境
（ｐＨ１４）をもたらすので、シリカ物質が唾液サンプ
ル中に存在するアルカリと反応して所望のアニオン性シ
リカ物質が生成し核酸増幅の糖タンパク質阻害剤と結合
するようにシリカ出発物質を唾液サンプルに加えること
ができる。生物学的サンプルにとって最も好ましくは結
合は約ｐＨ６．５−８．５で行われる。代表的シリカ物
質の出発物質と最終生成物の化学構造を以下に示す：
は還流により、ＳｉＯ2格子に水酸化物イオンを付加す
るのに十分な時間加熱する。反応に必要な時間はアルカ
リ溶液中の水酸化物イオン濃度および反応温度により変
化する。低い水酸化物イオン濃度および／または低い温
度を用いると長い反応時間を要し、一方高い水酸化物イ
オン濃度および／または高い温度を用いると反応時間が
短くなる。一般に、広範な水酸化物イオン濃度で、アル
カリ懸濁液を４８時間還流すれば十分である。最終生成
物を濾過により回収し、洗浄して乾燥する。洗浄試薬と
しては水、アセトン、核酸反応バッファーなどが適して
いる。次にアニオン性シリカ物質を用いて阻害性糖タン
パク質の結合と分離を行う。好ましくは、ＤＮＡの結合
に好適なアニオン性表面のプロトン化を避けるために阻
害剤の結合はおよそ中性ないしはアルカリ性ｐＨで行
う。唾液サンプルのＮＡＬＣ処理は高いアルカリ環境
（ｐＨ１４）をもたらすので、シリカ物質が唾液サンプ
ル中に存在するアルカリと反応して所望のアニオン性シ
リカ物質が生成し核酸増幅の糖タンパク質阻害剤と結合
するようにシリカ出発物質を唾液サンプルに加えること
ができる。生物学的サンプルにとって最も好ましくは結
合は約ｐＨ６．５−８．５で行われる。代表的シリカ物
質の出発物質と最終生成物の化学構造を以下に示す：
【化１】
【００２５】上述の方法で製造したアニオン性珪藻を、
あらかじめ調製したＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−ＳおよびＢ
ＳＭ Ｔｙｐｅ ＩＩのＮＡＬＣ／プロテイナーゼＫ処
理した溶液ならびに増幅に対して完全に阻害性であった
唾液サンプル（サンプル３６９９）とｐＨ７．６バッフ
ァー中で混合した。アニオン性珪藻とインキュベートし
た後、サンプルを遠心して上清を上述の増幅反応物に加
えた。処理したＢＳＭＴｙｐｅ Ｉ−ＳおよびＢＳＭ
Ｔｙｐｅ ＩＩの上清を上述のＳＤＡによって増幅し
た。阻害性臨床サンプル上清を従来法を用いるＰＣＲに
よって増幅した。増幅を化学発光アッセイで検出して以
下の結果を得た： ＲＬＵ ２０μＬ上清 １０μＬ上清 ５μＬ上清 サンプル３６９９（ＰＣＲ） ｗ／ｏアニオン性珪藻 １７２ ３１９８１ − ｗ／アニオン性珪藻 １０２０５ ６７１６０ − BSM Type I-S （ＳＤＡ） ｗ／ｏアニオン性珪藻 ６．５ ＮＡ １１．２ ｗ／アニオン性珪藻 １０９９ ９５８９ ８２５４ BSM Type II （ＳＤＡ） ｗ／ｏアニオン性珪藻 ３２．４ ＮＡ ２２７７ ｗ／アニオン性珪藻 １５．２ ６５５ ３２２８
あらかじめ調製したＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−ＳおよびＢ
ＳＭ Ｔｙｐｅ ＩＩのＮＡＬＣ／プロテイナーゼＫ処
理した溶液ならびに増幅に対して完全に阻害性であった
唾液サンプル（サンプル３６９９）とｐＨ７．６バッフ
ァー中で混合した。アニオン性珪藻とインキュベートし
た後、サンプルを遠心して上清を上述の増幅反応物に加
えた。処理したＢＳＭＴｙｐｅ Ｉ−ＳおよびＢＳＭ
Ｔｙｐｅ ＩＩの上清を上述のＳＤＡによって増幅し
た。阻害性臨床サンプル上清を従来法を用いるＰＣＲに
よって増幅した。増幅を化学発光アッセイで検出して以
下の結果を得た： ＲＬＵ ２０μＬ上清 １０μＬ上清 ５μＬ上清 サンプル３６９９（ＰＣＲ） ｗ／ｏアニオン性珪藻 １７２ ３１９８１ − ｗ／アニオン性珪藻 １０２０５ ６７１６０ − BSM Type I-S （ＳＤＡ） ｗ／ｏアニオン性珪藻 ６．５ ＮＡ １１．２ ｗ／アニオン性珪藻 １０９９ ９５８９ ８２５４ BSM Type II （ＳＤＡ） ｗ／ｏアニオン性珪藻 ３２．４ ＮＡ ２２７７ ｗ／アニオン性珪藻 １５．２ ６５５ ３２２８
【００２６】陽性対照（阻害剤を添加しない清浄なバッ
ファー系）は９６６３ＲＬＵであった。従って、アニオ
ン性珪藻による処理は阻害剤を有効に除去し、増幅レベ
ルを有意に増加した。アニオン性珪藻による処理の後、
臨床サンプル中では増幅阻害が完全に排除され処理後の
増幅は陽性対照を上回った。ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓ
サンプルでは増幅は２つの低い阻害剤濃度で陽性対照の
レベルまで回復した。最高濃度（２０μＬ）では、アニ
オン性珪藻による処理によって増幅は有意に改良された
（約１７０倍）が、陽性対照よりは低かった。ＢＳＭ
Ｔｙｐｅ ＩＩ（以前に試験したうちで最も阻害性であ
ると同定されたムチン）では、試験したどの濃度でもア
ニオン性珪藻による処理で増幅は回復しなかった。これ
らの結果は、ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓの高濃度および
すべてのＢＳＭ Ｔｙｐｅ ＩＩサンプルでは、アニオ
ン性珪藻の結合許容量が越えていたのかも知れないこと
を示唆する。
ファー系）は９６６３ＲＬＵであった。従って、アニオ
ン性珪藻による処理は阻害剤を有効に除去し、増幅レベ
ルを有意に増加した。アニオン性珪藻による処理の後、
臨床サンプル中では増幅阻害が完全に排除され処理後の
増幅は陽性対照を上回った。ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓ
サンプルでは増幅は２つの低い阻害剤濃度で陽性対照の
レベルまで回復した。最高濃度（２０μＬ）では、アニ
オン性珪藻による処理によって増幅は有意に改良された
（約１７０倍）が、陽性対照よりは低かった。ＢＳＭ
Ｔｙｐｅ ＩＩ（以前に試験したうちで最も阻害性であ
ると同定されたムチン）では、試験したどの濃度でもア
ニオン性珪藻による処理で増幅は回復しなかった。これ
らの結果は、ＢＳＭ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｓの高濃度および
すべてのＢＳＭ Ｔｙｐｅ ＩＩサンプルでは、アニオ
ン性珪藻の結合許容量が越えていたのかも知れないこと
を示唆する。
【００２７】アニオン性シリカ物質はフィルターの形で
あってもよい。この態様では、増幅前に阻害性の臨床サ
ンプルをアニオン性フィルターで濾過して阻害剤をフィ
ルターに結合させ、これによって濾過物から除去する。
あるいは、粒子状のアニオン性シリカ物質を慣用のフィ
ルター上に支持させて、阻害剤がアニオン性シリカ物質
と結合するようにサンプルを通過させる（例えば遠心に
よって）ことができる。
あってもよい。この態様では、増幅前に阻害性の臨床サ
ンプルをアニオン性フィルターで濾過して阻害剤をフィ
ルターに結合させ、これによって濾過物から除去する。
あるいは、粒子状のアニオン性シリカ物質を慣用のフィ
ルター上に支持させて、阻害剤がアニオン性シリカ物質
と結合するようにサンプルを通過させる（例えば遠心に
よって）ことができる。
【００２８】細菌細胞を破砕するために使用するような
ビーズ形のアニオン性シリカ物質は、核酸増幅のために
サンプルを処理するときに２つの機能を果たすことがで
きる。細胞破砕に適したシリカビーズ（例えばガラスま
たはジルコンシリケート）は、細胞破砕への使用を排除
する程度までのビーズの溶解を避ける反応条件を用い
て、上述の方法で処理してアニオン性物質を製造するこ
とができる。次にアニオン性シリカビーズを関心のある
細胞を含む疑いのある臨床サンプルに加えて、細胞を破
砕し、同時に存在するかも知れない増幅阻害剤を結合す
るのに使用できる。細胞は典型的にはビーズを含むサン
プルを音波処理または撹拌することによって破砕される
が、その他の適当な方法も当業界で公知である。細胞破
砕の後、典型的には濾過または沈降によって阻害剤が結
合したアニオン性ビーズをサンプルから分離する。同じ
く陰性に荷電している核酸はビーズのアニオン性表面に
は結合せず、増幅の液相に留まる。
ビーズ形のアニオン性シリカ物質は、核酸増幅のために
サンプルを処理するときに２つの機能を果たすことがで
きる。細胞破砕に適したシリカビーズ（例えばガラスま
たはジルコンシリケート）は、細胞破砕への使用を排除
する程度までのビーズの溶解を避ける反応条件を用い
て、上述の方法で処理してアニオン性物質を製造するこ
とができる。次にアニオン性シリカビーズを関心のある
細胞を含む疑いのある臨床サンプルに加えて、細胞を破
砕し、同時に存在するかも知れない増幅阻害剤を結合す
るのに使用できる。細胞は典型的にはビーズを含むサン
プルを音波処理または撹拌することによって破砕される
が、その他の適当な方法も当業界で公知である。細胞破
砕の後、典型的には濾過または沈降によって阻害剤が結
合したアニオン性ビーズをサンプルから分離する。同じ
く陰性に荷電している核酸はビーズのアニオン性表面に
は結合せず、増幅の液相に留まる。
【００２９】あるいは、糖タンパク質阻害剤は、グリコ
シダーゼで処理して炭水化物を完全に阻害性糖タンパク
質から除去することによってサンプルから除去または排
除される。正確な炭水化物構造がわからないときにすべ
てのグリコシド残基が除去されたことを確認するには、
グリコシダーゼの混合物が好ましい（例えばｎ−グリコ
シダーゼ、ｏ−グリコシダーゼおよびノイラミニダー
ゼ）。ｏ−グリカナーゼ、１，２α−フコシダーゼ、ヘ
キソサミニダーゼおよびノイラミニダーゼで連続的ある
いは同時に処理することによってムチンから炭水化物を
実質的に完全に除去することができる。この処理は、１
００個の糖タンパク質分子につき約１個の割合でタンパ
ク質と結合している１つのＧａｌＮＡｃを除いて、ムチ
ンからすべての炭水化物を除去する。典型的には、糖タ
ンパク質を含むサンプルと酵素を混合し、グリコシド結
合の分解に十分な時間（例えばｐＨ７．６で約１時間）
インキュベートする。
シダーゼで処理して炭水化物を完全に阻害性糖タンパク
質から除去することによってサンプルから除去または排
除される。正確な炭水化物構造がわからないときにすべ
てのグリコシド残基が除去されたことを確認するには、
グリコシダーゼの混合物が好ましい（例えばｎ−グリコ
シダーゼ、ｏ−グリコシダーゼおよびノイラミニダー
ゼ）。ｏ−グリカナーゼ、１，２α−フコシダーゼ、ヘ
キソサミニダーゼおよびノイラミニダーゼで連続的ある
いは同時に処理することによってムチンから炭水化物を
実質的に完全に除去することができる。この処理は、１
００個の糖タンパク質分子につき約１個の割合でタンパ
ク質と結合している１つのＧａｌＮＡｃを除いて、ムチ
ンからすべての炭水化物を除去する。典型的には、糖タ
ンパク質を含むサンプルと酵素を混合し、グリコシド結
合の分解に十分な時間（例えばｐＨ７．６で約１時間）
インキュベートする。
【００３０】糖タンパク質から炭水化物を除去するため
の化学的方法は公知であり、本発明で有用である。例え
ば、サンプルを無水条件下、４℃でトリフルオロメタン
スルホン酸で処理するか、あるいはスミス分解（過ヨウ
素酸ナトリウム処理とそれに続く弱酸による加水分解）
に付してもよい。これらの方法は唾液サンプルのＮＡＬ
Ｃ処理中に用いることができる。ＮＡＬＣ処理中はマイ
コバクテリウムが完全な形で残っているので、化学的処
理の有害な影響から核酸を保護しなければならない。次
に、増幅を阻害するかも知れない残渣化学物質をマイコ
バクテリウムの溶菌前にＮＡＬＣペレットから洗浄し去
り、標的核酸を増幅する。
の化学的方法は公知であり、本発明で有用である。例え
ば、サンプルを無水条件下、４℃でトリフルオロメタン
スルホン酸で処理するか、あるいはスミス分解（過ヨウ
素酸ナトリウム処理とそれに続く弱酸による加水分解）
に付してもよい。これらの方法は唾液サンプルのＮＡＬ
Ｃ処理中に用いることができる。ＮＡＬＣ処理中はマイ
コバクテリウムが完全な形で残っているので、化学的処
理の有害な影響から核酸を保護しなければならない。次
に、増幅を阻害するかも知れない残渣化学物質をマイコ
バクテリウムの溶菌前にＮＡＬＣペレットから洗浄し去
り、標的核酸を増幅する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アドリアン・エイチ・ウォルターズ アメリカ合衆国メリーランド州21212，バ ルティモア，コーディング・アベニュー 508 (72)発明者 マイケル・シー・リトル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27614，ローリー，エイクレス・ウェイ 1417
Claims (10)
- 【請求項１】 以下の工程： ａ）核酸増幅阻害剤がアニオン性固相と結合するように
サンプルをアニオン性固相と接触させ； ｂ）アニオン性固相とこれに結合した核酸増幅阻害剤を
サンプルから分離し、そして； ｃ）サンプル中に含まれる核酸を増幅する、からなる核
酸増幅阻害剤を含むサンプル中の核酸を増幅する方法。 - 【請求項２】 アニオン性固相がカチオン交換樹脂であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 アニオン性固相がアニオン性シリカ物質
である請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 アニオン性シリカ物質がアニオン性ガラ
スビーズ、アニオン性ガラスフィルター、アニオン性ジ
ルコンシリケートビーズおよびアニオン性珪藻からなる
群より選択される請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 アニオン性固相が濾過または沈降によっ
てサンプルから分離される請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 アニオン性固相がフィルターである請求
項１記載の方法。 - 【請求項７】 核酸がサンプル中の細胞中に含まれてお
り、細胞がアニオン性固相を用いて破砕される請求項１
記載の方法。 - 【請求項８】 アニオン性固相がアニオン性ガラスビー
ズおよびアニオン性ジルコンシリカビーズからなる群よ
り選択される請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 以下の工程： ａ）炭水化物が実質的に完全に糖タンパク質から除去さ
れるように１以上のグリコシダーゼでサンプルを処理
し；そして ｂ）処理サンプル中の核酸を増幅する、からなる核酸増
幅の糖タンパク質阻害剤を含むサンプル中の核酸を増幅
する方法。 - 【請求項１０】 １以上のグリコシダーゼがｏ−グリカ
ナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、１，２α−フコシダーゼ
およびノイラミニダーゼからなる群より選択される請求
項９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/535,605 US5620869A (en) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions |
| US535605 | 1995-09-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173065A true JPH09173065A (ja) | 1997-07-08 |
| JP2774958B2 JP2774958B2 (ja) | 1998-07-09 |
Family
ID=24134958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8256564A Expired - Fee Related JP2774958B2 (ja) | 1995-09-28 | 1996-09-27 | 核酸増幅反応の阻害を減少する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5620869A (ja) |
| EP (1) | EP0770689A3 (ja) |
| JP (1) | JP2774958B2 (ja) |
| AU (1) | AU6583696A (ja) |
| CA (1) | CA2185403C (ja) |
| TW (1) | TW369564B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2001206848A (ja) * | 2000-01-27 | 2001-07-31 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | シアロムチンの分泌促進剤 |
| WO2009060847A1 (ja) | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | 核酸増幅用サンプルの調製方法及び調製キット |
| KR20140014848A (ko) * | 2012-07-26 | 2014-02-06 | 삼성전자주식회사 | 이온성 액체를 사용하여 생물학적 시료로부터 핵산 증폭의 증폭 효율 및 감도를 증가시키는 방법 |
| JP2019517778A (ja) * | 2016-04-08 | 2019-06-27 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 細胞溶解及び核酸増幅のためのプロセス |
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| US5763185A (en) * | 1996-12-30 | 1998-06-09 | Becton Dickinson And Company | Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization |
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| US7727710B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-06-01 | 3M Innovative Properties Company | Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface |
| US20050142570A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-06-30 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and sedimenting reagent |
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| CA2655458A1 (en) * | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for obtaining amplifiable nucleic acids from tissues, cells, or viruses exposed to transport media |
| US9102911B2 (en) | 2009-05-15 | 2015-08-11 | Biofire Diagnostics, Llc | High density self-contained biological analysis |
| US9207240B2 (en) * | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
| EP2473596B1 (en) | 2009-09-03 | 2017-12-13 | Becton, Dickinson and Company | Methods and compositions for direct chemical lysis |
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| WO2014072367A1 (en) * | 2012-11-07 | 2014-05-15 | Qiagen Gmbh | Control for diagnostic assay |
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| JP6787916B2 (ja) | 2015-06-10 | 2020-11-18 | キアゲン ゲーエムベーハー | アニオン交換粒子を使用する細胞外核酸を単離する方法 |
| CN116121349B (zh) * | 2022-12-20 | 2024-04-09 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种扩增含乙醇的核酸样本的方法 |
Family Cites Families (3)
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