JPH09182581A

JPH09182581A - グリコペプチド抗生物質を産生する微生物

Info

Publication number: JPH09182581A
Application number: JP8301665A
Authority: JP
Inventors: Robert L Hamill; ロバート・エル・ハミル; James A Mabe; ジェイムス・アルバート・マベ; David F Mahoney; デビッド・フランシス・マホニー; Walter M Nakatsukasa; ウォルター・ミツオ・ナカツカサ; Raymond Che-Fong Yao; レイモンド・チー−フォン・ヤオ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 1997-07-15
Anticipated expiration: 2016-11-13
Also published as: JPS6393798A; PT85742A; US5843437A; CN87106483A; ZA877003B; EG18377A; HU198964B; AU7865887A; DK489787A; FI874082A0; FI90993B; AU608534B2; NZ221856A; HK44393A; ES2052574T3; DE3782720T2; EP0265071A1; CN1061095C; IE60132B1; IE872529L

Abstract

(57)【要約】【課題】バンコマイシン群の新規グリコペプチド抗生
物質Ａ８２８４６、その各個の成分Ａ８２８４６Ａ、Ａ
８２８４６ＢおよびＡ８２８４６Ｃを産生する新規微生
物の提供。【解決手段】同化しうる炭素源、窒素源および無機塩
源を含む培地中、液中好気的に発酵させることにより、
該新規グリコペプチド抗生物質を製造することができる
ノカルジア・オリエンタリス(Ｎocardia orientalis)Ｎ
ＲＲＬ１８０９８、ＮＲＲＬ１８０９９およびＮＲＲＬ
１８１００を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はバンコマイシン群の
新規グリコペプチド抗生物質を産生する微生物に関す
る。特に本発明は抗生物質Ａ８２８４６、その各個の成
分Ａ８２８４６Ａ、Ａ８２８４６ＢおよびＡ８２８４６
Ｃを産生する新規微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】現在多
くの有益な抗生物質を入手することができるが、人間の
医薬用の改良された抗生物質を見いだすことの必要性は
なお続いている。たとえばバンコマイシンは商業的に成
功した抗生物質であって多くの生命を救った。しかしバ
ンコマイシンは、たとえば聴覚毒性および腎毒性のよう
な問題の原因となることもある。従って、バンコマイシ
ンと同様の活性を有し、改善された薬物動態学的性質、
またはより副作用が少ない抗生物質が要請されている。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、同化し
うる炭素源、窒素源および無機塩源を含む培地中、ノカ
ルジア・オリエンタリス(Ｎocardia orientalis)ＮＲＲ
Ｌ１８０９８、ＮＲＲＬ１８０９９またはＮＲＲＬ１８
１００を液中好気的に発酵させることにより、大なる価
値を有するグリコペプチド抗生物質を製造することがで
きることが見いだされた。本発明者らはこれらのグリコ
ペプチド抗生物質を任意にＡ８２８４６およびその各成
分として命名した。

【０００４】抗生物質Ａ８２８４６は構造的にバンコマ
イシンに類似するが、グラム陽性菌に対する試験管内お
よび生体内活性、並びにバンコマイシンの半減期より非
常に長い半減期に起因する薬物動態学的性質が改良され
たものである。

【０００５】Ａ８２８４６成分は本質的に次の物理的お
よび分光学的性質を有する。Ａ８２８４６Ａの特性:− 分子量:１５５６実験式:Ｃ₇₃Ｈ₈₉Ｎ₁₀Ｏ₂₆Ｃl ＦＡＢ−ＭＳ(チオグリセロール):(Ｍ＋１)測定値１５
５７.５８０３、計算値Ｃ₇₃Ｈ₉₀Ｎ₁₀Ｏ₂₆Ｃl＝１５５
７.５７１６(図４参照) ＵＶ(水)λmax:２８１nm(ε５,０５２)、基線から３０
０nmシフト

【０００６】ＩＲ(ＫＢr):１７１６、１６５５、１６１
１、１５８６、１５５２、１５０４、１４１０、１３４
０、１３１０、１２３０、１２１２、１１３２、１０６
６、１０２８、１０１５cm^-1(図１参照) ＮＭＲ[(ＣＤ₃)₂ＳＯ]:図７参照 pＫa(水):４.７、９.５、および(６６％ＤＭＦ)５.５、
６.８、７.９、９.４、１２.３ (見掛けの分子量１５４２)

【０００７】Ａ８２８４６Ｂの特性:− 分子量:１５９０実験式:Ｃ₇₃Ｈ₈₈Ｎ₁₀Ｏ₂₆Ｃl₂ ＦＡＢ−ＭＳ(チオグリセロール):(Ｍ⁺１)測定値１５９
１.５３１５、計算値Ｃ₇₃Ｈ₈₉Ｎ₁₀Ｏ₂₆Ｃl₂＝１５９１.
５３２７(図５参照) ＵＶ(水)λmax:２８０nm(ε５,１９２)、基線から３０
０nmシフト

【０００８】ＩＲ(ＫＢr):１６５６、１５８６、１５６
２、１５０４、１４０３、１２６４、１２３０、１１３
５、１１０５、１０６５、１０２３、１０１８cm^-1(図
２参照) ＮＭＲ[(ＣＤ₃)₂ＳＯ]:図８参照 pＫa(水):４.６５、９.５

【０００９】Ａ８２８４６Ｃの特性:− 分子量:１５２２実験式:Ｃ₇₃Ｈ₉₀Ｎ₁₀Ｏ₂₆ ＦＡＢ−ＭＳ(チオグリセロール):(Ｍ⁺Ｎa)測定値１５
４５.５９９８計算値Ｃ₇₃Ｈ₉₀Ｎ₁₀Ｏ₂₆Ｎa＝１５４５.
５９２５(図６参照) ＵＶ(水)λmax:２８０nm(ε５,１９８)、基線から３０
０nmシフト

【００１０】ＩＲ(ＫＢr):３６００→３００４(広い)、
２９９９、２９９１、２９５０、１６８７→１６５０
(広い)、１５８５、１５７０、１５０９、１５０３、１
４５３、１４４９、１４０２、１２１２、１１３０、１
１０２、１０６０、１０３２、１０１４cm^-1(図３参照) ＮＭＲ[(ＣＤ₃)₂ＳＯ]:図９参照 pＫa(水):４.６、９.４

【００１１】６Ｎ塩酸による加水分解後のＡ８２８４６
Ａ、Ａ８２８４６ＢおよびＡ８２８４６Ｃのアミノ酸分
析の結果は、アスパラギン酸ならびに微量のグリシンに
符号する２個の広いピークの存在を示した。この２個の
ピークはアクチノイジン性(actinoidinic)およびバンコ
マイシン性(vancomycinic)アミノ酸(この２個は、バン
コマイシン類のグリコペプチド類中に存在する)に対応
するものと考えられる。

【００１２】相対ＮＭＲ研究により、Ａ８２８４６Ａ、
Ａ８２８４６ＢおよびＡ８２８４６Ｃがそれぞれ次の新
規アミノ糖４−epi−バンコサミン(３−メチル−アコサ
ミン)を含むことが見いだされた：

【化１】

【００１３】Ａ８２８４６Ａの分子式はバンコマイシン
の分子式（Ｃ₆₆Ｈ₇₅Ｎ₉Ｏ₂₄Ｃl₂)の塩素原子が１個少な
く、追加的にバンコサミン型アミノ糖(Ｃ₇Ｈ₁₄ＮＯ₂)要
素が多い分子式に対応する。Ａ８２８４６Ｂの分子式
は、水素原子１個が塩素原子１個で置換されたＡ８２８
４６Ａの分子式に対応する。Ａ８２８４６Ｃの分子式
は、塩素原子が水素で置換されたＡ８２８４６Ａの分子
式に対応する。

【００１４】Ａ８２８４６成分は、一般的組成のバンコ
マイシン分子に似ているが、主として塩素含量が異な
り、追加的にバンコサミン組成を有する部分単位１個が
存在することで異なる新規グリコペプチド類の構造を有
するものと考えられる。

【００１５】Ａ８２８４６成分の次の構造式を有すると
考えられる：

【化２】

【００１６】Ａ８２８４６化合物の糖成分の完全配置は
まだ決定されていない。Ａ８２８４６およびその各個の
成分Ａ８２８４６Ａ、Ａ８２８４６ＢおよびＡ８２８４
６Ｃは、これを反応させて種々の塩を形成させることが
できる。これらの塩型抗生物質はすべて本発明の一部で
ある。これらのＡ８２８４６塩は、たとえばＡ８２８４
６を分離および精製するのに有用である。加うるに塩類
は水に対して改良された溶解性を有する。

【００１７】Ａ８２８４６塩は標準的製造法により製せ
られる。たとえばＡ８２８４６を適当な酸で中和して酸
付加塩を形成させることができる。

【００１８】酸付加塩は特に有用である。代表的に適当
な塩は、有機酸または無機酸の双方たとえば硫酸、塩
酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイ
ン酸、フマル酸、コール酸、パモン酸、粘液酸、Ｄ−グ
ルタミン酸、ｄ−ショウノウ酸、グルタール酸、グリコ
ール酸、フタル酸、酒石酸、ギ酸、ラウリン酸、ステア
リン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、桂皮酸お
よび同様の酸などのような酸との標準的反応により形成
される塩を包含する。薬理的に許容される酸付加塩は、
本発明の特に好ましい塩類である。

【００１９】抗生物質Ａ８２８４６は、適当な培地中、
液中好気的条件下にノカルジア・オリエンタリスのＡ８
２８４６産生菌株を、実質的抗生物質活性が生成するま
で培養することにより製造することができる。この抗生
物質を、この技術分野で理解される種々の分離および精
製方法で回収することができる。

【００２０】また本発明はノカルジア・オリエンタリス
ＮＲＲＬ１８０９８、ノカルジア・オリエンタリスＮＲ
ＲＬ１８０９９、ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ
１８１００またはこれらの菌株のＡ８２８４６産生突然
変異菌株、変異菌株もしくは遺伝子組換え菌株(recombi
nant)から選ばれた生物学的に純粋な培養菌株に関す
る。これらの微生物は、抗生物質Ａ８２８４６を産生す
るので有用である。以下便宜上、ＮＲＲＬ１８０９８菌
株を培養菌株Ａ８２８４６、ＮＲＲＬ１８０９９菌株を
培養菌株Ａ８２８４６.１およびＮＲＲＬ１８１００菌
株を培養菌株Ａ８２８４６.２と呼称する。培養菌株Ａ
８２８４６はハイチ(Ｈaiti)の土壌試料から単離され
た。培養菌株Ａ８２８４６.１は化学的突然変異誘導(ch
emical mutagenesis)により得られた菌株、培養菌株Ａ
８２８４６.２は培養菌株Ａ８２８４６から単離された
自然的変異菌株である。

【００２１】培養菌株Ａ８２８４６、Ａ８２８４６.１
およびＡ８２８４６.２は、米国イリノイ州６１６０４
ペオリア、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１
５在米国農務省農業研究部ミドウエスト・エアリア・ノ
ーザン・リージョナル・リサーチ・センター(Ｍidwest
Ａrea Ｎorthern Ｒegional Ｒesearch Ｃenter)に、１
９８６年８月８日寄託し、そのストック・カルチュア・
コレクションの一部を構成する。これらの培養菌株は、
受理番号ＮＲＲＬ１８０９８(Ａ８２８４６、親菌株)、
ＮＲＲＬ１８０９９(Ａ８２８４６.１、突然変異菌株)
およびＮＲＲＬ１８１００(Ａ８２８４６.２、変異種菌
株)として公的に入手することができる。

【００２２】培養菌株Ａ８２８４６、Ａ８２８４６.１
およびＡ８２８４６.２の分類学上の(taxonomic)研究は
リリー研究所(Ｌilly Ｒesearch Ｌaboratories)のフレ
デリック・ピー・メルツ(Ｆrederick Ｐ．Ｍertz)が行
なった。この研究に基づき、新規微生物を、ノカルジア
・オリエンタリス(Ｐittenger and Ｂrigham １９５６)
プリダム・アンド・ライオンズ(Ｐridham and Ｌyons)
１９６９年タイプ・ストレイン：ＡＴＣＣ１９７９５菌
株として分類された[ピッテンガー(Ｒ．Ｃ．Ｐittenge
r)およびブリガム(Ｒ．Ｂ．Ｂrigham)“ストレプトミセ
ス・オリエンタリスn．sp.，ザ・ソース・オブ・バンコ
マイシン(Ｓtreptomyces orientalis n．sp.，the Ｓou
rce of Ｖancomycin)"アンチバイオテックス・アンド・
ケモセラピイ(Ａntibiotics and Ｃhemotherapy)第６巻
６４２〜６４７頁(１９５６年)]。この分類は、下記文
献に記載の研究所の直接的比較と実験に基づくものであ
る。

【００２３】[バーギース・マニュアル・オブ・デター
ミネイテブ・バクテリオロジィ(Ｂergey's Ｍanual of
Ｄeterminative Ｂacteriology)第８版、ブチャナン
(Ｒ．Ｅ．Ｂuchanan)およびギボンズ(Ｎ．Ｅ．Ｇibbon
s)編、ザ・ウイリアムズ・アンド・ウイルキンズ・カン
パニー(Ｔhe Ｗilliams and Ｗilkins Ｃo.(バルチモ
ア,１９７４年)刊;

【００２４】グッドフェロウ(Ｍ．Ｇoodfellow)および
シャール(Ｋ．Ｐ．Ｓchaal)著“アイデンテフィケイシ
ョン・メソッズ・フォー・ノカルジア・アクチノマデュ
ラ・アンド・ロドコックス(Ｉdentification Ｍethods
for Ｎocardia，Ａctinomaduraand Ｒhodococcus)"(ア
イデンテフィケイション・メソッズ・フォー・ミクロバ
イオロジスツ(Ｉdentification Ｍethods for Ｍicrobi
ologists)第２版、スキナー(Ｆ．Ａ．Ｓkinner)および
ラブロック(Ｄ．Ｗ．Ｌovelock)編、ソサエティ・フォ
ー・アプライド・バクテリオロジィ・テクニカル・シリ
ーズ(Ｓociety for Ａpplied Ｂacteriology Ｔechnica
l Ｓeries)Ｎo.１４、アカデミック・プレス社(Ａcadem
ic Ｐress,Ｉnc．)、ニューヨーク１９７９年刊、２６
１頁));

【００２５】ゴルドン(Ｒ．Ｅ．Ｇordon)、バーネット
(Ｄ．Ａ．Ｂarnett)、ハンダーハン(Ｊ．Ｅ．Ｈanderha
n)およびパング(Ｃ．Ｈ．Ｐang)著“ノカルジア・コエ
リアカ、ノカルジア・アウトトロピカ・アンド・ザ・ノ
カルジン・ストレイン(Ｎocardia coeliaca，Ｎocardia
autotrsphica，and the Ｎocardin Ｓtrain)"インター
ナショナル・ジャーナル・オブ・システマテカル・バク
テリオロジィ(Ｉnt．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteriol．)第２４
(１)巻５４〜６３頁(１９７４年);

【００２６】ゴルドン(Ｒ．Ｅ．Ｇordon)、ミシラ(Ｓ．
Ｋ．Ｍishra)およびバーネット(Ｄ．Ａ．Ｂarnett)著
“サム・ビッツ・アンド・ピーセス・オブ・ザ・ジーナ
ス・ノカルジア:ノカルジア・カルネア、ノカルジア・
ワクシニイ、ノカルジア・トランスバレンシス、ノカル
ジア・オリエンタリスおよびノカルジア・アエロコロニ
ゲネス(Ｓome Ｂits and Ｐieces of the Ｇenus Ｎoca
rdia：Ｎ．carnea，Ｎ．Ｖaccinii，Ｎ．transvalensi
s，Ｎ．orientalis，and Ｎ．aerocolonigenes)"ジャー
ナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオロジィ(Ｊ．Ｇe
n．Ｍicrobiol．)第１０９巻６９〜７８頁(１９７８
年);

【００２７】ミシラ(Ｓ．Ｊ．Ｍishra)、ゴルドン(Ｒ．
Ｅ．Ｇordon)およびバーネット(Ｄ．Ａ．Ｂarnett)著"
アイデンテフィケイション・オブ・ノカルジアエ・アン
ド・ストレプトミセス・オブ・メディカル・インポータ
ンス(Ｉdentification of Ｎocardiae and Ｓtreptomyc
es of Ｍedical Ｉmportance)"ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・ミクロバイオロジィ(Ｊ．Ｃlin．Ｍicrobio
l．)第１１(６)巻７２８〜７３６頁(１９８０年）；

【００２８】モルダルスカ（Ｈ．Ｍordarska)およびモ
ルダルスキ(Ｍ．Ｍordarski)著“ケモタキソノミク・キ
ャラクターズ・アンド・クラシフィケイション・オブ・
サム・ノカルジオホルム・バクテリア(Ｃhemotaxonomic
Ｃharacters and Ｃlassification of Ｓome Ｎocardi
oform Ｂacteria)"ジャーナル・オブ・ゼネラル・ミク
ロバイオロジィ(Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiology)第７１巻７
７〜８６頁(１９７２年);および

【００２９】シノブ(Ｒ．Ｓhinobu)およびカワト(Ｍ．
Ｋawato)“オン・ストレプトミセス・アエロコロニゲネ
スnov．sp．ホーミング・ザ・セカンダリィ・コロニー
ズ・オン・ザ・エアリアル・マイセリア(Ｏn Ｓtreptom
yces aerocolonigenes nov．sp.，Ｆorming the Ｓecon
dary Ｃolonies on the Ａerial Ｍycelia)"ボタニカル
・マガジン・トウキョウ(Ｂot．Ｍag．Ｔokyo)第７３巻
２１３〜２１６頁(１９６０年)]

【００３０】

【発明の実施の形態】分類方法ストレプトミセス属に属する種の特性検定のため、以下
の述べる方法は、ザ・インターナショナル・ストレプト
ミセス・プロジェクト(the Ｉnternational Ｓtreptomy
ces Ｐroject(ＩＳＰ))により推奨される方法[シャーリ
ング(Ｅ．Ｂ．Ｓhirling)およびゴットリーブ(Ｄ．Ｇot
tlieb)著“メソッズ・フォー・キャラクタリゼイション
・オブ・ストレプトミセス・スピーシーズ(Ｍethods fo
r Ｃharacterization of Ｓtreptomyces Ｓpecies)"イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマテカル
・バクテリオロジィ(Ｉnt．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteriol．)
第１６巻３１３〜３４０頁(１９６６年)]、ノカルジア
属の種の分類特性は、ゴルドン、バーネット、ハンダー
ハンおよびパング(Ｇordon, Ｂarnett, Ｈanderhan and
Ｐang)[上記文献]により推奨される方法である。

【００３１】形態学的特性は、光学顕微鏡を用いて研究
を行なった。胞子表面外観を研究するため走査電子顕微
鏡(ＳＥＭ)を用いた。

【００３２】リファムピンおよびリゾチームに対する抵
抗性は、ゴルドンにより推奨される方法により測定した
[ゴルドン(Ｒ．Ｅ．Ｇordon)およびバーネット(Ｄ．
Ａ．Ｂarnett, )著“レジスタンス・ツー・リファムピ
ン・アンド・リゾチーム・オブ・ストレインズ・オブ・
サム・スピーシーズ・オブ・ミクロバクテリウム・アン
ド・ノカルジア・アズ・ア・タキソノミック・ツール
(Ｒesistance to Ｒifampinand Ｌysozyme of Ｓtrains
of Ｓome Ｓpecies of Ｍycobacterium and Ｎocardia
as a Ｔaxonomic Ｔool)"インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマテック・バクテリオロジィ(Ｉn
t．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteriol．)第２７(３)第１７６〜１
７８頁(１９７７年)]。

【００３３】色名を指定するため、ＩＳＣＣ−ＮＢＳセ
ントロイド・カラー・チャート(Ｃentroid Ｃolor Ｃha
rts)・標準試料Ｎo.２１０６(ワシントンＤ．Ｃ．米国
商務省標準局(Ｎational Ｂureau of Ｓtandards)(１９
５８年))、およびカラー・ハーモニイ・マニュアル(Ｃo
lor Ｈarmony Ｍanual)第４版(イリノイ州シカゴ在コン
テナ−・コーポレイション・オブ・アメリカ(Ｃontaine
r Ｃorporation of Ａmerica)(１９５８年)を用いた。

【００３４】メラノイド色素産生(chromogenicity)は、
ＩＳＰＮo．１(トリプトン−酵母エキス液)、ＩＳＰ
Ｎo.６(ペプトン−酵母エキス鉄寒天)およびＩＳＰＮ
o.７(チロシン寒天)培地を用いて決定した。

【００３５】細胞全体の加水分解物中のジアミノピメリ
ン酸(ＤＡＰ)の異性体および炭水化物は、ベッカーら
[ベッカー(Ｂ．Ｂecker)、レチエバリアー(Ｍ．Ｐ．Ｌe
chevalier)、ゴルドン(Ｒ．Ｅ．Ｇordon)およびレチエ
バリアー(Ｈ．Ａ．Ｌechevalier)著“ラピッド・デファ
レンシエイション・ビトウイン・ノカルジア・アンド・
ストレプトミセス・バイ・ペーパー・クロマトグラフィ
ー・オブ・ホール−セル・ハイドロリセーツ(Ｒapid Ｄ
ifferentiation between Ｎocardia and Ｓtreptomyces
by Ｐaper Ｃhromatography of Ｗhole−cell Ｈydrol
ysates)"アプライド・ミクロバイオロジー(Ａppl．Ｍic
robiol)第１２巻４２１〜４２３頁(１９６４年)]および
レチエバリアー[レチエバリアー(Ｍ．Ｐ．Ｌechevalie
r)“アイデンテフィケイション・オブ・エアロビック・
アクチノミセテス・オブ・クリニカル・インポータンス
(Ｉdentification of Ａerobic Ａctinomycetes of Ｃl
inical Ｉmportance)"ジャーナル・オブ・ラボラトリィ
・アンド・クリニカル・メディシン(Ｊ．Ｌab．Ｃlin．
Ｍed．)第７１巻９３４〜９４４頁(１９６８年)]のクロ
マトグラフィーにより確定した。

【００３６】ミコール酸は、マンニキン記載の技術に基
づく方法により試験した[マンニキン(Ｄ．Ｅ．Ｍinniki
n)、ハッチンソン(Ｉ．Ｇ．Ｈutchinson)およびカルジ
コット(Ａ．Ｂ．Ｃaldicott)著“シン−レイヤー・クロ
マトグラフィ・オブ・メタノリセーツ・オブ・ミコリク
・アシッド−コンテイニング・バクテリア(Ｔhin−Ｌay
er Ｃhromatography of Ｍethanolysates of Ｍycolic
Ａcid−ＣontainingＢacteria)"ジャーナル・オブ・ク
ロマトグラフィ(Ｊ．Ｃhromatography)第１８８巻２２
１〜２３３頁(１９８０年)]。

【００３７】ホスファターゼおよびウレアーゼはブラゼ
ビク記載の方法により試験した[ブラゼビク(Ｄ．Ｊ．Ｂ
lazevic)およびエデラー(Ｇ．Ｍ．Ｅderer)著“プリン
シプルス・オブ・バイオケミカル・テスツ・イン・ダイ
アグノスチク・ミクロバイオロジィ(Ｐrinciples of Ｂ
iochemical Ｔests in Ｄiagnostic Ｍicrobiology)"ジ
ョン・ウイリイ・アンド・サンズ社(Ｊhon Ｗiley and
Ｓons,Ｉnc．)ニューヨーク１９７５年刊、１３６頁]。
プロテイナーゼ活性を測定するため、ゼラチン液化法を
用いた。

【００３８】抗生物質に対する抵抗性は、ＩＳＰＮo.
２寒天プレートに接種し、そのプレート上、抗生物質感
受性ディスクのパッド法により測定した。

【００３９】殿粉加水分解は、ＩＳＰＮo.４(無機塩−
殿粉)寒天プレート上、殿粉の存在をヨウ素で試験する
ことにより測定した(ブラゼビクおよびエデラー上掲参
照)。

【００４０】ヒップレート加水分解は、ヒップレートの
加水分解をすみやかに検出するバクト分別ディスク(Ｂa
cto Ｄifferentiation Ｄisks)を使用することにより測
定した。

【００４１】培養特性培養菌株Ａ８２８４６およびＡ８２８４６.２は、使用
するすべての複合および限定培地によく発育する。これ
らの培養菌株はほとんどの培地上で気生菌糸体を産生す
る。気生胞子塊の色は培地により白色または灰色であ
る。多くの培地上で特有の可溶性褐色色素を産生し、裏
面は褐色ないし黄色味を帯びた白色である。

【００４２】また培養菌株Ａ８２８４６.１はすべての
培地上で発育するが、その発育は親菌株に比してそれ程
豊富ではない。Ａ８２８４６.１はまれに気生菌糸体を
産生する。産生したその菌糸体の色は白色である。数種
の培地に時折、目立たない淡褐色の可溶性色素を産生
し、裏面は褐色ないし黄色味を帯びた白色である。

【００４３】培養菌株Ａ８２８４６、Ａ８２８４６.１
およびＡ８２８４６.２の培養特性を表１に要約する。
培養菌株Ａ８２８４６とＡ８２８４６.２は、数種の培
養特性だけが異なるが、非常に類似している。この類似
性の故に、またＡ８２８４６.２はＡ８２８４６の自然
変異種であるから、更に比較は行なわなかった。

【００４４】

【表１】表１:種々の寒天培地上、A82846,A82846.1およびA82846.2の培養特性^a,^b 寒天培地 A82846 A82846.1 A82846.2 G: 豊富豊富(表面脱離) 豊富 ISP R: 59.d.Br 57.l.Br 58.m.Br No.2 Am: 豊富:g中灰色なし微量 Sp: 暗褐色色素−pHなしなし淡褐色 G: 良好貧弱良好 ISP R: 92.y White 92.y White 92.y White No.3 Am: 良好: a 白色貧弱: a 白色かなり多い: a 白色 Sp: なしなしなし G: 豊富貧弱良好 ISP R: 56.deep Br 92.y White 77.m.y Br No.4 Am: 豊富: a 白色貧弱: a 白色良好: a 白色 Sp: なしなしなし G: 豊富豊富豊富 ISP R: 47.d.gy.rBr 47.d.gy.rBr 47.d.gy.rBr No.5 Am: 良好: d 淡灰色なし良好: d 淡灰色 Sp: 淡褐色淡褐色淡褐色 G: 豊富良好豊富 ISP R: 59.d.Br 78.d.yBr 59.d.Br No.7 Am: 豊富: e 中灰色微量豊富: d 淡灰色 Sp: 暗褐色色素−pH変化なし淡褐色色素暗褐色色素 G: 豊富良好豊富ザペック R: 56.deep Br 47.d.gy.rBr 5b.deep Br Am: 豊富: a 白色なし豊富: a 白色 Sp: なし赤味オレンジ色淡・赤味オレンジ色 G: 良好良好良好グルコース R: 58.m.Br(ハッチのみ) 77.m.yBr 58.m.Br アスパラギンAm: かなり多い:A 白色なしなし Sp: なしなしなし G: 豊富(表面脱離) 良好(表面しわ、湿気) 良好(表面しわ、湿気) グルコース R: 21.blackish red 77.m.yBr 77.m.yBr 酵素エキス Am: なしなしなし Sp: 深赤褐色なし淡褐色 G: 良好良好かなり豊富栄養寒天 R: 45.l.gy.rBr 76.l.yBr 79.l.gy.yBr Am: なしなし貧弱 Sp: 淡褐色なしなし G: 豊富豊富豊富トマトペースト R: 47.d.gy.rBr 57.l.Br 47.d.gy.rBr オートミール Am: 豊富:d 淡灰色痕跡: a 白色良好:d.淡灰色 Sp: 暗赤褐色なし赤褐色 G: かなり豊富かなり豊富良好水道水 R: 92.y White 92.y White 92.y White 寒天 Am: かなり豊富:a 白色かなり豊富:b 灰白色良好:a 白色 Sp: なしなしなし G: かなり豊富(加水分解なし) 良好(加水分解) かなり豊富(加水分解なし) りんご酸 R: 57.l.Br 58.m.Br 57.l.Br カルシウム Am: 微量なし微量 Sp: 淡褐色淡褐色淡褐色 a) Ｇ＝発育、Ｒ＝裏面、Ａm＝気生菌糸体、Ｓp＝可溶性色素 b) ３０℃で２１日間熟成培養

【００４５】形態学的特性培養菌株Ａ８２８４６、Ａ８２８４６.１およびＡ８２
８４６.２は、広範な基底菌糸体(substratemycelium)を
産生する。個別の菌糸は長鎖状の分生子を形成して蜘蛛
の巣状の外観を有し、バーギイス・マニュアル・オブ・
デタミネイテブ・バクテリオロジィ(Ｂergey's Ｍanual
of Ｄeterminative Ｂacteriology、前掲)における非
ストレプトミセテスの特性として分類される。

【００４６】すべての培養菌株において、胞子表面外観
は平滑で円筒状である。胞子の大きさはＡ８２８４６が
１.２〜１.３×０.４〜０.５μＭ、Ａ８２８４６.１が
１.４〜２.２×０.３〜０.４μＭである。

【００４７】液中振盪条件下に発育させたとき、Ａ８２
８４６は最少の断片を現わし、Ａ８２８４６.１は広範
に断片を現わし、Ａ８２８４６.２は中程度の断片を現
わす。

【００４８】生理学的特性培養菌株Ａ８２８４６およびＡ８２８４６.１は、アラ
ビノース、セロビオース、デキストラン、フルクトー
ス、ガラクトース、グルコース、α−メチル−Ｄ−グル
コシド、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マ
ルトース、マンニトール、マンノース、メリビオース、
ラムノース、リボース、シュクロース、トレハロースお
よびキシロースから酸を生成するか、アドニトール、セ
ルロース、ズルシトール、エリスリトール、イヌリン、
ソルビトールおよびキシリトールから酸を生成しない。
またＡ８２８４６はエタノール、グリコーゲン、メレチ
トース、ラフィノースおよびサリシンから酸を生成する
が、Ａ８２８４６.１は生成しない。双方の培養菌株は
アセテート、シトレート、ラクテート、マレート、オキ
サレート、プロピオネート、ピルベートおよびスクシネ
ートを利用するが、ベンゾエート、ムケートおよびター
トレートを利用しない。培養菌株Ａ８２８４６.１はブ
チレートを利用するがＡ８２８４６は利用しない。

【００４９】Ａ８２８４６およびＡ８２８４６.１はカ
ゼイン、ヒポキサンチン、チロシン、尿素およびＤＮＡ
を分解するがアデニン、リンゴ酸カルシウムまたはキサ
ンチンを分解しない。双方の培養菌株は殿粉を加水分解
するが、エスクリンまたはヒップレート、還元ナイトレ
ート、液化ゼラチンを加水分解しない。５０℃で８時間
生き残り、カタラーゼ、硫化水素およびホスファターゼ
を産生する。

【００５０】培養菌株Ａ８２８４６およびＡ８２８４
６.１は、同一の抗生物質抵抗パターンを有する。これ
らは、バシトラシン(１０単位)、セファロチン(３０μ
g)、ゼンタマイシン(１０μg)、リンコマイシン(２μ
g)、オレアンドマイシン(１５μg)、ペニシリンＧ(１０
単位)、ストレプトマイシン(１０μg)、バンコマイシン
（３０μｇ）、トブラマイシン(１０μg)、エリスロマ
イシン(１５μg)、ナリジキシン酸(３０μg)、ポリミキ
シンＢ(３００単位)、トリメトプリム(５μg)およびス
ルファジアジン(３００μg)に対して抵抗性を有し、ネ
オマイシン(３０μg)、リファムピン(５μg)、テトラサ
イクリン(３０μg)、クロラムフェコール(３０μg)、ノ
ボビオシン(３０μg)およびマンデルアミン(３μg)に対
して感受性を有する。

【００５１】Ａ８２８４６およびＡ８２８４６.１はそ
れぞれグラム染色される(＋)が、抗酸性染色されない。
Ａ８２８４６はメラノイド色素を産生するが、Ａ８２８
４６.１は産生しない。

【００５２】細胞壁の分析Ａ８２８４６の加水分解した全細胞は、ジアミノピメリ
ン酸のメソ異性体およびその糖類、アラビノースおよび
ガラクトースを含む。この培養菌株は、ベッカー(Ｂeck
er)ら(前掲)によるタイプIV細胞壁を有する。糖パター
ンはタイプＡである(レッチャバリヤー(Ｌechavalier)
前掲)。この培養菌株はミコール酸(ＬＣＮ−Ａ)を産生
しない。

【００５３】菌株Ａ８２８４６の同定菌株Ａ８２８４６の化学分類学的特性および一般的培養
特性は、そのノカルジア(Ｎocardia)属トレビサン(Ｔre
visan)１８８９への帰属に矛盾しない[スカーマン(Ｖ.
Ｂ.ＤＳkerman)、マクガバン(Ｖ．ＭcＧowan)および
スニース(Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓneath)編“アプルーブド・リ
スツ・オブ・バクテリアル・ネームス(Ａpproved Ｌist
s of Ｂacterial Ｎames)"インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマテカル・バクテリオロジィ(Ｉn
t．Ｊ．Ｓyst．Ｂacteriol．)第３０巻２２５〜４２０
頁(１９８０年)]。

【００５４】ノカルジアに属する１４種[ゴルドン(Ｇor
don)、ミシュラ(Ｍishra)およびバーネット(Ｂarnett)
により公表(前掲)されている]およびリリー・カルチュ
ア・コレクション(Ｌilly culture collection)から得
られた５種の菌株の特性から、類似性係数(similarity
coefficients)を計算した。ジャガード係数(coefficien
t of Ｊaccard[スニース(Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓneath)著“ジ
・アプリケイション・オブ・コンピューターズ・ツウ・
タキソノミイ(Ｔhe Ａpplication of Ｃomputers to Ｔ
axonomy)"ジャーナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオ
ロジィ(Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol．)第１７巻２０１頁(１
９５７年)参照]、および単純符号係数(simple matching
coefficient)[ソカル(Ｒ．Ｒ．Ｓokal)およびミチナー
(Ｃ．Ｄ．Ｍichener)著“ア・スタテステカル・メソッ
ド・フォー・エバリュエーテング・システマテク・リレ
ーションシップス(ＡＳtatistical Ｍethod for Ｅval
uating Ｓystematic Ｒelationships)"キャンザス・ユ
ニバーシティ・サイエンス・ブリテン(Ｋan．Ｕniv．Ｓ
ci．Ｂull．)第３８巻１４０９頁(１９５８年)参照]を
用いた。これらの比較結果を表２に示す。

【００５５】

【表２】表２:Ａ８２８４６および他のノカルジア属(Ｎocardia)に属する１９種の類似性係数類似性係数菌株Ｓsm Ｓj Ａ８２８４６１００１００Ｎ．アエロコロニゲネス８４７６Ｎ．アエロコロニゲネス(Ａ４２１２５)* ８３７８Ｎ．オリエンタリス(Ｍ４３−０５８６５) ７８７２Ｎ．オリエンタリス(Ａ５１５６８.１) ７８７２Ｎ．オリエンタリス７５６８Ｎ．オリエンタリス(Ｍ５−１８２１５) ７３６６Ｎ．オリエンタリス(Ｍ５−１８２６０) ７３６６Ｎ．マジュラエ７３６３Ｎ．ヒルスタ６２６０Ｎ．アウトトロピカ６２５３Ｎ．ダツソンビレイ６２５０Ｎ．アマラエ６２４６Ｎ．ブラシリエンシス５６４３Ｎ．バクシンシ５６４３Ｎ．トランスバレンシス４８３８Ｎ．カビアエ４８３２Ｎ．ペレテイエリ４８２４Ｎ．アステロイデス４６２３Ｎ．カルネア４３２５注)＊括弧内の数字はリリー・カルチュア・コレクションからの菌株を表わす。注)Ｎ．アエロコロニゲネス(Ｎ．aerocolonigenes)、Ｎ．オリエンタリス(Ｎ．orientalis)、Ｎ．マジュラエ(Ｎ．madurae)、Ｎ．ヒルスタ(Ｎ．hirsuta)、Ｎ．アウトトロピカ(Ｎ．autotrophica)、Ｎ．ダツソンビレイ(Ｎ．dassonville i)、Ｎ．アマラエ(Ｎ．amarae)、Ｎ．ブラシリエンシス(Ｎ．brasiliensis)、Ｎ．バクシンシ(Ｎ．vaccinci)、Ｎ．トランスバレンシス(Ｎ．transvalensis)、Ｎ．カビアエ(Ｎ．caviae)、Ｎ．ペレテイエリ(Ｎ．pelletieri)、Ｎ．アステロイデス(Ｎ．asteroides)、Ｎ．カルネア(Ｎ．carnea)。

【００５６】Ｎ．マジュラエはアクチノマジュラ(Ａcti
nomadura)属に移されたので、これは考察から除外し
た。Ｎ．アエロコロニゲネスおよびＮ．オリエンタリス
の２種は、良好な類似性係数を有する。Ａ８２８４６と
これら２種の実験室的比較を行なった。比較結果を表３
に示す。

【００５７】

【表３】表３: Ａ８２８４６ならびにＮ．オリエンタリス(表中、Ｎ．ori．と記載)およびＮ．アエロコロニゲネス(表中、Ｎ．aer．と記載)培養物ａ)の特性比較特性項目Ａ８２８４６Ｎ．ori．Ｎ．aer．気生菌糸の産生＋＋＋気生色白＋＋＋分生子の産生＋＋＋胞子表面平滑＋＋＋胞子形状円筒形＋＋ − 可溶性色素の産生＋ − − グラム(＋) ＋＋＋抗酸性 − − − 断片発現＋＋＋カタラーゼの産生＋＋＋加水分解:エスクリン − ＋＋ :ヒップレート − − − :澱粉＋＋＋ :リンゴ酸カルシウム − ＋＋ナイトレートを還元＋＋ − 分解:アデニン − − − 分解:カゼイン＋＋＋ :ピポキサンチン＋＋＋ :チロシン＋＋＋ :尿素＋＋＋ :キサンチン − − − ゼラチン液化＋＋ − ホスファターゼの産生＋＋＋５０℃．８時間で生存＋＋ − アドニトールから酸の生成 − ＋ − アラビノース〃＋＋＋セロビオース〃＋＋＋エリスリトール〃 − ＋ − グルコース〃＋＋＋ α−Ｍe−グルコシド〃＋＋ − グリセロール〃＋＋＋イノシトール〃＋＋＋ラクトース〃＋＋＋マルトース〃＋＋＋マンニトール〃＋＋＋マンノース〃＋＋＋メレチトース〃＋ − − メリビオース〃＋ − ＋ラフイノース〃＋ − − ラムノース〃＋＋＋ソルビトール〃 − − − トレハロース〃＋＋＋キシロース〃＋＋＋コントール − − − ベンゾエートを利用 − − − シトレート〃＋＋＋ムケート〃 − − − スクシネート〃＋＋＋タータレート〃 − − − コントール − − − 抵抗性: バシトラシン(１０単位) ＋ − − セファロチン(３０μg) ＋＋＋ゲンタマイシン(１０μg) ＋ − − リンコマイシン(２μg) ＋＋＋ネオマイシン(３０μg) − − − オレアンドマイシン(１５μg) ＋ − − ペニシリンＧ(１０単位) ＋＋＋リフアンピン(５μg) − − − ストレプトマイシン(１０μg) ＋＋ − テトラサイクリン(３０μg) − − − トブラマイシン(１０μg) ＋＋ − バンコマイシン(３０μg) ＋＋ − クロラムフエニコール(３０μg) − − − エリスロマイシン(１５μg) ＋ − − ナリジクス酸(３０μg) ＋＋ − ノボピオシン(３０μg) − ＋ − ポリミキシンＢ(３００単位) ＋＋＋トリメトプリム(５μg) ＋＋＋ a)＋＝菌株がその特性を有する; −＝菌株がその特性を有しない。

【００５８】多数の単位特性を用いて再度、類似性係数
を計算した。その結果を表４に要約する。

【表４】表４: Ａ８２８４６、ノカルジア・オリエンタリスおよびノカルジア・アエロコロニゲネスの類似性係数菌株名類似性係数Ｓsm Ｓj Ａ８２８４６１００１００Ｎ．オリエンタリス８１７６Ｎ．アエロコロニゲネス７３６５

【００５９】Ｎ．オリエンタリスもＮ．アエロコロニゲ
ネスもその細胞壁中にミコール酸が存在しない。ゴルド
ン(前掲)は、Ｎ．オリエンタリスとＮ．アエロコロニゲ
ネスの区別を助けるための鍵となる要点として３つの特
性を述べている。ゴルドンの要点特性を用いたＡ８２８
４６とノカルジア属の２種の比較結果を表５に示す。

【００６０】

【表５】表５：Ａ８２８４６、ノカルジア・オリエンタリスおよびノカルジア・アエ
ロコロニゲネスの要点特性の比較エリスリＭe−α− リゾチーム菌株名トールグリコシドに対するから酸の生成抵抗性Ａ８２８４６ − ＋＋Ｎ．オリエンタリス＋＋ − Ｎ．アエロコロニゲネス − − ＋

【００６１】Ａ８２８４６は、他のいずれのノカルジア
菌株の要点特性とも完全に一致しないが、Ａ８２８４６
は、培養特性およびＮ．オリエンタリスとの高い類似性
係数の点で、Ｎ．オリエンタリスへの近似性がより大で
ある。またＡ８２８４６は、これがグリコペプチド抗生
物質を産生するという点でＮ．オリエンタリスに似てい
る。それ故、Ａ８２８４６は、ノカルジア・オリエンタ
リス(ピッテンガー・アンド・ブリガム(Ｐittenger and
Ｂrigham)１９５６)プリダム・アンド・リオンズ(Ｐri
dham and Ｌyons)１９６９の菌株として分類される。
Ｎ．オリエンタリスは、アプルーブド・リスツ・オブ・
バクテリアル・ネームス(前掲)中に認知されているの
で、確実な根拠で公表された種である。

【００６２】培養菌株Ａ８２８４６．１は、菌株Ａ８２
８４６の化学的に誘導された突然変異菌株である。Ａ８
２８４６．１がＡ８２８４６と異なる特性を表６に示
す。

【表６】表６: Ａ８２８４６とＡ８２８４６．１の間の差異の比較特性項目Ａ８２８４６Ａ８２８４６．１断片最少豊富コロニーの大きさ７mm ５mm コロニーの表面硬軟気生菌糸豊富微量裏面の色暗褐色淡褐色可溶性色素＋ − エタノールから酸の生成＋ − グリコーゲン〃＋ − メレチトース〃＋ − ラフィノース〃＋ − サリシン〃＋ − α−Ｍe−グリコシドを利用＋ − グリコーゲン〃＋ − メレチトール〃＋ − ソルボース〃＋ − ブチレート〃 − ＋メラノイド色素産生＋ −

【００６３】またＡ８２８４６.１は、その産生する抗
生物質活性の量において、Ａ８２８４６と異なる。これ
らの菌株の間の他の最も明らかな差異は、Ａ８２８４６
と異なりＡ８２８４６.１が気生菌糸体と明確な可溶性
色素を産生しないことである。

【００６４】培養菌株Ａ８２８４６.２は培養菌株Ａ８
２８４６の自然変異種である。それ故、Ａ８２８４６.
２の同定された特性は、Ａ８２８４６のそれと本質的に
同様である。Ａ８２８４６とＡ８２８４６.２の間の主
要な差異は、振盪フラスコ中で発育させたとき、Ａ８２
８４６.２培養菌株はＡ８２８４６培養菌株より有意に
多量の抗生物質Ａ８２８４６を生産することである。

【００６５】他の微生物の場合と同様に、本発明のＡ８
２８４６生産菌株、ノカルジア・オリエンタリス(Ｎoca
rdia orientalis)菌株ＮＲＲＬ１８０９８、ＮＲＲＬ１
８０９９およびＮＲＲＬ１８１００の特性は、変異種に
従属する。それ故、これらの菌株の後代(子孫)たとえば
遺伝子組換え変異種、突然変異種および変異種は、この
技術分野における公知方法により得ることができる。た
とえば変異種は自然的選択により得ることができ、突然
変異種は、種々の公知の物理的および化学的突然変異誘
導物(mutagen)、たとえば紫外線、Ｘ線、ガンマ線およ
びＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
のような化学的突然変異誘導物で処理することにより得
ることができる。

【００６６】遺伝子組換え変異菌株は、この技術分野で
よく知られた方法を用いノカルジア・オリエンタリス菌
株を形質転換することにより開発することができる。ノ
カルジア属とストレプトミセス属は類似しているので、
ストレプトミセス用に開発された形質転換法および組換
えベクターを、ノカルジア属菌株の形質転換にも使用す
ることができる。遺伝子組換え技術を用いることによ
り、ノカルジア・オリエンタリスが生産する抗生物質に
加え、これらの菌株を形質転換して多くの遺伝子産物を
発現させることができる。たとえばノカルジア・オリエ
ンタリス菌株が通常、感受性を有する抗生物質に対する
抵抗性を付与する組換えベクターを用いて該菌株を形質
転換することができる。かくて得られた形質転換体は、
Ａ８２８４６抗生物質自体ばかりでなく、形質転換され
た細胞野性型からの選択を可能にする抵抗性付与酵素を
も生産する。更に同様に技術を用い、この菌株を処理し
て内生的抗生物質生合成遺伝子の多くのコピーを導入
し、より多くの抗生物質収量を得るように改良すること
ができる。Ａ８２８４６生産特性を保持するノカルジア
・オリエンタリス菌株ＮＲＲＬ１８０９８、ＮＲＲＬ１
８０９９およびＮＲＲＬ１８１００の後代(子孫)菌、す
なわちその自然のまたは誘導された変異種、突然変異種
ならびに遺伝子組換え種は、本発明の一部を構成する。

【００６７】ノカルジア・オリエンタリス培養菌株を発
育に使用する培地は、多くの培地のいずれかであること
ができる。しかし、生産上の経済性、最適収量および生
産、単離の容易さのため、ある種の培地が好ましい。こ
のように、たとえば大規模発酵における好ましい炭水化
物源は、グルコースおよびポテトデキストリンである
が、リボース、キシロース、フルクトース、ガラクトー
ス、マンノース、マンニトール、可溶性澱粉なども使用
することができる。

【００６８】好ましい窒素源は、酵素加水分解カゼイン
およびミートペプトン類であるが、酵母エキス、酸加水
分解カゼイン、牛肉エキス、魚粉、肝臓粉、その他も使
用することができる。

【００６９】培地中に配合することができる栄養無機塩
類中、亜鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、
アンモニウム、クロリド、カーボネート、サルフエー
ト、ニトレートなどのイオンを供与することができる通
常の可溶性塩を包含する。

【００７０】また微生物の生長および発育のために必要
な必須微量元素を培地中に含有させるべきである。かか
る微量元素は、微生物の生長需要に適合するのに充分量
で培地の他の成分中に不純物として通常存在する。もし
発泡が問題であるならば、ポリプロピレングリコールの
ような消泡剤少量(すなわち０.２ml／Ｌ)を、大規模発
酵培地中に加えてもよい。

【００７１】Ａ８２８４６抗生物質の実質的量の生産の
ため、タンクの液中好気的発酵が好ましい。少量の抗生
物質は振盪フラスコ培養により得ることができる。大型
タンクに胞子型の微生物を接種することに通常付随する
抗生物質生産における時間の遅れ(タイムラグ)の故に、
栄養接種物を用いるのが好ましい。栄養接種物は、少容
量の培地に胞子形微生物または菌糸体断片を接種し、微
生物の新鮮で活性を有する生長培養物を得ることにより
製造することができる。次いで、この栄養接種物を大型
タンクに移す。栄養接種物培地は、より大型の発酵のた
めに使用する培地と同様であってよいが、他の培地も適
当である。

【００７２】Ａ８２８４６抗生物質は、Ａ８２８４６産
生菌を約２３〜３７℃で生長させるとき生産される。Ａ
８２８４６生産のための最適温度は約３０〜３１℃であ
ると考えられる。

【００７３】液中好気的培養工程で通常行なわれている
ように、培地を常套のタービン羽根車で撹拌する間、底
部から容器内に滅菌空気を吹込む。従来採用されていた
条件下の発酵における最大酸素吸収量は約０.２mＭ／Ｌ
／分を越えていなかった。一般的には通気速度および撹
拌速度は、溶解した酸素濃度を、飽和の５０％またはそ
れ以上に保持するのに充分にするべきである。

【００７４】Ａ８２８４６抗生物質の製造は、抗生物質
に感受性を有することで知られた微生物に対する抗生物
質活性を監視するため、発酵の間、発酵液試料を試験す
ることにより製造を継続する。有用な供試微生物はバチ
ルス・スブテイリス(Ｂacillus subtilis)ＡＴＣＣ６６
３３である。生物試験法は寒天−くぼみ板(agar−well
plate)試験により行うのが好都合である。

【００７５】液中好気的発酵条件下に製造を行い、この
技術分野において用いる方法により発酵培地からＡ８２
８４６抗生物質を回収することができる。Ａ８２８４６
産生微生物の発酵の間、生成した抗生物質活性は、菌糸
体および発酵液の双方中に存在する。それ故、初めにp
Ｈ１０.５に調節して菌糸体からＡ８２８４６を分離
し、培地を濾過して菌糸体塊から発酵液を分離すること
により、Ａ８２８４６の最大量の回収を達成することが
できる。

【００７６】濾過した発酵液から、種々の方法によりＡ
８２８４６を回収することができる。好ましい方法は、
濾過した発酵液をpＨ約７に調節し、これを陽イオン交
換樹脂、たとえばダウエックス(Ｄowax)ＸＦ５−４３２
７８、ダウエックス−５０またはアンバーライト(Ａmbe
rlite)ＩＲ−１２０に吸収させる方法を包含する。たと
えば希水酸化アンモニウム溶液のような適当な溶媒を用
い、上記樹脂から活性物質を溶離する。この活性分画を
減圧下に濃縮し、マクロレテイキュラー樹脂、たとえば
ダイアイオン(Ｄiaion)ＨＰ−２０およびアンバーライ
トＸＡＤ−４に吸着させ、水:イソプロパノール(９５:
５)(１％酢酸含有)のような適当な溶媒で溶離してＡ８
２８４６を得る。また活性物質を、水:アセトニトリル
または水:メタノール混合物(少量の酸含有)で溶離する
こともできる。

【００７７】Ａ８２８４６を同様の方法により、その各
個の成分Ａ８２８４６Ａ、Ａ８２８４６ＢおよびＡ８２
８４６Ｃに分離することができる。好ましい分離方法
は、逆相シリカゲル(Ｃ₁₈またはＣ₈)クロマトグラフィ
を包含する。

【００７８】またＡ８２８４６源としての培地成分およ
び菌糸体を含む培地固体を、抽出または分離することな
く好ましくは水を除いた後、使用することができる、た
とえばＡ８２８４６を製造後、全発酵液を凍結乾燥、ド
ラム乾燥または共沸蒸留して乾燥することができる。次
いで、乾燥発酵液はこれをたとえば直接飼料プレミック
ス中に混合する。

【００７９】Ａ８２８４６抗生物質は、グラム陽性病原
菌に対して試験管内または生体内的にすぐれた活性を有
する。これらの抗生物質の特に予想外の特質は、長い血
清半減期である。たとえばラットに静脈内投与したと
き、バンコマイシンは４５分の血清半減期を有するが、
Ａ８２８４６ＡおよびＡ８２８４６Ｂはそれぞれ２.２
時間の半減期を有する。

【００８０】Ａ８２８４６抗生物質がある種の細菌を抑
制する最小抑制濃度(ＭＩＣ's)を表７および表８に示
す。表７および表８中のＭＩＣ'sは標準寒天希釈試験法
で試験した。

【００８１】表７：注)スタフィロコックス・アウレウ
ス(Ｓtaphylococcus aureus)、スタフィロコックス・エ
ピデルミデス(Ｓtaphylococcus epidermidis)、ストレ
プトコックス・ピオゲネス(Ｓtreptococcus pyogene
s)、ストレプトコックス・プノイモニアエ(Ｓtreptococ
cus pneumoniae)、ヘモフイルス・インフルエンザエ(Ｈ
aemophilus influenzae)、エシエリヒア・コリー(Ｅsch
erichia coli)、クレブシエラ・プノイモニアエ(Ｋlebs
iella pneumoniae)、プソイドモナス・アエルギノサ(Ｐ
seudomonas aeruginosa)。

【００８２】表８：注)ストレプトコックス・サリバリ
ス(Ｓtreptococcus salivaris)、ストレプトコックス・
サングイス(Ｓ．sanguis)、ストレプトコックス・ムタ
ンス(Ｓ．mutans)。

【００８３】

【表７】表７: Ａ８２８４６抗生物質の試験管内抗菌活性供試微生物ＭＩＣ(mcg／mＬ) Ａ８２８４６Ａ８２８４６ＢＡ８２８４６Ｃスタフィロコックス・アウレウスXI.1 ０.１２５０.１２５１スタフィロコックス・アウレウスV41^a ０.１２５０.１２５１スタフィロコックス・アウレウスX400^b ０.１２５０.１２５１スタフィロコックス・アウレウスS13E ０.１２５０.１２５１スタフィロコックス・エピデルミデス270 ０.２５０.２５１スタフィロコックス・エピデルミデス222 ０.２５０.２５１ストレプトコックス・ピオゲネスＣ203 ０.１２５０.１２５１ストレプトコックス・プノイモニアエ・パークＩ０.１２５０.１２５２ストレプトコックス・グループＤ X66 ０.２５０.２５２ストレプトコックス・グループＤ 2041 ０.５０.５４ヘモフイルス・インフルエンザエC.L.^c −^e − − ヘモフイルス・インフルエンザエ76^d − − − エシエリヒア・コリー EC14 − − − クレブシエラ・プノイモニアエ X26 − − − プソイドモナス・アエルギノサ X239 − − − 注) a ペニシリン抵抗性菌株; b メチシリン抵抗性菌株; c アンピシリン感受性菌株; d アンピシリン抵抗性菌株; −e １２８mcg／mＬで活性なし、最高濃度で試験

【００８４】

【表８】表８: Ａ８２８４６、Ａ８２８４６Ｂおよびバンコマイシンの試験管内活性微生物名供試ＭＩＣ(mcg／mＬ) 菌株数Ａ82846A Ａ82846B バンコマイシンスタフィロコックス・アウレウス 20 0.125〜1.0 0.25〜1.0 0.5〜2.0 スタフィロコックス・エピデルミデス 20 0.25〜2.0 0.5〜1.0 1.0〜2.0 ストレプトコックス・ピオゲネス 12 0.125〜0.25 0.125〜0.25 0.5 ストレプトコックス・プノイモニアエ 20 ≦0.015〜0.25 0.125〜0.25 ≦0.015〜4.0 ストレプトコックス・sp．group Ｄ 20 0.25〜1.0 0.25〜1.0 1.0〜2.0 ストレプトコックス・サリバリス 1 1.0 0.25 0.5 ストレプトコックス・サングイス 4 0.25〜0.5 0.25 0.5〜1.0 ストレプトコックス・ムタンス 2 0.125〜0.5 0.125〜1.0 0.125〜2.0

【００８５】Ａ８２８４６化合物の抗菌活性の重要な側
面は、その嫌気性菌に対する活性である。この活性を表
９に示す。表９は標準寒天−希釈試験法で試験した種々
の嫌気性菌に対するＡ８２８４６ＡおよびＡ８２８４６
Ｂの活性を要約したものである。２４時間熟成後、終末
点と解釈した。

【００８６】表９: 注)Ｃ．デイフイシレ(Ｃlostridium
difficile)、Ｃ．ペルフリンゲンス(Ｃlostridium per
fringens)、Ｃ．セプチクム(Ｃlostridium septicum)、
Ｅ．アエロファシエンス(Ｅubacterium aerofaciens)、
Ｐ．アサッカロリテイクス(Ｐeptococcus asaccharolyt
icus)、Ｐ．プレボテイ(Ｐeptococcus prevoti)、Ｐ．
バリアビリス(Ｐeptococcus variabilis)、Ｐ．コンス
テラツス(Ｐeptococcus constellatus)、Ｐ．マグヌス
(Ｐeptococcus magnus)、Ｐ．アナエロビウス(Ｐeptost
reptococcus anaerobius)、Ｐ．インテルメデイウス(Ｐ
eptostreptococcus intermedius)、Ｐ．アクネス(Ｐrop
ionibacterium acnes)。Ｂ．フラギリス(Ｂacteroides
fragilis)、Ｂ．テタイオタオミクロン(Ｂacteroides t
hetaiotaomicron)、Ｂ．メラニノゲニクス(Ｂacteroide
s melanilogenicus)、Ｂ．ブルガテイス(Ｂacteroides
vulgatis)、Ｂ．コロデンス(Ｂacteroides corroden
s)、Ｆ．シムビオスム(Ｆusobacterium symbiosum)、
Ｆ．ネクロフオルム(Ｆusobacterium necrophorum)。

【００８７】

【表９】表９: 嫌気性菌に対するＡ８２８４６ＡおよびＢの活性嫌気性菌供試ＭＩＣ(mcg／mＬ) 菌株数Ａ82846A Ａ82846B バンコマイシングラム陽性菌Ｃ.デイフイシレ 19 0.125〜1 ≦0.06〜0.125 0.5〜4 Ｃ.ペルフリンゲンス 1 ≦0.25 0.5 2 Ｃ.セプチクム 1 0.5 0.5 2 Ｃ.アエロフアシエンス 1 ≦0.25 0.5 2 Ｐ.アサッカロリテイクス 3 ≦0.25 0.06〜0.5 1 Ｐ.プレボテイ 4 1〜2 1〜4 1〜4 Ｐ.バリアビリス 1 0.2 1 1 Ｐ.コンステラツス 1 0.25 0.25 1 Ｐ.マグヌス 3 0.06〜0.125 0.125〜0.25 0.25〜1 Ｐ.アナエロビウス 8 0.06〜2 0.06〜8 0.25〜2 Ｐ.インテルメデイウス 3 ≦0.25 0.25〜0.5 0.5〜1 Ｐ.アクネス 19 ≦0.25 ≦0.25 2〜16 グラム陰性菌Ｂ.フラギリス 3 ＞128 ＞128 32〜64 Ｂ.テタイオタオミクロン 1 128 128 64 Ｂ.メラニノゲニクス 2 ＞128 ＞128 ＞128 Ｂ.ブルガテイス 1 128 ＞128 64 Ｂ.コロデンス 1 ＞128 ＞128 64 Ｆ.シムビオスム 1 128 128 4 Ｆ.ネクロフオルム 1 128 128 1

【００８８】またＡ８２８４６抗生物質は、実験動物に
実験的に誘導した感染に対する生体内抗菌活性を示す。
実験的に供試微生物に感染させたマウスに試験化合物を
２回投与したとき、観察された活性をＥＤ₅₀値として測
定した[供試動物５０％を保護する有効投与量(mg／kg):
ウオレン・ウイック(Ｗarren Ｗick)ら著、ジヤーナル
・オブ・バクテリオロジィ(Ｊ．Ｂacteriol．)、第８１
巻、２３３〜２３５頁(１９６１年)]。例示する化合物
について観察されたＥＤ₅₀値を表１０に示す。

【００８９】

【表１０】表１０: Ａ８２８４６抗生物質の生体内活性化合物名ＥＤ₅₀値^a Ｓ.アウレウスＳ.ピオゲネスＳ.プノイモニアエＡ８２８４６Ａ０.１９０.１９０.１７Ａ８２８４６Ｂ０.１９０.２００.１８Ａ８２８４６Ｃ２.１８２.７１５.８７バンコマイシン１.３０.７２１.５２注) a)mg／kg×２; 感染後、１および４時間マウスに対する皮下投与量。Ｓ．アウレウス(Ｓtaphylococcus aureus)、Ｓ．ピオゲネス(Ｓtreptococcus pyogenes)、Ｓ．プノイモニアエ(Ｓtreptococcus pneumoniae)。

【００９０】抗菌活性の重要な一側面において、Ａ８２
８４６抗生物質は腎盂腎炎の処置のために有用である。
たとえばＡ８２８４６ＡおよびＡ８２８４６Ｂは、ラッ
トの腎孟腎炎の罹患を実験的に減少させて保護すること
においてバンコマイシンより有効である。この試験は、
米国特許第４,２０８,４０３号に開示されたような方法
を用いて行われる。観察結果を表１１に要約する。

【００９１】

【表１１】表１１: ラットの腎孟腎炎減少試験におけるＡ８２８４６ＡおよびＢの活性化合物名投与量治癒した４−Ｌog力価 (mg/kg×12)^a ラット(％) 減少ラットの(％) Ａ８２８４６Ａ１０８８１００〃５７５８８〃２６３１００Ａ８２８４６Ｂ１０１００１００〃５１００１００〃２５０８８バンコマイシン１０６３１００〃５３８８８〃２３８７５注) a)皮下投与による１日当たり２回６日間の投与量。

【００９２】また、Ａ８２８４６抗生物質は心内膜炎に
有用である。たとえばＡ８２８４６ＡおよびＢは、実験
的にカテーテルを挿入して心内膜炎に罹患させたラット
を処置することにおいてバンコマイシンと同様な効果を
有する。この試験において、ラットの右頸動脈にプラス
チックカテーテルを挿入し、これを右心室中に到達させ
て確実に固定することによりラットの実験準備をする。
動物を２日間安静に保った後、供試微生物: ストレプト
コックス・フエカリス(Ｓtreptococcus faecalis)Ｘ−
６６を静脈注射する。微生物力価は約５×１０⁸／mＬ、
注射量は０.５mＬである。

【００９３】活性化合物を、感染１５分前および１２時
間間隔で１４日間、全２８回皮下投与する。治療後、動
物を２日間保持した後、心臓を切除して均質にし、希釈
し、トリプチカーゼ大豆寒天上に板状に延ばす。計数
前、板状物を４８時間熟成する。実験結果を表１２に示
す。

【００９４】

【表１２】表１２: ラット心内膜炎試験 ^a におけるＡ８２８４６ＡおよびＢの活性化合物名投与量 ^b １６日 (mg/kg×28) 治癒率(％) ４Ｌog ドロップ ^c Ａ８２８４６Ａ２０１００１００Ａ８２８４６Ｂ２０１００１００バンコマイシン２０１００１００注) a)カテーテルを用い、ストレプトコックス・フエカリスＸ−６６で誘発させた心内膜炎試験。 b)１２時間間隔で１４日間皮下注射。 c)４Ｌogドロップでぎ性となった動物の％。

【００９５】Ａ８２８４６抗生物質の薬物製剤もまた本
発明の一部である。それ故、この抗生物質、好ましくは
その薬理学的に許容される塩類型を、菌類感染症の治療
的または予防的処置のため、経口的もしくは非経口的投
与剤形に製剤することができる。たとえば活性化合物
を、通常の薬学的担体または賦形剤と混合し、錠剤、カ
プセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエー
ファスなどの剤形で使用することができる。

【００９６】Ａ８２８４６抗生物質を含有する薬剤組成
物は、これに活性化合物約０．１〜９０重量％、より一
般的には約１０〜３０重量％を含有せしめる。かかる組
成物は、これに通常の担体および賦形剤、たとえばコー
ンスターチまたはゼラチン、ラクトース、シュクロー
ス、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン
酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸を含
有せしめることができる。本発明組成物に通常使用する
崩壊剤は、クロスカルメロース(croscarmellose)ナトリ
ウム、微結晶セルロース、コーンスターチ、グリコール
酸ナトリウム澱粉およびアルギン酸を包含する。

【００９７】包含することができる錠剤混合組成物は、
アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン(Ｐovidon
e)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、シュクロー
ス、澱粉およびエチルセルロースを包含する。

【００９８】使用することができる滑沢剤は、ステアリ
ン酸マグネシウムまたは他のステアリン酸金属塩、ステ
アリン酸、液状シリコーン、タルク、ワックス、油脂類
およびコロイド状シリカを包含する。

【００９９】ペパーミント、冬緑油、チェリー香料、そ
の他のような香料を使用することができる。投与剤型を
外観上より美的にし、薬物の識別を助けるため、着色剤
を加えるのが好ましいこともある。

【０１００】静脈内(ＩＶ)使用のため、水溶性型抗生物
質を、通常用いる静脈注射用液体に溶解し、注射により
投与することができる。たとえば生理的食塩水、リンゲ
ル液または５％デキストロース溶液のような液体を使用
することができる。

【０１０１】筋肉内投与用製剤として、化合物の適当な
可溶性塩、たとえば塩酸塩の滅菌調製物を、注射用水、
生理的食塩水または５％グルコース溶液のような薬学的
希釈剤に溶解して投与することができる。水性基質また
は薬学的に許容される油性基質、たとえばオレイン酸エ
チルのような長鎖脂肪酸エステル中の懸濁液として、活
性化合物の適当な不溶性剤型を製剤し、投与することが
できる。

【０１０２】経口的用途のため、抗生物質の適当な塩型
たとえば塩酸塩を、蒸留水または脱イオン水中に調製し
た滅菌製剤は特に有用である。

【０１０３】また、本発明の抗生物質の単位投与剤型
は、適当な滅菌希釈剤中、抗生物質好ましくはその塩の
溶液を密閉して封入したアンプルであることができる。
単位投与剤中の抗生物質の濃度は、抗生物質の特定の剤
形、その溶解性および医師の所望する投与剤形に依存し
てたとえば約１〜５０％の範囲で変えることができる。

【０１０４】更に上記以外の観点から、本発明は動物の
感染症、特にグラム陽性菌に起因する感染症を処置する
方法を提供する。動物は微生物に感受性を有するか、ま
たは感染するかいずれかであることができる。処置方法
は当該目的のために有効なＡ８２８４６抗生物質の量を
動物に投与することから成る。一般にＡ８２８４６抗生
物質の有効量は、約０.５〜１００mg／kgの投与量であ
る。好ましい投与量は活性化合物約１〜６０mg／kgであ
る。成人１人１日当り典型的投与量は約５０mg〜約１.
０gである。

【０１０５】この方法の実施において、抗生物質を１日
当り１個または１日当り複数個の剤形で投与することが
できる。養生処置は長期間、たとえば数日間または１〜
６週間に渡る投与が必要なこともある。単位投与量また
は投与総量は、感染の症状および重篤度、患者の年令お
よび一般的健康度、患者の抗生物質に対する耐性、なら
びに感染症に含まれる１種ないし複数種の微生物のよう
な因子に依存する。

【０１０６】処置方法を実施するのに好都合な方法は抗
生物質を静脈注射(IV infusion)により投与することで
ある。この方法において、抗生物質の適当な可溶性塩の
滅菌組成物を、５％デキストロース溶液のような生理的
液体中に配合し、得られた溶液をゆっくり静脈(IV)注射
する。また静脈注射のピギーバック法(piggy−backmeth
od)を採用してもよい。

【０１０７】他の実施態様において、本発明は(１)家
禽、豚、羊および牛のような動物の飼料利用効率を高め
る方法、(２)家禽、豚、羊および牛のような動物の肉生
産を上げるための生長促進法および(３)反芻動物の乳汁
分泌における乳生産増強方法に関する。飼料利用効率を
高め、生長を促進するため、Ａ８２８４６抗生物質を、
全飼料トン当り約２〜２００gの量で適当な飼料に配合
して経口的に投与する。肉牛のために、たとえば約１２
〜３０００mg／頭／日の割合が適当である。反芻動物の
乳汁分泌における乳生産増強のための経口投与量を示せ
ば、１日当り約０.０４〜１６mg／kg(体重)(または約２
５〜５０００mg／動物／日)である。

【０１０８】かかる観点において本発明化合物を、生理
学上許容される担体を含む動物飼料プレミックス型とし
て正規に販売することができる。本発明の実施をより完
全に説明するため、以下実施例を列挙する。

【０１０９】

【実施例】実施例１Ａ８２８４６ＨＰＬＣ試験法:− Ａ８２８４６成分のため次の分析的ＨＰＬＣ系は有用で
ある。１．陽イオン交換樹脂カラムカラム支持:ゾルバックス＊ＳＣＸ(４.６×１５０mm)、
系:傾斜溶離、Ａ:Ｂ(４:１)→Ａ:Ｂ(１:９)、５分中、
１５分間保つ。Ａ＝ＭeＯＨ:０.１Ｍ・ＮaＨ₂ＰＯ₄(１:９) Ｂ＝ＭeＯＨ:０.９Ｍ・ＮaＨ₂ＰＯ₄(１:９) 流速:１.０mＬ／分、検出:２２５nmＵＶ保持時間:濃度に依存するが、概略、Ａ８２８４６Ｃ＝
６.６分、Ａ８２８４６Ｂ＝８.９分、Ａ８２８４６Ａ＝
９.５分。

【０１１０】２．逆相カラムカラム支持:ゾルバックス＊ＯＤＳ(４.６×１５０mm)、
系:傾斜溶離、１％(ＮＨ₄)Ｈ₂ＰＯ₄:ＣＨ₃ＣＮ、(９５:
５)→(１:１)、２０分中。流速:１.０mＬ／分、検出:２２５nmＵＶ保持時間:Ａ８２８４６Ａ＝７.３分、Ａ８２８４６Ｃ＝
７.６分、Ａ８２８４６Ｂ＝８.０分。注)＊ゾルバックス(Ｚorbax)はＥ．Ｉ．デュポン・ド・
ナムール社(du Ｐontde Ｎemours Ｃo.，Ｉnc．)(デラ
ウェア州１９８９８ウイルミントン)の製品。

【０１１１】実施例２培養菌株Ａ８２８４６を用いる抗生物質Ａ８２８４６の
製造:− Ａ．培養菌株Ａ８２８４６の振盪フラスコ発酵:− 培養菌株ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１８０９
８(凍結乾燥したペレットまたは液体窒素に保持した懸
濁液のいずれかとして)を使用し、次の組成を有する種
菌培地に接種する。

【０１１２】種菌培地の組成:グルコース１.０％;可溶
性澱粉２.０％;酵母エキス０.５％;カゼイン＊の酵素加
水分解物０.５％;炭酸カルシウム０.１％;脱イオン水全
量１Ｌになる量。滅菌前、培地を水酸化ナトリウムでp
Ｈ７.５に調節。注)＊ＮＺアミンＡ(シェフィールド・ケミカル・カンパ
ニー(Ｓheffield Ｃhemical Ｃo．(ＮＹ,ノーウィッ
チ))。

【０１１３】種菌培地に２.５％寒天を加えて斜面培地
および平板培地を調製する。接種した斜面培地を３０℃
で約１０〜１４日間インキュベートする。熟成した斜面
培養物を滅菌器具でかき削って胞子を解き離し、菌糸体
マットを除き浸漬する。解き離して得られた胞子と生長
培養物の約１／４量を使用して第１段階の種菌培地５０
mＬに接種する。

【０１１４】接種した第１段階の培地を、２５０mＬエ
ルレンマイヤーフラスコ中、２インチ(５.０８cm)旋
回、回転数２５０rpmのシェーカー上、３０℃で約２４
〜４８時間熟成する。上記熟成した第１段階の培地(０.
５mＬ)を用い、次の組成を有する生産培地５０mＬに接
種する。

【０１１５】生産培地の組成:グルコース２.５％;大豆
粉１.５％;ポテトデキストリン３.０％;炭酸カルシウム
０.２５％;廃糖蜜０.３％;酸加水分解カゼイン＊０.５
％;脱イオン水、全量１Ｌとなる量。(滅菌前、水酸化ナ
トリウムでpＨ７.５に調節) 注)＊ハイ−ケース(Ｈy−Ｃase)(シェフィールド・ケミ
カル・カンパニー) 接種した生産培地を、２５０mＬ広口エルレンマイヤー
フラスコ中、２インチ、２５０rpmの回転シェーカー
上、３０℃で４〜５日間熟成する。

【０１１６】Ｂ．培養菌株のタンク発酵:− 大容量の接種材料を製造するため、前記Ａ項に記載のよ
うに製造した第１段階の熟成培地１０mＬを用い、第１
段階の培地の組成と同一の組成を有する第２段階の生長
培地４００mＬに接種する。この第２段階の栄養培地
を、２−Ｌ広口エルレンマイヤーフラスコ中、２インチ
旋回、回転数２５０rpmのシェーカー上、３０℃で約４
８時間熟成する。

【０１１７】熟成して得られた第２段階の栄養培地１０
００mＬを用い、前記Ａ項に記載のように製造した滅菌
生産培地(ただしＰ−２０００消泡剤０.３g／Ｌを加え
る)１００lに接種する。接種した生産培地を、撹拌中の
１６５Ｌ発酵タンク中、３０℃で９０〜１００時間発酵
させる。撹拌(８０rpm)している容器中の空気流を、溶
解酸素濃度(空気の飽和の５０％以上)に保持するよう調
節する。

【０１１８】Ｃ．培養菌株Ａ８２８４６の別のタンク発
酵:− 栄養培地の適当量を用い、１６００ガロン(４５３６−
Ｌ)発酵タンク中、生産培地約１２００ガロンに接種す
る。

【０１１９】実施例３培養菌株Ａ８２８４６.１を用いる抗生物質Ａ８２８４
６の製造:ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１８０
９９(凍結乾燥したペレットまたは液体窒素中に保持し
た懸濁液のいずれかとして)を、実施例２に記載の方法
(但し生産培地は次の組成を有する)により培養する。

【０１２０】成分:グルコース１.０％;ポテトデキスト
リン２.０％;ペプトン＊１.０％;炭酸カルシウム０.２
％;廃糖蜜２.０％;脱イオン水を加えて全量１Ｌ。pＨを
調節しない。注)＊バクト−ペプトン(Ｂacto−peptone
(ディフコ・ラボラトリーズ(Ｄifco Ｌaboratories))。

【０１２１】実施例４培養菌株Ａ８２８４６.２を用いる抗生物質Ａ８２８４
６の製造:− 培養菌株ノカルジア・オリエンタリスＮＲＲＬ１８１０
０(凍結乾燥ペレットまたは液体窒素中に保持した懸濁
液のいずれかとして)を、実施例２に記載の方法(ただし
用いた酸加水分解カゼインはアミカーゼ(Ａmicase、シ
ェフィールド・ケミカル・カンパニー)である)により、
培養する。

【０１２２】実施例５粗Ａ８２８４６の製造:− 実施例２のＣ項記載のように製造された１６００ガロン
発酵容器から得られた発酵液４２００Ｌを、５Ｎ水酸化
ナトリウムでpＨ１０.５に調節し、３％セライト５４５
(濾過助剤)を加える。混合物をフィルタープレスに通し
て濾過し、プレスを水洗する。濾液と洗液(４２００Ｌ)
を合して５Ｎ塩酸(または硫酸)でpＨ７に調節し、ダウ
エックス−ＸＦＳ−４３２７８(ＮＨ₄ ⁺)樹脂カラム(濾
液２００Ｌ／樹脂１０Ｌ)に適用する。このカラムを流
速７５０mＬ／分で溶離する。各分画をバチルス・スブ
チリス(Ｂacillus substilis)による生物試験法または
ＨＰＬＣのいずれかで試験する。

【０１２３】カラムを５カラム容量の水で洗い、残部１
００Ｌ分画を集める。５カラム容量の０.０５Ｎ水酸化
アンモニウムで樹脂から活性物質を溶離し、２５Ｌ分画
を集める。Ａ８２８４６を含む分画を合して減圧下、約
３０Ｌ容に濃縮する。この溶液を、水中ダイアイオン
(Ｄiaion)ＨＰ−２０樹脂の１０Ｌカラムに適用する。
このカラムを、流速３００mＬ／分の下に３カラム容量
の水で洗う。洗水を捨てる。１.０％酢酸を含有する水:
イソプロパノール(９５:５)溶液を用い、流速１００mＬ
／分でカラムから活性物質を溶離し、４Ｌ分画を集め、
生物試験法およびＨＰＬＣで試験する。Ａ８２８４６
(＃６−１４)含有分画を合して減圧下に濃縮し、凍結乾
燥して３５６gの粗Ａ８２８４６を得る。

【０１２４】実施例６Ａ８２８４６ＡおよびＡ８２８４６Ｂの単離:− Ａ．濃厚なＡ８２８４６ＡおよびＡ８２８４６Ｂの分
離:− 実施例５で製せられたＡ８２８４６(３０g)を水５００m
Ｌに溶解し、１％リン酸二水素アンモニウム中加圧して
平衡にしたシリカゲルＬＰ−１／Ｃ₁₈の３０Ｌステンレ
ススチールカラムに適用する。１％リン酸二水素アンモ
ニウム６０Ｌから１％リン酸二水素アンモニウム含有の
水:アセトニトリル(８８:１２)６０Ｌの傾斜溶離剤を用
い、流速２５０〜３００mＬ／分(最大圧力６００psi)
で、カラムを展開し、４Ｌ分画を集め、２５４nmのＵＶ
検出器を用いて溶出液を監視する。各分画を分析的ＨＰ
ＬＣで試験する。Ａ８２８４６Ａに富む分画(＃６〜９)
とＡ８２８４６Ｂに富む分画(＃１０〜１７)それぞれを
合し、減圧下に濃縮する。

【０１２５】Ｂ．Ａ８２８４６Ａの精製:− 前記Ａ項記載のように処理した１回の操作３０gの２回
分から得られたＡ８２８４６Ａに富む濃厚物を、ダイア
イオンＨＰ−２０ＳＳの１７５０mＬカラム上で脱塩、
水洗し、０.５％酢酸含有の水:イソプロパノール(９５:
５)で溶離し、分析的ＨＰＬＣにより試験する。Ａ８２
８４６Ａを含む分画を合して濃縮し、凍結乾燥してＡ８
２８４６Ａに富む生成物７.４gを得る。

【０１２６】Ａ８２８４６Ａに富む生成物７.２gを水に
溶解し、１％リン酸二水素アンモニウム中シリカゲルＬ
Ｐ−１／Ｃ₁₈のプレパラテブＨＰＬＣカラムに適用す
る。１％リン酸二水素アンモニウムから１％リン酸二水
素アンモニウム:アセトニトリル(９:１)の傾斜溶離剤を
用いてカラムを展開し、分析的ＨＰＬＣによる溶出液を
２５４nmで監視しながら流速４８mＬ／分で溶離する。
最初の１０Ｌを溶離した後、５００mＬ分画を集める。

【０１２７】Ａ８２８４６Ａを含む分画(＃４〜１０)お
よびＡ８２８４６Ｂを含む分画(＃１２〜２０)それぞれ
を合し、減圧下に濃縮する。３回の操作で得られたＡ８
２８４６Ａの濃厚物を合し、ダイアイオンＨＰ−２０Ｓ
Ｓの１７５０mＬカラムに適用して溶液を脱塩する。カ
ラムを水洗し、０.５％酢酸含有の水:イソプロパノール
(９５:５)で溶離する。ＨＰＬＣで溶出液を監視する。
Ａ８２８４６Ａを含む分画を合して濃縮し、凍結乾燥し
て純品Ａ８２８４６Ａ７.９gを得る。

【０１２８】ＫＢrディスク中Ａ８２８４６ＡのＩＲス
ペクトルを図１;チオグリセロール中Ａ８２８４６Ａの
ＦＡＢ−ＭＳを図４;ブラッカー(Ｂruker)ＡＭ５００分
光計(ＨＤＯ抑制)を用いて(メチルスルホキシド)−d₆中
(６０℃)、Ａ８２８４６Ａ塩酸塩のＮＭＲスペクトルを
図７に示す。

【０１２９】Ｃ．Ａ８２８４６Ｂの精製:− 前記Ｂ項記載のようにプレパラティブＨＰＬＣの操作３
回でＡ８２８４６ＡとＡ８２８４６Ｂを分離して得られ
たＡ８２８４６Ｂに富んだ分画を合し、ダイアイオンＨ
Ｐ−２０ＳＳの１７５０mＬカラム上で脱塩し、水洗し
て０.５％酢酸含有の水:イソプロパノール(９５:５)で
溶離する。溶出液をＨＰＬＣで監視し、このＡ８２８４
６Ｂ分画を合して減圧下に濃縮し、凍結乾燥してＡ８２
８４６Ｂ純品８.８gを得る。

【０１３０】ＫＢrディスク中Ａ８２８４６ＢのＩＲス
ペクトルを図２;チオグリセロール中Ａ８２８４６Ｂの
ＦＡＢ−ＭＳを図５;ブラッカー(Ｂruker)ＡＭ５００分
光計を用いて(メチルスルホキシド)−d₆中(６０℃)、Ａ
８２８４６Ｂ酢酸塩のＮＭＲスペクトルを図８に示す。

【０１３１】Ｄ．脱塩:− ダイアイオンＨＰ−２０樹脂を用い、０.１％酢酸含有
のメタノール:水(４:１)で溶離し、脱塩することもでき
る。

【０１３２】実施例７Ａ８２８４６Ｃの単離:− Ａ．Ａ８２８４６の分離:− 実施例２・Ｂ項のように処理した１６５Ｌ発酵４回から
得られた発酵液４６１Ｌを、５Ｎ水酸化ナトリウムでp
Ｈ１０.５に調節し、３％ハイフロ・スーパーセル(Ｈyf
lo Ｓupercel)濾過助剤で濾過する。濾液４３０Ｌを５
Ｎ塩酸でpＨ７に調節し、ダウエックス(Ｄowex)−ＸＦ
Ｓ−４３２７８(ＮＨ₄ ⁺)樹脂を含むカラムに適用する。
カラムを水５０Ｌで洗い、０.０５Ｎ水酸化アンモニウ
ム５０Ｌで活性物質を溶離し、４Ｌ分画を集める。溶出
液を生物試験法で監視する。活性分画(＃１〜７)を合し
て減圧下、約１７００mＬ容に濃縮し、凍結乾燥して粗
Ａ８２８４６(２８３.９g)を得る。

【０１３３】Ｂ．Ａ８２８４６Ａ、ＢおよびＣの分離:
− 前記Ａ項で得られた粗Ａ８２８４６(２g)を水に溶解
し、１％リン酸二水素アンモニウム中、シリカゲルＬＰ
−１／Ｃ₁₈樹脂２１１０mＬ含有の２"×４５"ステンレ
ススチール製プレパラテブＨＰＬＣカラムに適用する。
１％リン酸二水素アンモニウムから１％リン酸アンモニ
ウム:アセトニトリル(９２:８)の傾斜溶離剤を用い、流
速７０mＬ／分でカラムを展開し、４００mＬ分画を集
め、２５４nmのＵＶで監視する。

【０１３４】Ａ８２８４６Ａを含む分画(＃１１〜１４)
を合してプール１とし;Ａ８２８４６Ｃを含む分画(＃１
６〜２０)を合してプール２とし、Ａ８２８４６Ｂを含
む分画(＃２１〜２５)を合してプール３とする。

【０１３５】Ｃ．Ａ８２８４６Ｃの精製:− プール２を約２００mＬ容に濃縮し、脱塩するため、ダ
イアイオンＨＰ−２０樹脂１８００mＬ含有の７×４５c
mグラスカラムに適用する。０.１％酢酸含有のメタノー
ル:水(４:１)を用い、流速２５mＬ／分で活性物質を溶
離し、１Ｌ分画を集める。Ｃ含有分画(＃９〜１２)を合
して減圧下に濃縮し、凍結乾燥して半精製Ａ８２８４６
Ｃ(６６２.２mg)を得る。

【０１３６】シリカゲルＬＰ−１／Ｃ₁₈(４５０mＬ)含
有の１"×４８"スチールカラム上、１％リン酸二水素ア
ンモニウムから１％リン酸二水素アンモニウム:アセト
ニトリル(９２:８)の傾斜溶離剤を用い、流速１１mＬ／
分で逆相ＨＰＬＣ操作を反復し、２５mＬ分画を集め、
２５４nmで監視することにより、上記半精製Ａ８２８４
６Ｃ(５００mg)を更に精製する。Ａ８２８４６Ｃ含有分
画(＃１６９〜２１０)を合し、ＨＰ−２０樹脂を含む５
×４５cmグラスカラム上で脱塩する。このカラムを０.
１％酢酸含有メタノール／水(４:１)で溶離し、１００m
Ｌ分画を集め、分析的ＨＰＬＣ上、２２５nmのＵＶを用
いて溶離を続ける。Ａ８２８４６Ｃを含む分画(＃５〜
１１)を合して減圧下に濃縮し、凍結乾燥してＡ８２８
４６Ｃ(１２７.３g)を得る。

【０１３７】Ａ８２８４６Ａを含むプール１およびＡ８
２８４６Ｂを含むプール３を上記Ａ８２８４６Ｃの精製
と同様の方法で精製し、更にＡ８２８４６ＡおよびＡ８
２８４６Ｂ純品を得る。

【０１３８】Ｄ．更にＡ８２８４６Ｃの精製:− 下記プレパラテブクロマトグラフィ操作によりＡ８２８
４６Ｃ(７０mg)を更に精製する。カラム:ゾルバックスＳＣＸ(９.２×２５０mm)陽イオン
交換移動相:１０％メタノール含有の０.１５Ｍリン酸二水素
ナトリウム緩衝液から出発して１０％メタノール含有の
０.９Ｍリン酸二水素ナトリウム緩衝液に到る線型傾斜
溶離剤(６分間移動、５分間保持、緩衝液に対して無調
節) 流速:６.０mＬ／分検出:２８０nmのＵＶ負荷:６.０mg／水中注入

【０１３９】ピーク検出機構を備えた自動フラクション
コレクター(Ｇilson ２０１Ｃ)を用いてＡ８２８４６
Ｃを集める。移動相をミリポア・ウォーターズ(Ｍillip
oreＷaters)Ｍ６００傾斜溶離ＨＰＬＣ系で供給し、試
料溶液を日立(Ｈitachi)オートサンプラーにより注入す
る。

【０１４０】Ａ８２８４６Ｃを含む分画を合して３０m
Ｌ容に濃縮し、ＨＰ−２０カラム(５０mＬ)に適用す
る。カラムを水洗し、０.５％酢酸含有の水:イソプロパ
ノール(９５:５)で溶離し、２５mＬ分画を集める。Ａ８
２８４６Ｃ含有分画(＃９〜１４)を合して濃縮し、凍結
乾燥してＡ８２８４６Ｃ純品３７mgを得る。

【０１４１】ＫＢrディスク中Ａ８２８４６ＣのＩＲス
ペクトルを図３;チオグリセロール中Ａ８２８４６Ｃの
ＦＡＢ−ＭＳを図６;およびブラッカーＡＭ５００分光
計(ＨＰＯ抑制)上、(メチルスルホキシド)−d₆中(６０
℃)、Ａ８２８４６Ｃ酢酸塩のＮＭＲスペクトルを図９
に示す。

【０１４２】実施例８Ａ８２８４６塩の製造:− 操作:それぞれの場合において、Ａ８２８４６成分(１０
０mg)を脱イオン水(１０mＬ)に溶解する。この溶液を
０.５Ｎ酸(塩酸、硫酸およびリン酸)でpＨ約３に調節す
る。溶液を凍結乾燥して相当の塩型化合物を得る。もし
pＨ３より非常に低く(すなわちpＨ２)なれば成分の品質
が低下することに注意することが重要である。

【表１３】収量(mg) 塩Ａ８２８４６ＡＡ８２８４６Ｂ塩酸塩９３.８８８.１硫酸塩９２.５７５.４リン酸塩１１０.８１０５.７

【０１４３】実施例９Ａ８２８４６Ａ錠剤の製造:− 下記成分と量によりＡ８２８４６Ａ含有錠剤を製造す
る。成分:Ａ８２８４６Ａリン酸塩２８２.９mg;微結晶セル
ロース１０１.１mg;クロスカルメロース・ナトリウム１
２.０mg;プロビドン１２.０mg;ステアリン酸マグネシウ
ム３.０mg;ステアリン酸４.０mg;純水０.１６mＬ。注)クロスカルメロース(croscarmellose);プロビドン(p
rovidone)。

【０１４４】Ａ８２８４６Ａリン酸塩、微結晶セルロー
スの一部およびクロスカルメロース・ナトリウムの一部
を適当な容器に入れ、均質になるまで混和する。プロビ
ドンの水溶液を製し、このプロビドン溶液を上記粉末混
合物に加える。得られた混合物を顆粒化し、必要に応じ
て計測し、乾燥する。この乾燥混合物に微結晶セルロー
ス残部とクロスカルメロース・ナトリウム残部を加え、
混和する。ステアリン酸マグネシウムとステアリン酸を
加え、この混合物を混和し、得られた粉末を圧縮して錠
剤を製造する。

【０１４５】実施例１０Ａ８２８４６Ｂカプセル剤の製造:− 下記成分と量によりＡ８２８４６Ｂ含有カプセル剤を製
造する。成分:Ａ８２８４６Ｂ塩酸塩２６２.２mg;流動性コーン
スターチ粉末１３７.７mg;シリコーン液体３５０センチ
ストロークス２.７mg;コーンスターチ１４７.１mg。

【０１４６】Ａ８２８４６Ｂ塩酸塩、流動性コーンスタ
ーチ粉末、シリコーン液体３５０センチストロークスお
よびスターチ粉末を適当なミキサー中、均質になるまで
混和する。適当なサイズの硬質ゼラチンカプセルに充填
する。

【０１４７】実施例１１Ａ８２８４６Ａ懸濁液の製造:− 結晶化または沈澱により、Ａ８２８４６Ａの滅菌不溶性
型薬剤を製造する。粉砕または篩別けして懸濁薬に適す
る粒形の大きさにする。下記賦形剤中にＡ８２８４６Ａ
を懸濁する。成分:レシチン１％;クエン酸ナトリウム２％;プロピル
パラベン０.０１５％;注射用水、所望の容量になる量。

【０１４８】懸濁液をばらで、またはバイアルに充填す
るか、もしくはバイアル中のＡ８２８４６Ａに上記賦形
剤を即席的に加えることにより懸濁液を製造する。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ８２８４６ＡのＫＢr法によるＩＲスペク
トルを示す図である。

【図２】Ａ８２８４６ＢのＫＢr法によるＩＲスペク
トルを示す図である。

【図３】Ａ８２８４６ＣのＫＢr法によるＩＲスペク
トルを示す図である。

【図４】Ａ８２８４６ＡのＦＡＢ−質量スペクトルを
示す図である。

【図５】Ａ８２８４６ＢのＦＡＢ−質量スペクトルを
示す図である。

【図６】Ａ８２８４６ＣのＦＡＢ−質量スペクトルを
示す図である。

【図７】Ａ８２８４６ＡのＮＭＲスペクトルを示す図
である。

【図８】Ａ８２８４６ＢのＮＭＲスペクトルを示す図
である。

【図９】Ａ８２８４６ＣのＮＭＲスペクトルを示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ //(Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:365） (72)発明者ジェイムス・アルバート・マベアメリカ合衆国インディアナ46259、インディアナポリス、リトル・オーク・レイン 7410番 (72)発明者デビッド・フランシス・マホニーアメリカ合衆国インディアナ46260、インディアナポリス、ベクテル・ロード1927番 (72)発明者ウォルター・ミツオ・ナカツカサアメリカ合衆国インディアナ46217、インディアナポリス、アイアン・リージ・ロード1517番 (72)発明者レイモンド・チー−フォン・ヤオアメリカ合衆国インディアナ46032、カーメル、ホーソーン・ドライブ987番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ノカルジア・オリエンタリス菌株ＮＲＲ
Ｌ１８０９８、ＮＲＲＬ１８０９９およびＮＲＲＬ１８
１００またはそのＡ８２８４６産生後代菌から選択され
た生物学的に純粋な培養物。