JPH09176197A

JPH09176197A - ２−エチルチオメチルフェニルメチルカルバマートに特異的な抗体及びその製造方法

Info

Publication number: JPH09176197A
Application number: JP7338787A
Authority: JP
Inventors: Shigeyuki Watanabe; 繁幸渡邊; Yoshio Kamata; 良雄鎌田; Naiki Omoda; 内記面田; Atsushi Fujii; 淳藤井; Masao Hayashi; 昌郎林; Michiyasu Kawada; 充康川田
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Current assignee: Otsuka Chemical Co Ltd; Kankyo Meneki Gijutsu Kenkyusho KK
Priority date: 1995-12-26
Filing date: 1995-12-26
Publication date: 1997-07-08

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、２−エチルチオメチルフェニル
メチルカルバマートに特異的な抗体およびその製造方法
に関する。【解決手段】本発明の抗体は、以下の式：【化１】を有する化合物にシュレッパーを結合させたものを抗原
として用いることにより製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２−エチルチオメ
チルフェニルメチルカルバマートに特異的な抗体およ
びその製造方法に関する。本発明の抗体は、２−エチル
チオメチルフェニルメチルカルバマート以外のカルバ
マート系化合物に対して極めて交差反応性が低いという
特徴を有する。本発明はさらに該抗体を使用した２−エ
チルチオメチルフェニルメチルカルバマートの免疫化
学的測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】２−エチルチオメチルフェニルメチル
カルバマートは、以下の化学式：

【化６】を有するカルバマート剤で、アブラムシ防除剤として広
く使用されている。一般名をエチオフェンカルブとい
い、ドイツのバイエル社によって開発され、アリルメー
ト（Ａｒｙｌｍａｔｅ）、フルアップ、Ｃｒｏｎｅｔｏ
ｎ等の商品名で市販されている。エチオフェンカルブは
アブラムシに対し、接触効果と浸透移行効果を有し、即
効的に効く優れた殺虫剤である。コリンエステラーゼを
阻害して殺虫活性を発現するが、殺虫スペクトルは吸汁
性のアブラムシ類に限られ選択的である。さらに、エチ
オフェンカルブは有機リン抵抗性のアブラムシにも十分
な殺虫活性を有する。しかも、有益昆虫、天敵には悪影
響が少ないという特性を持つ（農薬ハンドブック１９
９４年版日本植物防疫協会）。

【０００３】このようにエチオフェンカルブは広く使用
されている有効なアブラムシ除去剤であるが、比較的毒
性の高い化合物（劇物）（２％以下普通物）である。ま
た、本明細書に参考文献として取り込まれる The Pesti
cide Manual Ed.Charles R.Worthing The British Co
rp Protection Council によれば、エチオフェンカルブ
のＡＤＩは０.１ｍｇ／ｋｇ体重である。

【０００４】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。エチオフェンカルブについても以下のように食品に
残留する基準値が定められている：麦・雑穀（１ｐｐ
ｍ）、豆類（１ｐｐｍ）、果実（５−１０ｐｐｍ）、い
も類（０.５−１ｐｐｍ）．野菜（０.５−１０ｐｐ
ｍ）、オイルシード（５ｐｐｍ）、ナッツ類（５ｐｐ
ｍ）、茶（３０ｐｐｍ）（最新農薬の残留分析法農薬
残留分析法研究班編集中央法規出版）。環境や食品に
関する安全確保のためには、これらに含有されるエチオ
フェンカルブの量を迅速、かつ正確に測定することが必
要である。

【０００５】従来、エチオフェンカルブは、主に試料か
ら農薬を抽出し、精製後、ガスクロマトグラフィー（Ｇ
Ｃ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
分析されている。例えば、試料をアセトンで抽出し、濃
縮した後、多孔性ケイソウ土カラムを利用し、次にスル
ホンに酸化した後、シリカゲルミニカラムを用いて精製
し、キャピラリーカラムを用いたＧＣで測定する方法が
採用されていた（最新農薬の残留分析法農薬残留分析
法研究班編集中央法規出版）。これらの方法は、試料
の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟
練を有すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費
用を必要とする等の問題点があった。エチオフェンカル
ブの測定は、測定試料が多大で、特に、輸入農産物等の
残留農薬の分析では短時間内に結果をだす必要があり、
精度面以外にも、簡便性、迅速性及び経済性を具備した
新しい測定法が要求されている。

【０００６】免疫測定法は、抗体が抗原を特異的に認識
する、抗原−抗体反応に基づいて抗原の検出を行う方法
であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から
近年注目を集めている。免疫測定法においては検出方法
として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレー
サー、化学発光性および蛍光性標識、金属原子およびゾ
ル、安定遊離基、ラテックスならびにバクテリオファー
ジが適用されてきた。

【０００７】免疫測定法の内でも、酵素を使用する酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広く使用
されるに至った。酵素免疫測定法についての優れた論評
が、Tijssen P, "Practice and theory of enzyme immu
noassays" in Laboratory techniques in biochemistry
and molecular biology, Elsevier Amsterdam New Yor
k, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) により提供され
ている。

【０００８】一般に、大きい抗原分子および小さい生物
学的有機分子については、それ以上修飾することなく動
物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗
原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、
エチオフェンカルブのような小さい分子（ＭＷ＜１,０
００）は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すこ
とができない。これら分子はより大きい分子（シュレッ
パー）に結合させることによって初めて一団のエピトー
プとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起
こし、その結果、１群のＢリンパ球により抗体を産生さ
せる。このようにシュレッパーと結合させて初めて免疫
原性を生じる分子を総称して「ハプテン」という。

【０００９】しかし、小分子をシュレッパーと結合させ
たものを抗原としても、得られた抗体は望む分子は認識
しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合が
しばしばある。即ち、小さい分子に対する抗体を産生さ
せるためには、これをシュレッパーと結合させる必要が
ある。その際には、一般に小さい分子そのものではな
く、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム
（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必
要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、
結合手の大きさ等を全ての問題を考慮して導入が適切に
行われたものを使用しないと、上述したような好ましく
ない抗体しか得られない。適切な導入は個々の分子に応
じて工夫しなけらばならない。エチオフェンカルブに対
する適切な抗体についてはその必要性が非常に高かった
にもかかわらず、本出願前には得られていなかった。

【００１０】

【発明の解決しようとする課題】本発明は、エチオフェ
ンカルブに特異的な新規な抗体およびその製造方法を提
供することを目的とする。

【００１１】本発明はその一態様において、エチオフェ
ンカルブに対する特異性が極めて高く、他のカルバマー
ト系化合物との交差反応性が低いという特徴を有するモ
ノクローナル抗体を提供する。前記抗体は、さらに５０
％以下のメタノール存在下においてエチオフェンカルブ
を濃度依存的に認識できるという特徴を有する。

【００１２】本発明は、また、前記抗体を産生するハイ
ブリドーマを提供することを目的とする。

【００１３】本発明は、さらに、前記抗体を使用するこ
とを含む、エチオフェンカルブまたはその誘導体の免疫
化学的測定法を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
重ねた結果、エチオフェンカルブの−ＮＨＣＨ₃部分を
−ＮＨ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ（ｎは１〜５の整数）に変化
させたエチオフェンカルブ誘導体をハプテンとして使用
することにより、エチオフェンカルブに特異的な抗体を
得られることを見いだし、本発明の完成に至った。

【００１５】すなわち本発明の方法は、以下の一般式
（１）：

【化７】（ｎは、１〜５の整数、好ましくは３である）を有する
エチオフェンカルブ誘導体を適当なシュレッパーと結合
させたものを抗原として用いることによって得られた、
エチオフェンカルブに特異的な抗体およびその製造方
法、ならびに該抗体を用いるエチオフェンカルブの免疫
化学的測定法に関する。

【００１６】エチオフェンカルブ誘導体の作製一般式（１）で表されるエチオフェンカルブ誘導体は、
公知の方法に従って製造することができる。例えば、一
般式（２）：

【化８】［式中、Ｒはカルボキシル保護基を示す。ｎは一般式
（１）に同じ］で表されるエステル化合物から、Ｒで示
されるカルボキシル保護基を除去することにより製造で
きる。

【００１７】上記一般式（２）中、Ｒで示されるカルボ
キシル保護基は公知のものでよく、その具体例として、
例えばｔｅｒｔ−ブチル基、ｐ−メトキシベンジル基、
トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−
ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニル
シリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリ
ル基、トリメチルシリルエトキシメチル基、トリチル
基、メチル基、エチル基等を挙げることができる。

【００１８】Ｒで示されるカルボキシル基の除去は、公
知の方法に従って行うことができる。例えば、該保護基
がｔｅｒｔ−ブチル基である場合を例にとれば、一般式
（２）のエステル化合物を含む有機溶媒に強酸性触媒を
加えて好ましくは撹拌下に反応させることにより行われ
る。有機溶媒としては、例えば、ベンゼン等の芳香族炭
化水素類、ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタン等
のハロゲン化炭化水素類、又はこれらの混合溶媒等を使
用できる。強酸性触媒としては公知のもの、例えばトリ
フルオロ酢酸等のカルボン酸、ｐ−トルエンスルホン酸
等のスルホン酸、塩酸、硫酸等の鉱酸などが使用できる
が、その中でもトリフルオロ酢酸が好ましい。反応温度
は、通常０−５０℃程度、好ましくは室温付近がよく、
反応時間は通常２−２４時間程度とすればよい。

【００１９】また、保護基の除去は、アルカリ加水分解
によっても行うことができる。更にベンジル基の除去は
加水素分解によっても行うことができる。

【００２０】尚、一般式（１）および（２）において、
ｎは１〜５の整数、好ましくは３である。ここにおいて
ｎは反応物が実質上その整数で表されるという意味であ
る。

【００２１】一般式（２）のエステル化合物は、種々の
方法によって合成することができる。その具体例として
（イ）〜（ハ）の方法を以下に示す。

【００２２】（イ）一般式（３）：ＮＨ₂−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＲ（３）［式中、Ｒ及びｎは上記に同じ］で表される直鎖アミノ
酸と式（４）：

【化９】で表されるヒドロキシ化合物とを、溶媒中にて塩基及び
ハロ蟻酸エステル類、ホスゲン、トリホスゲン等のカル
ボニル化剤の存在下に反応させる。溶媒としては、例え
ば、酢酸エチル等のエステル類、ジクロロエタン、ジク
ロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン、エチルベンゼン、クロロベンゼン、ア
ルキルナフタレン等の芳香族炭化水素類、シクロヘキサ
ノン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等
のケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ
シド、アセトニトリル、鉱油留分等やこれらの混合溶媒
等の有機溶媒が好適に使用される。塩基としては公知の
もの、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩
無水物、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカ
リ水酸化物、トリエチルアミン、ピリジン、４−ジメチ
ルアミノピリジン、２,４,６−コリジン、トリエチルア
ミン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩基等が使用でき
るが、その中でもトリエチルアミンが好ましい。反応温
度は氷冷温度−室温付近とすればよく、反応時間は１−
５時間程度とすればよい。尚、式（４）のヒドロキシ化
合物は種々の合成法により製造され得るが、エチオフェ
ンカルブを加水分解することにより容易に製造できる。
この加水分解は、従来公知の加水分解条件、例えば酸ま
たは塩基の存在下、水溶液もしくは有機溶媒を含む水溶
液を、通常室温−加熱下に撹拌することにより行われ
る。酸としては、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸、ｐ
−トルエンスルホン酸等のスルホン酸、塩酸、硫酸等の
鉱酸を例示できる。塩基としては、公知のもの、例えば
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩無水物、水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ水酸化物、
トリエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリ
ジン、２,４,６−コリジン、トリエチルアミン、Ｎ−メ
チルモルホリン等の有機塩基等を例示できる。有機溶媒
としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、エ
チルベンゼン、クロルベンゼン、アルキルナフタリン等
の芳香族炭化水素類、シクロヘキサノン、メチルエチル
ケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、メタノ
ール、エタノール、イソプロピルアルコール等の低級ア
ルコール類、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ等の
セロソルブ類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、アセトニトリル、鉱油留分等やこれらの混合溶
媒等を例示できる。またこれら有機溶媒と水との２相系
で反応を行うこともできる。該反応は、通常０−５０℃
にて良好に進行する。

【００２３】（ロ）式（４）のヒドロキシ化合物と塩基
とを数時間程度加熱撹拌してヒドロキシ化合物の塩を生
成させ、更に室温でカルボニル化剤を加えて。８０−９
０℃程度の温度下に１時間程度反応させることにより、
一般式（５）：

【化１０】［式中、Ｘはハロゲン原子を示す。］で表されるアルコ
キシカルボニルハライドが製造される。塩基としては、
好ましくは炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩無
水物、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ
水酸化物、トリエチルアミン等の有機塩基が用いられ
る。またカルボニル化剤としては、例えばクロロ蟻酸ト
リクロロメチル等のハロ蟻酸エステル類、ホスゲン、ト
リホスゲン等を例示できる。次に一般式（５）のアルコ
キシカルボニルハライドを反応系から単離精製し、上記
一般式（３）の直鎖アミノ酸と反応させることにより、
一般式（２）のエステル化合物が得られる。この反応
は、上記（イ）の方法と同様の条件下に行われる。

【００２４】（ハ）式（４）のヒドロキシ化合物と一般
式（６）Ｐｈ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯＯＲ（６）［式中、Ｐｈはフェニル基を示す。Ｒは上記に同じ。］
で表されるフェニルカルバマートを、有機溶媒中にて塩
基触媒の存在下で反応させることにより、一般式（２）
のエステル化合物が得られる。この反応において、有機
溶媒としては、例えばアセトニトリル等のニトリル類、
ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、又はこれら
の混合溶媒を使用できる。塩基触媒としては公知のも
の、例えばトリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリ
ジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、１,
５−ジアザビシクロ［４,３,０］ノン−５（ＤＢＮ）、
１,８−ジアザビシクロ［５,４,０］ウンデク−７−エ
ン（ＤＢＵ）、１,４−ジアザビシクロ［２,２,２］オ
クタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭
酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム
等の無機塩基等が使用できるが、その中でも１,８−ジ
アザビシクロ［５,４,０］ウンデク−７−エンが好まし
い。反応温度は氷冷温度−室温程度、反応時間は１−３
時間程度とするのが好ましい。

【００２５】以下、本発明の抗原、抗体の作製、および
免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製
は、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本
生化学会編）等に記載の公知の方法に従って行うことが
できる。

【００２６】抗原の作製上述のように合成されたエチオフェンカルブ誘導体は適
当なシュレッパー（Ｓｃｈｌｅｐｐｅｒ）に結合させて
から免疫用抗原として使用する。シュレッパーとは、キ
ャリアーまたは担体のことでり、免疫原性が非常に弱い
か、またはハプテン基のように単独では抗体生産能をも
たない構造物と結合して、免疫原性を増強するか、また
は発現させる物質をいう。一般には分子量の比較的大き
なタンパク質が用いられるが、赤血球などの細胞や、多
糖体なども用いられる。好ましいシュレッパーの例とし
ては、スカシガイのヘモシアニン、卵白アルブミン、ウ
シ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミンなどがある。
スカシガイのヘモシアニン及びウシの血清アルブミンが
好ましい。

【００２７】エチオフェンカルブとシュレッパーとの結
合は、例えば、混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:
J.Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)）または活性化エ
ステル法（A.E. KARU et al.:J. Agric. Food Chem. 42
301-309 (1994)）等の公知の方法によって行うことが
できる。

【００２８】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを通常単離することなくシュレッパーと反応さ
せることにより目的とするハプテン−シュレッパー結合
体が製造される。ショッテン−バウマン反応は塩基性化
合物の存在下に行われる。塩基性化合物としてはショッ
テン−バウマン反応に慣用の化合物を使用することがで
き、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピ
リジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｄ
ＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナト
リウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常−
２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃におい
て行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５
分から２時間である。得られた混合酸無水物とシュレッ
パーとの反応は、通常−２０℃から１５０℃、好ましく
は１０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分
から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合
酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、
混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可
能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、
ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、
トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエ
ーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシ
エタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエ
ステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロ
トン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法におい
て使用されるアルキルハロカルボン酸としては、例えば
クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げ
られる。当該方法におけるハプテンとアルキルハロカル
ボン酸とシュッレパーの使用割合は、広い範囲から適宜
選択され得る。

【００２９】ポリクローナル抗体の作製エチオフェンカルブ−シュレッパー結合体を使用して、
慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を
作製することができる。例えば、エチオフェンカルブ−
ウシ血清アルブミン結合体をリン酸ナトリウム緩衝液
（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、フロイント完全
アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫原として哺乳
動物を免疫化することによって行う。免疫化される動物
としては当該分野で常用されるものをいずれも使用でき
るが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等
を挙げることができる。特に好ましいのはウサギ、ヤギ
である。

【００３０】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で行うことができる。

【００３１】免疫化した動物から血液を採取し、そこか
ら分離した血清を用いて後述する方法によってエチオフ
ェンカルブを測定し、ポリクローナル抗体を評価するこ
とができる。

【００３２】ポリクローナル抗体によるエチオフェンカ
ルブの測定本発明で使用するポリクローナル抗体によるエチオフェ
ンカルブの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）（Engval
l,E.,Meth. Enzymol., 70, 419-439 (1980)）、蛍光抗
体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応、オクタ
ロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｙ）等の一般に抗体の検出
に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモ
ノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、
第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられ
る。感度、迅速性、正確性、自動化等の観点からＥＬＩ
ＳＡ法およびＲＩＡ法が好ましい。

【００３３】上述の測定は、例えば間接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法により、以下のような手順により行うことができ
る。（ａ）まず、抗原であるエチオフェンカルブ−シュ
レッパー結合体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着
していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質により
ブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のエチオフェ
ンカルブを含む試料及びポリクローナル抗体（及び／又
はモノクローナル抗体）を加え、該抗体を前記固相化抗
原および遊離エチオフェンカルブに競合的に結合させ
て、抗体−固相化抗原複合体及び抗体−遊離エチオフェ
ンカルブ複合体を生成させる。（ｄ）抗原−固相化抗原
複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線
から試料中の遊離エチオフェンカルブの量を決定するこ
とができる。

【００３４】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特に制限されず、ＥＬＩＳＡ法において常
用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６穴マイクロプレートが挙げら
れる。

【００３５】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、１４５ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７.２）の組成のものを挙げることができる。
緩衝液中の抗原の濃度は特に制限されず広い範囲から選
択できるが、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好
ましくは０.０５−５μｇ／ｍｌが適している。また、
担体として９６穴マイクロプレートを使用する場合に
は、２０−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、
インキュベーションの条件も特に制限はないが、通常４
℃程度で一晩インキュベーションが適している。

【００３６】（ｂ）工程のブロッキングは、エチオフェ
ンカルブ−シュレッパー結合体を固相化した担体におい
て、エチオフェンカルブの部分以外に後で添加する抗体
が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそ
れを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキンミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋＡｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分にブロックエース
を適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした
後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液とし
ては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.
０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅ
ｅｎ２０の組成のものが適している。

【００３７】次いで（ｃ）工程において、エチオフェン
カルブを含む試料とポリクローナル抗体（および／また
はモノクローナル抗体）を抗原の固相化部分に加え、抗
体を固相化抗原及び遊離エチオフェンカルブと反応させ
ることにより、固相化抗原−抗体複合体及び遊離エチオ
フェンカルブ−抗体複合体が生成する。

【００３８】この際、抗体としては、第一抗体としてポ
リクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体を加
え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に
対する抗体を順次加えて反応させる。

【００３９】第一抗体は緩衝液に含ませて添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。この反応に用いる試薬とし
ては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）、０.８％
（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌの組
成のものが好ましい。

【００４０】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてウサギ抗血清を用いる場合、酵素（例えば、ペ
ルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）を結
合した抗ウサギＩｇＧヤギ抗体、マウスのハイブリドー
マからの第一抗体を用いる場合は抗マウスＩｇＧヤギ抗
体画分を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗
体に約５０００−１００００倍、好ましくは最終吸光度
が１.０−１.５となるように希釈した第二抗体を反応さ
せるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定され
るわけではないが、反応は約２５℃で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。

【００４１】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と基質との反応によって発色する試薬を
加え、吸光度を測定することによって検量線からエチオ
フェンカルブの量を算出することができる。

【００４２】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発
色試薬としてｏ−フェニレンジアミンを使用することが
望ましい。限定されるわけではないが、発色溶液を加え
約２５℃で約１０分間反応させた後、４Ｎの硫酸を加え
ることにより酵素反応を停止させる。ｏ−フェニレンジ
アミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵
素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が
適している。

【００４３】遊離エチオフェンカルブを添加しない反応
溶液の吸光度に対して、エチオフェンカルブを添加して
抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として
計算する。既知の濃度のエチオフェンカルブを添加した
反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用い
て、試料中のエチオフェンカルブの濃度を算出できる。

【００４４】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のポリクローナル抗体は、エチオフェンカル
ブの量を、０.０１−１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは
０.１−１００μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。

【００４５】モノクローナル抗体の作製エチオフェンカルブ−シュレッパー結合体を使用して、
慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を
作製することができる。

【００４６】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００４７】（ａ）免疫用抗原として使用するエチオフ
ェンカルブ−シュレッパー結合体の作製（ｂ）哺乳動物への免疫用抗原の接種（ｃ）血液を採取、アッセイし、抗体産生細胞調製の時
期を決定することからなる抗体産生細胞の調製（ｄ）ミエローマの調製（ｅ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのクロ
ーニング（ｇ）場合によってはモノクローナル抗体を大量に製造
するためのハイブリドーマの培養またはハイブリドーマ
を移植した哺乳動物の飼育（ｈ）製造されたモノクローナル抗体の生理活性または
標識試薬としての検定等

【００４８】モノクローナル抗体を産出するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリングハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００４９】以下、本発明の抗エチオフェンカルブモ
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエロー
マ、他の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用で
きることは、当業者によって明らかであろう。

【００５０】（ａ）−（ｃ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５１】ミエローマとしては、例えば、８−アザグ
アニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株の
Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Nature，256, 495-4
97 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ
１）（Current Topics.in Microbiology and Immunolog
y, 81 1-7 (1987)）、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１
（ＮＳ−１）（Eur.J.Immunol., 6, 511-519 (197
6)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Nature 2
76, 269-270 (1978)）、ＦＯ（J. Immuno. Meth., 35,1
-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３.６５３、Ｓ１９
４等のマウスから得られた骨髄腫株化細胞、あるいはラ
ットにおける２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ
３）（Nature 277, 131-133, (1979)）等を使用でき
る。

【００５２】これらの細胞株は、適当な培地、例えば８
−アザグアニン培地、ＩＭＤＭ（Iscove Modified Dulb
ecco's Medium）またはＤＭＥＭ（Dulbecco's MEM）で
継代培養するが、細胞融合の数日前に正常培地で継代培
養し、融合当日に３Ｘ１０³以上の細胞数を確保する。

【００５３】抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一
般には脾臓、リンパ節、末梢血液またはこれらの組み合
わせからえることができるが脾細胞が最も一般的に用い
られる。

【００５４】最終免疫後、抗体産生が確認されたマウス
より抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程（ｄ）で得られたミエローマの融合は公知の方
法、例えばミルスタイン（Milstein）らの方法（Method
s in Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うこと
ができる。現在最も一般的に行われているのは、細胞毒
性が比較的少なく、融合作用も簡単なポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法につい
ては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記
載されている。あるいは、電気処理（電気融合）による
方法等を適宜採用することもできる。また、細胞の使用
比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞
に対して脾細胞を５〜１０倍程度用いればよい。

【００５５】抗体産生細胞とミエローマとが融合し、抗
体生産能および増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選
択は、例えば、ミエローマ細胞株として８−アザグアニ
ン耐性株を使用した場合、ＨＡＴ培地の使用により行う
ことができる。さらに、選択されたハイブリドーマ群を
含む培養上清の一部をとり、例えば上述したＥＬＩＳＡ
法により、エチオフェンカルブに対する活性を測定す
る。

【００５６】さらに、上述の測定によりエチオフェンカ
ルブ特異的抗体を産生することが判明したハイブリドー
マのクローニングを行う。このクローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法；軟寒天培地上に撒きコロ
ニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１
個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の
分離する「ソータークローン」法等が挙げられる。限界
希釈法が簡単でありよく用いられる。

【００５７】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗エチオフェンカル
ブモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。

【００５８】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含
むＩＭＥＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、
例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００
％湿度中の恒温器中）で培養するが好ましい。大量培養
は大型培養ビンを用いた回転培養等によって行われる。
または、同系統のマウス（例えば、上述のＢＡＬＢ／
ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドー
マを増殖させることも可能である。

【００５９】この培養上清液あるいは腹水液をエチオフ
ェンカルブモノクローナル抗体として使用することでき
るが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル
濾過、凍結乾燥等を行い、ＩｇＧ画分を集め精製するこ
とにより抗エチオフェンカルブモノクローナル抗体を
得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファ
ロースカラム、プロテインＡ−セファロースカラム、Ｈ
ＰＬＣなどの慣用されている方法を使用してＩｇＧ画分
を集める操作を１回、または複数回行うことにより実施
できる。

【００６０】以上のようにして得られた抗エチオフェン
カルブモノクローナル抗体は、例えば上述したＥＬＩ
ＳＡ法などの公知の方法を使用して、イソタイプ、サブ
クラス、抗体価等を決定することができる。本発明の１
態様において得られたモノクローナル抗体１Ａ２４−２
−１を使用して、エチオフェンカルブの量を０.００１
−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０.０１−１０μｇ／
ｍｌの範囲で測定することができる。

【００６１】本発明のモノクローナル抗体と他のカルバ
マート系化合物との交差反応性を、上述した間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法によって調べることができる。本発明の
モノクローナル抗体１Ａ２４−２−１は、エチオフェン
カルブのみを特異的に認識し、他のカルバマート系化合
物とはほとんど交差反応しなかった。

【００６２】本発明の方法により作製された抗体による
エチオフェンカルブの測定上述した方法によって得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えば免疫化学的測定法によりエチオフェンカ
ルブを定量するために使用できる。免疫化学的測定法
は、それぞれの抗原物質に対応する抗体が、選択的に反
応するという抗原抗体反応の特異性に基づく反応を応用
したものであり、検出感度も高く、抗原物質、抗体の定
量を行うのに適している。

【００６３】既に述べたように、免疫化学的測定法とし
ては、例えばＲＩＡ法，ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、血
液凝集反応法等があり、種々の点においてＥＬＩＳＡ法
が最も適している。

【００６４】本発明のモノクローナル抗体を用いたエチ
オフェンカルブの測定は、例えば以下に述べるような直
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。即
ち、本発明のエチオフェンカルブ特異的モノクローナル
抗体を、固相に吸着させ、抗原と無関係なタンパク質に
より、該抗体により吸着されていない固相表面を覆う。
該表面を洗浄後、非標識抗原を含むと考えられる試料な
らびに酵素標識抗原とを加え、反応させる。これに酵素
基質を加え、試料添加による吸光度の減少を測定するこ
とにより、抗原の定量を行うことができる。本発明の１
態様であるモノクローナル抗体１Ａ２４−２−１は、直
接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でエチオフェンカルブの量を
０.００１−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０.０１−１
０μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。

【００６５】本発明の抗体のメタノール耐性本発明の１態様であるモノクローナル抗体１Ａ２４−２
−１はさらに、既述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によ
れば、０％−５０％、好ましくは１０％−４０％濃度の
メタノール存在下においてエチオフェンカルブを濃度依
存的に認識できる。エチオフェンカルブは有機溶媒に易
溶性であり、一般に分析はメタノール等の有機溶媒中で
行われることを考慮すると、本発明のモノクローナル抗
体のこのような特性は非常に有効である。

【００６６】以下、本発明の説明のために実施例を記載
するが、実施例は本発明の技術的範囲を制限するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。

【００６７】

【実施例】参考例１エチオフェンカルブ誘導体の合成

【化１１】Ａ．４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）酪酸（７
ａ）の合成４−アミノ酪酸（２８ｇ、２７０ミリモル）を２Ｎの水
酸化ナトリウム溶液１４０ｍｌに加えて氷冷した。この
溶液を激しく撹拌しながらクロロ蟻酸ベンジル（７０
ｇ、４１０ミリモル）及び２Ｎの水酸化ナトリウム溶液
２００ｍｌをそれぞれ３回に分けて交互に滴下した。滴
下終了後、氷冷下で３０分間撹拌し、引き続いて室温で
一晩撹拌した。氷冷したジエチルエーテル（１５０ｍｌ
ｘ３回）で未反応のクロロ蟻酸ベンジルを抽出し、氷冷
下で濃塩酸を加えｐＨを約２に調整した。ジクロロメタ
ン（１５０ｍｌｘ４回）で分配抽出し、集めたジクロロ
メタン抽出物を無水硫酸ナトリウムで脱水し、吸引濾過
で硫酸ナトリウムを除去した後、減圧濃縮した。その濃
縮物を少量の酢酸エチルで溶解しヘキサンを加えると、
目的物（７ａ）が白色の結晶として析出してきた（収量
６０ｇ、収率９３％）。

【００６８】Ｂ．４−（ベンジルオキシカルボニルアミ
ノ）酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（８ａ）の合成Ａで得られた４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
酪酸（７ａ）（２８ｇ、１１８ミリモル）のジクロロメ
タン溶液を食塩−氷で−１６℃に冷却し、その溶液中に
イソブテンの気流を５分間徐々に流し込んだ。次にリン
酸（０.９２ｇ、９.４ミルモル)と三フッ化ホウ素ジエ
チルエーテル錯体(２.５ｇ、１７.７ミリモル）をシリ
ンジで徐々に滴下し、更にイソブテンを５分間徐々に流
し込んだ。この溶液をそのまま室温になるまで撹拌し、
更に一晩撹拌し続けた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液
を加えて３０分間撹拌した後、ジクロロメタン（１５０
ｍｌｘ４回）で抽出した。集めたジクロロメタン抽出物
を無水硫酸ナトリウムで脱水し、吸引濾過で硫酸ナトリ
ウムを除去した後、減圧濃縮した。この濃縮物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル
＝４：１）で精製し、目的物（８ａ）を無色透明な液体
として得た（収量３１ｇ、収率９０％）。

【００６９】Ｃ．４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（３
ａ）の合成Ｂで得られた４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）
酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（８ａ）（１１.７ｇ、４０ミリ
モル）のメタノール溶液にパラジウムカーボン（１ｇ）
を加えて水素存在下で撹拌した。反応溶液を濾過して、
濾液を減圧濃縮し、真空ポンプで完全に溶媒を除くと少
し黄色がかった液体として、目的物（３ａ）が得られた
（収量６.１ｇ，収率１００％）。

【００７０】Ｄ．エチオフェンカルブハプテンのｔｅｒ
ｔ−ブチルエステル（２ａ）の合成Ｃで得られた４−アミノ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（３ａ）
（３ｇ、１９ミリモル）及びトリエチルアミン（１.８
ｇ、１８ミリモル）の酢酸エチル溶液（５０ｍｌ）を氷
冷し、撹拌下でトリホスゲン（２ｇ、６.７ミリモル）
の酢酸エチル溶液（５０ｍｌ）を滴下して３０分間０℃
で撹拌後、室温で１時間撹拌し続けた。更に氷冷下で２
−（エチルチオメチル）フェノール（４）（３ｇ、１８
ミリモル）の酢酸エチル溶液を滴下し、３０分間撹拌
後、室温で１時間撹拌した。水を加えて反応を終了さ
せ、酢酸エチル（１５０ｍｌｘ４回）で分配抽出した。
集めた酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウムで脱水
して吸引濾過で硫酸マグネシウムを除去した後、減圧濃
縮した。その濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー（ヘキサン−酢酸エチル、９：１−１：１）で精製
すると薄く黄色い液体として目的物（２ａ）を得た（収
量０.９５ｇ、収率１５％）。

【００７１】Ｅ．エチオフェンカルブハプテン（１ａ）
の合成Ｄで得られたエチオフェンカルブハプテンのｔｅｒｔ−
ブチルエステル（２ａ）（１.５ｇ、１５ミリモル）を
５０ｍｌの１,２−ジクロロエタン（ＥＤＣ）に溶解
し、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて室
温で２.５時間撹拌した。反応溶液をそのまま４０℃以
下で減圧濃縮し、ＴＦＡの刺激臭がなくなるまでジクロ
ロメタンの添加および減圧濃縮を繰り返した。その濃縮
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−
酢酸エチル、１：１）で精製すると僅かに茶色いほぼ白
色の結晶としてエチオフェンカルブハプテン（１ａ）が
得られた（収量０.４ｇ、収率３２％）。

【００７２】実施例１免疫抗原の作製免疫原としてエチオフェンカルブ誘導体とウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）との結合体を混合酸無水物法を用いて
作製した。参考例１で作製したエチオフェンカルブ誘導
体１２ｍｇを、無水ジオキサン１ｍｌ，次にＮ−メチル
モルフィリン２５μｌを添加し、室温で１５分間撹拌し
た。次に、クロロ蟻酸イソブチル１０μｌを添加し、室
温で２０分間撹拌した（これを、以下「Ａ液」と言
う）。

【００７３】一方、蒸留水２ｍｌに牛血清アルブミン４
０ｍｇを溶解し、０.５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを
８．０に調整した後に無水ジオキサン１.３ｍｌを加
え、先に調製したＡ液をｐＨ８.０になるように調整し
ながら滴下し、１０℃にて４時間反応させた後、蒸留水
に対して４℃で透析した。こうして得たエチオフェンカ
ルブ誘導体−牛血清アルブミン結合体を免疫用抗原とし
て用いた。

【００７４】また、ＢＳＡの代わりにウサギ血清アルブ
ミン（ＲＳＡ）およびスガシガイヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）との結合体も同様の方法で調製した。

【００７５】実施例２免疫感作免疫用抗原１００μｇを１４５ｍＭＮａＣｌ−０.０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２：以下「ＰＢＳ」とい
う）１００μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュ
バントと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種し
た。さらに、２週間および４週間後に不完全アジュバン
トを用いて調製した免疫用抗原を、前記と同様にマウス
の皮下に追加免疫した。また、６週間目にＰＢＳに溶解
した免疫用抗原をマウスの尾静脈に追加免疫した。

【００７６】実施例３抗血清によるエチオフェンカル
ブの測定実施例２におけるマウス尾静脈への接種後、採血し抗血
清を作製して、以下に詳述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ
法にてエチオフェンカルブを測定し、抗血清を評価し
た。

【００７７】免疫用抗原と同様に調製したエチオフェン
カルブハプテン−ウサギ血清アルブミン結合体の溶液
（０.１μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６穴
プレートにコーティングした。４倍希釈したブロックエ
ース（「ＢｌｏｃｋＡｃｅ」、雪印乳業社製、コード
Ｎｏ.ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングした後、抗血清希
釈液と、各種濃度のエチオフェンカルブを含む２０％メ
タノール溶液とを等量混合し、その５０ｍｌをウェルに
入れ、室温で１時間反応させた。

【００７８】ＰＢＳで５回洗浄後に、１０倍希釈のブロ
ックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５
０μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反応させた。

【００７９】ＰＢＳで５回洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのオル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０.０２％の過
酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５.０）を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温で１０
分間反応させて発色させた。

【００８０】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量
で加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。その一例を図１に示す。図１より、マウスの抗血清
（ポリクローナル抗体）を使用することにより、エチオ
フェンカルブの量を０．１−１００μｇ／ｍｌの範囲で
測定できた。

【００８１】実施例４ハイブリドーマ細胞の作製実施例２に続いて、血清中の抗エチオフェンカルブ抗体
の活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、ミエローマ細
胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組
織細胞化学：日本組織細胞化学会編：学際企画。１９８
６年）に従ってポリエチレングリコール法により融合
し、培養した。細胞の増殖が見られた培養液につき、エ
チオフェンカルブに対する抗体活性を以下の方法で調べ
た。

【００８２】免疫用抗原と同様に調製したエチオフェン
カルブハプテン−ウサギ血清アルブミン結合体の溶液
（０.１μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６穴
プレートにコーティングした。４倍希釈したブロックエ
ース（雪印乳業社製）でブロッキング後、融合細胞の培
養上清液を５０μｌ／ウェルの量で加え室温で６０分間
反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、１０倍希釈のブロッ
クエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０
μｌ／ウェルの量で加え、室温で１時間反応させた。

【００８３】ＰＢＳで５回洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのオル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０.０２％の過
酸化水素を含む０.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５.０）を５０μｌ／ウェルの量で加え室温で１０分
間反応させて発色させた。

【００８４】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量
で加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
抗原結合活性を示すウェル（融合細胞）を選抜した。

【００８５】次に、各ウェルのエチオフェンカルブとの
反応性を実施例３に記載した方法で調べ、目的の抗体を
産生している細胞について限界希釈法によりクローニン
グを行った。その結果、数個のハイブリドーマ細胞がエ
チオフェンカルブに特異的な抗体を産生する細胞として
クローン化された。そのうちの１つである１Ａ２４−２
−１を平成７年１２月１４日に、寄託番号ＦＥＲＭＰ
−１５３４３で、工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した。

【００８６】実施例５モノクローナル抗体の評価：間
接競合阻害ＥＬＩＳＡによるエチオフェンカルブ測定クローン化したハイブリドーマ１Ａ２４−２−１に由来
するモノクローナル抗体１Ａ２４−２−１について、そ
の培養上清を用いて実施例３に記載した方法で反応性を
調べた。この結果を図２に示す。図２により、１Ａ２４
−２−１を用いてエチオフェンカルブの量を０．０１−
１０μｇ／ｍｌの範囲で測定することができた。

【００８７】実施例６他のカルバマート系化合物と本
発明の抗体との反応性実施例５と同様にして、エチオフェンカルブまたはその
誘導体以外のカルバマート系化合物と本発明のモノクロ
ーナル抗体（１Ａ２４−２−１）との反応性を調べた。
その結果を表１および図３に示す。

【００８８】

【表１】表１他のカルバマート系化合物と本発明の抗体との反
応性カルバマート系化合物抗体１Ａ２４−２−１エチオフェンカルブ１００フェノブカルブ０．２５＞イソプロカルブ０．２５＞プロポキスル０．２５＞クロエトカルブ０．２５＞ジオキサカルブ０．２５＞フォルメタネート０．２５＞アミノカルブ０．２５＞カルボナレート０．２５＞テルブカルブ０．２５＞カルバリル０．２５＞カルボフラン０．２５＞３，４，５−トリメタカルブ０．２５＞アルジカルブ０．２５＞メソミル０．２５＞

【００８９】表１は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で抗体
結合を５０％阻害する濃度について、エチオフェンカル
ブの値を１００％とした場合の相対値を示す［（エチオ
フェンカルブ／各化合物）ｘ１００］。

【００９０】表１に示される通り、モノクローナル抗体
１Ａ２４−２−１はエチオフェンカルブを特異的に検出
し、他のカルバマート系化合物とはほとんど交差反応し
なかった。図３より、上記モノクローナル抗体を用いて
エチオフェンカルブの量を０.０１−１０μｇ／ｍｌの
範囲で測定することができた。

【００９１】実施例７モノクローナル抗体を用いたエ
チオフェンカルブ量の測定：直接競合阻害法実施例４で得られたハイブリドーマ細胞（１Ａ２４−２
−１）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得ら
れた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗
体を分取し、以下の試験法（直接競合阻害ＥＬＩＳＡ
法）にてエチオフェンカルブ量を測定した。

【００９２】モノクローナル抗体溶液（１０μｇ／ｍ
ｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６穴マイクロプレート
に加え、４℃で一晩静置し、コーティングし、ＰＢＳで
４倍希釈したブロックエースでブロッキングした後、エ
チオフェンカルブ、ペルオキシダーゼ結合エチオフェン
カルブを含む１０％メタノール−ＰＢＳ溶液を５０μｌ
／ウェルの量で加え、２５℃で１時間反応させた。

【００９３】ＰＢＳで５回洗浄した後に、２ｍｇ／ｍｌ
のＯＰＤおよび０.０２％の過酸化水素を含む０.１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウ
ェルの量で加え、室温で１０分間反応させた。次に、１
Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で加え、４９０ｎｍの
吸光度を測定した。この結果を図４に示した。図４より
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法においても、本発明のモノク
ローナル抗体はエチオフェンカルブの量を０．０１−１
０μｇ／ｍｌの範囲で測定できた。

【００９４】実施例８本発明のモノクローナル抗体の
標準曲線におけるメタノールに対する耐性実験エチオフェンカルブ誘導体とＲＳＡとの結合体、０.１
μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ希釈）５０μｌを９６穴プレートに
入れ、４℃にて一晩静置させた。この溶液を廃棄後、蒸
留水にて４倍に希釈したブロックエースを３００μｌ加
え、４℃にて一晩静置した。

【００９５】この溶液を廃棄後、あらかじめ所定の濃度
に設定して希釈列を作製しておいたエチオフェンカルブ
溶液にＰＢＳ溶液とメタノール溶液との混合により得ら
れた各メタノール濃度のエチオフェンカルブ溶液を調製
し、これに所定の濃度の抗エチオフェンカルブ抗体産生
細胞培養上清希釈液を混合比１：１になるように調合し
て、各穴５０μｌずつプレートに添加し、室温にて１時
間反応させた（最終メタノール濃度は０、１０、２０、
３０、４０、５０％）。反応後、各穴をＰＢＳにて５回
洗浄し、蒸留水にて１０倍希釈したブロックエースを用
いて２０００倍希釈したＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体
（Ｔａｇｏ社製、コードＮｏ.６４４０）を各穴に５０
μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応後、こ
のプレートをＰＢＳにて５回洗浄し、２.０ｍｇ／ｍｌ
のＯＰＤ及び０.０２％過酸化水素を含む０.１Ｍリン酸
−クエン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を５０μｌ各穴に添加
し、室温にて１０分間反応させた。反応後、１Ｎ硫酸
を各穴に５０μｌずつ添加して反応を停止させ、４９０
ｎｍの波長にて吸光度を測定した。

【００９６】表５に結果を示す。表５より、本発明のモ
ノクローナル抗体は１０％−４０％メタノール存在下に
おいて間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によってエチオフェン
カルブを濃度依存的に認識することができた。

【００９７】

【発明の効果】本発明によって、農産物及び環境中の
水、土壌に残存するエチオフェンカルブの量を簡便かつ
迅速に測定することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウス抗血清を用いたエチオフェン
カルブの測定を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体（１Ａ
２４−２−１）によるエチオフェンカルブの測定を示
す。

【図３】図３は、１Ａ２４−２−１の他のカルバマー
ト系化合物との交差反応性を示す。

【図４】図４は、１Ａ２４−２−１の直接競合阻害法
によるエチオフェンカルブの測定を示す。

【図５】図５は、１Ａ２４−２−１の標準曲線のメタ
ノールによる影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者面田内記東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者藤井淳東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者林昌郎東京都港区浜松町１丁目27番14号株式会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者川田充康徳島県鳴門市里浦町里浦字花面615番地大塚化学株式会社鳴門工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式：【化１】［式中、ｎは１−５の整数である］を有する化合物にシ
ュレッパーを結合させたものを抗原として用いることに
より製造された、以下の式：【化２】を有する化合物に特異的な抗体。
【請求項２】前記ｎが３である、請求項１に記載の抗
体。
【請求項３】モノクローナル抗体である、請求項１ま
たは２に記載の抗体。
【請求項４】免疫化学的測定法により０.００１−１
０００μｇ／ｍｌの濃度の２−エチルチオメチルフェニ
ルメチルカルバマートを測定することを特徴とする、
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】５０％以下のメタノール存在下におい
て、２−エチルチオメチルフェニルメチルカルバマー
トを濃度依存的に認識できる請求項３または４に記載の
抗体。
【請求項６】１Ａ２４−２−１である、請求項３ない
し５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】以下の式：【化３】［式中、ｎは１−５の整数である］を有する化合物にシ
ュレッパーを結合させることにより抗原を作製し、当該
抗原を用いることにより、以下の式：【化４】を有する化合物に特異的な抗体を作ることを特徴とす
る、請求項１ないし６のいずれか１項に記載された抗体
の製造方法。
【請求項８】請求項１ないし６のいずれか１項に記載
のモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハ
イブリドーマ。
【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭＰ−１５３４３で寄
託されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】請求項１ないし６のいずれか１項に記
載の抗体を使用することを特徴とする、以下の式：【化５】を有する化合物の免疫化学的測定法。