JPH09173082A - ロドサーマス マリナスの熱安定性アルカリホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】熱安定性アルカリホスファターゼを提供する。 【解決手段】本発明は、ポリメラーゼがロドサーマス
マリナスのアルカリホスファターゼの酵素活性部分とそ
のアミノ酸配列において少なくとも75% 相同である熱安
定性アルカリホスファターゼの酵素活性部分を提供する
ものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ロドサーマス マ
リナスの熱安定性アルカリホスファターゼに関する。

【０００２】

【従来技術】アルカリホスファターゼは通常、核酸分子
の末端からリン酸基を除去するために行われるごく普通
の生化学的手法に使用される。たとえば、子牛腸のアル
カリホスファターゼは、このようなリン酸基を除くため
に使用される熱不安定性酵素であり、高熱に曝されるこ
とにより不活化される。この熱不安定性は、アルカリホ
スファターゼを次の操作の前に反応混合物から除去する
必要がないので有利である。

【０００３】アルカリホスファターゼはまた、特異的た
んぱく質またはDNA 標識物の検出のための非- 放射性マ
ーカーとしても使用される。これはたんぱく質またはDN
A オリゴヌクレオチドと結合してこれらの標識物の検出
の助けとなる。酵素熱安定性は50 bp より大きいDNA の
標識化に使用するのに望ましく、貯蔵の間に酵素の安定
性を向上するための他の用途にも有用である。

【０００４】様々な好熱性のおよび他の生物由来のアル
カリホスファターゼが知られている：イェーおよびトレ
ラ( Yeh and Trela) (1976) “ サーマス アクアティ
カス由来の代表的アルカリホスファターゼの精製および
特性決定( Purification andCharacterization of a Re
pressible Alkaline Phosphatase from Thermus aquati
cus）" J. Biol. Chem. 251 : 3134-3139 ;ハルトッグ
およびダニエル( Hartog and Daniel ）(1992) “サー
マス種菌株 Rt41A由来のアルカリホスファターゼ(An Al
kaline Phosphatase from Thermus sp Strain Rt41A）"
Int. J. Biochem. 24 : 1657 - 1660 ; シャッフェル
およびヒューレット( Schaffel and Hulett）(1978)“
バチルス リチェニホルミス由来のアルカリホスファタ
ーゼ( Alkaline Phosphatase from Bacillus lichenifo
rmis）" Biochimica et Biophysica Acta 526 : 457-46
7 ; ヒューレット- カウリングおよびキャンベル( Hul
ett-Cowling and Campbell）(1971) “ バチルス リ
チェニホルミス由来のアルカリホスファターゼの精製お
よび性質( Purification and Properties of an Alkali
ne Phosphatase of Bacillus licheniformis）" Bioche
m. 10: 1364 - 1371。

【０００５】

【発明の構成および効果】出願人は、好熱種ロドサーマ
ス マリナス(Rhodothermus marinus)から新規アルカリ
ホスファターゼを単離および精製した。この酵素は高pH
適合性( 〜10.8)を有し、そして65℃で24時間インキュ
ベーション後でさえもその活性の60% を維持する熱安定
性である。この酵素はまた、6M尿素中65℃で一晩インキ
ュベーションすることを含む他の変性条件にも耐性があ
る。この酵素のより高いpHの適合性は非常に有利であ
る。この高pH適合性およびしたがって高pHでの安定性
は、たとえば酵素をストレプタビジンとともに使用する
場合に、非- 放射性検出システムにおける酵素の使用を
強化する。さらに、高pH適合性により、この酵素がアル
カリ性pHで発光形へ迅速に転化するジオキセタン基質と
ともに使用するのに適するようになる。

【０００６】アルカリホスファターゼの熱安定性はま
た、酵素を核酸プローブへ直接架橋した後で、厳しい条
件下で、すなわち高い温度下で重大な酵素活性の損失が
なくこのような標識化プローブをハイブリッド化し次い
で洗浄することができるようになる点でも有利である。

【０００７】したがって、第一の見地において本発明
は、pHが10.5以上、たとえば10.8以上の最適pHを有し、
また少なくとも65℃の温度にも耐性がある( すなわち、
この温度でその活性の少なくとも10% を維持する）ロド
サーマス マリナスに存在する熱安定性アルカリホスフ
ァターゼの酵素活性部分を特徴とするものである。

【０００８】ホスファターゼとは、たとえばDNA 分子ま
たは他の分子たとえばp-ニトロフェニルホスフェート(p
NPP)からリン酸基を除去する活性を有するたんぱく質ま
たはそのフラグメントを単に意味する。“ アルカリホ
スファターゼ" は、pH7 以上で活性であるもの、そして
本発明では以下に列挙した条件を用いて10.0以上の最適
pHを有するものである。当業者であれば、最適pHが緩衝
液の条件および基質濃度に依存することはわかるであろ
う。

【０００９】“ 熱安定性" とは、酵素が65℃で1 時間
以上、好ましくは5 または10時間加熱後にその活性が少
なくとも10% を維持するものを意味する。

【００１０】出願人は本発明のアルカリホスファターゼ
の一実施例を提供するが、約10.8の最適pHを有するアル
カリホスファターゼが天然に存在しそして単離すること
ができるという事実を知った当業者であれば、容易に細
胞抽出物をスクリーニングしてこのような活性の存在を
確認することができ、そしてここに記載した標準的方法
でこのような酵素部分を単離しそして精製することがで
きる。

【００１１】本発明はまた図9 に示すロドサーマス マ
リナスのアルカリホスファターゼの酵素活性部分と少な
くとも75% 相同の他の酵素的に活性の熱安定性アルカリ
ホスファターゼ( 配列番号 4) を包含する。75% 相同と
は、熱安定性アルカリホスファターゼが多くて25% まで
ロドサーマス マリナスのものと異なったアミノ酸配列
を有することができ、そしてロドサーマス マリナスの
アルカリホスファターゼの酵素活性部分と実質的に同じ
酵素活性( すなわち、分子からリン酸基を除去すること
のできる能力）を維持することを意味する。このような
差は保守的交換、付加、欠失、および同義コドン以外の
置換を含む。好ましい実施態様において、アルカリホス
ファターゼのアミノ酸配列はロドサーマス マリナスの
アルカリホスファターゼの酵素活性部分と比較した10個
未満の保守的アミノ酸交換または10個未満のアミノ酸付
加を含む。実質的に同じ酵素効率とは、ロドサーマス
マリナスの熱安定性アルカリホスファターゼの酵素活性
部分の活性の少なくとも50% を意味する。

【００１２】本発明において、酵素は精製形で提供され
るのが好ましく、すなわちこれが天然に生じる環境から
単離される。一般にはこのような環境は細菌細胞内にあ
り、そしてたんぱく質は細胞における存在と比べて少な
くとも10- 倍または100-倍豊富な細胞の細胞壁および／
またはその細胞膜から単離される。より好ましくは、こ
れが実質的に均質の調製物であるように、すなわちこれ
が調製物におけるたんぱく質性物質の主な種であるよう
に、1000-10,000-倍またはそれ以上豊富である。さらに
好ましくは、たんぱく質はただ一つの種であり、すなわ
ちサンプルにおけるたんぱく質性物質の少なくとも95%
を表す。このようなたんぱく質は、これが天然に産生す
る細菌細胞から調製されるか、またはこれが天然に産生
しない細菌または他の細胞、たとえば大腸菌において高
いたんぱく質発現レベルを起こさせるための標準的組換
えDNA 方法を用いて調製されうる。このような組換えた
んぱく質の粗製抽出物は精製たんぱく質の定義の範囲内
である。

【００１３】標準的技術を用いて、以下に示す酵素は、
たんぱく質またはそのフラグメントをミクロ配列化し、
望ましい生物たとえばロドサーマス マリナスの核酸か
ら生じるクローンのライブラリーのためのプローブとし
て有用なオリゴヌクレオチドを調製し、そしてこのよう
なプローブでそのライブラリーをスクリーニングしてた
んぱく質をコードするDNA のフラグメントを単離するこ
とにより、直ちにクローン化されうる。これに代わり、
たんぱく質に対する抗体を作り、どのクローンがこの抗
体により識別される抗原決定基を発現するかを確認する
ために発現ライブラリーをスクリーニングしてもよい。
他の標準技術は、請求の範囲に記載のたんぱく質をコー
ドするような遺伝子を単離するために当業者に公知のも
のである。このような遺伝子は組換えアルカリホスファ
ターゼをコードする。

【００１４】したがって、第二の見地において、本発明
は前記性質を有する組換えアルカリホスファターゼ、お
よびこのような組換えDNA を含む核酸をコードする細胞
を特徴とするものである。このようなホスファターゼを
コードする同等遺伝子は標準的技術を用いてクローン化
される。

【００１５】第三の見地において、本発明はたんぱく質
または核酸の標識化において、および様々な分子バイオ
ロジー技術において前記酵素を使用するための方法を特
徴とするものである。すなわち、本発明の酵素は標準ラ
ベル化反応および診断分析に使用されうる。これらはま
た、リン酸基の除去が望ましい分子バイオロジー技術に
おいても使用される。

【００１６】本発明の他の特徴および利点は、好ましい
実施態様の以下の記載および特許請求の範囲から明らか
であろう。

【００１７】実施例：ロドサーマス マリナス由来のア
ルカリホスファターゼ 以下はロドサーマス マリナスアルカリホスファターゼ
の単離および特性決定の例である。これは本発明を限定
するものではない。

【００１８】培養条件：ロドサーマス マリナス、菌
株、ATCC 43812は、アルフレッドソンら( Alfredsson e
t al. ） (1988) “Rhodothermus marinus, gen. nov.,
sp. nov., a Thermophilic, Halophilic Bacterium fr
om Submarine Hot Springs in Iceland" J. Gen. Micro
biology 134, 299-306 に記載のように65℃にて好気性
条件下で増殖した。連続流れ遠心分離により細胞を採取
し、-80 ℃で貯蔵した。

【００１９】活性分析：アルカリホスファターゼ活性
を、p-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)をp-ニトロフ
ェノールへ転化し続いて405 nmで分光分析によりモニタ
ーした。1 単位は、1 分間にp-ニトロフェノールの1 μ
モルを放出するのに必要な酵素の量として定義される。
すべての検定は、特記しないかぎり、100 mM CAPS (3-
(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸) pH 10
、15% グリセロール、1mM MgCl₂ および6mM pNPPにお
いて37℃で行われた。

【００２０】精製：凍結した細胞( 33 g) を、25mM ト
リス-HCl pH 7.4 、50mM NaCl 、1mM MgCl₂ および0.1%
トリトンX-100(最終容量100ml)に懸濁させ、そして超音
波により溶菌した。溶菌物を遠心分離して細胞破壊物を
除き透明にし、最終NaCl濃度350mMへ補給し、そして25m
Mトリス-HCl pH7.4および350mM NaClで平衡化したDE 52
陰イオン交換樹脂( ワットマン(Whatman);細胞1g当た
り樹脂4g) においてクロマトグラフィーを行った。アル
カリホスファターゼ活性の大部分は、塩濃度を100mMま
で低めるために25mMトリス-HCl pH7.4において希釈され
た流れにおいて現れた。希釈した流れを、25mMトリス-H
Cl pH7.4および100mM NaClで平衡化したヘパリン- セフ
ァロース( Heparin Sepharose ）CL-6B 樹脂( ファルマ
シア( Pharmacia)）へ施した。アルカリホスファターゼ
活性は樹脂と結合しなかった。流れを次いで、25mMトリ
ス-HCl pH7.4および100mM NaClで平衡化したQ-セファロ
ースFFカラム( ファルマシア）へ施した。カラムを25mM
トリス-HCl pH7.4において100-350mM NaClまでの直線状
勾配で展開した。アルカリホスファターゼは〜250mM Na
Clで溶出した。適当なフラクションをプールして、1mM
MgCl₂ へ補給し、そして25mMトリス-HCl pH7.4および10
mM NaCl ( 緩衝液A)で平衡化したヒドロキシルアパタイ
ト( バイオ- ラド(BIO-RAD) ）において溶解した。酵素
活性が100%緩衝液Aから100%緩衝液B (50mM Naホスフェ
ート、pH7.0)までの直線状勾配で溶出した。アルカリホ
スファターゼ活性を含むフラクションをプールし、セン
トリプレプ(Centriprep）-30 濃縮器( アミコン( Amico
n) ）において50mMトリス-HCl pH 9.3および25mM NaCl
( 緩衝液A)で平衡化し、そして緩衝液 Aで平衡化したQ-
セファロース FF カラムへ施した。酵素活性は、緩衝液
A における25 -600mM NaClまでの直線状勾配で溶出し
た。プールしたフラクションを、前記した25mMトリス-H
Cl pH7.4および25mM NaCl へ交換し、同じ緩衝液におい
てDEAE- セファセル( Sephacel）カラム( ファルマシ
ア）へ施した。アルカリホスファターゼは25mMトリス-H
Clにおいて25 - 300mM NaCl からの直線状勾配で溶出し
た。適当なDEAE- セファセルフラクションを集め、セン
トリプレプ-30 装置において25mMトリス-HCl、25mM NaC
l および50mM MgCl₂へ交換し、100 ℃で10分間加熱し
た。不溶性の熱変成たんぱく質を遠心分離により除去し
た。

【００２１】特性決定：前記精製方法に続いて、SDS-PA
GEによる調製物の分析により、酵素サブユニットがほぼ
55,000ダルトンの見掛け上の分子量で移動する二つの密
接した間隔のポリペプチドに相当することが明らかにな
った( 図1)。使用するゲルはバイオ- ラッド社からミニ
- プロテイン( Mini-Protein）IIレディ- ゲル( Ready
Gel）,カタログ番号161 - 0902として入手されるもの
で、製造業者の手引き書にしたがって使用された。酵素
活性を示す二つのたんぱく質バンドの存在は、同じたん
ぱく質のイソ酵素、酵素の翻訳後修飾形、部分的たんぱ
く質分解または場合により精製方法よる人為的産物を表
す。後者が本当であるなら、当業者は、二つのポリペプ
チドを得るかまたは得られないかもしれない他の手段で
酵素を精製してもよいことが分かる。

【００２２】最終生成物は、比活性の研究により確認さ
れるように粗製細胞溶解物の350 倍以上の精製を表す。
酵素調製物はさらに、最適酵素活性の温度およびpHを測
定することにより特性決定された。最適酵素活性の温度
を測定するために、貯蔵アルカリホスファターゼ( 0.32
mg/ml) を、25mMトリス-HCl pH 7.4 、25mM NaCl およ
び1mM MgCl₂ において250 倍に希釈し、指示された温度
で標準条件( 前記参照）下に活性を検定した。結果を図
2 に示す。最適酵素活性のpHを測定するために、貯蔵ア
ルカリホスファターゼを、25mMトリス-HCl pH 7.4 、25
mM NaCl および1mM MgCl₂ において200 倍に希釈した。
酵素検定は、いずれかの0.1M CAPS 、1mM MgCl₂ および
6mM pNPP、またはエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、1mM MgCl₂ および6mM pNPP
の各々0.1Mにおいて37℃で指示されたpH値で行われた(
前記）。結果を図4 に示す。65℃での酵素安定性を測定
するために、貯蔵アルカリホスファターゼを、25mMトリ
ス-HCl pH 7.4 、25mM NaCl 、1mM MgCl₂ および 15%グ
リセロールにおいて20倍に希釈し、65℃で指示された時
間インキュベーションした。サンプルをさらに10倍に希
釈した後、標準条件下で活性検定を行った。結果を図3
に示す。

【００２３】またアルカリホスファターゼをドットブロ
ットDNA の非- 同位体検出に使用した( 図5)。標的DNA
( λ- Hind III) を、TE + 0.2M NaOHにおいて変性し、
様々な量(0.01 ng、0.05 ng 、0.1 ng、0.5 ng、1 ng、
5 ng、10ng）でナイロン膜(バイオダイン( Biodyne ）
A; パル( Pall) ）にスポットし、80℃で1 時間焼成す
ることにより定着した。400mMNaCl 、4%カゼインおよび
50mM MgCl₂を補給したECL ゴールドハイブリッド化緩衝
液( アマーシャム( Amersham) ）において65℃で1.5-2
時間予備ハイブリッド化した。プローブは、ロドサーマ
ス マリナスアルカリホスファターゼをλ- Hind III D
NAへ架橋することにより調製された。熱変性プローブ(1
0mM Naホスフェート pH5.5中、10ng/ μl ) 、アルカリ
ホスファターゼ(10mM Naホスフェート pH5.5中、60ng/
μl ) およびグルタルアルデヒド(1.5%)の等量( 一般的
には各々10μl ）を混合し、37℃で45分間インキュベー
ションした。酵素/ プローブ複合物を予備ハイブリッド
化反応物へ直接添加(10ngプローブ/ ハイブリッド化緩
衝液 ml)) し、65℃で一晩ハイブリッド化した。ハイブ
リッド化に続いて膜を以下のもので洗浄した：2X SSC、
25mMトリス-HCl pH7.4 、10mM MgCl₂、0.1% SDS (室温
で3 x 5 分）；0.2X SSC, 25mMトリスpH 7.4、10mM MgC
l₂( 37℃で3 x 5 分); 0.1M CAPS pH10 、15% グリセロ
ール、2mM MgCl₂(室温で30分間) 。洗浄してから、膜
を、膜1cm²当たり〜20μl CDP-スター(Star）基質( ト
ロピックス( Tropix) ）とともに食品密閉バッグ(seal-
a-meal bag) に入れ、1 分間オートラジオグラフィーフ
ィルムへ暴露した。

【００２４】ロドサーマス マリナスアルカリホスファ
ターゼのクローニング 標準的方法を用いて、ゲノムDNA をロドサーマス マリ
ナスから単離した。クロモゾームDNA に部分的Sau 3AI
消化を受けさせ、低融点アガロースにおいてゲル電気泳
動により溶解した。4-9 kbの範囲のフラグメントをゲル
から単離し、すでにBamHI で消化されそして脱ホスホリ
ル化されたp ブルースクリプト(pBluescript) SK+ ( ス
トラタジーン( Stratagene) ）へ結合した。結合後、DN
A を超官能性大腸菌株 XL2- ブルーMRF ´( ストラタジ
ーン）へ形質転換し、そして100μg /ml アンピシリ
ン、50μg /ml BCIP( 5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリ
ルホスフェート、クロモゲンインジケーター) および5m
M IPTG( イソプロピル- β-D-チオガラクトピラノシド)
を含む LB 寒天培地に塗布した。プレートを37℃にて
一晩インキュベーションした。単一の青いコロニー(pBR
M1) がほぼ6000個の形質転換体として観察された。

【００２５】クローン pBRM1 クローン pBRM1の制限分析により、細胞溶解物における
アルカリホスファターゼ活性をコードするほぼ6kb の挿
入部が示された。空のp ブルースクリプトベクターで行
われた平行研究では酵素活性はほとんど見られなかっ
た。アルカリホスファターゼ活性は、100 ℃で10分間の
加熱後に酵素活性の75% 以上を維持しているので、熱安
定性であることがわかった。SDS-PAGEに続いて正常化さ
れた細胞溶解物において行われたゲル比色分析では、酵
素活性が見掛けの分子量〜46,000ダルトンで移動するポ
リペプチドへ局部化することが示された。pBRM1 を大腸
菌 CC118 [ara D139 Δ( ara,leu) 7697 Δlac X74
phoA Δ20 galE galK thi rpsE rpoB arg Eam recA1]
へ形質転換し、そして BCIP インジケータープレートに
おいて増殖した。この大腸菌株は、アルカリホスファタ
ーゼ(pho A) 遺伝子における欠失を含む。青いコロニー
の発生は、クローン化酵素が天然大腸菌アルカリホスフ
ァターゼ(BAP) と区別されることを示す。

【００２６】クローン pBRM1/ Kpn I マッピング、欠失および発現の研究により、pBRM1 にお
ける6 kb挿入部のほぼ1/2 が酵素活性に影響を与えるこ
となく失われることが示された。〜3kb の挿入部を含む
より小さいクローンを、pBRM1/ Kpn Iとして消化した(
配列番号 1。図7 参照）。DNA 配列決定を促進するため
に、pBRM1/ KpnI をSacII で消化して0.45、1.9 および
0.5 kbフラグメントを得、個々に pブルースクリプトへ
サブクローンした。

【００２７】クローン pCRM1.8 DNA 配列データのBLAST 分析( ギッシュ(Gish)ら、(199
3) Nat. Genet. 3:266-72)により、〜1kb の挿入部がア
ルカリホスファターゼをコードせず、したがって欠失さ
れたことが示された。pBRM1/ KpnI をHind III/Kpn Iで
消化して、1.8kb フラグメントを放出し、これを次いで
pUC19 へサブクローンした。得られたクローンを pCRM
1.8として消化した( 配列番号 2。図8 参照）。

【００２８】クローン化アルカリホスファターゼの発現
および精製 組換えプラスミド pBRM1.8を含む大腸菌株 JM109の一晩
培養物を、LB + 100μg / mlアンピシリンにおいて1:40
に希釈し、そしてA₆₀₀が1.30に達するまで37℃で振盪し
ながら増殖した。培養を、2.5mM IPTGの添加により始
め、次いでさらに18時間インキュベーションした。細胞
を4 ℃で20分間 6000Xg で遠心分離することによりペレ
ット化し、-80 ℃で貯蔵した。凍結細胞(12g) を溶か
し、溶菌緩衝液(25mM トリスHCl pH 7.4、50mM NaCl 、
1mM MgCl₂ 、1mM EDTA、0.05% トリトン X-100および1m
g/mlリソチーム）60 ml に再懸濁した。再懸濁物を時々
4 ℃にて45分間攪拌し、超音波処理して粘度を下げ、4
℃にて30分間70,000Xgで遠心分離することにより透明化
した。上澄みを最終濃度50 mM MgClへ補給し、80℃で20
分間加熱すると熱不安定なたんぱく質が沈殿し、これを
次いで前記のように遠心分離により除去した。上澄み
を、緩衝液 A(25mM トリスHCl pH 7.4、20mM NaCl、1mM
MgCl₂)で1:1 に希釈して塩濃度を低下させ、そしてDE
52 陰イオン交換樹脂( ワットマン）においてクロマト
グラフィーにかけた。カラムを、緩衝液A における20-5
00mM NaCl の6 カラム容量直線状勾配で展開した。アル
カリホスファターゼ活性が〜180mM NaClで溶出した。適
当なフラクションをプールし、25mMトリスHCl pH 7.4お
よび50mM NaCl ( 緩衝液B)で平衡化したヒドロキシルア
パタイトカラム( バイオ- ゲル HTP; バイオラド）へ施
した。カラムを緩衝液B の2 カラム容量で洗浄して残留
MgCl₂ を除去し、次いで緩衝液A から150mM Naホスフェ
ート pH7.0 へ8 カラム容量直線状勾配で展開した。ア
ルカリホスファターゼはホスフェート濃度〜40mMで溶出
した。プールしたフラクションを緩衝液B で1:1に希釈
し、Q-セファロースFF 陰イオン交換カラム( ファルマ
シア）へ施した。カラムを緩衝液B で洗浄し、残留ホス
フェートを除去し、そして緩衝液A において20-500mM N
aCl の10- カラム容量直線状勾配で展開した。酵素活性
は〜250mMNaClで溶出することがわかった。最終生成物
は、SDS-PAGEにより測定されると90%以上の純度であり
〜3000ユニット/ mgの比活性であることがわかった。ク
ローン化たんぱく質は、ロドサーマス マリナスから単
離された天然たんぱく質のものより低い見掛け分子量を
有する。両方のたんぱく質のアミノ酸末端のたんぱく質
配列決定により、ロドサーマス マリナスから単離され
た成熟アルカリホスファターゼの大部分がセリン残基22
で開始し( 配列番号 4、図9 参照) 、一方大腸菌から単
離されたたんぱく質はグルタミン残基21で開始すること
が明らかであった。したがって、両方のたんぱく質の間
の明らかなな分子量における差はクローン化たんぱく質
のアミノ酸末端において先端を切ったこと(truncation)
によるものではない。アルカリホスファターゼが大腸菌
および他の細菌においてペリプラズミ酵素であるので、
これらの残基のアミノ酸上流は、シグナルペプチドとし
て機能すると思われる。

【００２９】クローン化ロドサーマス マリナスアルカ
リホスファターゼで標識化されたDNAプローブ クローン化アルカリホスファターゼを、ヒトゲノムDNA
の同位体検出に使用した( 図6)。N-ras 遺伝子は、サザ
ンブロット分析により全ヒトゲノムDNA の0.1μg サン
プルにおいて簡単に検出される。ブロットは、1.0%アガ
ロースゲルによりゲノムDNA のHind III消化物を分画
し、続いて10 X SSC緩衝液を用いてハイボンド(Hybond)
N 膜( アマーシャム）へ毛管移植することにより作られ
た。400mMNaCl、4%カゼインおよび20mM MgCl₂を補給し
た変性ECL ゴールドハイブリッド化緩衝液( アマーシャ
ムから、6M尿素の代わりに2M尿素、0.4% SDSの代わりに
0.2% SDS ）において、膜を1.5 - 2 時間予備ハイブリ
ッド化した。プローブは、クローン化ロドサーマス マ
リナスアルカリホスファターゼをN-ras DNA へ架橋する
ことにより作られた。熱変性プローブ( 水中、10ng/m
l)、使用直前に希釈されたクローン化アルカリホスファ
ターゼ(10 mM MES緩衝液 pH 5.0 中、40ng/ml ）および
ホルムアルデヒド( 水中、2%）の等量( 一般的には各々
10μl ）を混合し、37℃で30分間インキュベーションし
た。プローブを予備ハイブリッド化反応物( ハイブリッ
ド化緩衝液 5ng/ml)へ直接添加し、50℃で一晩ハイブリ
ッド化した。ハイブリッド化に続いて、膜を以下のよう
にして洗浄した：1 回リンスし、次いで55℃まで予備加
熱した以下の緩衝液で2 x 10分洗浄した( 洗浄は室温に
て振盪器の台上で行った）；100mM Naホスフェート pH
7.0 、150 mM NaCl 、2M尿素、0.4% SDS、10mM MgCl₂。
続いて1 回リンスし、次いで55℃まで予備加熱した以下
の緩衝液で2 x 5 分洗浄した( 室温で洗浄）；100mM Na
ホスフェート pH7.0 、150 mM NaCl 、10mM MgCl₂。最
後のリンスを室温にて50mMトリス pH 10、100 mM NaCl
、2mM MgCl₂ で行った。膜を、膜 1cm² 当たり20μl
のCDP-スター基質( トロピックス( Tropix))を入れた密
閉プラスチックバッグに入れ、オートラジオグラフィー
フィルムへ2 時間曝した。

【００３０】使用 本発明のアルカリホスファターゼは、たんぱく質および
核酸の検出のための多数の非- 同位体方法において幾つ
かの潜在的用途がある。たとえば、この酵素の高い最適
pHによりアルカリpHでは発光形へ迅速に転化するジオキ
セタン基質に好適なものとなる。核酸ハイブリッド化に
おけるように、陽性に帯電した膜においてアルカリホス
ファターゼと結合したストレプタビジンを用いる場合、
バックグラウンドを低下させるために、9.5 以上のpHが
好ましい。さらに、このアルカリホスファターゼの高い
熱安定性により核酸プローブへの直接の架橋に有用にな
る。ハイブリッド化およびその後に続く洗浄を、厳しい
条件下( すなわち高い温度またはたとえば6M尿素のよう
な変性因子の存在下）に、酵素活性を損なうことなく行
うことができる。

【００３１】異なった生物からのアルカリホスファター
ゼは、精製の間に同じように反応するかもしれない( ま
たはしないかもしれない）。活性の高いpH最適値は、精
製自体には利用することはできないが、しかしスクリー
ニングについて以下を参照する。高温最適値は、中程度
の温度で増殖する宿主たとえば大腸菌へクローニング後
に酵素を精製することにおいて有用である。大腸菌から
の抽出物を熱処理して高温で変性する全てのたんぱく質
を沈殿させることができるであろう。

【００３２】65 - 75 ℃で安定な酵素が望ましい場合、
これらの温度で良好に増殖する新規生物を単離すること
を試みることによりこのような酵素の発見のチャンスを
増すことができる。また、高いpHに耐性のある微生物を
選択することもできる。さらに、アルカリホスファター
ゼが望ましいと分かっていると、化合物 5- ブロモ-4-
クロロ-3- インドリルホスフェート( BCIP) の使用によ
りアルカリホスファターゼ活性について、生物または組
換えクローンのライブラリーをスクリーニングすること
ができる。この化合物からリン酸基を除去すると青色が
得られ、活性をスクリーニングするのに非常に都合がよ
くなる。次いでpH活性曲線を作り、リン酸基除去活性が
アルカリホスファターゼであったかどうかを調べるよう
にしてもよい。

【００３３】他の実施態様は特許請求の範囲内である。

【００３４】

【配列表】

【００３５】配列番号：１ 配列の長さ：２９３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGGTACCGGA GCGGCCGGGG TTGATGAGCG TGGCGAAGCG CTCGACGATC CGGCCGCCCT 60 GCACACGCAC GGCTGCCAGC TCGATGATCC GATCGGCAGG CCCGGAGCCC GTCGTCTCGG 120 TATCGACGAC GACGAACGAA ACGGCGTCGA GCTGCATCCC CTCAGTGGGC TTTCGCCGAC 180 GGCTTCCTCC CGCCGGAGGC CGTCTTCGGT CAGGGCTGGC AGGTCGAAAC CCATGAGCTT 240 CGGCCAGTAA GCTGACCGTA GTTCAGTCAT TCTCGAAGCT GCCCACCAGC CGATTCGGCG 300 GCACGGATCC GAAGGCGTAC AGATTGACGT CCACAGCGGT GTGGCCATTC GAGAGTCCAG 360 CCCACCACGG ACCCGGCGAC CGATCAGCTC GGTAACCACC TCGGCCCAGG TGTCGGGTTC 420 GGCCGTGGCC TGCGCGACGA GCGCCTGCTC GTCGGCGCGC AGGCTGTCGA GCCCGAGCCA 480 GGCCTGCAGG AGCGAGTCGG GTCGCTCCGA ACGGCGCAGT GCCGGGATAA GCCGTTCGTA 540 GGAAGCCTGC ACGCGGGCCA GCACTTCCGG GTGCCAGTCG TAGACGCCGC GGCCGTCCAC 600 GTTGCGCCCC AGCGACAGAC CGCCCGTCTC GTGGTCGGCC ACCGAGACGA CGAGCGTCTG 660 TCCGTCGCGG CGGGCAAAGT CGAGCGCCAC GGCCACGGCT TCATCGTAAG CCAGCACTTC 720 GCGGACGTGG GCGGCGGCGT CGTTGGCATG TCCGGCGTGG TCGATGCGGC TGCCCTCCAC 780 CATCAGGAAG AAGCCGTCCG GATCGTCCGC CAGCAGCTCG AGTGCCGCGC GGGTCATCTC 840 GGCCAGCGTA GGGGACCTCT TACCGGGTAC GACCGGTCAA TCTCGTAGGG CAGATGGCTT 900 GGCCCGAACA GTCCCAGCAC CGGTCTCCTC ACCCCCCGGC GGAAGTCGGC GGCCGTACGC 960 ACTACCTGGT AGCCCATCGC TTCGGCTTCG CGCAGCAGAT TGCGGCCGTC CTGTCTCCGT 1020 CCGCCCTCCG CGGTCGGCAG GAAATAGCTC CAGCCACCCC CCAGCAGCAC ATCGACGCGT 1080 TGCGCCAGCA TCTGCGCGGC GATTTCGCTT TCCATGCGCG CTGCGGCACA TGGGCGGCGA 1140 AGGCGGCCGG CGTGGCGTGT GAGATCCGGC TGGTCGCCAC CAGCCCGGTC GCCATCCCAC 1200 GCGCTTTTGC CGCTTCGAGC AACGTGGCGA GTGGGCGTCC GGCCGTATCG ACGGAATCGC 1260 GCCGTTGTAG GTCTTGACGC CGCAGGCATA GGCCGTCGCC CCGGCGAGCC GGAGTCGGTC 1320 ACCCGGCTGG AGGCCGAAGC AGTACGCACG GCACCGGTCT GAATGGCATC CAGCGTCAGT 1380 TCCTCACGTC CCAGCACGGC CCGGGCATAG TCACGGGCCA TCGTGATGCT GGCCGGACCA 1440 CACCCGTCGG CAATCATCAG GATCAGGTTC TTCGGACGCG GCGACTGGGC CCGAGCCCCT 1500 TCTCCGACCC CCAACAGCAT CACCAAAAAA CAGCAATATC CAGCGCATTG TCGATTCGCT 1560 CCCATCTTGA TGAACACGGG CTGTTCAAAG ATACGACAGA TCGGCTTTCA TCCACAGCGC 1620 CCGGATTATC TACGGAAAGA GCACCATAAA AAAGCCAACC ACCCGAACAC CTGTCCACCT 1680 TGAGGGCCAA CCCGGCCGGG TTGCGACCTC AACGCAGCAG GCCAAACAGG CCGCACAATC 1740 ACCCCGATCT GTCCGCCAGA AAATAAACAT CCAGCGCACC AGACTTGCAT ACCGCCGCTT 1800 AGCATCACTT TCACCTCGGC AATCCGGCTA TCAAGCTTCG CCTCCACCTC GGCAATCCGG 1860 CTGTCGAGCT TCGCCTCCAC TTCGGCGATC CGGCCGTCGA GCTTCGCTTC AACCTTGGAG 1920 ATCCGGCCAT TAAACTTTGC CTCTACCTCG GCAATTCGGC GGTCAAGCTT CACCTCTACG 1980 GCAGCGATGC GTTGTTCCAG ATGCGACACC TCCTACGCTG AATCCGACGG TCCACGCTTC 2040 GCCACCTCCT CCGTGATCGC GTCTGCTCCA GCACGCGCTT CCACCTCGGT GATGCGATTG 2100 TCCAGGCGCT TTTCGGTCTC GGCGACCCGC CGCGCGAAAC GCTCCTCTAC AATCCCCAGC 2160 AGATTGTTAC GCTCGTGATG GGCCGCCTCG TTGAGCAAAT TGATGAGCGC CTCGACACCT 2220 TCGTCGCCGA GCTTTTCACG CAAAGCTTTT CACGCAAAAC TTTCGGACGG TCAGATTGCC 2280 ATGAGCGCCT CCACATAGGA TAGGCTAAAA GGAAATCGCA CCTTATTTCT GGAGGTTCCC 2340 GTTTTCGTCC AAACCGTCCG GTGTCTCGTT GTCAATTGCC CGGCCAGGTT CGGAGGCTAG 2400 ATTCGAGCTG TCGGGCTAGC CAGGCGCCGT ATTGCGGATT GGGCAGGACG ATCCAGCGCG 2460 TGCCCCACCA GGAGCGATAA CGCCGGACCA GTGCTCGCCG TGCTTCGGCT CTGGTTTCAG 2520 GATCGACATA AAGTCGCCCA GCTGGTCGCC GATCTGGAGC AGGATGCGAT AGCGCTGGCC 2580 CAGGATACCC GGCGCGGTTC TTTGTCGGAA GATCCGCATT CGGGCCGCTC GCCACGCGTC 2640 AGGATTACGT CGAGCGTGTA CCGGCAGTGG GAAGCCGACG GCCTGCAGGT TACGACGGGT 2700 GGCCTCCTCC AGGTCGGCCG TGCGGTTGGT CACATAAAAG ACCTGACGCC GTGCCGGCGC 2760 GCCTCCTGTA CGAACACGAC AGCACCGGGC ACAGGTTCGG CCTGTGCAGC CTGCACCCAG 2820 CGCGCCCAGC TCTCCGGCGC AAAAGTCCGG CCCGTCGCAA CGAGCCAGGC CTGATAGGGG 2880 CTGTTGTCGA GCACGGTCTC GTCCACGTCC ACGATCCACT AGTTCTAGAG CGGCCG 2936

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：４４５４ 配列の型：核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60 CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120 TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC 240 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 300 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT 360 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGAGCTCGGT ACCGAGCGGC 420 CGGGGTTGAT GAGCGTGGCG AAGCGCTCGA CGATCCGGCC GCCCTGCACA CGCACGGCTG 480 CCAGCTCGAT GATCCGATCG GCAGGCCCGG AGCCCGTCGT CTCGGTATCG ACGACGACGA 540 ACGAAACGGC GTCGAGCTGC ATCCCCTCAG TGGCTTTCGC CGACGGCTTC CTCCCGCCGG 600 AGCGTCTCGG TCAGGGCTGG CAGGTCGAAA CCCATGAGTT CGGCCAGTAA GCGGCCGAGT 660 TCGTCATTCT CGAAGCTGCC CACCAGCCGT TCGGCGCCGG GTCCGAAGGC GTACAGATTG 720 ACGTCCACAG CGGTGTGGCC ATTCGAGGTC CAGCCCACCA CGGCCCGGCG ACCGATCAGC 780 TCGGTAACCA CCTCGGCCCA GGTGTCGGGT TCGGCCGTGG CCTGCGCGAC GAGCGCCTGC 840 TCGTCGGCGC GCAGGCTGTC GAGCCCGAGC CAGGCCTGCA GGAGCGAGTC GGGTCGCTCC 900 GAACGGCGCA GTGCCGGGAT AAGCCGTTCG TAGGAAGCCT GCACGCGGGC CAGCACTTCC 960 GGGTGCCAGT CGTAGACGCC GCGGCCGTTC ACGTTGCGCC CCAGCGACAG ACCGCCCGTC 1020 TCGTGGTCGG CCACCGAGAC GACGAGCGTC TGTCCGTCGC GGCGGGCAAA GTCGAGCGCC 1080 ACGGCCACGG CTTCATCGTA AGCCAGCACT TCGCGGACGT GGGCGGCGGC GTCGTTGGCA 1140 TGTCCGGCGT GGTCGATGCG GCTGCCCTCC ACCATCAGGA AGAAGCCGTC CGGATCGTCC 1200 GCCAGCAGCT CGAGTGCCGC GCGGGTCATC TCGGCCAGCG AGGGGACCTC TTCCGGGTCG 1260 CGGTCAATCT CGTAGGGCAG ATGGCTTGGC CCGAACAGTC CCAGCACCGG TCTCCTCACC 1320 CCCCGGCGGA AGTCGGCGGC CGTACGCACT ACCTGGTAGC CCATCGCTTC GGCTTCGCGC 1380 AGCAGATTGC GGCCGTCCTG TCTCCGTCCG CCCTCCGCGG TCGGCAGGAA ATAGCTCCAG 1440 CCACCCCCCA GCAGCACATG GACGCGTTGC GCCAGCATCT GCGCGGCGAT TTCGCTTTCC 1500 ATGGCGCGCT GCGGCACATG GGCGGCGAAG GCGGCCGGCG TGGCGTGTGA GATCCGGCTG 1560 GTCGCCACCA GCCCGGTCGC CATCCCACGC GCTTTTGCCG CTTCGAGCAA CGTGGCGAGT 1620 GGGCGTCCGG CCGTATCGAC GGCAATCGCG CCGTTGTAGG TCTTGACGCC GCAGGCATAG 1680 GCCGTCGCCC CGGCGGCCGA GTCGGTCACC CGGCTGGAGG CCGAAGCAGT ACGCACGGCA 1740 CCGGTCTGAA TGGCATCCAG CGTCAGTTCC TCACGTCCCA GCACGGCCCG GGCATAGTCA 1800 CGGGCCATCG TGATGCTGGC CGGACCACAC CCGTCGGCAA TCATCAGGAT CAGGTTCTTC 1860 GGACGCGGCG ACTGGGCCCG AGCCCCTTCT CCGACCCCCA ACAGCATCAC CAAAAACAGC 1920 AATATCCAGC GCATTGTGCA TCGCTCCATC TGATGAACAC GGGCTGTTCA AAGATACGAC 1980 AGATCGGCTT TCATCCACAG CCCCGGATAC TACGGAAAGA GCACCATAAA AAAGCCAACC 2040 ACCCGAACAC CTGTCCACCT TGAGGGCCAA CCCGGCCGGG TTGCGACCTC AACGCAGCAG 2100 CGCAAACAGC GCCACAATCA CCCCGATCTG TCCCGCCCAG AAAATAAACA TCCAGCGCAC 2160 CAGACTTGCA TACCGCTCGC TTAGCATCAC TTTCACCTCG GCAATCCGGC TATCAAGCTT 2220 GGCGTAATCA TGGTCATAGC TGTTTCCTGT GTGAAATTGT TATCCGCTCA CAATTCCACA 2280 CAACATACGA GCCGGAAGCA TAAAGTGTAA AGCCTGGGGT GCCTAATGAG TGAGCTAACT 2340 CACATTAATT GCGTTGCGCT CACTGCCCGC TTTCCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT 2400 GCATTAATGA ATCGGCCAAC GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC 2460 TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA 2520 CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG 2580 AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA 2640 TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA 2700 CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC 2760 TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC 2820 GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT 2880 GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG 2940 TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG 3000 GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA 3060 CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG 3120 AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT 3180 TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT 3240 TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG 3300 ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT 3360 CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC 3420 TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT 3480 AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC 3540 ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG 3600 AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG 3660 AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT 3720 GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG 3780 AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT 3840 TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC 3900 TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC 3960 ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA TACGGGATAA 4020 TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG 4080 AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC 4140 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG 4200 GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT 4260 CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT 4320 TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC 4380 ACCTGACGTC TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC 4440 GAGGCCCTTT CGTC 4454

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：１３６８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATGCGCTGGA TATTGCTGTT TTTGGTGATG CTGTTGGGGG TCGGAGAAGG GGCTCGGGCC 60 CAGTCGCCGC GTCCGAAGAA CCTGATCCTG ATGATTGCCG ACGGGTGTGG TCCGGCCAGC 120 ATCACGATGG CCCGTGACTA TGCCCGGGCC GTGCTGGGAC GTGAGGAACT GACGCTGGAT 180 GCCATTCAGA CCGGTGCCGT GCGTACTGCT TCGGCCTCCA GCCGGGTGAC CGACTCGGCC 240 GCCGGGGCGA CGGCCTATGC CTGCGGCGTC AAGACCTACA ACGGCGCGAT TGCCGTCGAT 300 ACGGCCGGAC GCCCACTCGC CACGTTGCTC GAAGCGGCAA AAGCGCGTGG GATGGCGACC 360 GGGCTGGTGG CGACCAGCCG GATCTCACAC GCCACGCCGG CCGCCTTCGC CGCCCATGTG 420 CCGCAGCGCG CCATGGAAAG CGAAATCGCC GCGCAGATGC TGGCGCAACG CGTCCATGTG 480 CTGCTGGGGG GTGGCTGGAG CTATTTCCTG CCGACCGCGG AGGGCGGACG GAGACAGGAC 540 GGCCGCAATC TGCTGCGCGA AGCCGAAGCG ATGGGCTACC AGGTAGTGCG TACGGCCGCC 600 GACTTCCGCC GGGGGGTGAG GAGACCGGTG CTGGGACTGT TCGGGCCAAG CCATCTGCCC 660 TACGAGATTG ACCGCGACCC GGAAGAGGTC CCCTCGCTGG CCGAGATGAC CCGCGCGGCA 720 CTCGAGCTGC TGGCGGACGA TCCGGACGGC TTCTTCCTGA TGGTGGAGGG CAGCCGCATC 780 GACCACGCCG GACATGCCAA CGACGCCGCC GCCCACGTCC GCGAAGTGCT GGCTTACGAT 840 GAAGCCGTGG CCGTGGCGCT CGACTTTGCC CGCCGCGACG GACAGACGCT CGTCGTCTCG 900 GTGGCCGACC ACGAGACGGG CGGTCTGTCG CTGGGGCGCA ACGTGAACGG CCGCGGCGTC 960 TACGACTGGC ACCCGGAAGT GCTGGCCCGC GTGCAGGCTT CCTACGAACG GCTTATCCCG 1020 GCACTGCGCC GTTCGGAGCG ACCCGACTCG CTCCTGCAGG CCTGGCTCGG GCTCGACAGC 1080 CTGCGCGCCG ACGAGCAGGC GCTCGTCGCG CAGGCCACGG CCGAACCCGA CACCTGGGCC 1140 GAGGTGGTTA CCGAGCTGAT CGGTCGCCGG GCCGTGGTGG GCTGGACCTC GAATGGCCAC 1200 ACCGCTGTGG ACGTCAATCT GTACGCCTTC GGACCCGGCG CCGAACGGCT GGTGGGCAGC 1260 TTCGAGAATG ACGAACTCGG CCGCTTACTG GCCGAACTCA TGGGTTTCGA CCTGCCAGCC 1320 CTGACCGAGA CGCTCCGGCG GGAGGAAGCC GTCGGCGAAA GCCACTGA 1368

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：４５５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Arg Trp Ile Leu Leu Phe Leu Val Met Leu Leu Gly Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Gln Ser Pro Arg Pro Lys Asn Leu Ile Leu Met Ile 20 25 30 Ala Asp Gly Cys Gly Pro Ala Ser Ile Thr Met Ala Arg Asp Tyr Ala 35 40 45 Arg Ala Val Leu Gly Arg Glu Glu Leu Thr Leu Asp Ala Ile Gln Thr 50 55 60 Gly Ala Val Arg Thr Ala Ser Ala Ser Ser Arg Val Thr Asp Ser Ala 65 70 75 80 Ala Gly Ala Thr Ala Tyr Ala Cys Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala 85 90 95 Ile Ala Val Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Ala Thr Leu Leu Glu Ala 100 105 110 Ala Lys Ala Arg Gly Met Ala Thr Gly Leu Val Ala Thr Ser Arg Ile 115 120 125 Ser His Ala Thr Pro Ala Ala Phe Ala Ala His Val Pro Gln Arg Ala 130 135 140 Met Glu Ser Glu Ile Ala Ala Gln Met Leu Ala Gln Arg Val His Val 145 150 155 160 Leu Leu Gly Gly Gly Trp Ser Tyr Phe Leu Pro Thr Ala Glu Gly Gly 165 170 175 Arg Arg Gln Asp Gly Arg Asn Leu Leu Arg Glu Ala Glu Ala Met Gly 180 185 190 Tyr Gln Val Val Arg Thr Ala Ala Asp Phe Arg Arg Gly Val Arg Arg 195 200 205 Pro Val Leu Gly Leu Phe Gly Pro Ser His Leu Pro Tyr Glu Ile Asp 210 215 220 Arg Asp Pro Glu Glu Val Pro Ser Leu Ala Glu Met Thr Arg Ala Ala 225 230 235 240 Leu Glu Leu Leu Ala Asp Asp Pro Asp Gly Phe Phe Leu Met Val Glu 245 250 255 Gly Ser Arg Ile Asp His Ala Gly His Ala Asn Asp Ala Ala Ala His 260 265 270 Val Arg Glu Val Leu Ala Tyr Asp Glu Ala Val Ala Val Ala Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Arg Arg Asp Gly Gln Thr Leu Val Val Ser Val Ala Asp His 290 295 300 Glu Thr Gly Gly Leu Ser Leu Gly Arg Asn Val Asn Gly Arg Gly Val 305 310 315 320 Tyr Asp Trp His Pro Glu Val Leu Ala Arg Val Gln Ala Ser Tyr Glu 325 330 335 Arg Leu Ile Pro Ala Leu Arg Arg Ser Glu Arg Pro Asp Ser Leu Leu 340 345 350 Gln Ala Trp Leu Gly Leu Asp Ser Leu Arg Ala Asp Glu Gln Ala Leu 355 360 365 Val Ala Gln Ala Thr Ala Glu Pro Asp Thr Trp Ala Glu Val Val Thr 370 375 380 Glu Leu Ile Gly Arg Arg Ala Val Val Gly Trp Thr Ser Asn Gly His 385 390 395 400 Thr Ala Val Asp Val Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Pro Gly Ala Glu Arg 405 410 415 Leu Val Gly Ser Phe Glu Asn Asp Glu Leu Gly Arg Leu Leu Ala Glu 420 425 430 Leu Met Gly Phe Asp Leu Pro Ala Leu Thr Glu Thr Leu Arg Arg Glu 435 440 445 Glu Ala Val Gly Glu Ser His 450 455

【図面の簡単な説明】

【図１】精製したロドサーマス マリナスアルカリホス
ファターゼのSDS-PAGEゲルの再現である。レーン1 は、
分子量マーカーを表す。レーン2 、3 、4 および5 はそ
れぞれ精製たんぱく質の0.4 、0.8 、1.6 および3.2 μ
g を表す。

【図２】酵素の温度活性曲線である。温度はx 軸におい
て示される。比活性( μ/ mg)はy 軸において示され
る。

【図３】65℃における酵素の安定性のグラフである。65
℃( 時間）におけるインキュベーションがx 軸において
示される。初期活性パーセントはy 軸において示され
る。

【図４】酵素のpH活性曲線である。白い四角形は、0.1M
CAPS 、1mM MgCl₂ および6 mMpNPP において検定され
た酵素活性を示す。黒塗りのダイヤモンド形は各々0.1M
のエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノ
ールアミン、1mM MgCl₂および6 mM pNPP において検定
された酵素活性を示す。x 軸においてpHが示される。比
活性( μ/ mg) はy 軸において示される。

【図５】ロドサーマス マリナスアルカリホスファター
ゼを用いたドットブロットDNAの様々な量(0.01 ng、0.0
5ng、0.1 ngおよび0.5ng 、 1 ng 、5 ng、10 ng ）の
非- 同位体検出を表す。

【図６】クローン化ロドサーマス マリナスアルカリホ
スファターゼで標識化したN-ras DNA フラグメントでプ
ローブしたヒトゲノムDNA のサザンブロットを表す。全
DNA の四つの量を充填した：1.0 、0.5 、 0.2、 0.1μ
g 。標識DNA は0.5 、0.25、0.1 、0.05 pg に相当す
る。

【図７】アルカリホスファターゼの遺伝子および側枝領
域を有するロドサーマス マリナス由来のゲノムDNA の
配列である( 配列番号 1) 。

【図８】pUC19 へクローンされたロドサーマス マリナ
ス由来のアルカリホスファターゼおよび側枝領域を含む
ゲノムDNA の1.8kb セグメントを有するプラスミドpCRM
1.8 の配列を表す( 配列番号 2) 。

【図９】Rma アルカリホスファターゼの推定の全長たん
ぱく質配列( 455 アミノ酸）(配列番号 4) および相当
する核酸配列(1368 bp)(配列番号 3) を表す。最初の20
個のアミノ酸配列は、大腸菌において単一配列として機
能すると推定される。アミノ酸配列の下線の部分は大腸
菌から単離されたクローン化酵素のたんぱく質配列化に
より変化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:01） (71)出願人 596154583 26111 Ｍｉｌｅｓ Ｒｏａｄ，Ｃｌｅｖ ｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ 44128，Ｕｎｉｔ ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ ａ (72)発明者 マリア・デービス アメリカ合衆国オハイオ州44087，トゥイ ンズバーグ，ナザニエル・レイン 12080

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ホスファターゼがロドサーマス マリナ
   ス( Rhodothermus marinus) のアルカリホスファターゼ
   の酵素活性部分とそのアミノ酸配列において少なくとも
   75% 相同である酵素活性熱安定性アルカリホスファター
   ゼまたはその部分。
2. 【請求項２】 前記ホスファターゼのアミノ酸配列がロ
   ドサーマス マリナスの前記ホスファターゼと比べて10
   個未満の保守的アミノ酸交換を含む請求項1のアルカリ
   ホスファターゼ。
3. 【請求項３】 前記ホスファターゼのアミノ酸配列がロ
   ドサーマス マリナスの前記ホスファターゼと比べて10
   個未満の追加のアミノ酸を含む請求項1 のアルカリホス
   ファターゼ。
4. 【請求項４】 SDS-PAGEにより測定されると約45,000-5
   5,000 の見掛け上のサブユニット分子量を有し、そして
   65℃で1 時間加熱に対して安定なロドサーマス マリナ
   スに存在する熱安定性アルカリホスファターゼの精製さ
   れた酵素活性部分。
5. 【請求項５】 請求項1-4 のいずれか1 の熱安定性アル
   カリホスファターゼをコードする精製された核酸。
6. 【請求項６】 請求項5 の核酸を含む細胞。
7. 【請求項７】 SDS-PAGEゲルにより測定されると約45,0
   00-55,000 の見掛け上のサブユニット分子量を有し、そ
   して65℃で1 時間加熱に対して安定なロドサーマス マ
   リナス由来の組換えアルカリホスファターゼ。
8. 【請求項８】 65℃で1 時間の加熱に対して安定な熱安
   定性アルカリホスファターゼで標識化された核酸、たん
   ぱく質、または抗体を提供する工程を含むサンプルにお
   ける核酸またはたんぱく質を検出する方法。
9. 【請求項９】 65℃で1 時間の加熱に対して安定なロド
   サーマス マリナス由来の熱安定性アルカリホスファタ
   ーゼで標識化された核酸、たんぱく質または抗体を提供
   する工程を含むサンプルにおける核酸またはたんぱく質
   を検出する方法。